Tendo em vista fazer uma verificação de algumas das características de microorganismos com potencial probiótico, esse trabalho tem por objetivo identificar, avaliar e comparar o potencial probiótico de Enterococcus faecium isolados de queijo artesanal da cidade de Londrina. Primeiramente foram identificadas por técnica molecular as cepas já isoladas de Enterococcus. O restante dos testes foram feitos somente com os isolados de Enterococcus faecium. Fez-se então, um antibiograma frente à eritromicina 15 µg, tetraciclina 30 µg e vancomicina 30 µg, verificando-se a resistência ou sensibilidade de cada isolado frente a estes antibióticos. Em seguida foram realizados testes de simulação in vitro do trato gastro-intestinal e comparados com a cepa comercial de Lactobacillus acidophilus. Para simular as condições na boca foi realizado o teste de resistência à lisozima, verificando assim a sua viabilidade. Já para simular as condições no estômago realizou-se o teste de tolerância em meio ácido, em cultivo. Foram avaliadas as condições de sobrevivência simulando o intestino delgado, determinando-se a viabilidade destes micro-organismos frente à pancreatina em pH 8,0. No estudo de auto-agregação, cada isolado de E. faecium e a cepa comercial de L. acidophilus, foram colocados separadamente e verificados em densidade óptica de 540 nm. Os resultados demonstraram que dos 98 isolados de Enterococcus, 54,0 % eram E. faecium, 39,8% eram E. faecalis e 6,2% eram Enterococcus spp. Em relação à susceptibilidade à antimicrobianos foram pouco resistentes aos antibióticos testados, sendo que 24,5% apresentaram resistência à eritromicina e 1,9% apresentaram resistência à tetraciclina e vancomicina. Já no teste de resistência à lisozima após 120 min obteve-se 15 isolados que não apresentaram diferença significativa ao nível de 5% quando comparados ao L. acidophilus e 7 isolados que foram mais resistentes que o mesmo. No resultado frente ao estresse ácido após 3 h, 3 isolados não apresentaram diferença significativa ao nível de 5 % quando comparados com L. acidophilus e 2 isolados apresentaram maior resistência que o Lactobacillus. Em relação ao teste sobrevivência ao intestino delgado, em comparação a cepa comercial de L. acidophilus, apresentaram-se com taxas de sobrevivência sem diferença significativa, 21 isolados de E. faecium, e ainda pode-se destacar 7 isolados, onde encontrou-se uma taxa de sobrevivência maior que o controle. Dos 53 isolados analisados 60 % apresentaram capacidade de auto-agregação. / The purpose of this work was to identify, assess and compare some Enterococcus faecium potential probiotic micro-organisms isolated from artisanal cheese in Londrina. First, identified by molecular techniques already isolated strains of Enterococcus. The rest of the tests were made only with isolates of Enterococcus faecium. There was then a antibiogram forward to erythromycin 15 mg, 30 mg tetracycline and vancomycin 30 mg, checking the resistance or sensitivity of each isolate against these antibiotics. It was then performed simulation tests in vitro gastro-intestinal tract and compared with the commercial Lactobacillus acidophilus strain. To simulate the conditions in the mouth was performed to test for resistance to lysozyme, thus verifying its viability. Have to simulate conditions in the stomach was performed tolerance test in acid medium in cultivation. We evaluated the survival conditions simulating the small intestine, determining the viability of these micro-organisms against the pancreatin at pH 8.0. In the study of auto-aggregation, either isolated from E. faecium and a strain of commercial L.acidophilus were separately placed and the optical density verified of 540 nm. The results showed that the 98 Enterococcus, isolated from cheese, was 54.0% E. faecium, 39.8% E. faecalis and 6.2% Enterococcus spp. Regarding antimicrobial susceptibility were slightly resistant to the antibiotics tested, and 24.5% were resistant to erythromycin and 1.9% to tetracycline and vancomycin. Already in lysozyme resistance test after 120 min showed 15 isolates that had no significant difference at 5% when compared to L. acidophilus and 7 isolates were more resistant than the same. In result against acid stress after 3 h, 3 isolates showed no significant difference at 5% when compared with L. acidophilus and 2 isolates had greater resistance than Lactobacillus. Regarding testing survival to the small intestine, compared to commercial strain of L. acidophilus, presented with survival rates without significant difference, 21 isolates of E. faecium, and still can highlight the isolates 7 isolates, which found a higher survival rate than the control. 32 of the 53 isolates tested showed the ability to auto-aggregation, or 60%.

Toxoplasma gondii infection in susceptible C57BL/6 mice induces a strong Th1 immune response causing intense inflammation and lesions in ileum in response to microbial antigens and if controlled causes death of animals. The Th1 immune response is similar to that in patients with inflammatory bowel disease (IBD) such as Crohn\'s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Therefore find alternative treatments that have adjuvant effect of conventional treatments are of great interest. The use of probiotics is increasing due to several benefits found in inflammatory diseases. To verify the effects of probiotics Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus acidophilus and Lactococcus lactis NCDO 2118 in C57BL/6 mice, we treat one day before and 7 days after oral infection with 30 cysts of the ME-49 strain. We found that L. casei- and L. acidophilus-treatment mice decreased intestinal parasitism reducing the pathology in small intestine of C57BL/6 mice and prevent death. In addition, the microbiological culture of organs shows L. casei- and L. acidophilus-treatment mice prevent bacterial translocation from the intestinal lumen to organs such as liver, spleen, lung and blood, moreover the microbiological analysis of feces showed that there were fewer gram negative bacteria species in feces of probiotic treated mice. The NAG, MPO and EPO assay that are characteristic of macrophages, and eosinophils neutrophils respectively showed that there was a decrease in the activity of enzymes MPO and NAG and a small increase in activity and EPO. Finally, the qPCR analysis revealed that treatment with L. acidophilus decreased IFN-γ and TNF-α mRNA induced by infection with T. gondii and L.casei treatment increased the expression of Foxp3 and IL-10. Our results demonstrate the ability of probiotics to control the inflammation response and reduce mortality caused by ileitis. However, further studies are needed to find out what the precise mechanisms that probiotics L. casei and L. acidophilus modulate the host immune response. / A infecção por Toxoplasma gondii em camundongos susceptíveis C57BL/6 com 30 cistos da cepa ME-49 induz uma forte resposta do sistema imune do tipo Th1 causando uma intensa inflamação com lesão no íleo em resposta a antígenos da microbiota e se não for controlada causa a morte dos animais. Essa resposta é semelhante à encontrada em pacientes com doenças inflamatórias intestinais (IBD) como a doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC). Portanto encontrar tratamentos alternativos que tenham efeito adjuvante aos tratamentos convencionais é de grande interesse. O uso de probióticos em produtos fermentados vem aumentando devido aos vários benefícios encontrados em pacientes com doenças inflamatórias que utilizam esses produtos. Com o objetivo de investigar o efeito da administração dos probióticos Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus acidophilus e Lactococcus lactis NCDO 2118 no intestino delgado, tratamos camundongos C57BL/6 um dia antes e 7 dias depois da infecção oral com 30 cistos da cepa ME-49 de T. gondii. O tratamento com L. casei ou L. acidophilus diminuiu o parasitismo intestinal, reduziu a patologia associada ao intestino delgado e evitou a morte dos animais. Além disso, a cultura microbiológica dos órgãos revelou que L. casei e L. acidophilus foi capaz de impedir a translocação de bactérias do lúmen intestinal para órgãos como fígado, baço, pulmão e também para o sangue. O cultivo microbiológico das fezes mostrou que houve menos espécies de bactérias gram negativas encontradas nas fezes dos animais tratados com probióticos. A análise das enzimas NAG, MPO e EPO que são características de macrófagos, neutr´filos e eosinófilos, respectivamente mostrou que houve diminuição na atividade das enzimas MPO e NAG e um pequeno aumento na atividade e EPO. Por último, a análise em qPCR revelou que o tratamento com L. acidophilus diminuiu a expressão de IFN-γ e TNF-α induzido pela infecção por T. gondii e o tratamento com L.casei aumentou a expressão de Foxp3 e IL-10. Esses resultados demonstram a capacidade dos probióticos em controlar a resposta inflamação e reduzir a mortalidade causada pela ileíte. Contudo, serão necessários mais estudos para descobrir quais os mecanismos precisos que os probióticos L. casei e L. acidophilus utilizam para modular a resposta imune em favor do hospedeiro. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Introdução: O trato gastrointestinal humano é composto por uma comunidade microbiana diversificada que atua no controle da saúde. Estudos recentes demonstraram que o equilíbrio da microbiota intestinal é afetado na doença renal crônica (DRC), ocasionando o quadro de disbiose intestinal. Estes estudos sugeriram uma associação da disbiose intestinal com complicações metabólicas como acúmulo de toxinas urêmicas, progressão da DRC, inflamação e risco cardiovascular. Diante disso, medidas com o objetivo de restaurar o equilíbrio da microbiota intestinal são sugeridas, tais como a ingestão oral de probióticos, mas poucos estudos têm abordado o efeito destes suplementos na progressão da DRC e no risco cardiovascular destes pacientes. Objetivo: Avaliar o efeito do consumo de probióticos em fatores associados com progressão da DRC e risco cardiovascular de pacientes com DRC. Material e métodos: Trata-se de um estudo clínico controlado por placebo registrado no Clinical Trials NCT03400228. O estudo incluiu 30 pacientes adultos com DRC nos estágios 3 a 5 não em diálise, com função renal estável e proteinúria igual ou superior a 500 mg. A coleta de dados ocorreu entre novembro de 2015 até dezembro de 2017. O protocolo do estudo constou de período de washout de 4 semanas e randomização dos pacientes para o grupo de intervenção (GI, suplemento com probiótico) ou para o grupo controle (GC, maltodextrina). Foi realizado avaliação basal e após 24 semanas de consumo de probiótico ou placebo. Todos os pacientes receberam a orientação de consumir 2 sachês por dia do probiótico ou do placebo (maltodextrina). Foram avaliadas variáveis demográficas, clínicas, nutricionais, hábito intestinal e exames laboratoriais com amostras sanguíneas e urinárias. Resultados: Dos 30 pacientes incluídos, 20 completaram as 24 semanas do estudo, sendo 10 no grupo intervenção e 10 no grupo placebo. Após o uso de probiótico houve aumento na taxa de filtração glomerular estimada (p<0,001) e diminuição nos níveis séricos de creatinina (p<0,001), ureia (p=0,015), proteína C reativa (p=0,03), hormônio da paratireóide (p=0,03) e potássio (p=0,012), em comparação ao grupo placebo. Os efeitos positivos do probiótico na taxa de filtração glomerular estimada e na diminuição dos níveis séricos de creatinina e ureia permaneceram após análise de regressão multivariada. Não houveram diferenças significativas nos parâmetros urinários entre os grupos. Sintomas de constipação (p<0,001) e consistência fecal (p=0,016) apresentaram melhora no grupo intervenção versus placebo. Conclusão: A suplementação de probióticos melhorou os marcadores de função renal e reduziu inflamação, além de auxiliar na melhora dos sintomas de constipação intestinal em pacientes com DRC. / Introduction: The human gastrointestinal tract is colonized by a diversified microbial community that acts in control of health. Recent studies have shown that intestinal microbiota balance is affected in chronic kidney disease (CKD) leading to intestinal dysbiosis. These studies have suggested association of intestinal dysbiosis with several metabolic disorders such as accumulation of uremic toxins, progression of CKD, inflammation and cardiovascular risk. Therefore, interventional measurement that improve intestinal microbiota balance are suggested such as supplementation of probiotics, however few studies evaluated the effect of these supplements on the progression of CKD and cardiovascular risk in CKD patients. Aim: The purpose of the study was to evaluate the effects of probiotic supplementation on the factors associated with progression of CKD and cardiovascular risk in patients with CKD. Desing and Methods: This was a randomized, double-blind, placebo-controlled study. Thirty patients with CKD stages 3 to 5 not on dialysis, with stable renal function and protein-creatinine ratio > 0.50 were included. Data collection was between November 2015 and December 2017. Study protocol was 4-week washout period, patients randomized to intervention group (IG, probiotic supplement) or control group (CG, maltodextrin), and follow for 24 weeks. Renal function, C-reactive protein (CRP), bone and mineral metabolism, nutritional, and lipid profile markers and intestinal habit were measured at baseline and 24 weeks of study. Results: From 30 patients included in this study, 20 completed the 24 study weeks, 10 in the TG and 10 in PG. After probiotic supplementation, there was increase in estimated glomerular filtration rate (p<0.001) and decrease in serum creatinine 8 (p<0.001), urea (p=0.015), C-reactive protein (p=0.030), parathyroid hormone (p=0.03), and potassium (p=0.012) levels compared to CG. The beneficials effects of probiotics on estimated glomerular filtration rate and serum creatinine, urea, and Creactive protein remained after multivariate linear regression. There were no significant differences in the urinary parameters between the two groups. Symptoms of constipation (p<0.001) and stool consistency (p=0.016) improved in IG compared to CG. Conclusion: Probiotic supplementation improved markers of renal function and reduced inflammation. In addition, it improved the symptoms of intestinal constipation in patients with CKD.

Allergic diseases, for example asthma and eczema, are nowadays considered belonging to the most common chronic diseases amongst children in the West, but the cause for this increase in allergy prevalence is unknown. Since studies have indicated a connection between children's exposure of microorganisms during infancy and risk of developing allergic disease, it is suggested that this exposure is a crucial factor in question of allergy development or not. Other studies have established differences in microflora composition between healthy children and children with allergic disease, and several studies have shown that probiotic therapy can give positive results in both prevention and treatment of allergic diseases. The aim of this master's thesis was to develop a method, using PCR and denaturing gradient gel electrophoresis, to study the diversity of Lactobacillus spp. in fecal samples retrieved from a study of the probiotic strain L. reuteri ATCC 55730. The developed method was successful in detecting lactobacilli in fecal samples, but three other bacterial genera commonly found in humans were also amplified. Comparison of average numbers of detected bacterial strains and lactobacilli strains between samples belonging to the probiotics and placebo groups, respectively, showed higher numbers for the probiotics group. Also, the only fecal samples that contained L. reuteri belonged to the probiotics group. Although the results are far from statistically significant, they support the theories that probiotics may influence the intestinal microbiota.

The composition and diversity of the gastrointestinal microbiota and its interaction with human cells have been frequently associated with immune system functions and disease development, including autoimmunity and allergy. This is believed to be mediated in part through epigenetic modifications, mainly as DNA methylation. Several studies have collectively supported the beneficial effects of probiotics for the prevention of allergic disease. However, there have been few studies addressing the possibility for probiotic supplementation to induce epigenetic changes and its importance for allergy development. This study aims to investigate whether probiotic treatment with Lactobacillus reuteri, distributed during and after the pregnancy period, leads to epigenetic changes in the offspring and if this have any effect on the development of allergic disease. DNA methylation data received from a clinical allergy prevention study was analysed through a set of bioinformatics methods and basic network analysis. The obtained results suggests that supplementation with L. reuteri indeed induces some significant changes in DNA methylation. These changes did not exhibit any significant correlation with allergy outcome of the children. Furthermore, the methylation changes were found at positions located in genes not enriched for any allergy-related biological pathways. However, when taking the genes interactions with other genes into account an interconnected gene interaction module could be identified that showed enrichment for biological processes involved in the T cell receptor signaling pathway, central for immune response transduction. Further analyses did not fit into the time-frame of this thesis, but the obtained results gives a first informative view of the effects of L. reuteri on methylation patterns, and points out directions for the continuing project work.

Os objetivos deste trabalho foram avaliar a sobrevivência de cepas probióticas incorporadas em queijo petit-suisse potencialmente probiótico e simbiótico no produto armazenado por até 28 dias e em ensaios de sobrevivência in vitro frente às condições encontradas no trato gastrintestinal, utilizando-se métodos independentes de cultivo, paralelamente aos métodos convencionais de semeadura em ágar seletivo, bem como avaliar características tecnológicas dos queijos elaborados. O delineamento experimental constituiu-se de 3 tratamentos de queijo petit-suisse: QP = queijo probiótico (com cultura ABT-4, composta por Lactobacillus acidophilus LA-5 e Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 e da cultura starter Streptococcus thermophilus); QS = queijo simbiótico, contendo os probióticos e prebióticos (cultura ABT-4 + inulina e fruto-oligossacarídeo) e QC = queijo controle, elaborado apenas com uma cultura starter de Streptococcus thermophilus. Os queijos foram armazenados a 4 ºC e as análises foram realizadas semanalmente, por 28 dias. A contagem dos micro-organismos probióticos foi realizada por técnicas independentes (qPCR) e dependentes de cultivo. Adicionalmente, foi monitorada a presença de contaminantes e avaliadas a aceitabilidade sensorial e a textura instrumental dos produtos ao longo de seu armazenamento. Os queijos petit-suisse apresentaram populações de L. acidophilus LA-5 e B. animalis BB-12 superiores a 7 log UFC/g, até o 28º dia de armazenamento. Em QS, observou-se maior estabilidade da população de L. acidophilus LA-5, ao longo do armazenamento e maior sobrevivência in vitro de B. animalis BB-12, até 14 dias de armazenamento (p < 0,05), com taxas médias de sobrevivência diminuindo de 88,0% (dia 1) para 59,6% (dia 28) em QS e de 80,0% (dia 1) para 59,8 (dia 28) em QP. Em contrapartida, para L. acidophilus LA-5, as taxas médias de sobrevivência diminuíram de 49,1% (dia 1) para 36,9% (dia 28) em QS e de 61,6% (dia 1) para 39,2% (dia 28) em QP, e foram maiores em QP nos dias 1 e 14 (p < 0,05). A adição de probióticos no queijo petit-suisse resultou em influência significativa nos parâmetros de textura, com uma diminuição da dureza, o que provavelmente contribuiu para maiores escores de aceitabilidade, nas formulações com probióticos (> 5,9), em relação ao produto controle (< 5,3). Adicionalmente, houve influência positiva da mistura prebiótica na aceitabilidade de QS (escore = 6,8), aos 21 dias de armazenamento (p < 0,05). Entre os métodos utilizados para a quantificação de micro-organismos, os valores obtidos através dos métodos convencional e qPCR foram semelhantes, porém observou-se uma tendência a superestimar a população dos micro-organismos, no método de qPCR. No ensaio de sobrevivência in vitro, observou-se valores semelhantes e um coeficiente de correlação de Pearson de 0,92 entre os método de qPCR com Propidium Monoazide (PMA) e convencional, para B. animalis subsp. lactis BB-12, enquanto que para L.acidophilus LA-5, os resultados mostraram-se promissores, particularmente na quantificação de células viáveis, porém não cultiváveis. Os resultados obtidos sugerem que a formulação QS foi a mais favorável em termos de estabilidade e sobrevivência dos probióticos, além de apresentar a melhor aceitabilidade aos 21 dias de armazenamento. Em relação aos métodos de quantificação, técnicas moleculares mostraram-se mais adequadas, particularmente com a utilização de PMA, embora requeiram otimizações. / This study aimed to evaluate the survival of probiotic strains incorporated into petit-suisse cheese in the product stored for up to 28 days and under in vitro gastrointestinal tract simulated resistance assay, using culture-independent and culture-dependent methods. Furthermore, sensory acceptability and instrumental texture of the cheeses studied were evaluated. Experimental design involved the evaluation of three trials of petit-suisse cheese, as follows: PC = probiotic cheese (with the ABT-4 culture, containing Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12, and Streptococcus thermophilus, as starter culture), SC = synbiotic cheese, containing both the probiotics and the prebiotics (with the ABT-4 culture + inulin and fructooligosaccharides), and CC = control cheese (containing only the starter culture of Streptococcus thermophilus). Cheeses were stored at 4°C and the microbial counts in the products, as well as the in vitro survival assays were conducted weekly up to the 28th day. The probiotic counts in the product and in the in vitro assays were conducted through culture-independent (qPCR) and dependent methods. Additionally, the presence of contaminants was monitored and the sensory acceptability and instrumental texture of the products were evaluated during storage at 4°C. The petit-suisse cheeses presented L. acidophilus LA-5 and B. animalis BB-12 populations above 7 log CFU/g, up to the 28th day of storage. For SC, a higher L. acidophilus LA 5 population stability during the shelf-life and a higher B. animalis BB-12 in vitro survival up to 14 days of storage (p < 0.05) were observed. BB-12 presented mean survival rates decreasing from 88.0% (day 1) to 59.6% (day 28) in SC and from 80.0% (day 1) to 59.8% (day 28) in PC. In contrast, for L. acidophilus LA-5, the mean survival rates decreased from 49.1% (day 1) to 36.8% (day 28) in SC and from 61.6% (day 1) to 39.2% (day 28) in PC, which presented higher survival rate on days 1 and 14 (p < 0.05). The addition of probiotics in petit-suisse cheese influenced texture parameters significantly, leading to decreased hardness (p < 0.05), which probably contributed for the higher acceptability scores of both cheeses supplemented with probiotics (> 5.9), compared to the control product (< 5.3). Additionally, there was a positive influence of the prebiotic mixture on the SC acceptability (score = 6.8) on day 21 of storage (p < 0.05). Regarding the methods used for the enumeration of microorganisms, the results for the qPCR and the conventional method were quite similar. However, a trend towards overestimating microbial populations with the qPCR method was observed. For the in vitro survival assays, we observed similar results for the qPCR method with Propidium Monoazide (PMA) and the conventional method for B. animalis subsp. lactis BB-12 and a Pearson correlation coefficient of 0.92, whereas for L. acidophilus LA-5, the results were promising, especially in the quantification of viable, but not cultivable cells. The results suggest that the synbiotic cheese was the most favorable in terms of stability and probiotics survival, besides presenting the highest acceptance at 21 days of storage. Regarding quantification methods, molecular techniques have proved to be more suitable, particularly with PMA, but an optimization is required.

Apesar do sucesso do transplante na clínica, os importantes efeitos adversos dos imunossupressores, usados para prevenir e tratar a rejeição, apontam para a necessidade de novas terapias imunorreguladoras. A via oral tem sido efetiva na indução de imunorregulação, em diversos modelos experimentais, principalmente de doenças autoimunes. A Hsp60/65 é uma molécula com grande potencial imunoterapêutico, por sua capacidade de induzir respostas imunes pró-inflamatória e imunorreguladora. Testamos se a terapia oral com o probiótico Lactococcus lactis que expressa a Hsp65, combinada à administração de aloantígenos do doador (AloAg-doador), atua sinergicamente na indução de tolerância ao enxerto de pele semialogeneico murino, ou no aumento de sua sobrevida. Testamos diferentes combinações de terapia oral, assim como a influência da utilização de um anti-inflamatório, inibidor seletivo de COX-2 (celecoxibe). O transplante de pele foi realizado 10 dias após a última administração oral dos probióticos e aloantígenos do doador. Não observamos efeitos benéficos na sobrevida do enxerto no grupo de animais que receberam L.lactis que produz Hsp65, sozinho ou em combinação com AloAg-doador e/ou o anti-inflamatório. Em contraste, a terapia oral combinada com o probiótico L.lactis selvagem e AloAg-doador aumentou significativamente a sobrevida do enxerto (p=0,01), em comparação com o grupo não tratado. Nesse grupo que teve maior sobrevida do aloenxerto (L,lactis selvagem e AloAg-doador), também observamos maior quantidade de epitélio preservado (p=0,02) e maior expressão de TGF-beta (p=0,04), no enxerto, em comparação com o grupo sem tratamento. Não observamos diferenças significativas na expressão, in situ, de FOXP3 e IL-17, que foi baixa em todos os grupos experimentais. Concluímos que a Hsp65 não induziu efeito imunorregulador capaz de prolongar a sobrevida do enxerto. No entanto, a manipulação da microbiota com a terapia combinada com o L.lactis selvagem e a exposição a antígenos do doador, previamente, ao transplante, induz mecanismos imunorreguladores capazes de controlar, mesmo que parcialmente, as respostas inflamatórias dirigidas ao aloenxerto de pele, provavelmente, com a participação de TGF-beta / Despite the success of clinical transplantation, the significant side effects induced by immunosupressants used to prevent and treat rejection, indicate the need for novel immunoregulatory therapies. The oral route has been effective in inducing immunoregulation in several experimental models, mostly in pathological autoimmunity. Heat Shock protein 60/65 (Hsp) displays great immunotherapeutic potential due to its capacity to induce both pro-inflammatory and immunregulatory responses. We tested whether oral therapy with the probiotic Lactococcus lactis that expresses Hsp65, in combination with donor alloantigens (Donor-Allo-Ag), acted synergically, inducing immunotolerance or increasing graft survival, in a murine model of semiallogeneic skin transplantation. We tested different oral therapy combinations, as well as the association with a COX-2 selective nonsteroidal anti-inflammatory drug (celecoxib). Skin transplantation was performed 10 days after the last oral administration of probiotics and Donor-Allo-Ag. We observed no beneficial effect on graft survival in the group that received L.lactis that produce Hsp65, alone or in combination with Donor-Allo-Ag/and/or the anti-inflammatory drug. In contrast, combined oral therapy with wild type L.lactis and Donor-Allo-Ag significantly prolonged graft survival (p=0.01), in comparison to non-treated animals. In this prolonged-survival group (L.lactis and Donor-Allo-Ag), we also found higher extension of preserved epithelium (p=0.02) and higher expression of TGF-beta (p=0.04), within the graft, in comparison to non-treated animals. We found no significant differences in the intragraft expression of FOXP3 and IL-17, which was essentially absent or very low. We conclude that Hsp65 did not induce immunoregulatory effects capable of prolonging graft survival. However, the microbiota manipulation with the combined oral therapy with wild type L.lactis and Donor-Allo-Ag, prior to transplantation, induce immunoregulatory mechanisms capable of partially controlling the inflammatory responses to the graft, most likely involving the participation of TGF-beta

As bactérias ácido lácticas (BAL) possuem papel importante em uma ampla variedade de alimentos, incluindo produtos lácteos e cárneos. Neste trabalho foram investigadas as atividades antimicrobiana e antioxidante, do sobrenadante bruto e do extrato intracelular, de 36 BAL isoladas de produtos lácteos e cárneos. Estas bactérias foram identificadas através do seqüenciamento do rRNA da região 16S. A análise através do GenBank BLAST revelou que todos os isolados pertencem ao gênero Enterococcus. Três isolados foram identificados como E. hirae, um isolado como Enterococcus sp., 17 como E. faecium e 15 como E. faecalis. A atividade antimicrobiana frente ao microrganismo indicador Listeria monocytogenes foi observado em 21 isolados, utilizando o sobrenadante bruto, destacando-se com os maiores halos de inibição os isolados IS 196 (10,7 mm) e IS 197 (11,0 mm) e, em 7 isolados, utilizando o extrato intracelular, os maiores halos de inibição foram obtidos com os isolados IS 196 (9,7 mm) e IS 197 (9,3 mm), sendo estes dois isolados identificados como E. faecium. A avaliação da atividade antioxidante foi realizada por três métodos distintos. Os 36 isolados apresentaram atividade antioxidante pela determinação às Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbiturico (TBARS), utilizando tanto o sobrenadante bruto quanto o extrato intracelular. A A capacidade antioxidante também foi verificada pelo seqüestro de radicais livres através do método de ABTS (2,2 azino-bis (3-•+etilbenzotiazolino-6-ácido sulfônico)) e pela captura do radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil). Nestes dois métodos verificou-se que apenas as amostras do sobrenadante bruto demonstraram capacidade antioxidante. A atividade antioxidante mais elevada foi observada nos isolados IS 196 e IS 197. Foi realizado também o enriquecimento das espécies de Enterococcus com selênio (Selenito de Sódio - Se(IV)). Neste estudo, selecionaram-se os isolados que bioacumularam maior concentração de Se(IV) na biomassa, BAL 14 e BAL 18, identificados como E. faecalis e E. faecium, respectivamente. Os isolados tiveram ótimo crescimento à 35ºC por 24 h (DO BAL 14=1,4 e BAL 18=1,5), a remoção 600ótima do selênio foi verificada com o pH inicial de 7,0 e temperatura de 25ºC. Através da curva de crescimento observou-se que após 8 h de incubação, as culturas BAL 14 e BAL 18 apresentaram a maior produção de biomassa (DO=1,42 e 1,41) e bioremoção do Se(IV) (14,89 e 14,79 mg L), 600-1respectivamente. Quantidade considerável de selênio foi detectada na biomassa de E. faecium (0,4599 mg g de peso seco e E. faecalis (0,4759 mg g de peso -1-1seco). Estes resultados mostram que estas bactérias podem auxiliar particularmente na redução ou inibição de microrganismos patogênicos, na inibição da oxidação de alimentos e ração animal, bem como reduzir os danos oxidativos provocados pela produção de radicais livres nos organismos vivos. A absorção significativa de Se(IV) pelas espécies de Enterococcus observados neste estudo, indicam que estes microrganismos podem ser utilizados para estudos posteriores visando à suplementação alimentar animal, através da utilização da biomassa produzida pelos Enterococcus enriquecidos com Se(IV). / The lactic acid bacteria (LAB) have an important role in a wide variety of foods, including dairy products, meat and fermented foods. In this study, antimicrobial and antioxidant activities of culture supernatants and intracellular extracts of 36 LAB isolated from meat and dairy products were investigated. These bacterial were identified by 16S rRNA sequencing. GenBank BLAST analysis revealed that all the isolates belong to the genus Enterococcus. Three isolates were identified as E. hirae, one isolate as Enterococcus sp., 17 as E. faecium and 15 as E. faecalis. Antimicrobial activity against the indicator microorganism Listeria monocytogenes was observed for 21 supernatants culture, it is highlighted with the largest inhibition zones the strains IS196 (10.7 mm) and IS197 (11.0 mm), and 7 strains using cell extracts, showed the highest inhibition zones. Strains IS196 (9.7 mm) and IS197 (9.3 mm) were identified as E. faecium. Evaluation of antioxidant activity was performed by three different methods. The 36 isolates showed antioxidant activity to determination Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) method with supernatant culture and cell-free extract. Antioxidant capacity was also observed for the scavenger of free radicals by the method of ABTS (2,2-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) and the capture of the •+radical DPPH (2,2-diphenyl-1 - picrylhydrazyl). These two methods showed that only supernatant culture samples had antioxidant capacity. The highest antimicrobial and antioxidant activities were observed by E. faecium, IS196 and IS197. It also was performed the enrichment of Enterococcus species with Selenium (Sodium selenite - Se(IV)). In these study, it was selected the isolates with highest selenium bioaccumulation capacity, LAB 14 and LAB 18, identified as E. faecalis and E. faecium, respectively. The isolates had high growth at 35ºC for 24 h (DO BAL 14=1.4 and BAL 18=1.5), and the Se(IV) removal was maximum 600at inicial pH 7.0 and 25ºC. Time course experiment showed that both LAB 14 and LAB 18 had highest biomass production (OD=1.42 and 1.41) and Se(IV) 600bioremoval (14.89 and 14.79 mg L) respectively -1after 8 h of incubation. Substantial amount of selenium was detected in biomass of E. faecium (0.4599 mg g-1 of dry weight and E. faecalis (0.4759 mg g-1 of dry weight). These results showed that these bacteria can particularly help to reduce or inhibit pathogenic microorganisms, in the inhibition of oxidative spoilage in foods and animal feed, as well as, reduce oxidative damage caused by free radical production in living organisms. The significant uptake of Se(IV) by the Enterococcus species observed in this study, indicate that they can be used to deliver dietary selenium through feed augmentation with Se(IV)-enriched Enterococcus biomass.

Bactérias lácticas probióticas e peptídeos bioativos são importantes componentes de alimentos funcionais. Neste trabalho, bactérias lácticas isoladas de leite ovino cru e de queijo de ovelha foram identificadas por 16S rDNA como pertencentes ao gênero Lactobacillus e avaliadas quanto ao potencial probiótico. Todas as linhagens demonstraram adequada tolerância ao pH 3,0 e a sais biliares em concentrações de até 0,5%. A linhagem LCN 56, quando exposta ao tratamento de pH 2,0 e pepsina, adicionado de leite desnatado, não teve sua viabilidade reduzida durante 4 horas em função do efeito protetor do alimento. Adicionalmente, propriedades de autoagregação e hidrofobicidade, atividades antioxidante e antibacteriana, e ainda, produção da enzima β-galactosidase foram avaliadas em 12 Lactobacillus e em 2 linhagens de referência. Estas características foram bastante variáveis entre as linhagens, mesmo entre aquelas pertencentes à mesma espécie. Nenhuma das bactérias exibiu todas as propriedades desejáveis, porém dois isolados apresentaram conjuntamente o maior número de atributos funcionais, L. brevis SM-B e L. plantarum SM-I. Com relação aos peptídeos com atividade biológica, extratos aquosos de queijos de ovelha maturados foram avaliados e apresentaram propriedades antioxidantes de sequestro do cátion radical 2,2 azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-ácido sulfônico) (ABTS) e atividade quelante de ferro bastante variáveis, enquanto as análises de poder redutor e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) apresentaram similaridade para a maioria dos queijos. A atividade inibitória da enzima conversora de angiotensina foi elevada, em contraste à atividade antibacteriana que não foi encontrada em nenhuma das amostras. Os resultados encontrados podem ser atribuídos a possíveis peptídeos bioativos presentes. O perfil proteico do extrato aquoso correspondente ao queijo Roquefort foi visualizado por SDS-PAGE, por ter sido a amostra com a melhor intensidade das bioatividades. Portanto, os resultados refletem a potencial funcionalidade dos produtos lácteos ovinos. / Probiotic lactic bacteria and bioactive peptides are important components of functional foods. In this work, lactic bacteria isolated from raw ovine milk and cheese were identified by 16S rDNA as belonging to Lactobacillus genus and evaluated for probiotic potential. All strains demonstrated appropriate tolerance to pH 3.0 and bile salts until 0.5% of concentration. The strain LCN 56, when exposed to the treatment of pH 2.0 and pepsin added with skim milk, did not reduce viability during 4 hours due to protective effect of the food. Additionaly, autoaggregation and hydrophobicity properties, antioxidant and antibacterial activities and also β-galactosidase production were evaluated for 12 lactobacilli and for 2 reference strains. These characteristics were quite variable among strains, even among strains belonging to the same species. None of them exhibited all the desired properties, but two strains showed the greatest number of functional attributes together, L. brevis SM-B and L. plantarum SM-I. In relation to peptides with biological activity, water soluble extracts of ewe´s ripened cheeses were evaluated and presented antioxidant properties of scavenging of the cation radical 2,2‘-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and iron chelating activity quite variable, whereas power reduction and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) analysis presented similarity for the major of the cheeses. Inhibition of the angiotensin-converting enzyme (ACE) was elevated, in contrast to antibacterial activity that was not found for any sample. The results found can be attributed for the possible presence of bioactive peptides. The protein pattern of water soluble extract corresponding to Roquefort was visualized by SDS-PAGE for being the sample that displayed the best bioativities. Therefore, the results reflect potential functionality of dairy sheep.

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