Este trabalho objetivou investigar a existência de polimorfismos de seqüência nucleotídica (SNPs "single nucleotide polymorphisms") em fragmentos genômicos de cana-de-açúcar homólogos a genes de resistência. Para tal, iniciadores sintéticos homólogos às extremidades de uma seqüência expressa identificada (ESTs "expressed sequence tag") como homóloga ao gene Xa1 de arroz (EST SCCCCL3080E03.g) e outra ao gene Rp1-D de milho (EST SCCCCL3080B03.g) foram utilizados para amplificar, em duplicata, fragmentos genômicos de variedades de cana-de-açúcar. Em seguida, os fragmentos foram clonados e seqüenciados. No caso do primeiro EST, foram obtidas seqüências de 119 insertos de uma variedade resistente (SP804966) e 156 de uma variedade suscetível (SP80180) a Xanthomonas albilineans. No segundo caso, foram obtidas seqüências de 167 insertos de uma terceira variedade resistente (R570) e 135 de outra suscetível (SP811763) a Puccinia melanocephala. Para cada EST considerado, as seqüências foram comparadas por meio do programa DNA Sequencher 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Nesta análise, somente foram consideradas seqüências reproduzíveis, isto é, que ocorreram nas duas repetições. No caso de ambos ESTs, a comparação de seqüências entre variedades possibilitou a identificação de quatro a seis fragmentos distintos. A comparação entre variedades, por sua vez, revelou a existência de até duas seqüências comuns. Presume-se que estas seqüências reproduzíveis e confirmadas por meio de digestões de clones representativos de cada uma com enzimas de restrição, correspondam a seqüências alélicas. Iniciadores foram sintetizados com base em polimorfismos encontrados entre os diferentes alelos. No entanto, tentativas de amplificar alelos específicos por meio destes iniciadores se revelaram infrutíferas. Tal insucesso deve-se possivelmente à condição polialélica da cana-de-açúcar, que faz com que polimorfismos entre dois alelos sejam compensados por monomorfismos entre estes e os demais alelos. Assim, a utilização de SNPs como marcadores moleculares baseados em PCR em cana-de- açúcar mostra-se mais complexa quando comparada a plantas diplóides. / The objective of this work was to investigate the existence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genomic fragments homologous to resistance genes in sugarcane. For this purpose, primers were designed based on the sequence of the extremities of an identified expressed sequence tag (ESTs) similar to the Xa1 gene of rice (EST SCCCCL3080E03.g) and another to the maize Rp1-D gene (EST SCCCCL3080B03.g). These primers were used to amplify genomic fragments of sugarcane varieties in duplicate. The fragments were then cloned and sequenced. In the case of first EST, sequences of 119 inserts from a resistant variety (SP804966) and 156 from a susceptible variety (SP80180) to Xanthomonas albilineans were analyzed. In the case of the second EST, sequences of 167 inserts from a third variety (R570) and 135 of a fourth one (SP811763), resistant and susceptible respectively to Puccinia melanocephala, were analyzed. Sequences were compared using the program DNA Sequencher 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). In this analysis, only reproducible sequences were considered, that is, sequences that occurred in both replicates. Four to six different sequences were identified within varieties whereas comparisons among varieties revealed the existence of up to two sequences in common. These reproducible sequences, which were further confirmed through digestion of representative clones with appropriate restriction enzymes, could correspond to allelic sequences. Primers were designed based on the SNPs detected among these so-called alleles. However, attempts to amplify specific alleles using these primers were unsuccessful. This could be due to the polyallelic condition of sugarcane in which polymorphisms between two alleles could be compensated by monomorphisms between these and other alleles. Thus the use of SNPs as PCR-based molecular markers is not as straightforward in sugarcane as in diploid species.

Entre as principais culturas do Brasil, a cana-de-açúcar é afetada por doenças responsáveis por reduções na produção. Entre elas, a ferrugem alaranjada, causada por Puccinia kuehnii relatada recentemente no país, tem merecido atenção dos Programas de Melhoramento Genético da cultura. Neste trabalho avaliaram-se parâmetros epidemiológicos monocíclicos da ferrugem alaranjada em duas variedades de cana, sob duas condições de temperatura. Plantas com 40 dias de idade das variedades SP891115 e RB855156, que se comportam como suscetível e medianamente resistente respectivamente, foram inoculadas com urediniósporos coletados de plantas com sintomas típicos da doença e colocadas em condições de alta umidade e 22 °C por 24 horas. Em seguida, as plantas foram transferidas para câmaras de crescimento com temperaturas de 18 oC e 25°C. Dois experimentos idênticos foram conduzidos, sendo que no primeiro o inóculo foi proveniente de plantas do campo, no segundo foi obtido em condições controladas. Avaliaram-se período de incubação, período de latência, germinação de esporos e formação de apressórios, freqüência de infecção, tamanho de pústula, severidade, esporulação e viabilidade dos esporos produzidos. O uso de inóculo produzido em condições controladas mostrou-se mais adequado para estudos dos parâmetros monocíclicos. A temperatura de 25 oC foi mais adequada para a manifestação da doença, em todas as variáveis avaliadas. A variedade RB 855156 mostrou maior nível de resistência poligênica que a variedade SP 891115, revelada por períodos de incubação e latência mais longos, menor frequência de infecção e menor área das pústulas. No caso das variáveis frequência de infecção e área das pústulas, a variedade RB 855156 mostrou menores valores somente a 18 oC, revelando que a resistência é influenciada pela temperatura. Não houve efeito da variedade de cana na esporulação ou na viabilidade dos esporos produzidos. / Among the main crops in Brazil, sugar cane is affected by several diseases responsible for reductions in yield. Among them, orange rust caused by Puccinia kuehnii, which was recently reported in the country, has deserved special attention by the breeding programs. In this work it were evaluated the monocyclic parameters of orange rust on two different varieties, under two conditions of temperature. Fortydays plants of SP891115 and RB855156 varieties, which are considered respectively susceptible and moderately resistant were inoculated with urediniospores collected from infected plants and kept in wet chamber at 22 °C for 24 hours. Then the plants were transferred to growth chambers with temperatures of 18 °C and 25 °C. Two identical experiments were conducted. Inoculum used in the first experiment was collected on naturally infected plants in the field while for the second experiment it was obtained through artificial inoculations. It were evaluated incubation and latency periods, spores germination and appressoria formation, frequency of infection, pustules size, severity, sporulation and viability of spores produced on each condition. The use of artificially obtained inoculums proved to be more suitable for monocyclic parameters study. Temperature of 25 °C was more suitable for disease development in all variables evaluated. Variety RB 855156 showed higher level of polygenic resistance than variety SP 891115 as revealed by longer incubation and latency periods, as well as by higher infection frequency and pustules area. Variety RB 855156 showed lower levels of infection frequency and pustules area only at 18 °C, revealing that its resistance is influenced by temperature. No effects of sugarcane variety on sporulation or spores viability were observed.

O Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) e o Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) são as duas espécies de potyvírus que mais causam danos em cucurbitáceas no estado de São Paulo e no Brasil. Uma boa alternativa de controle para as doenças causadas por esses vírus é o emprego da premunização. O principal objetivo desse trabalho foi estudar a competição por sítios de replicação como possível mecanismo de proteção entre a estirpe fraca PRSV-W-1 e a estirpe severa PRSV-W-C em plantas de abobrinha-de-moita. Além disso, procurou-se também conhecer o período mínimo necessário para a proteção de plantas de abobrinha-de-moita premunizadas com a estirpe fraca ZYMV-M, só e em dupla premunização com a estirpe fraca PRSV-W-1, para fornecer subsídios para o uso em condições de campo. O estudo da competição por sítios de replicação como mecanismo de proteção foi feito inoculando-se plantas de abobrinha-de-moita ‘Caserta‘ com a estirpe fraca PRSV-W-1 e desafiando-as com a estipe severa PRSV-W-C. As inoculações de proteção foram feitas nas folhas cotiledonares e as de desafio na folha nova verdadeira, e vice-versa, aos 3, 6 e 9 dias após a primeira inoculação. Plantas infectadas com a estirpe fraca e não desafiadas e plantas infectadas com a estirpe severa foram usadas como controles. As avaliações foram feitas com base na manifestação dos sintomas 30 dias após o desafio. Também foi feito teste de recuperação da estirpe desafiante e detecção desta por RT-PCR, com primers específicos, aos 8 dias após o desafio. Os resultados sugerem que, independente do local onde foi realizada a inoculação de proteção (folha cotiledonar ou folha nova expandida), de uma maneira geral parece haver alguns sítios livres para a superinfecção com a estirpe severa. Quando esta foi inoculada aos três dias após a proteção, ela se estabeleceu em algumas plantas, moveu-se sistemicamente e sobrepôs a estirpe fraca, uma vez que as plantas exibiram sintomas severos. Com o passar do tempo (seis e nove dias após a proteção), todas as plantas ficaram protegidas contra a expressão dos sintomas severos da estirpe desafiante, porém esta foi capaz de se estabelecer nas folhas inoculadas e até mesmo mover sistemicamente em algumas plantas. No caso da proteção com a estirpe fraca ZYMV-M, só ou em mistura com a estirpe fraca PRSV-W-1, contatou-se que plantas de abobrinha-de-moita premunizadas e desafiadas sete dias depois ficaram protegidas contra a infecção e/ou manifestação dos sintomas das respectivas estirpes severas usadas no desafio. / Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) are two potyviruses associated with severe yield losses on cucurbit crops in the State of São Paulo and other parts of the Brazilian territory. Preimmunization with mild strains has proved to be a good alternative for the control of both viruses in susceptible cultivars. The main purpose of this work was to evaluate the competition for infectable sites as a possible mechanism of cross protection between the mild strain PRSV-W-1 and the severe strain PRSV-W-C in zucchini squash (Cucurbita pepo cv. Caserta). Protective inoculation with the mild strain was done at the cotyledon and the challenge inoculation with the severe strain was applied on the first true expanded leaf, and viceversa. Different plants were challenged at three, six and nine days, respectively. No challenge protected plants and healthy plants infected with the severe strain were used as controls. Evaluations were based on the expression of the symptoms at 30 days after challenge inoculation. Attempts to recover the challenge strain from challenge inoculated and new developed leaves were also done at eight days after challenge inoculation. RT-PCR with specific pairs of primers was also used to detect both stains in some of these samples. Regardless the leaf on which the protective strain was applied (cotyledon or first true expanded leaf) there appear to be some infectable sites available for superinfection with the severe strain. When the challenge inoculation was done at three days after preimmunization, the severe strain was able to superinfect some plants, move systemically and overcome the mild strain, since these plants expressed severe symptoms. All plants become protected against the expression of the symptoms induced by the severe strain when the challenge inoculation was done at six and nine days after preimmunization. However, the severe strain was still detected in the inoculated and upper leaves of few test-plants, eight days after challenge inoculation. In addition to this, it was also determined the period of time necessary to protect zucchini squash plants with a mild strain of ZYMV, named ZYMV-M, alone and in mixture with mild strain PRSV-W-1. The results indicated that single and double preimmunized plants were protected against infection and/or expression of the homologous severe strain seven days after protective inoculation.

Doenças causadas por Phytophthora spp. ocorrem em todas as regiões produtoras de citros do mundo e as manifestações mais comuns são a podridão do pé e de raízes. A principal medida de controle desses patógenos é a exclusão, porém em áreas contaminadas o mesmo pode ser obtido através do uso de produtos químicos ou com o plantio de copas enxertadas sobre portaenxertos resistentes, que onera menos o custo de produção. Os porta-enxertos menos suscetíveis a Phytophthora nicotianae são o citrumelo Swingle e o Poncirus trifoliata. Apesar de sua importância, pouco se sabe sobre as alterações fisiológicas e bioquímicas da interação citros - P. nicotianae. Dessa maneira, o trabalho visou analisar e comparar alterações fisiológicas e bioquímicas provocadas por P. nicotianae em dois porta enxertos de citros: tangerina Sunki (suscetível) e citrumelo Swingle (resistente). Para tanto, porta-enxertos das duas variedades com nove ou dois meses de cultivo tiveram as raízes inoculadas com P. nicotianae. As plantas mais velhas foram mantidas sob condições de campo por nove meses e as mais novas foram mantidas por uma semana a 28 oC sob 12 h de luz. Periodicamente, avaliou-se a biomassa do sistema radicular e a colonização pelo patógeno, bem como parâmetros fisiológicos: troca gasosa, consumo de água e produção de etileno; do metabolismo primário: carboidratos e proteínas; e secundário: atividades da superóxido dismutase, catalase, quitinase, -1,3-glucanase, guaiacol peroxidase, polifenoloxidase, fenilalanina amônia-liase, fenóis totais e lignina. Observou-se nos porta-enxertos inoculados aos nove meses de cultivo que P. nicotianae comprometeu o sistema radicular e a troca gasosa apenas de tangerina Sunki a partir do quarto e quinto meses após a inoculação, respectivamente. A concentração de carboidratos em raízes de tangerina Sunki foi reduzida pelo patógeno a partir do terceiro mês após a inoculação, enquanto que em citrumelo Swingle só foram detectadas diferenças no terceiro e no quinto meses após a inoculação. Além disso, análises em HPLC, que envolveram os porta-enxertos com dois meses de cultivo, mostraram que as concentrações de sacarose e glicose em raízes de citrumelo Swingle foram afetadas pelo patógeno. Ademais, P. nicotianae estimulou a produção de etileno em plântulas de tangerina Sunki seis e sete dias após a inoculação, bem como reduziu a troca gasosa e o consumo de água nesse porta-enxerto a partir do quarto e quinto dia após a inoculação, respectivamente. Conclui-se que P. nicotianae reduz o sistema radicular de tangerina Sunki, o que diminui as trocas gasosas e afeta o balanço hídrico e estimula a síntese de etileno. Além disso, inicialmente P. nicotianae altera o metabolismo de carboidratos em raízes de citrumelo Swingle, seguida por reduções mais severas nas concentrações de açúcares em raízes de tangerina Sunki. Finalmente, não foram verificadas alterações relevantes no metabolismo secundário, que pudessem auxiliar na elucidação dos mecanismos de resistência de citrumelo Swingle a P. nicotianae. / Phytophthora diseases affect citrus plantations all over the world and the main symptoms are foot and root rot. Exclusion is the most important control method for these diseases, but they can be controlled in infected areas by using chemical control, or by planting scion grafted on resistant rootstocks, which is less costly. The less susceptible rootstocks to Phytophthora nicotianae are Swingle citrumelo and Poncirus trifoliata. Besides the importance of citrus-P. nicotianae interactions, it is still poorly understood its physiology and biochemistry. In this way, the objectives of this work were to analyze and to compare physiological and biochemical changes caused by P. nicotianae in two citrus rootstock: Sunki tangerine (susceptible) and Swingle citrumelo (resistant). Initially, nine and two months-old plants of both genotypes had their roots inoculated with P. nicotianae. The oldest plants were kept under field conditions during nine months and the youngest ones were incubated at 28 oC under 12 h of light for one week. Periodically, it was analyzed root biomass and pathogen colonization as well as physiological parameters: gas exchange, water consumption and ethylene production; primary metabolism: carbohydrates and protein; and secondary metabolism: superoxide dismutase, catalase, chitinase, -1,3-glucanase, guaiacol peroxidase, polyphenoloxydase, phenylalanine ammonia-lyase activities, total phenolics and lignin content. P. nicotianae reduced the root system and gas exchange of Sunki tangerine on the oldest rootstocks after the fourth and fifth months after the inoculation, respectively. This rootstock also showed reduction on the root carbohydrate content from the third month after the inoculation to the end of the experiment. On the other hand, the pathogen just changed this parameter on Swingle citrumelo on the third and fifth months after the inoculation. More over, HPLC analysis on two month-old plants indicated that sucrose and glucose concentration on Swingle citrumelo root system were affected by the pathogen. P. nicotianae also stimulated the ethylene production on Sunki tangerine six and seven days after the inoculation as well as decreased gas exchange and water consumption from the fourth to fifth days after the inoculation, respectively. It was concluded that P. nicotianae reduces the root system of Sunki tangerine, which decreases the gas exchange and water balance and increases ethylene synthesis. Moreover, initially P. nicotianae changes the carbohydrate metabolism in Swingle citrumelo root system, which is followed by severe reductions on sugar content on Sunki tangerine root. It was not found relevant changes on the secondary metabolism that could explain the mechanisms of resistance in Swingle citrumelo against P. nicotianae.

Huanglongbing é a mais destrutiva doença da citricultura mundial. Seu recente relato no Brasil, em 2004, e a detecção de duas espécies bacterianas associadas à doença -Candidatus Liberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus resultaram em poucos estudos do comportamento do Huanglongbing nas condições dos pomares brasileiros. Os objetivos deste trabalho foram (i) comparar a eficiência de infecção por Candidatus Liberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus em plantas cítricas inoculadas por meio de enxertia com as duas espécies bacterianas, separadamente, e mantidas sob diferentes temperaturas, e (ii) comparar o progresso temporal e espacial do Huanglongbing causado por ambas as espécies, a partir da infecção natural por Diaphorina citri, tendo plantas de citros ou Murraya paniculata (murta) como fonte primária de inóculo. Para alcançar o primeiro objetivo, dois experimentos foram conduzidos em câmaras de crescimento com temperatura e fotofase controladas. A incidência da doença foi determinada por Real-Time PCR de amostras foliares. As temperaturas mais amenas foram favoráveis à infecção por Candidatus Liberibacter americanus, enquanto que altas temperaturas não afetaram a infecção de Candidatus Liberibacter asiaticus. A eficiência de infecção para esta última espécie foi favorecida nas temperaturas de 17/22°C e 22/27°C (noturna/diurna, respectivamente). Para cumprir com o segundo objetivo, um experimento foi conduzido com diferentes fontes de inóculo, que corresponderam aos seguintes tratamentos: (i) plantas de laranjeira doce da variedade Natal infectadas por Candidatus Liberibacter asiaticus ou Candidatus Liberibacter americanus, (ii) unicamente plantas de Murraya paniculata infectadas por Candidatus Liberibacter americanus e (iii) unicamente plantas de laranjeira doce da variedade Natal infectadas por Candidatus Liberibacter americanus. Cada tratamento foi aplicado em um compartimento isolado de uma casade- vegetação. O primeiro tratamento foi repetido. Em todos os compartimentos, 156 a 158 plantas de laranjeira doce da variedade Valência foram dispostas ao redor das plantas fonte de inóculo. Psilídeos livres das bactérias foram periodicamente confinados em plantas fonte de inóculo e, posteriormente foram liberados na casa-de-vegetação para livre movimentação e multiplicação. Quando as duas espécies bacterianas estavam presentes nas diferentes plantas cítricas utilizadas como fonte de inóculo, houve maior detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus e maior eficiência de aquisição desta espécie bacteriana por psilídeos. Quando somente Candidatus Liberibacter americanus estava presente nas plantas fonte de inóculo, a eficiência de transmissão foi maior quando Murraya paniculata foi utilizada como fonte de inóculo, mostrando que Diaphorina citri pode adquirir naturalmente Candidatus Liberibacter 12 americanus de Murraya paniculata e transmiti-la para plantas cítricas. A eficiência de aquisição da espécie Candidatus Liberibacter americanus também foi maior tendo Murraya paniculata como planta fonte de inóculo e não citros. / Huanglongbing is the most destructive disease of citrus worldwide. There are few studies on the behavior of Huanglongbing in the Brazilian orchards conditions due to the recent report in Brazil, in 2004. Two bacterial species were associated with the disease in Brazil: Candidatus Liberibacter asiaticus and Candidatus Liberibacter americanus. The aims of this work were (i) to compare the efficiency of infection by Candidatus Liberibacter asiaticus and Candidatus Liberibacter americanus in citrus graft-inoculated plants with both bacterial species, separately, and kept under different temperatures, and (ii) to compare the spatio-temporal progress of Huanglongbing caused by both species, naturally transmitted by Diaphorina citri, having infected citrus plants or Murraya paniculata (jasmine orange) as primary inoculum sources. To achieve the first objective, two experiments were carried out in plant growth chambers with controlled temperature and light. Disease incidence in the inoculated plants was determined by Real-Time PCR of the leaf samples. The milder temperatures were favorable to Candidatus Liberibacter americanus infection, while the higher temperatures did not affect the infection by Candidatus Liberibacter asiaticus. The infection by this latter species was favored by temperatures of 17/22ºC and 22/27°C (night/day, respectively). To achieve the second objective, an experiment was carried out with different sources of inoculum, corresponding to the following treatments: (i) Natal sweet orange plants infected by Candidatus Liberibacter asiaticus or Candidatus Liberibacter americanus, (ii) only Murraya paniculata plants infected by Candidatus Liberibacter americanus and (iii) only Natal sweet orange plants infected by Candidatus Liberibacter americanus. Each treatment was applied in an isolated compartment of a screenhouse. The first treatment was repeated. In all of the compartments, from 156 to 158 Valencia sweet orange plants were located around the source of inoculum plants. Psyllids free of the bacteria were periodically confined in source of inoculum plants and, after this period, they were set free, and allowed to the free movement and multiplication inside the screenhouse. When both bacterial species were present in the different citrus plants as source of inoculum, there was higher detection of Candidatus Liberibacter asiaticus than Candidatus Liberibacter americanus and higher acquisition efficiency of the former bacterial species than the later by psyllids. When only Candidatus Liberibacter americanus was present in the source of inoculum plants, the higher transmission efficiency was reached when Murraya paniculata served as source of inoculum, showing that Diaphorina citri can naturally acquire Candidatus Liberibacter americanus from Murraya paniculata and transmit it to citrus plants. The acquisition efficiency of the 14 Candidatus Liberibacter americanus species was higher with Murraya paniculata as source of inoculum than with citrus plants was the source of inoculum.

O vírus do mosaico amarelo da abobrinha (Zucchini yellow mosaic virus - ZYMV) é provavelmente um dos mais dinâmicos e prejudiciais vírus emergentes de plantas. Desde sua primeira detecção na Itália e na França em 1973 e 1979, respectivamente, o ZYMV tem sido reportado em mais de 50 países variando de condições climáticas tropicais a temperadas em todos os continentes, exceto na Antártida. No Brasil esse potyvirus foi constatado primeiramente nos Estados de São Paulo e Santa Catarina, no início da década de 90 e posteriormente nos Estados do Ceará, da Bahia, do Rio Grande do Norte, do Pará, do Mato Grosso do Sul e do Maranhão. É provável que atualmente ocorra em todos os estados brasileiros onde se cultivam cucurbitáceas. Embora ocorra no Brasil há mais de 20 anos, pouco se conhece sobre as características biológicas, sorológicas e moleculares dos isolados até então encontrados no país. Esse projeto de pesquisa teve por objetivo cobrir parcialmente essa lacuna para fornecer subsídios para programas de melhoramento genético. Foram utilizados 11 isolados coletados em diversos estados brasileiros. A caracterização biológica consistiu no estudo da reação de diversas espécies vegetais inoculadas mecanicamente. A caracterização sorológico consistiu na marcação da proteína capsidial dos isolados com o antissoro policlonal contra o vírus. A caracterização molecular foi feita por meio da análise das sequências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos do gene da proteína capsidial dos isolados. A reação das espécies variou de acordo com o isolado inoculado. Análises de RFLP mostraram que a enzima de restrição Hpa II permitiu diferenciar o isolado fraco ZYMV-M da maioria dos isolados severos. O peso molecular da proteína capsidial dos isolados analisados foi em torno de 36 KDa, típico da proteína capsidial desse potyvirus. A identidade de nucleotídeos do gene da proteína capsidial entre os isolados brasileiros do ZYMV variou de 93% a 100% e a de aminoácidos deduzidos variou de 97% a 100%. Comparados com as sequências correspondentes de isolados do ZYMV de diferentes origens geográficas a identidade de nucleotídeos variou de 82% a 99%, enquanto a de aminoácidos deduzidos ficou entre 87% e 99%. Na árvore filogenética os isolados brasileiros do ZYMV pertencem ao grupo A, subdivisões I ou II, indicando uma variação entre os isolados. Nenhum evento de recombinação foi detectado nos isolados brasileiros. / Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) is probably one of the most dynamics and economically important emerging plant viruses. Since it was first report in Italy and France in 1973 and 1979, respectively, ZYMV has been found in over than 50 countries ranging from tropical to temperate climate conditions in all continents, except in Antartida. In Brazil this potyvirus was first reported in the beginning of 90´s in São Paulo and Santa Catarina States, and then in Ceará, Bahia, Rio Grande do Norte, Pará, Mato Grosso do Sul and Maranhão states. Probably it occurs in all Brazilian states which grow cucurbit species. Although ZYMV occurs in Brazil for more than 20 years, there is little information about the biological, serological and molecular characteristics for the isolates found in the country. The purpose of this work was to cover partially this gap to provide subsidies for genetic breeding programs. Eleven isolates collected in several Brazilian states were used. The biological characterization consisted in the study of the reaction of several vegetal species mechanically inoculated with the virus. The serological characterization consisted in the identification of the molecular weight of the coat protein through western blot analysis. The molecular characterization was done by the analyses of nucleotides and deduced amino acids sequences for the coat protein gene. The host reaction showed slight variation according to the virus. RFLP analyses showed that restriction enzyme HpaII allowed differentiate the mild ZYMV-M isolate from the majority of severe isolates. The coat protein molecular weight for all studied isolates was about 36 KDa, typical of the coat protein of this potyvirus. The nucleotide identity of the coat protein gene among the ZYMV Brazilian isolates ranged from 93% to 100%, and the deduced amino acids sequences ranged from 97% to 100%. Compared to corresponding sequences of ZYMV isolates from different geographical locations the nucleotide sequences identity ranged from 82% to 99%, while the deduced amino acids sequences ranged from 87% to 99%. Phylogenetic analysis place the Brazilian isolates of ZYMV into the group A, subdivision I or II, showing some diversity between the isolates. No recombination event was detected in the Brazilian isolates.

A leprose é uma das principais doenças na citricultura brasileira devido à sua ocorrência difundida nos pomares e aos altos custos para o controle químico do ácaro vetor. A doença compromete a produção da planta e sua vida útil, manifestando-se através de lesões locais cloróticas ou necróticas em folhas, ramos e frutos, levando à queda prematura destes órgãos e à seca de ramos. O patógeno, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recentemente classificado como espécie tipo de um novo gênero de vírus de planta, Cilevirus, é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Apesar de haver consenso de que a doença tem etiologia viral, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações vírus-planta-vetor, cujas soluções contribuirão para o controle integrado da doença. O presente trabalho teve como objetivo obter informações sobre a interação do vírus com células hospedeiras através de ensaios de imunolocalização das proteínas MP (putativa proteína de movimento), helicase (associada à replicação) e p29 (putativa proteína capsidial) do CiLV-C. Para tal, as sequências codificadoras das ORFs mp e hel foram amplificadas via RT-PCR e clonadas em vetor de expressão. Em seguida, promoveu-se a expressão in vitro das respectivas proteínas em células de E. coli e purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica. A proteína MP pura foi utilizada para produção de antissoro policlonal específico que foi testado quanto à especificidade por métodos sorológicos. Os resultados do ELISA mostraram que o antissoro apresentou reação positiva com extratos foliares de lesões lepróticas em todos os estágios de desenvolvimento da doença, quando utilizado em altas concentrações. Além disso, lesões maduras reagiram mais intensamente que lesões mais novas. Por Western Blot, detectou-se somente a proteína pura, não sendo possível obter reação positiva em extrato de lesões foliares. Também não foi possível detectar a MP por imunolocalização in situ. Os resultados em conjunto sugerem que ocorre baixo nível de expressão da MP nos tecidos do hospedeiro. Empregando-se anticorpo policlonal contra proteína p29 do CiLV-C, foi possível detectar o CiLV-C em extratos de lesões foliares de leprose por ambos os métodos sorológicos testados e também por Tissue Blotting. Ensaios de imunolocalização in situ permitiram confirmar que as partículas baciliformes presentes em cisternas do retículo endoplasmático de tecidos de lesões lepróticas em plantas representam de fato vírions do CiLV-C. Além disso, também demonstrou-se que o viroplasma que ocorre no citoplasma representa o sítio de acúmulo da proteína p29. Este mesmo ensaio revelou que partículas baciliformes que ocorrem entre membranas de células adjacentes (intestino médio, glândulas prosomais, músculos e epiderme) de B. phoenicis virulíferos são de fato do CiLV-C. A ausência de viroplasma no ácaro sugere que a relação vírus/vetor seria do tipo circulativo, sem replicação. Baseado neste fato discutem-se alternativas para explicar como o vírus trafegaria do lúmen do intestino até o duto salivar para causar infecção numa planta sadia. / Citrus leprosis is one of the most important diseases in the Brazilian citrus production due to the wide occurrence in orchards and also to the high costs involved in the chemical control of the mite vector. The disease affects the plant production and longevity and it is characterized by localized chlorotic and/or necrotic spots on the leaves, stems and fruits. Affected leaves and fruits may drop prematurely and dieback can be observed in stems. The pathogen, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recently considered as the type member of a new genus, Cilevirus, is transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis Geijskes. Despite the consensus that citrus leprosis has viral etiology, there are many pending questions regarding the viral interactions with the infected plant and the viruliferous mites. The solution of these questions may contribute to a better disease integrated management. This work aimed to obtain a better understanding about the virus-plant-vector relationship with the host cell by immunolocalization assays of the putative movement protein (MP), helicase (protein involved in the viral replication) and p29 (putative coat protein) of the CiLV-C. ORFs coding sequences of mp and hel was amplified by RT-PCR and cloned in the expression vector. Afterwards, in vitro expression of these proteins in E. coli and its purification by affinity chromatography were realized. The purified MP was used to produce specific polyclonal antibody that was tested for specificity by serological methods. The ELISA results showed that high concentration antibody reacted with the leaves extracts from lesions in all the disease stage of development. Furthermore, the old lesions reacted more intensely than the younger. Western blot (which detected only the pure protein) and in situ immunolocalization assays failed to detect the native MP in lesioned leave extracts. The results as a hole suggest the occurrence of low expression of MP in host tissue. The polyclonal antibody against p29 was able to detect the virus in lesioned plant extracts by PTA-ELISA, Western Blot, and Tissue Blotting. The viral nature of the putative viral particles, present within endoplasmic reticulum cisternae of infected leaf tissue, was confirmed by immunogold label. The labeling also occurred intensely in the viroplasmas, indicating that these structures represent p29 protein accumulation site. Putative virus particles, visualized in viruliferous B. phoenicis, between membranes of adjacent cells (midgut, prosomal glands, epidermis, muscles), was also immunogold labeled indicating that they represent CiLV-C. The absence of viroplasma in the mite tissues suggests that CiLV-C / B. phoenicis relationship is of the circulative type, without replication. Based on this finding, we search for possible alternatives for the viral circulation in the mite body from the midgut lumen to the salivary duct for the infection of a healthy plant to occur.

A mancha preta dos citros (MPC) é uma doença que limita a exportação de laranja brasileira para o Japão e países da Europa. Exceto para Citrus aurantium e seus híbridos, todas as outras variedades são susceptíveis ao patógeno. O fungo Guignardia citricarpa, descoberto por Kiely em 1948 em New South Wales na Austrália, é o estádio sexual do agente causal da MPC e a sua fase imperfeita é Phyllosticta citricarpa. Uma importante característica da MPC é seu longo período de latência. A infecção pode ser efetuada por ascósporos e picnidiósporos. A lesão nos frutos fica restrita ao flavedo (epicarpo), sendo que o fungo não infecta o albedo (mesocarpo). O albedo é rico em celulose, carboidratos solúveis, pectinas, compostos fenólicos (flavonóides), aminoácidos e vitaminas. Os compostos fenólicos presentes nas plantas são produtos do metabolismo secundário, e podem ser resultantes da interação planta-ambiente e podem sintetizados como resposta ao ataque de fitopatógenos. Os fenólicos presentes nos citros incluem flavonóides, antocianinas, coumarinas e psorolenos entre outros. Estes compostos podem exibir ação antimicrobiana e antiviral e podem contribuir controle da MPC. A aplicação de fungicidas é o método de controle da MPC. Uma outra possibilidade de controle seria a ativação de fatores de resistência através do uso de indutores bióticos (Saccharomyces cerevisiae) e abióticos (Bion e ácido salicílico). Deste modo, este trabalho teve como objetivos estudar os efeitos do uso de extratos aquosos, metanólicos e etanólicos de albedo de laranja na germinação formação de apressório e crescimento micelial de P. citricarpa in vitro, bem como avaliar o uso da indução de resistência para o controle da MPC através dos indutores S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico em pós e pré-colheita em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’ e folhas de limão ‘Siciliano’. Os resultados experimentais mostraram que os extratos de albedo, nas concentrações de 10 e 100 mg / mL de água, foram capazes de inibir em 100% a germinação, formação de apressório e o crescimento micelial de P. citricarpa. Foi observado que os extratos, dependendo da concentração, podem ter ação fungicida ou fungistática. No tocante a utilização de S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico, aplicados em pós-colheita, foi observado que estes agentes não foram capazes de impedir o desenvolvimento de novas lesões em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’. Também foi constatado que S. cerevisiae e Bion, aplicados em pré-colheita, não foram capazes de induzir resistência contra P. citricarpa em folhas de limão ‘Siciliano’ inoculadas previamente a campo com G. citricarpa. Nesse sentido, sugere-se que outros estudos sejam conduzidos, principalmente no que se refere ao uso potencial de extratos do albedo de laranja como medida alternativa de controle da MPC. / Black spot of citrus (CBS) has been a limiting factor in the export of brazilian oranges to Japan and European countries and Japan. Except for Citrus aurantium and its hybrids, all commercially growing Citrus spp. are susceptible to the pathogen. The fungus Guignardia citricarpa, discovered by Kiely in 1948 in New South Wales, is the sexual stage of the causal agent of CBS and Phyllosticta citricarpa is the imperfect stage. An important characteristic of CBS is the long latent period after infection. The infection is carried out by ascospores and pycnidiospores. The fungicidal application is the most important method of control of CBS. The CBS lesion in citrus fruits is limited to the flavedo, since P. citricarpa does not infect the albedo. The albedo is rich in cellulose, soluble carbohydrates, pectin, phenolic compounds, amino acids and vitamins. The phenolics present in the plants are secondary metabolic products and are believed to be produced as a result of the plant interaction with the enviromment and synthesized as a response to attempted phytopathogen attacks. The phenolics that occur in Citrus include flavonoids, anthocyanins, coumarins and psorolens. These compounds may exhibit antiviral and antimicrobial activities, and may contribute to the control of CBS disease. An another possibility to the CBS control is the activation of factors resistance by the use of abiotics (Bion and salicylic acid) and biotics (Saccharomyces cerevisiae) “plant defence activator” (inducers). Therefore, the objectives of this paper were to study the in vitro effects of aqueous, ethanolic and methanolic albedo orange extracts on the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa as well as to evaluate the use of the S. cerevisiae, Bion and salicylic acid as “plant defence activator” at post and preharvest conditions in fruit of “Pêra-Rio” and leaves of ’Siciliano’ lemon. The results showed that the use of albedo extracts, 10 and 100 mg per mL of water, inhibited 100 % the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa. It was also observed that the extracts of albedo, depending upon the concentration, exhibited fungicidal or fungistatic activity. The use of S. cerevisiae, Bion and salicylic acid at postharvest conditions did not affect the development of new lesions of CBS in ‘Pêra-Rio’ orange fruit. It was also observed that the use of S. cerevisiae and Bion at preharvest conditions, did not induce resistance against P. citricarpa in leaves of ‘Siciliano’ lemon naturally infected with G. citricarpa under field conditions. Thus, it is suggested that other studies be carried out, mainly regarding the potential of orange albedo’s extracts as a alternative method for CBS control.

Os agroecossistemas consistem em complexas relações tróficas entre plantas, herbívoros, e seus inimigos naturais. Sabe-se que a maioria das plantas é capaz de produzir compostos voláteis, utilizados como sinais químicos por diferentes grupos de insetos. Esses voláteis podem ser produzidos de forma constitutiva em plantas sadias, ou seja, sem indução. Por outro lado, a produção de voláteis induzidos se dá a partir do contato de secreções liberadas pelo fitófago com injurias ocasionadas pela alimentação ou oviposição no tecido vegetal. Para os fitófagos esses voláteis podem sinalizar a presença da planta hospedeira, bem como a presença de coespecíficos e do parceiro sexual. Já para os inimigos naturais, predadores e parasitóides, os voláteis induzidos podem sinalizar a presença do inseto fitófago (presa/ hospedeiro) na planta. Nesse contexto as respostas comportamentais de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), aos voláteis de plantas de murta, Murraya paniculata (L.) Jack (Rutaceae), infestadas ou não por coespecíficos, foram estudadas. Também foram investigadas as respostas dos psilídeos aos voláteis de plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck (Rutaceae) infectadas por bactérias causadoras do Huanglongbing ou HLB, uma das mais sérias doenças dos citros. Nos bioensaios visando compostos repelentes a D. citri, foram testados os voláteis de plantas de goiaba, Psidium guajava L.(Myrtaceae) e sua interferência na localização de plantas de Citrus limonia (L.) Osbeck (Rutaceae) pelos psilídeos. As respostas comportamentais foram mensuradas em olfatômetro Y e de quatro vias. Antes de estabelecer os bioensaios de olfatometria foram realizados estudos do comportamento sexual de D. citri. Os resultados obtidos evidenciaram que o início da atividade sexual de D. citri ocorreu entre o segundo e terceiro dia após a emergência, e que os psilídeos foram mais ativos durante a fotofase. Quanto às influências dos voláteis de plantas, machos e fêmeas de D. citri responderam diferentemente aos mesmos estímulos olfativos. Assim, os machos foram atraídos apenas aos odores associados às fêmeas. Já as fêmeas, foram atraídas aos odores das plantas, porém, evitando os odores associados aos machos, inclusive de plantas previamente infestadas por estes. Verificou-se também, que os adultos de D. citri distinguiram os voláteis de citros com HLB dos voláteis de plantas saudáveis. Sendo assim, ficou nítida a atratividade dos voláteis de plantas infectadas, tanto aos psilídeos machos quanto às fêmeas. Na busca por compostos repelentes, também foi possível demonstrar que os voláteis de P. guajava não somente dificultou à localização de plantas de C. limonia por D. citri, como também repeliram os psilídeos. As descobertas aqui apresentadas poderão auxiliar a elaboração de novas táticas para o manejo comportamental de D. citri. / The agro-ecosystems consist of complex trophic relationships between plants, herbivores and their natural enemies. It is known that the majority of plants can produce volatiles compounds used as chemical signals by different groups of insects. These compounds can be produced constitutively in healthy plants, i.e., without induction. In other hand, the production of induced volatiles occurs from the contact of secretions released by phytophagous with injuries caused by feeding or oviposition in plant tissue. For phytophagous, these volatile compounds may signal the presence of the host plant, as well as the presence of conspecifics and the sexual partner. Although, natural enemies, predators and parasitoids, the induced volatiles can signal the presence of phytophagous insects (prey / host) in the plant. In this context, the behavioral responses of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) to plant volatiles of jasmine, Murraya paniculata (L.) Jack (Rutaceae) infested or not by conspecifics, were studied. It was also investigated the responses of psyllids to volatiles of Citrus sinensis infected by bacteria that cause the huanglongbing or HLB, one of the most serious diseases of citrus. Given the studies that aim to identify repellent compounds to D. citri, it was tested plant volatiles of guava, Psidium guajava L. (Myrtaceae) and their impact on plant location of Citrus limonia (L.) Osbeck (Rutaceae) by psyllids. Behavioral responses were measured by Y-tube and four-way olfactometers. Before establishing the olfactometry assays, studies of D. citri sexual behavior were performed. The obtained results showed that the beginning of D. citri sexual activities occurred between the second and third days after emergence, and the psyllids were more active during the photophase. In regard to the effects of plant volatiles, males and females of D. citri differently responded to the same olfactory stimuli. Thus, males were attracted only to odors associated with females. Females were attracted to plant odors, although they avoided odors associated with males, including plants previously infested by them. It was also verified that D. citri adults distinguished volatiles citrus with HLB from volatiles released by healthy plants. Given that, it was clear that volatiles from infected plants were attractive to both males and females psyllids. In search of repellent compounds, also was possible demonstrated that P. guajava volatiles not only hindered the location of plants of C. limonia by D. citri, but also provided repellent effect to psyllids. The findings presented here may help the development of new tactics for the behavioral management of D. citri.

A ferrugem da soja (Phakopsora pachyrhizi Sydow e Sydow) foi constatada pela primeira vez no Brasil na safra 2000/01, e representa até o momento, um importante desafio para os programas de melhoramento genético de soja. As cultivares e linhagens inicialmente identificadas como resistentes, tiveram sua resistência quebrada já na safra 2002/03, pela ocorrência de prováveis novas raças do patógeno. Por consequência, a longevidade da resistência genética vertical foi colocada em risco, e o desenvolvimento de trabalhos através da utilização da tolerância é a alternativa. Como suporte para a manutenção da longevidade do controle genético da ferrugem, este trabalho objetivou testar estratégias de seleção de genótipos de soja para tolerância à ferrugem, na ausência de genes principais de resistência. Os experimentos foram conduzidos durante os anos agrícolas 2004/05 e 2005/06 em diferentes locais administrados pelo Departamento de Genética, ESALQ/USP, município de Piracicaba, SP. Foi utilizado o delineamento experimental de blocos casualizados com repetições estratificadas em conjuntos experimentais e testemunhas comuns aos conjuntos experimentais. Em 2004/05, no local Anhembi, 60 linhagens experimentais mais quatro testemunhas suscetíveis à ferrugem (BR-16, FT-2000, Conquista e IAC-100), foram avaliadas em três experimentos com e sem fungicidas (Controle, Derosal e Impact). Em 2005/06, as 26 melhores linhagens para tolerância à ferrugem, selecionadas em 2004/05, foram novamente avaliadas através dos três experimentos (Controle, Derosal e Impact) juntamente com as testemunhas (BR-16, IAC-100 e BRS-232), nos locais Anhembi, ESALQ e Areão. Contrastes das médias de produtividade de grãos entre os experimentos de fungicidas, e uma adaptação do modelo de regressão de Eberhart e Russel, foram utilizados para medir a ação da ferrugem e das doenças de final de ciclo (DFC) sobre as linhagens, com o intuito de realizar seleção de linhagens tolerantes. A ferrugem reduziu a produtividade de grãos mas não alterou significativamente o ciclo e o peso de mil sementes, bem como não alterou as outras características agronômicas estudadas. As duas estratégias de seleção propostas e utilizadas neste trabalho, foram eficientes para separar os efeitos das doenças (ferrugem e DFC), e identificar e selecionar genótipos tolerantes na ausência de genes principais de resistência, viabilizando a seleção de linhagens tolerantes. Houve associação entre tolerância à ferrugem, DFC e resistência ao nematóide de cisto da soja. / Soybean rust (Phakopsora pachyrhizi Sydow and Sydow) was first recorded in Brazil during the 2000/01 season and, even today, represents an important challenge to soybean breeding. The cultivars and lines initially identified as resistant had their resistance breakdown on the 2002/03 season, probably by the occurrence of new races of the pathogen. Consequently, the longevity of the vertical genetic resistance was put in risk and the development of works through the use of tolerance is the alternative. As support for the maintenance of the longevity of the genetic control of rust, this work aimed to evaluate strategies for selection of genotypes to rust tolerance in the absence of major resistance genes. The experiments were conducted during the agricultural years of 2004/05 and 2005/06 in different locations administered by the Department of Genetics ESALQ/USP, Piracicaba, SP. It was used the randomized complete-block design with replications stratified in experimental sets with common checks. In 2004/05 at Anhembi, 60 experimental lines and four rust-susceptible checks (BR-16, FT-2000, Conquista and IAC- 100), were evaluated in three experiments with and without fungicides (Control, Derosal and Impact). In 2005/06, the 26 best lines for rust tolerance, selected in 2004/05, were evaluated again through the three experiments (Control, Derosal and Impact) together with the checks (BR-16, IAC-100 and BRS-232), in the locations Anhembi, ESALQ and Areão. Contrasts of seed yield means among the fungicide experiments, and an adaptation of the regression model of Eberhart and Russel, were used to measure the action of rust and late season leaf diseases (LSLD) on the lines, with the intention of selecting tolerant lines. Rust reduced the seed yield but did not significantly alter the cycle or the weight of one thousand seeds, just as there was no significant change in other agronomical traits studied. Both selection methodologies were efficient to separate the effects of the diseases (rust and LSLD) and identify and select tolerant genotypes at the absence of major resistance genes, enabling the selection of tolerant lines. There was an association between rust, LSLD tolerance and soybean cyst nematode resistance.