La vaccination est un moyen de prévention très efficace contre les infections. La majorité des vaccins sont administrés par voie sous-cutanée ou intra-musculaire avec des adjuvants et stimulent ainsi des réponses immunitaires adaptatives systémiques. Les muqueuses représentent une porte d’entrée majeure pour de nombreux pathogènes ayant un impact en Santé Publique. Cependant, peu de vaccins sont délivrés par les muqueuses en raison du manque d’adjuvants adaptés à ces voies. Ainsi le développement d'adjuvants muqueux permettrait la stimulation de réponses immunitaires locales et une protection efficace avant la dissémination des pathogènes. Les agonistes des Toll-Like-Receptors (TLR) sont développés comme adjuvants vaccinaux car ils stimulent l’immunité innée et adaptative. Au laboratoire, la flagelline de Salmonella enterica qui est un puissant agoniste de TLR5 est utilisée comme modèle afin de disséquer les mécanismes d’action des adjuvants muqueux. En effet, l'administration intranasale de vaccins adjuvantés par la flagelline se caractérise par une réponse T CD4+ de type Th1/Th2, une réponse en anticorps sécrétoires dans le compartiment respiratoire et une réponse systémique contre les antigènes vaccinaux. Seule l’activation de TLR5 dans le compartiment épithélial est nécessaire à l’activité adjuvante.Dans un premier temps, l'analyse transcriptionnelle du tissu pulmonaire a permis d'identifier une signature épithéliale spécifique du recrutement de cellules immunitaires, en particulier de monocytes et de neutrophiles ainsi que de l'activation fonctionnelle des cellules dendritiques. L'analyse de la dynamique cellulaire au niveau du tractus respiratoire et des ganglions drainants a ensuite été réalisée en réponse à l’administration intranasale de vaccin adjuvanté. Bien que les monocytes inflammatoires et les neutrophiles infiltrent massivement les poumons et capturent les antigènes, ils ne jouent pas de rôle majeur dans l’activation de la réponse immunitaire. Au contraire les cellules dendritiques conventionnelles CD11b+ capturent, migrent et présentent efficacement l’antigène aux lymphocytes T CD4+. A l'instar de l’effet adjuvant, l’activation de ces cellules dendritiques par la flagelline n'est pas directe mais requiert une expression de TLR5 dans les cellules structurales incluant les cellules épithéliales de la muqueuse. De plus, nos travaux suggèrent que les interleukines de la famille IL-1 ne sont pas à l'origine de la transactivation des cellules dendritiques.En conclusion, ce travail de thèse ouvre des perspectives intéressantes quant au développement d’adjuvants muqueux. / Many pathogens of public health concern (including the influenza and respiratory syncytial viruses, and bacteria such as Streptococcus pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa) enter the body via the respiratory tract in general and the lung mucosa in particular. Mucosal vaccines induce a local adaptive immune response (i.e. secretory antibodies and specific T cells) and constitute a unique means of directly preventing these infections. Most vaccines are delivered systemically and use systemic adjuvants. Although the few commercially available mucosal vaccines are generally effective, mucosal adjuvant candidates have not demonstrated sufficient levels of potency and safety. TLR signaling is instrumental for the induction of innate immunity and the concomitant ignition of adaptive immune responses. Thus TLR agonists are largely used as vaccine adjuvants. In the lab we use flagellin from Salmonella enterica (a potent TLR5 agonist) as a model to better understand the mode of action of mucosal adjuvants. The intranasal adjuvant effect of flagellin is characterized by an antigen-specific Th1/Th2 cell response, and a strong mucosal and systemic antibody response. However this adaptive immune response mainly depends on TLR5-mediated epithelial signaling.We used molecular profiling to show that cytokine/chemokine and dendritic cell maturation pathways are surrogate signatures for flagellin activation in the lung. Neutrophils and inflammatory monocytes were massively recruited to the lungs but were not essential for the adjuvant activity. In contrast, flagellin signaling did not induce a significant recruitment of conventional dendritic cells but enhanced their maturation and migration to the lymph nodes. In particular, CD11b+ migratory dendritic cells were essential for induction of a CD4+ T-cell response. Importantly, the functional activation of dendritic cells was independent of direct signaling via TLR5, suggesting the role of inflammatory cytokines produced by the activated epithelium. However or data suggest that IL-1 and IL-36 interleukins are not responsible for transactivation of dendritic cell. In conclusion, this thesis project opens up new perspectives for the development of mucosal adjuvants.

Ce projet de thèse se propose d’évaluer le devenir, la cytotoxicité et la réponse inflammatoire pulmonaire in vitro suite à l’exposition aux nanoparticules, et plus particulièrement vis-à-vis de la région alvéolaire.Les nanoparticules étudiées sont formulées à base d’acide poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) (polymère biodégradable), stabilisées, ou non, par différents polymères de surface (alcool polyvinylique (PVA), chitosane (CS), pluronic F68 (PF68)). Les nanoparticules ont une taille d’environ 200 nm, et présentent des charges de surface neutre (PLGA/PVA), positive (PLGA/CS) ou négative (PLGA/PF68 et PLGA sans stabilisant). Des nanoparticules non-biodégradables de dioxyde de titane (TiO2) et de polystyrène ont été choisies comme contrôle positif. Pour mimer les conditions alvéolaires, la lignée cellulaire A549 d’épithélium alvéolaire humain a été utilisée en mono-culture et en co-culture en contact direct avec des macrophages différenciés de monocytes humains (lignée THP-1). Les caractérisations phénotypique et microscopique de la co-culture, ont confirmé la présence de deux types cellulaires viables et en contact. Le CD14, récepteur membranaire exprimé uniquement par les macrophages, sera utilisé pour identifier chaque sous-population cellulaire. D’autre part, l’analyse du récepteur CD54 a montré la présence d’interactions intercellulaires en co-culture : exprimé uniquement par les macrophages en mono-culture, il est exprimé par les deux sous-populations cellulaires en co-culture. Ces interactions ont été confirmées lors de la quantification des cytokines sécrétées après exposition au lipopolysaccharide: les niveaux de sécrétions en co-culture étant jusqu’à 5 fois supérieurs aux niveaux théoriques (issus de la somme des sécrétions en mono-culture).L’analyse en microscopie confocale a confirmé que les nanoparticules sont internalisées par chaque type cellulaire, Les cinétiques d’internalisation suivies en cytométrie en flux ont montré que les nanoparticules de charge de surface négative sont internalisées en plus grande quantité que les autres, quelque soit le type cellulaire, en mono ou en co-culture, selon un mécanisme énergie-dépendant. Enfin, en co-culture, les macrophages internalisent davantage de nanoparticules que les cellules épithéliales.La cytotoxicité des nanoparticules a été évaluée par la mesure de l’activité mitochondriale, l’étude de l’intégrité membranaire, et le type de mort cellulaire. Les résultats montrent qu’à faible concentration toutes les nanoparticules de PLGA induisent une cytotoxicité généralement faible (60 à 80 % de viabilité), avec une mort exclusivement nécrotique, sans induire de forts dommages à la membrane. La toxicité des nanoparticules de PLGA/CS peut être expliquée par la toxicité propre du chitosane. A forte concentration, le cas des nanoparticules de PLGA sans stabilisant mérite d’être noté, car elles n’induisent aucune cytotoxicité vis-à-vis des macrophages, contrairement aux nanoparticules stabilisées. La cytotoxicité des nanoparticules de TiO2 est plus importante, mais peu de dommages à la membrane sont causés. La réponse inflammatoire a été évaluée par la quantification des cytokines sécrétées après 24 h d’exposition aux nanoparticules (0,1 mg/mL). En mono-culture, seules les nanoparticules de PLGA/PF68 induisent une réponse inflammatoire sur les cellules A549, corrélée à leur plus grande internalisation. En co-culture, la réponse inflammatoire est peu prononcée. En revanche, ni les polymères de surface ni les nanoparticules de PLGA sans stabilisant, n’induisent de réponse inflammatoire spécifique.Ces résultats montrent la faible toxicité des nanoparticules de PLGA vis-à-vis des conditions alvéolaires, et soulignent l’importance du recouvrement de surface. En conclusion, les nanoparticules de PLGA testées présentent un fort intérêt pour une application biomédicale, modulée par l’ajustement des propriétés de surface. / The pulmonary route has attracted great attention for the delivery of nanomedicines due to the non invasiveness, a weak enzymatic activity and potential alveolar retention and/or absorption. However, the potential pulmonary toxicity of nanoparticles raises a lot of concern, especially for manufactured, non-biodegradable nanoparticles. In this study, we design and characterize an in vitro model of lung epithelium based on a co-culture of alveolar epithelial-like cells (A549) and macrophages (differentiated from THP-1 monocytes), and use it to assess the potential toxicity of various biodegradable nanoparticles in the form of nanocarriers, as compared to non-biodegradable nanoparticles used in manufactured products. The ultimate goal is to provide a safety pattern of nanoparticles relevant for drug delivery to the lung.The co-culture was characterized by flow cytometry (analysis of three cell membrane receptors: CD14, CD11b and CD54) and confocal laser scanning microscopy. The presence of two different cell types was evidenced, as well as several cellular interactions. For instance, after exposure to a pro-inflammatory compound, synergistic effects were observed, in terms of cytokine secretions ( IL-6, IL-8, TNF-α and MCP-1). Such co-cultures are thus a valuable tool to investigate the inflammatory response following exposure to nanoparticles. On the other hand, the cell membrane receptor CD14 (expressed only by macrophages) was used as an identification tool to distinguish each cell population in co-culture.Biodegradable nanoparticles having size around 230 nm, were prepared according to an emulsion-evaporation process using poly(lactide-co-glycolide) (PLGA). The use of polyvinylalcohol (PVA), chitosan (CS) or poloxamer (PF68) as stabilizers allows the formation of, respectively, neutral, positively- or negatively-charged nanoparticles. In addition, stabilizer-free nanoparticles (negatively charged) were prepared. Commercial titanium dioxide and polystyrene nanoparticles were used as non-biodegradable nanoparticles.After exposure to nanoparticles, uptake kinetics (flow cytometry and confocal microscopy) were performed in cells in mono and co-culture. Negatively-charged nanoparticles (stabilizer-free PLGA and PLGA/PF68 nanoparticles) were found in higher quantity in each cell population. Several cytotoxicity tests (MTT, trypan blue, selective membrane permeability, lactate dehydrogenase (LDH) release) have shown a low to medium cytotoxicity of PLGA nanoparticles. The cytotoxicity of PLGA/CS nanoparticles was attributed to the cytotoxicity of the chitosan in solution, whereas the cytotoxicity of PLGA/PF68 nanoparticles was attributed to their higher uptake. After 24 h exposure to a low dose of PLGA nanoparticles, a low inflammatory response was detected. Non-biodegradable nanoparticles have shown a slightly higher toxicity.Differences observed among PLGA nanoparticles in terms of cytotoxicity, cell uptake quantity and inflammatory response highlight the importance of the coating of nanocarriers for drug delivery application.

La chimioembolisation est une thérapie loco-régionale qui consiste à injecter, au moyend’un microcathéter, un principe actif et un agent d’occlusion vasculaire de manière la plussélective possible dans les artères nourricières du processus pathologique. Les microsphèresde chimioembolisation sont des microsphères calibrées et chargeables en principe actif,développées ces dernières années afin d’optimiser la chimioembolisation et permettre unelibération ciblée et contrôlée du principe actif au sein du territoire pathologique. L’utilisationde ces microsphères n’a encore jamais été appliquée à la chimioembolisation du poumon. Ellepourrait être intéressante dans le traitement des tumeurs pulmonaires malignes en permettantune imprégnation de la tumeur par un anticancéreux, tout en évitant une toxicité systémiquede ce dernier et dans le traitement des hémoptysies massives en évitant les récidives, dues àune recanalisation des vaisseaux après embolisation, par l’utilisation d’un inhibiteur duremodelage vasculaire.Notre travail a consisté à évaluer les performances de libération de l’irinotécan et dusirolimus à partir des microsphères de chimioembolisation au niveau systémique et au niveautissulaire, sur des modèles de chimioembolisation pulmonaire chez la brebis. Nos résultats ontmontré que les microsphères de chimioembolisation ne permettaient pas une délivrancetissulaire prolongée de l’irinotécan pour espérer obtenir une imprégnation efficace d’un lobepulmonaire. Les microsphères chargées en sirolimus semblent permettre une libérationcontrôlée du principe actif et paraissent intéressantes pour prévenir la recanalisation.Les microsphères de chimioembolisation doivent être améliorées pour permettre unelibération prolongée du principe actif. Des études complémentaires notamment en termesd’efficacité (modèle tumoral) doivent être réalisées pour montrer l’intérêt d’utiliser lachimioembolisation pulmonaire par microsphères en pratique clinique. / Chemoembolization is a loco-regional therapy, which consists of delivering selectively and directly to the pathologic area, by means of catheters through the vasculature, a drug and an embolic agent. The purpose is to achieve nutrient and oxygen starvation of the tumor, to minimize chemotherapy wash-out with prolonged contact with tumor tissue and therefore to increase the local drug concentration and reduce systemic toxicity. Drug eluting beads are a new generation of calibrated embolization beads, which behave as a drug delivery system. They have been developed in order to optimize chemoembolization and to control precisely the release and the dose of drug into the treatment site. Drug eluting beads have never been used for lung chemoembolization. It may be interesting to evaluate them in the treatment of lung tumors in order to impregnate the tumor with an anticancer drug while avoiding systemic toxicity of this drug and in the treatment of massive hemoptysis to avoid recurrences, induced by a recanalization of vessels after embolization, by using an inhibitor on vascular remodeling. Our purpose was to evaluate the release performances of irinotecan and sirolimus from drug eluting beads, in systemic circulation and in lung tissue, in sheep lung chemoembolization models. Our results showed that drug eluting beads did not allow a sufficient sustained delivery of irinotecan to expect to obtain an effective impregnation of a pulmonary lobe. Sirolimus eluting beads seem to allow a drug controlled release and appear interesting to prevent recanalization. Drug eluting beads have to be improved in order to allow sustained and controlled release of the drug. Complementary studies especially efficacy studies have to be investigated for showing the interest to use lung chemoembolization with drug eluting beads in clinical practice.

Les expositions professionnelles représentent la 2nde étiologie de cancer du poumon. Parmi elles, les laines minérales (LM) utilisées comme substitut à l’amiante sont suspectées d’augmenter le risque de cancer du poumon en raison de leur structure proche de celle de l’amiante. Dans ce contexte, ce travail a pour objectif d'évaluer le rôle de l'histoire professionnelle et en particulier celui de l'exposition professionnelle aux LM dans la survenue de cancer du poumon en tenant compte des expositions à l'amiante, à la silice, autres substances très prévalentes dans le secteur de la construction. Une dernière partie a consisté à étudier le risque de cancer du poumon associé à l'exposition professionnelle aux poussières de ciment.Nous avons analysés les histoires professionnelles complètes des cas et témoins inclus dans l'étude cas-témoins en population générale ICARE, identifiés dans 10 départements français abritant un registre général de cancer. Au total, 2 276 cas de cancer du poumon chez les hommes et 2 780 témoins ont été inclus ainsi que 650 cas de cancers du poumon féminins et 775 témoins. Deux stratégies d'évaluation des expositions aux LM et à l'amiante ont été utilisées: une matrice emplois-expositions (MEE) et une matrice tâche-exposition élaborée par des hygiénistes industriels et tenant compte des données individuelles. Les expositions à la silice et au ciment ont toujours été évaluées par MEE. Nos résultats confirment le rôle important des expositions professionnelles comme déterminant du risque de cancer du poumon en mettant en évidence des associations avec de nombreuses professions et secteurs d'activité. L'hypothèse d'une association entre le risque de cancer du poumon et l'exposition professionnelle aux LM est suggérée sans toutefois pouvoir exclure une confusion résiduelle par l'amiante car ces deux expositions sont très corrélées. Par ailleurs, nos résultats confirment le rôle cancérogène de l'amiante et de la silice et suggèrent une association entre l'exposition aux poussières de ciment et le risque de cancer du poumon. / Occupational exposures are the second main risk factor of lung cancer. Asbestos has progressively been substituted by mineral wools (MW). Because of their similarity in shape with asbestos, they have been suspected of causing cancer of the respiratory system. In this context, the objectives of this work were to assess the role of occupational history in lung cancer risk; to investigate in details lung cancer risk associated with exposure to MW, carefully taking into account occupational exposures to asbestos and crystalline silica, two common potential carcinogenic exposure among construction workers; and to study the risk of lung cancer associated with occupational exposure to cement dusts.We analysed lifetime occupational history of cases and controls included in the ICARE study, a large multi-centre, population-based, case-control study. They were recruited in 10 French départements with a general cancer registry. The study included 6481 subjects (men: 2 276 lung cancer cases and 2 780 controls, women: 650 lung cancer cases and 775 controls). Two strategies of assessment of occupational exposure to MW and asbestos were used: a job-exposure matrix (JEM) and a task-exposure matrix constructed by trained hygienist and taking into account individual information. Occupational exposures to crystalline silica and cement dusts were both assessed using specific JEMs.Our results confirm the important role of occupational exposure as a determinant of lung cancer risk by showing associations between lung cancer risk and several occupations or industries. An association between MW exposure and lung cancer risk is suggested without being able to exclude a potential residual confounding by asbestos since these two exposures are deeply correlated. Our results also confirm asbestos and silica carcinogenicity and suggest an association between cement dusts and lung cancer risk.

Les thérapies ciblées sont des agents dont le but est d’inhiber une voie oncogénique spécifiquement activée dans une tumeur. Ces thérapies peuvent donc cibler l’angiogenèse tumorale, les voies de signalisation cellulaire, la prolifération infinie, l’anti-apoptose ou le pouvoir métastatique. Outre leur effet en monothérapie, leur intérêt repose également sur leur combinaison avec les traitements standards, chimiothérapie, radiothérapie ou même chirurgie. Dans ce contexte, l’association des thérapies ciblées et de la radiothérapie paraît séduisante. En effet, les mécanismes qui sous-tendent la sensibilité ou la résistance à une irradiation sont maintenant mieux connus et permettent d’envisager des manipulations thérapeutiques afin d’améliorer encore les résultats d’une radiothérapie ou d’une radiochimiothérapie. L’objectif de cette thèse était d’exploiter les données d’histologie moléculaires des carcinomes pulmonaires pour évaluer de nouvelles approches de radiosensibilisation basée sur l’inhibition de signaux de survie en ciblant les protéines Bcl-2 et Bcl-XL et la voie IGF-1 dans les carcinomes à petites cellules (CPC) et en ciblant la voie EGFR dans les carcinomes non à petites cellules du poumon (CPNPC). L’un des objectifs était également d’intégrer une méthodologie de combinaison plus précise compte-tenu des discordances très fréquemment observées entre les effets pré-cliniques d’une association et les résultats des études cliniques de la même combinaison. Dans une première partie, nous avons cherché à inhiber les mécanismes antitapoptotiques mis en jeu dans les CPC au moyen de deux nouvelles classes de thérapies ciblées : un oligonucléotide antisens ciblant l’ARNm du gène BCL2 (oblimersen) et un « BH3 mimetic » inhibiteur des protéines Bcl-2/Bcl-XL (S44563). Nous avons démontré dans ces deux études l’intérêt du ciblage de « l’anti-apoptose » pour radiosensibliser les lignées de CPC. En utilisant le S44563, un « BH3 mimetic » qui induit une apoptose via la voie mitochondriale dans les lignées qui surexpriment les cibles à savoir Bcl-2 et Bcl-XL,, nous avons montré que l’inhibition de Bcl-2 et Bcl-XL permettait d’induire une radiosensibilisation par induction de l’apoptose. Le mécanisme d’interaction reposait probablement par une induction de l’expression des protéines anti-apoptotiques, en particulier Bcl- XL à la suite d’une irradiation via l’activation de la voie NF-κB. Ceci est confirmé par les études de séquence montrant que l’administration pendant et après l’administration de la radiothérapie est plus efficace réalisant ainsi une chimiosensibilisation sous l’effet d’une irradiation rendant les cellules tumorales plus dépendantes (concept d’addiction oncogénique contextuelle) aux mécanismes de résistance à l’apoptose. Dans une seconde partie, nous avons également montré que l’inhibition d’une voie de signalisation cellulaire (la voie IGF-1) permettait également d’obtenir une radiosensibilisation tumorale validant ainsi l’intérêt de ces combinaisons. En particulier, L’anticorps monoclonal ciblant IGF-1R, le R1507 augmente l’efficacité du cisplatine et au final améliore l’efficacité de la radio-chimiothérapie dans plusieurs lignées de CPC via la diminution de l’expression de IGF-1R avec pour conséquence une diminution de l’activation de ses effecteurs, en particulier AKT, indiquant que le R1507 augmente la radiosensibilité en supprimant l’activation de IGF-1R secondaire à l’irradiation. Cependant, nous avons montré par différentes approches d’étude du transcriptome que les cellules tumorales traitées par le R1507 pendant 4 semaines s’adaptaient en ré-exprimant IGF-1R, en activant p-IRS1 et en activant différentes voies oncogéniques telles que l’angiogenèse ou d’autres voies de signalisation cellulaire. Ces résultats suggèrent donc les limites d’un schéma adapté chez l’homme lors d’une radio-chimiothérapie concomitante et plaident pour une association précoce à d’autres thérapies ciblées. / Targeted therapies are drugs that block a specific molecular target involved in following alterations in cell physiology: growth signal self-sufficiency, insensitivity to growth-inhibitory signals, evasion of apoptosis, an unlimited replicative potential, sustained angiogenesis, tissue invasion, and metastasis. Although these compounds showed efficacy when given alone, there is now a rationale to combine these agents with other antitumor therapies such as chemotherapy, radiation and surgery. In this context, there is compelling data supporting the association between targeted therapies and radiation. The better understanding of mechanisms of sensitivity or resistance to radiation may help to envision new strategies to improve its efficacy. The primary goal of this work was to assess new strategies of radiosensitization based on molecular characteristics of both small cell lung cancer (by targeting Bcl-2 and Bcl- XL proteins as well as IGF-I pathway) and non-small cell lung cancer (by targeting EGFR pathway). The second objective was also to assess new methods to better investigate combination of radiation with new targeted therapies. In the first part of the work, we evaluated the impact of the inhibition of BCL-2 in small cell lung cancer cell lines with oblimersen, an antisense BCL-2 oligodeoxynucleotide and with a small peptide BH3 mimetic, S44563 which targets both Bcl-2 and Bcl- XL proteins. We showed that inhibiting anti-apoptotic mechanisms could enhance radiosensitivity of SCLC cells. S44563 caused SCLC cells to acquire hallmarks of apoptosis through activation of the mitochondrial pathway in Bcl2 and Bcl- XL overexpressing cell lines. S44563 markedly enhanced the sensitivity of SCLC cells to radiation in both in vitro and in vivo assays through apoptosis induction. This positive interaction was explained by the induction of radiation-induced anti-apopototic proteins, mainly Bcl- XL by the NF-κB pathway. These data were confirmed by in vivo experiments showing that the radiosensitization was greater when S44563 was given after the completion of the radiation in the context of radiation-induced oncogenic addiction. In the second part of the work, we showed that IGF-1R targeting increases the antitumor effects of DNA-damaging agents in SCLC model. R1507 (a monoclonal antibody directed against IGF-1R), exhibited synergistic effects with both cisplatin and IR in SCLC cell lines through IGF-IR downregulation and reduced activation of downstream AKT. However, we observed a transient reduction of IGF-1R staining intensity in vivo, concomitant to the activation of multiple cell surface receptors and intracellular proteins involved in proliferation, angiogenesis, and survival. These data underscore the challenge of the combination of concomitant radiotherapy and chemotherapy and support the early use of targeted therapies to improve the antitumor efficacy.

La calpaïne 1 est une protéase à cystéine activée par le calcium, qui peut être partiellement externalisée. Les calpaines extracellulaires favorisent la résolution de l'inflammation et la réparation des tissus, à travers la prolifération et la migration cellulaire. Le récepteur Toll like (TLR) 2 a été identifié comme une cible des calpaïnes extracellulaires dans les lymphocytes. L'objectif est d'étudier le rôle de la calpaïne extracellulaire 1 dans la progression tumorale de l'adénocarcinome pulmonaire lepidique (ADL). La calpaïne extracellulaire, le fragment soluble de TLR2, le versican et les cytokines étaient analysés par ELISA dans des surnageants de lavage bronchoalvéolaire (LBA) de patients atteints d'ADL (n = 68). La source de calpaïne était analysée par immunohistochimie. TLR2, cible de la calpaïne extracellulaire était étudiée par cytométrie de flux sur les polynucléaires neutrophiles (PNN) et des lignées humaines de cancer bronchiques. Calpain 1 extracellulaire, sécrété par les cellules tumorales, était associée à la progression tumorale, l'inflammation à neutrophiles, avec un facteur de mauvais pronostic de survie (p = 0,003). TLR2 était exprimé sur les cellules tumorales ou les PNN avec une diminution d¿expression après traitement par calpaïne. Le fragment soluble de TLR2 était corrélée à la concentration extracellulaire de calpaïne 1 dans les surnageants de LBA (r = 0,624; p <0,001). Le fragment soluble de TLR2 élevé était associé à la progression tumorale et un environnement pro-inflammatoire La calpain extracellulaire sécrétée par la cellule tumorale, favorise un microenvironnement inflammatoire et la progression tumorale médiée par TLR2 dans ADL. / Calpain 1 is pro inflammatory calcium-activated cysteine proteases, which can be partly externalized. Extracellular calpains limit inflammatory processes and promote tissue repair, through cell proliferation and migration. Toll like receptor (TLR) 2 has been identified as a target of extracellular calpains in lymphocytes. The aim was to investigate the role of extracellular calpain 1 in tumor progression of lepidic pulmonary adenocarcinoma (LPA). Extracellular calpain 1, soluble fragment of TLR2 and cytokines were analyzed by ELISA in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) supernatants from patients with LPA (n=68). Source of calpain was analyzed by immunohistochemistry. TLR2 as target of extracellular calpain was studied by flow cytometry on polymorphonuclear neutrophils (PMN) and human lung cancer cell lines. Extracellular Calpain 1, secreted by tumor cells, was associated to tumor progression, neutrophilic inflammation, with a poor prognostic factor on survival (p=0,003). TLR2 was expressed on PMN or tumor cells and decreased after calpain treatment. The soluble fragment of TLR2 was correlated to the extracellular calpain 1 concentration in the BALF supernatants (r=0.624; p<0.001). High soluble fragment of TLR2 was associated with tumor progression and a pro-inflammatory environment. Extracellular Calpain 1 secreted by tumor cell, promotes inflammatory microenvironment and tumor progression through TLR2 in LPA.

De nombreuses études ont impliqué des TLR dans le développement et la progression tumorale. Précédemment, il a été démontré que les cellules tumorales expriment TLR7, un récepteur à ARNsb, et qu’une forte expression de TLR7 par les cellules tumorales de patients atteints de cancer du poumon est associée à un mauvais pronostic. Dans un modèle murin de cancer du poumon, cet effet pro-tumoral a été reproduit lors de l’injection d’agoniste de TLR7. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif de déterminer les mécanismes impliqués dans les effets pro-tumoraux de TLR7. La stimulation de ce récepteur au niveau des cellules tumorales induit une production plus importante de CCL2 et GM-CSF, ainsi qu’un fort recrutement de MDSC au site de la tumeur. Ces MDSC, de par leurs propriétés immunosuppressives sont responsables de l’effet pro-tumoral à la suite de la stimulation de TLR7. Nous avons également mis évidence que la stimulation de TLR7 était pro-métastatique dans un modèle murin de cancer du poumon et que les MDSC étaient également impliquées dans cet effet. Ces effets pro-métastatiques associés au TLR7 ont été confirmés chez l’homme, grâce à l’étude de transcrits de molécules associées à l’invasion, l’angiogénèse, la transition épithélio-mésenchymateuse et les métastases. Enfin nous avons démontré la présence de ligand de TLR7 chez les patients atteints de cancer du poumon et démontré que l’injection intratumorale de virus respiratoires, IAV et RSV, a un effet pro-tumoral dans notre modèle de cancer du poumon. Ces virus respiratoires pourraient donc être à l’origine de la surexpression de TLR7 et du mauvais pronostic associé à ce récepteur chez les patients atteints de cancer du poumon. Ces recherches ont donc permis de mettre en évidence de nouveaux facteurs aggravants dans le cancer du poumon, dont les virus respiratoires, et de découvrir les mécanismes impliqués. / Numerous studies have implicated some TLR in tumor development. Previously, we have demonstrated that lung tumor cells express TLR7, a receptor for ssRNA, and that high TLR7 expression confers to NSCLC patients bad clinical outcome. In mice models of lung cancer, we further demonstrated that the injection of TLR7 agonists led to a pro-tumoral effect.My thesis work has firstly demonstrated the mechanisms involved in the pro-tumoral effects of TLR7 in lung cancer: TLR7 stimulation on tumor cells induces a high production of CCL2 and GM -CSF, as well as a sharp MDSC recruitment within the tumor. These MDSC, by their immunosuppressive properties, are implicated in the pro-tumoral effect upon TLR7 stimulation. We also demonstrated that TLR7 stimulation was pro-metastatic in a mice model of lung cancer and that MDSC were also involved in this effect. These pro-metastatic effects associated with TLR7 have been confirmed in humans through the studies of transcripts and proteins involved in invasion, angiogenesis, Epithelial–mesenchymal transition and metastasis. Finally, we demonstrated that TLR7 ligands are present in tumor microenvironment of lung cancer patients and that intratumoral injection of respiratory viral infections such as IAV and RSV, have a pro-tumoral effect in lung cancer mice model. These respiratory viruses could therefore be at the origin of the overexpression of TLR7 and the poor clinical outcome associated with this receptor in lung cancer patients. This research has thus made possible to highlight new aggravating factors in lung cancer, including respiratory viruses, and to discover the mechanisms involved.

Le radon est un carcinogène pulmonaire avéré chez l'homme à fortes doses mais l'existence d'un risque de cancer à faibles doses n'est pas établie car les approches épidémiologiques se heurtent, à ce niveau de doses, à de nombreux facteurs confondants. Ces données soulignent la nécessité de disposer d'un modèle d'étude des tumeurs pulmonaires chez l'animal. <br />Le but de ce travail de thèse est de caractériser, sur le plan moléculaire, une série de tumeurs pulmonaires radon-induites chez le rat qui comprend des adénocarcinomes (AC), des carcinomes épidermoïdes (Sq) et des carcinomes adénosquameux (ASq) formés des composantes cellulaires AC et Sq. Une analyse cytogénétique globale de ces tumeurs par la technique de CGH a permis de définir des déséquilibres récurrents de régions chromosomiques, sur lesquelles ont été ciblés des gènes candidats potentiellement impliqués dans le développement des tumeurs, comme p16Ink4a, p19Arf, Rb1, K-Ras ou c-Myc. Une analyse plus précise des voies p16Ink4a/Cdk4/Rb1 et p19Arf/Mdm2/Tp53 a été menée et a permis de mettre en évidence une inactivation fréquente de la voie Rb1, par la perte d'expression de la protéine p16Ink4a, indiquant que cette voie joue un rôle majeur dans le développement de ces tumeurs pulmonaires. Enfin, une analyse transcriptomique comparative des trois types de tumeurs induites a révélé que les tumeurs complexes ASq ont un profil d'expression génique qui reflète leur nature composite mais qu'elles présentent également des spécificités. <br />L'ensemble de ce travail à mis à jour des caractéristiques moléculaires communes aux tumeurs pulmonaires murines et humaines qui encouragent à poursuivre l'étude des spécificités des tumeurs pulmonaires radio-induites chez le rat pour aider à une meilleure caractérisation de ces tumeurs chez l'homme.

La protéine E2F-1 est un facteur de transcription qui participe au contrôle de la prolifération cellulaire en stimulant le passage des cellules en phase S du cycle cellulaire et est aussi capable d'induire l'apoptose. Ayant préalablement décrit son profil d'expression différentielle dans les tumeurs bronchiques, nous avons étudié son rôle potentiel dans ces tumeurs.<br>L'épissage alternatif des pré-ARNm joue un rôle important dans la régulation de l'apoptose et les protéines de la famille SR sont des régulateurs principaux des événements de l'épissage alternatif et constitutif. Actuellement très peu de données existent concernant leurs activateurs en amont ainsi que leurs gènes cibles impliqués au cours du processus apoptotique. Dans ce travail, nous avons identifié la protéine SC35, un membre de la famille des protéines SR, comme une cible transcriptionnelle directe de E2F1. Nous avons montré que les deux protéines interagissent et coopèrent pour induire l'apoptose, notamment en réponse aux agents génotoxiques, en modifiant les patrons d'épissage de certains gènes apoptotiques dont Bcl-x, ou caspase-9, en faveur des transcrits codant pour les isoformes pro-apoptotiques. Ces résultats démontrent la capacité de E2F1 à réguler les profils d'épissage de transcrits contrôlant l'apoptose via la protéine SC35. Finalement, nous avons obtenu des résultats impliquant SC35 dans le contrôle des fonctions transactivatrices de E2F1 au niveau de gènes contrôlant la division cellulaire, et notamment la synthèse d'ADN. La protéine VEGF-A existe sous la forme de multiples isoformes protéiques résultant de l'épissage alternatif de son ARNm pré-messager et dénommées de façon générique VEGFxxx (formes pro-angiogéniques) et VEGFxxxb (formes anti-angiogéniques). L'expression des différentes isoformes de VEGF-A est fortement dérégulée dans les tumeurs. Dans un deuxième axe de ce travail, nous avons montré que E2F1 réprime l'activité du promoteur du VEGF-A dans nos lignées dépourvues de p53 fonctionnelle et dans des conditions normoxiques. De plus, nous avons montré que E2F1 n'affecte pas négativement le niveau d'expression des isoformes VEGFxxxb suggérant que E2F1 stimule l'inclusion de l'exon 8b du VEGF-A par un mécanisme restant à identifier. Nos résultats montrent qu'E2F1 affecte la balance des isoformes du VEGFA en faveur de ses formes anti-angiogeniques et suggèrent que le facteur d'épissage SC35 contribue à ces effets. Nos travaux ouvrent des perspectives quand aux conséquences biologiques de la dérégulation de l'expression de E2F1 dans les cancers bronchiques via une modification des facteurs d'épissage et un rôle de E2F1 dans le processus de néoangiogénèse.

De nombreuses études montrent une corrélation nette entre les pics de pollution atmosphérique et la fréquence d'apparition de maladies respiratoires telles que l'asthme. La pollution par les particules de diesel (DEP ou Diesel Exhaust Particles) est en partie responsable de ces effets sur la santé. Cependant, le mode d'action de ces particules n'est pas totalement élucidé. Pour se défendre des agressions par des polluants ou des agents microbiens, la muqueuse respiratoire dispose d'un réseau d'immuno-surveillance constitué de cellules dendritiques (DC) localisées au sein de la muqueuse respiratoire. Les DC jouent un rôle clé dans le développement et le contrôle de la réponse immune locale, alors que l'épithélium bronchique participe au contrôle de la réaction inflammatoire. La discrimination du soi par rapport au non soi ou au soi modifié est effectuée par les Pattern Recognition Receptors (PRR) (notamment les Toll-like Receptors ou TLR, Scavenger Receptors ou SR) qui reconnaissent notamment les PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern ou PAMP). De façon intéressante, les SR semblent impliqués dans l'élimination de particules inertes inhalées.<br />Le but de ce travail est d'étudier le dialogue entre l'épithélium bronchique et les DC dans un contexte d'exposition au polluant et/ou aux PAMP en se focalisant sur le rôle des molécules membranaires dans ces interactions, en particulier ICAM-1, les protéines de jonctions intercellulaires (PJI) et les SR.<br />Le kpOmpA, une protéine membranaire de Klebsiella pneumoniae, active les macrophages et les DC, et possède des propriétés immunomodulatrices. Notre but était d'étudier les interactions entre CEB et DC dans le contexte de l'exposition à un PAMP et les conséquences sur la réponse LcT. Nos résultats montrent que après inhalation de kpOmpA, l'épithélium bronchique participe au déclenchement de la réponse immune innée par le recrutement de précurseurs de DC myéloïdes par un mécanisme dépendant d'ICAM-1. Ces DC favorisent l'induction d'une réponse Th2. Cette étude démontre la participation active des CEB au développement de la réaction immunitaire en facilitant la transition entre l'immunité innée et acquise.<br />Au niveau intestinal, la capture des bactéries au niveau de la lumière intestinale par les DC implique l'expression de protéines de jonctions intercellulaires, permettant aux DC d'insinuer des pseudopodes entre les cellules épithéliales afin de capturer l'antigène sans rompre l'intégrité de la barrière épithéliale. Dans ce contexte, nous supposons que l'ouverture des jonctions intercellulaires de l'épithélium pourrait également permettre la capture de l'antigène dans la lumière bronchique et influer sur les fonctions des DC et. Nos résultats montrent que les DC expriment les protéines de jonctions adhérentes E-Cadhérine et β-Caténine et les protéines de jonctions serrées Occludine et ZO-1 à l'état basal. Les ligands de TLR modulent l'expression de ces protéines au niveau des ARNm et des protéines. Nous avons montré pour la première fois que la E-Cadhérine jouait un rôle clé dans la maturation des DC lors de l'établissement des jonctions intercellulaires entre CEB et DC.<br />Concernant les SR, les ligands de TLR modulent l'expression des SR au niveau des ARNm et des protéines contrairement aux DEP qui n'ont que peu d'effet. Associées aux ligands de TLR, les DEP modulent l'action des ligands des TLR sur l'expression des SR. Le prétraitement avec de l'ovalbumine maleylée et du dextran sulfate (agonistes des SR) bloque uniquement les effets d'une faible dose de DEP (1µg/ml) sur la maturation des DC et la sécretion de cytokines. En revanche, les ligands de SR n'ont pas d' effet sur la maturation ou encore la production d'espèces réactives de l'oxygène lorsque les DC sont exposées à une dose plus importante de DEP (10µg/ml). Ces données suggèrent la participation des SR au cours de la rèponse des DC aux DEP.<br />Ces données suggèrent l'importance des molécules d'adhésion comme l'ICAM-1 ou les PJI et des SR dans la réponse des cellules dendritiques de la muqueuse bronchique aux PAMP et aux DEP. De plus, ils confirment les interactions existantes entre ces deux types de stimuli