Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-06T16:58:22Z No. of bitstreams: 2 Tese - Sara Fernandes Soares - 2012.pdf: 2842867 bytes, checksum: dff92fa87ddeabaa7f16510a5ac58f11 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-06T17:07:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Sara Fernandes Soares - 2012.pdf: 2842867 bytes, checksum: dff92fa87ddeabaa7f16510a5ac58f11 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T17:07:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Sara Fernandes Soares - 2012.pdf: 2842867 bytes, checksum: dff92fa87ddeabaa7f16510a5ac58f11 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Rhipicephalus sanguineus is an ectoparasite of domestic dogs which can also be found in other mammals, including humans. It has high medical and veterinary importance, given that it can transmit pathogens that cause diseases such as Rocky Mountain spotted fever and Boutonneuse fever in humans and babesiosis and ehrlichiosis in dogs. The main control method to this tick is the use of chemical acaricides which, over the years, has selected resistant tick populations to these products. To develop strategies to control this tick, it is necessary to know its ecology. Electrophysiological techniques are important tools in the study of substances that interfere with the behavior of animals. In this study, the existence of gustatory sensilla on the chelicerae of R. sanguineus was investigated by scanning electron microscopy (SEM). Also, the electrophysiological responses of the neurons present in this sensilla in nonfed ticks to substances with the potential to act as phagostimulant, such as salts (KCl and NaCl), sugars (glucose, sucrose and fructose), the nucleotide adenosine triphosphate (ATP), the tripeptide reduced glutathione (GSH) and two purine (guanine and hypoxanthine) were assessed. Phytoecdysteroids (PES), compounds analogous to ecdysteroids, known as the molting hormones in arthropods, were also tested in electrophysiology. The PES ecdysone (E), 20-hidroxyecdysone (20E), ponasterone A (PonA), makisterone A (MakA), inokosterone (Inok) and Pterosterone (Pte) were tested on nonfed and fed ticks. To evaluate the influence the PEs identified as active in electrophysiology on feeding behavior of R. sanguineus, attachment bioassays in vivo were proceeded. The images obtained with SEM revealed the existence of a pore in the inner digit of the chelicerae, involved in taste perception in these ticks. The results obtained in electrophysiology showed strong activity of R. sanguineus cheliceral neurons to glucose and GSH, at concentrations above 10-4 M, to ATP from 10-2 M, and salts from 10-1 M. The action potentials observed in response to ATP at all used concentrations (from 10-6 M to 10-2 M), and to KCl at 1 M were from different neurons, while the action potentials to the other potentially phagostimulant stimuli were from a single neuron. Considering the responses to PEs in nonfed ticks, MakA and Pte triggered action potentials frequencies greater than the negative control, with detection thresholds of 10-6 M and 10-12 M, respectively. The action potentials amplitudes for these substances as well as for 20E and PonA were higher than those for the control, indicating the activity of a different neuron from that observed for the negative control. In fed ticks, only Pte at 10-4 M remained active. In the behavior assays, there was no difference in attachment between PEs and the control and no interference in the biological parameters was observed. The results obtained in this study showed the ability of R. sanguineus to detect in their cheliceral taste sensilla substances with different natures, as potential phagostimulants and PEs. Further studies in this area are needed to elucidate the role of these substances in the chemical ecology of these ticks. / Rhipicephalus sanguineus é um ectoparasita de cães domésticos, também encontrado em outros mamíferos, inclusive no homem. Tem elevada importância nas medicinas humana e veterinária, podendo transmitir agentes patogênicos causadores de doenças, como as febres botonosa e maculosa em humanos e a babesiose e a erliquiose em cães. Seu controle é feito com o uso de acaricidas químicos, o que, ao longo do tempo, selecionou populações deste carrapato resistentes a estes produtos. Para a elaboração de estratégias de controle deste carrapato é necessário conhecer sua ecologia. Técnicas eletrofisiológicas são ferramentas importantes na identificação de substâncias que interferem no comportamento de animais. Neste trabalho foi investigada a existência de sensilas gustativas nas quelíceras de R. sanguineus por meio da microscopia eletrônica de varredura (MEV). Também se avaliou a resposta eletrofisiológica dos neurônios destas sensilas, em carrapatos não alimentados, a substâncias com potencial para efeito fagoestimulante, tais como sais (KCl e NaCl), açúcares (glicose, sacarose e frutose), o nucleotídeo trifosfato de adenosina (ATP) e o tripeptídeo glutationa reduzida (GSH), assim como purinas (guanina e hipoxantina). Fitoecdisteróides (FES), compostos análogos aos ecdisteróides, conhecidos como hormônios da muda em artrópodes, foram igualmente avaliados pela eletrofisiologia. Foram empregados carrapatos antes e após a alimentação e os seguintes FEs: ecdisona (E), 20-hidroxiecdisona (20E), ponasterona A (PonA), makisterona A (MakA), inokosterona (Inok) e pterosterona (Pte). Para avaliar a interferência, no comportamento de alimentação de R. sanguineus, dos FEs que foram identificados ativos na eletrofisiologia, foram empregados testes de fixação in vivo. As imagens obtidas com a MEV evidenciaram a existência de um poro no dígito interno das quelíceras, envolvido na percepção gustativa, nesses carrapatos. Os resultados obtidos com a eletrofisiologia revelaram forte atividade de neurônios quelicerais de R. sanguineus à glicose e à GSH, em concentrações acima de 10-4 M, ao ATP, a partir de 10-2 M, e aos sais a partir de 10-1 M. Os potenciais de ação observados em resposta ao estímulo com ATP, em todas as concentrações empregadas (de 10-6 M a 10-2 M), e ao KCl a 1 M foram oriundos de diferentes neurônios, enquanto que aos demais estímulos potencialmente fagoestimulantes foram provenientes de um único neurônio. Quanto aos FEs, em carrapatos não alimentados, MakA e Pte desencadearam frequências de potenciais de ação superiores ao controle negativo, com limiares de detecção de 10-6 M e 10-12 M, respectivamente. As amplitudes dos potenciais de ação para estas substâncias bem como para 20E e PonA foram maiores que as do controle, indicando a atividade de um neurônio diferente do observado para o controle negativo. Nos carrapatos após alimentação, somente Pte à 10-4M permaneceu ativa. Nos testes comportamentais, não houve diferença de fixação entre os tratamentos com FEs e com o controle negativo e nem interferência do FEs nos parâmetros biológicos avaliados. Os resultados obtidos no presente estudo evidenciaram a capacidade de R. sanguineus em detectar, em suas sensilas gustativas quelicerais, substâncias de diferentes naturezas, como potenciais fagoestimulantes e FEs. Mais estudos nesta área são necessários visando esclarecer o papel destas substâncias na ecologia química destes carrapatos.

Submitted by Fabielle Cheuczuk (fabielle.cheuczuk@unioeste.br) on 2018-05-07T13:28:45Z No. of bitstreams: 2 Dissertaçao Andreia final.pdf: 1005086 bytes, checksum: b352c63e848b1a7a5cfd8e1f42b47aca (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T13:28:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertaçao Andreia final.pdf: 1005086 bytes, checksum: b352c63e848b1a7a5cfd8e1f42b47aca (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / The quality of school feeding influences directly the schoolchildren’s quality of life. Some animal origin products provided to the school feeding in the municipal network of Francisco Beltrão – PR come from the family agriculture, this research aimed to evaluate the quality of samples of meat products and of fish supplied, microbiological analyzes of beef (piece and ground), pork, chicken, bovine liver and fillet of tilapia, and the facilities, equipment, utensils and manipulators, with the verification of the items that evaluate the agro-industries hygienic-sanitary conditions of producing these products. The perception of the good manufacturing practices of the agribusiness manipulators was carried out by the application of a questionnaire. The results showed that some samples of pork, bovine meat, bovine liver and fillet of tilapia are not suitable for consumption, because they present Salmonella spp. in 25g. In the pork, bovine and fish agroindustries, facilities, equipments and utensils presented contamination by aerobic mesophiles and enterobacteria, ranging from 4 CFU to> 300 CFU and 9.6x10UFC to> 300 CFU, respectively. Regarding the checklist, the cattle and fish agro-industries accounted for 85% of the items and the pork agroindustry accounted for 50% of the items. However, food handlers are aware of good manufacturing practices, they know how contamination occurs, but they do not seem to take the necessary care, which was verified in the hand swab evaluation whose counts indicated readings of up to> 300 CFU / hand. / A qualidade da alimentação escolar influencia diretamente a qualidade de vida dos escolares. Considerando que alguns produtos de origem animal fornecidos para a alimenta- ção escolar da rede municipal de Francisco Beltrão – PR são provenientes da agricultura familiar, esta pesquisa teve o objetivo de avaliar a qualidade de amostras dos produtos cárneos e do pescado fornecidos pelas agroindústrias familiares, por meio de análises microbiológicas das carnes bovina (pedaço e moída), suína, frango, fígado bovino e do filé de tilápia, e das instalações, equipamentos, utensílios e dos manipuladores, ainda com a verificação dos itens que avaliam as condições higiênico-sanitárias das agroindústrias produtoras destes produtos. A percepção das boas práticas de fabricação, dos manipuladores das agroindústrias foi realizada com a aplicação de um questionário. Os resultados obtidos demonstraram que algumas amostras de carne suína, bovina em pedaço, fígado bovino e filé de tilápia encontram-se impróprias para consumo, pois apresentaram presença de Salmonella spp. em 25g. Nas agroindústrias de suínos, bovinos e pescado, as instalações, equipamentos e utensílios apresentaram contaminação por mesófilos aeróbios e enterobactérias, que variaram de 4 UFC a > 300 UFC e 9,6x10UFC a >300 UFC, respectivamente. Com relação à lista de verificação, as agroindústrias de bovinos e de peixe atenderam à 85% dos itens e a agroindústria de suínos a 50% dos itens. Já os manipuladores de alimentos têm noção das boas práticas de fabricação, conhecem como ocorre a contaminação, mas não parecem adotar os cuidados necessários, o que foi verificado na avaliação de swab de mãos, cujas contagens apontaram leituras de até > 300 UFC/ mão.

Submitted by Fabielle Cheuczuk (fabielle.cheuczuk@unioeste.br) on 2018-05-07T17:52:04Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Bruna R. Thomé.pdf: 2032184 bytes, checksum: d442ce6dd97e3297cc725e1cda0ec8d9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T17:52:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Bruna R. Thomé.pdf: 2032184 bytes, checksum: d442ce6dd97e3297cc725e1cda0ec8d9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-08-11 / Food consumption patterns have changed according to concerns regarding environmental sustainability, regional development, nutritional aspects and, mainly, health issues. The results on changing this habit involve demand growth and the need for food that, besides nourishing the organism, can also offer other healthy qualities. Therefore, meat products have become the objects of many scientific studies, which, mainly, concern their nutritional composition. The usage of replacements for fat, such as the green banana biomass (GBB), is an alternative that can be sought in order to create this appeal for the consumers. The GBB is a kind of food that can be added to several formulations without altering their original taste. It also has many nutritional advantages, like the presence of fiber and resistant starch in it. However, there are not studies that use the GBB in cooked pork sausage. Because of this, this study aims to make cooked and smoked pork sausage with added green bananas biomass and to reduce its sodium and fat levels. For this purpose, three formulations were developed: Control and Treatment (TC), without adding the green bananas biomass and without reducing the sodium and fat levels; Treatment 1 (T1), by adding 2,17% of GBB and reducing the sodium and fat levels in 15%; and Treatment 2 (T2), with added 3,12% GBB and a reduction of 20% on sodium level and 30% on fat levels. Physicochemical, microbial and sensory analysis have been carried out in three different times: one day after processing (t0), seven days after processing (t7) and twenty-one days after processing (t21), and these analyses aimed to check possible alterations, over time during storage, under refrigeration. We concluded, through the obtained results, that the developed product, with added GBB and reduction on its sodium and fat levels, was in accordance to the current physicochemical and microbial regulation standards, during the storage time. As for the sensory analysis, excepting the scent aspect, we concluded that all other aspects did not present statistical differences. The T2 treatment was the most indicated one among the evaluated aspects. / Os padrões de consumo de alimentos têm experimentado mudanças em função das preocupações sobre sustentabilidade ambiental, desenvolvimento regional, aspectos nutricionais e, sobretudo, questões relacionadas à saúde. O resultado desta mudança de hábito consiste no crescimento da demanda e necessidade por alimentos, que além de nutrir o organismo ofereçam também características benéficas à saúde. Neste sentido, os produtos derivados de carnes tornaram-se objetos constantes de estudos científicos, principalmente na busca de estratégias e formulações que os tornem saudáveis em relação à sua composição nutricional. O emprego de substitutos de gordura, como a biomassa de banana verde (BBV), é uma das alternativas que pode ser buscada para conseguir este apelo diante dos consumidores. A BBV é um alimento que pode ser incorporado em diversas formulações sem alterar o sabor original, apresenta muitas vantagens nutricionais, principalmente pela presença de fibras e amido resistente. No entanto, há a ausência de estudos utilizando a BBV em linguiça suína cozida. Diante desse fato, objetivou-se neste trabalho, desenvolver uma linguiça suína, cozida e defumada com adição de biomassa de banana verde e redução dos teores de sódio e gordura, além de verificar a preferência e a intenção de compra da linguiça. Para tanto, foram desenvolvidas três formulações, sendo Tratamento Controle (TC), sem adição de biomassa de banana verde, sem redução nos teores de sódio e gordura; Tratamento 1 (T1), com adição de 2,17% de BBV e redução de 15% nos teores de sódio e gordura e Tratamento 2 (T2), correspondeu à formulação com adição de 3,12 % de BBV e redução de 20% no teor de sódio e 30% no teor de gordura. Foram realizadas análises físico-químicas, microbiológicas e sensorial, em três tempos distintos, um dia após o processamento (t0), sete dias após o processamento (t7) e vinte e um dias após o processamento (t21), a fim de verificar possíveis alterações, ao longo do tempo de estocagem, sob refrigeração. Com os resultados obtidos, podese concluir que o produto desenvolvido com a adição de BBV e as reduções dos teores de sódio e gordura estavam de acordo com os padrões físico-químicos e microbiológicos estabelecidos pela legislação vigente, durante o período de estocagem. Em relação à análise sensorial, com exceção do atributo aroma, todos os demais atributos não apresentaram diferença estatística. O tratamento T2 apresentou maior preferência e intenção de compra entre os tratamentos avaliados.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-04T10:18:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 619624 bytes, checksum: 5386063ae0816c0b88770090de34a0a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-04T10:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 619624 bytes, checksum: 5386063ae0816c0b88770090de34a0a0 (MD5) Previous issue date: 2014-04-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em condições de estresse ácido, micro-organismos do gênero Salmonella spp. utilizam como estratégia de sobrevivência um complexo mecanismo de tolerância que envolve vários genes. Os genes rpoS e nlpD são responsáveis pela expressão de proteínas que promovem a proteção da célula bacteriana contra os danos provocados pelo estresse, e os genes clpP, clpX e mviA estão envolvidos na regulação dessas proteínas no interior da célula. O presente estudo tem como objetivo associar as variações na expressão desses genes com as populações de Salmonella spp. durante um estresse ácido, condição que pode ser encontrada em carcaças bovinas que sofrem a aspersão de ácidos orgânicos para descontaminação microbiológica. A partir de uma coleção composta por 79 cepas de Salmonella spp., foi realizado um agrupamento genético por restrição enzimática através da técnica PFGE utilizando-se a enzima XbaI, e detecção dos genes rpoS, nlpD, clpP, clpX e mviA. Três cepas foram selecionadas (sorotipos: S. Derby, S. Typhimurium e S. Meleagridis) e semeadas em caldo extrato de carne com diferentes valores de pH (4,0, 5,0, e 6,0), ajustados com ácido lático e ácido acético. Logo após inoculação, e após 6, 12, 24 e 48 h de incubação a 37 °C, as populações bacterianas foram monitoradas por plaqueamento direto, e a expressão dos genes rpoS, nlpD, clpP, clpX e mviA por qPCR. Os resultados revelaram que Salmonella spp. pode se adaptar aos ácidos testados (acético e lático), principalmente quando estão em pH 5,0 ou 6,0, com expressão evidente do gene rpoS. Em pH 4,0, a redução completa das populações de Salmonella spp. ocorreu após 6 ou 24 h de incubação, o que em uma situação industrial representaria um período suficiente para que as proteínas da carne promovam o aumento do pH do meio, possibilitando dessa forma a adaptação de Salmonella spp. nesse substrato. A capacidade de adaptação de Salmonella spp. em valores de pH 5,0 e 6,0, demonstrada no presente estudo, ressalta a importância de um monitoramento adequado da redução de pH promovido pela aspersão de ácidos orgânicos em carcaças bovinas durante o processamento: caso o controle de pH não seja adequado, cepas de Salmonella spp. potencialmente contaminantes podem sobreviver e se manterem ativas nos produtos cárneos finais. Adicionalmente, é necessário que ocorra um equilíbrio entre a aplicação de ácidos orgânicos em concentrações que garantam o controle de Salmonella spp., além de outros micro-organismos, e a ausência de efeitos negativos sobre qualidade sensorial dos produtos cárneos, além de descoloração e exsudação. Os resultados obtidos permitem concluir que os ácidos orgânicos avaliados no presente estudo (ácido lático e ácido acético) podem ser considerados alternativas no controle de Salmonella spp., desde que ocorra um rígido controle dos valores de pH das soluções durante a interação com esse patógeno, e demanda o desenvolvimento de estudos em sistemas cárneos para demonstração desse comportamento. / Under acid stress conditions, Salmonella spp. presents a complex mechanism of tolerance that involves multiple genes. The rpoS, nlpD genes are responsible for the proteins expression that protect the bacterial cell against damage caused by acid stress, and clpP, clpX, mviA genes are involved in the regulation of these proteins inside the cell. The aim of this study was to associate the variations in these genes expression and Salmonella spp. populations when subjected to acid stress condition, a situation usually observed in bovine carcasses after cleaning procedures with organic acids spraying in slaughterhouse environment. Considering a culture collection composed by 79 Salmonella spp. strains, their fingerprinting were obtained by PFGE using XbaI, and all strains were subjected to PCR reactions to detect rpoS, nlpD, clpP, clpX, mviA genes. Based on the obtained data, three strains were selected (serotypes: S. Derby, S. Typhimurium and S. meleagridis) and inoculated in meat extract broth with different pH values (4.0, 5.0, and 6.0), adjusted with lactic acid and acetic acid. Immediately after inoculation, and after 6, 12, 24 and 48 h of incubation at 37 °C, the bacterial populations were monitored by direct plating, and the expression of rpoS, nlpD, clpP, clpX and mviA genes by qPCR . The results showed that Salmonella spp. can adapt to the tested acids (acetic and lactic), especially at pH 5.0 and 6.0, with evident expression of the rpoS gene. When the pH was adjusted to 4.0, complete reduction of Salmonella spp. populations occurred after 6 or 24 h of incubation, but in industrial situation this period would be sufficient for the meat proteins promote an increase in pH value, enabling the adaptation of Salmonella spp. on the substrate. The adaptability of Salmonella spp. at pH 5.0 and 6.0, as demonstrated in this study, shows the importance of adequate monitoring of pH reduction promoted by the organic acids spraying in bovine carcasses during processing: if pH control is not adequate, strains of Salmonella spp. can survive and remain active in the end meat products. Additionally, the ideal concentration of organic acids for the application in meat products depends in the balance between the pathogen contamination reduction and the absence of negative effects under sensorial quality. The results indicate that organic acids evaluated in the present study (lactic acid and acetic acid) can be considered as alternatives to control Salmonella spp., since associated to a rigorous pH control of the applied solutions during interaction with this pathogen. Furthermore, it demands further studies in meat systems to demonstrate this behavior.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-04T10:40:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 943889 bytes, checksum: 2c73252c1e6bb98d5e7d98fa75eb15c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-04T10:40:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 943889 bytes, checksum: 2c73252c1e6bb98d5e7d98fa75eb15c3 (MD5) Previous issue date: 2014-07-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As principais culturas starter utilizadas para produção de derivados cárneos fermentados são micro-organismos do grupo das bactérias láticas (BAL) e Staphylococcus coagulase negativa. Os gêneros Pediococcus e Lactobacillus possuem como principal característica a acidificação dos produtos e produção de compostos responsáveis pela determinação de aroma e sabor. Staphylococcus coagulase negativa contribuem para o desenvolvimento e a estabilidade da cor vermelha e para o desenvolvimento de outras propriedades sensoriais, como textura e aroma. O monitoramento adequado dessas populações é indispensável para manutenção da qualidade e inocuidade desses produtos. Porém, as metodologias convencionais de enumeração de culturas starter em alimentos possuem limitações quanto a praticidade e seletividade. Com isso, placas PetrifimTM AC tem sido empregadas para enumeração de culturas starter em produtos lácteos fermentados, desde que associadas a meios de cultura com agentes seletivos para grupos microbianos específicos. Considerando a escassez de dados científicos que demonstrem a pertinência de utilização de placas PetrifimTM AC associadas a meios de cultura seletivos para enumeração de BAL em produtos cárneos fermentados, o presente estudo tem como objetivo avaliar o uso de placas PetrfilmTMAC associado ao caldo MRS e vermelho de clorofenol para enumeração de culturas starter adicionadas em salames. Quatorze culturas puras e dois mix de culturas starter foram enumerados em seis protocolos diferentes: 1) PetrifilmTM AC associados ao caldo MRS adicionado de vermelho de clorofenol incubado em aerobiose e 2) em anaerobiose, 3) ágar MRS associado a vermelho de clorofenol, 4) MRS associado a púrpura de bromocresol, 5) MRS pH 5,7, e 6) ágar All Purpose Tween. Em seguida, amostras de salame foram obtidas e suas culturas starter enumeradas pelos protocolos 1, 2, 3 e 5. A análise de variância indicou ausência de diferenças significativas entre os protocolos de enumeração, independente dos tempos de incubação considerados (24, 48 e 72 horas). De maneira geral as contagens de culturas puras e culturas starter não apresentaram diferenças significativas considerando os diferentes tempos de incubação (exceto para AS 308 e S. xylosus em MRS com pH 5.7). Houve correlação significativa entre os protocolos, indicando a equivalência entre as contagens de culturas puras e culturas starter obtidas em aerobiose e em anaerobiose (p < 0,05). Os parâmetros de regressão linear também indicam correlações adequadas entre as contagens obtidas após 24, 48 e 72 h de incubação, indicando a confiabilidade dos resultados obtidos em um menor tempo de análise (24 h). Considerando os resultados obtidos na enumeração de culturas starter em salames, não foram observadas diferenças significativas entre os protocolos, independente dos tempos e condições de incubação e todas as correlações foram significativas (p < 0,05), indicando equivalências entre os protocolos independente das condições (aerobiose ou anaerobiose) e tempos (24, 48, 72h) de incubação. Após análise morfológica e identificação molecular de isolados obtidos das amostras de salame pelos protocolos avaliados, verificou-se uma seletividade adequada dos mesmos, que permitiram a formação de colônias apenas por micro-organismos dos gêneros Lactobacillus e Pediococcus, bem como Staphylococcus coagulase negativa, tipicamente utilizados como culturas starter para a produção de salame. Esses resultados confirmam a viabilidade da utilização de PetrifilmTM AC associado ao caldo MRS e vermelho de clorofenol para enumeração de culturas starter isoladas e em amostras de salame, em diferentes condições de aerobiose e em um reduzido período de incubação, representando vantagens a serem consideradas no monitoramento desses micro- organismos. / The main starter cultures used for the production of fermented meat products are microorganisms from the group of lactic acid bacteria (LAB) and Staphylococcus coagulase negative. Pediococcus and Lactobacillus present as main technological characteristic the acidification of products and production of compounds responsible for determining aroma and flavor. Staphylococcus coagulase negative contributes to the development and stability of the red color and the development of others sensory properties such as flavor and texture. Monitoring the populations is essential for maintaining the quality and safety of these products. However, conventional methods for enumeration of starter cultures in foods have limitations, due to poor selectivity and handling. Thus, PetrifilmTM AC plates have been used for enumeration of starter cultures in fermented dairy products, since associated with culture media with selective agents for specific microbial groups. Considering the lack of scientific data demonstrating the relevance of using PetrifilmTM AC plates associated with selective culture media for LAB enumeration in fermented meat products, the present study aimed to assess alternative protocols for the enumeration of starter culture in salami. Fourteen reference strains and two mix of starter cultures were plated on six different protocols: 1) PetrifilmTM AC added to MRS broth and chlorophenol red incubated in aerobiosis and 2) in anaerobiosis 3) agar MRS added to chlorophenol red 4) MRS added to bromocresol purple 5) MRS pH 5.7 and 6) agar All Purpose Tween. Then, samples of salami were obtained and their starter cultures enumerated by plating using protocols 1, 2, 3 and 5. The analysis of variance showed no significant differences between the enumeration protocols, independent of the incubation time: 24, 48 and 72 h. Generally, the counts of pure cultures of microorganisms and reference starter cultures showed no significant differences considering the different incubation times (except for AS 308 and S. xylosus in MRS at pH 5.7). The results indicated a significant correlation between the protocols, indicating equivalence between the counts of reference cultures and starter cultures in aerobiosis and anaerobiosis (p < 0.5). The linear regression parameters also indicate appropriate correlations between the counts obtained after 24, 48 and 72 h of incubation, indicating a reliability of the results obtained in a shorter analysis time (24 h). Considering the results obtained in the enumeration of starter cultures in salami, no significant differences were observed among the protocols considered, independent of time and incubation conditions, and all correlations were significant (p < 0.05), indicating equivalence between the protocols independent the conditions (aerobiosis and anaerobiosis) and time (24, 48 and 72 h) of incubation. After morphological and molecular identification of isolates obtained from samples of salami by the tested protocols, it was observed an adequate selectivity, which allowed the formation of colonies only by microorganisms of the genera Lactobacillus, Pediococcus and Staphylococcus coagulase negative, typically considered as starter cultures for the salami production. These results confirm the feasibility of using PetrifilmTM AC associated to MRS broth and chlorophenol red for enumeration of isolated starter cultures and starter cultures from salami samples, in different aerobic conditions and in a reduced incubation period, representing advantages to be considered during the monitoring of these microorganisms.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-16T15:33:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 838823 bytes, checksum: 982bfa8bcc9ffcfbc6012cbf3a3d91b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-16T15:33:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 838823 bytes, checksum: 982bfa8bcc9ffcfbc6012cbf3a3d91b3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / A obtenção de alimentos com padrões de inocuidade e qualidade microbiológica é essencial, uma vez que alimentos contaminados estão frequentemente envolvidos em casos de enfermidades de origem alimentar. Nesse contexto, destaca-se a importância da pesquisa de micro-organismos indicadores de higiene e também de patógenos nas diferentes etapas da linha de abate e processamento. A pesquisa de Salmonella spp. é fundamental na cadeia produtiva de frangos, pelo fato desse patógeno ser frequentemente associado a esse alimento e à grande maioria das gastroenterites. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade microbiológica das carcaças e cortes de frango e do ambiente de abate em diferentes pontos das linhas de processamento de dois estabelecimentos industriais, através da pesquisa de micro- organismos indicadores de higiene e da pesquisa de Salmonella spp., bem como traçar as principais rotas de contaminação por esse patógeno através da identificação dos perfis genéticos dos isolados obtidos. Foram obtidas 277 amostras em dois matadouros de aves (Mt1-grande porte e Mt2-pequeno porte) localizados em Minas Gerais, Brasil, e consistiam de carcaças de frangos em três etapas distintas do abate (após depenagem- C1, após evisceração-C2, após pré-resfriamento-C3) e cortes finais (coxa, asa, peito) usando a metodologia de enxágue, e amostras de superfície (400cm2) de caixas de transportes de aves, esteiras de cortes, mãos de funcionários e facas. As amostras foram submetidas a análises laboratoriais para pesquisa de aeróbios mesófilos, enterobactérias, coliformes totais e Escherichia coli, e também à detecção de Salmonella spp. de acordo com a ISO 6975, e os isolados suspeitos foram confirmados por PCR pela identificação dos genes ompC e sifB. Ainda, todos os isolados confirmados como Salmonella spp. foram submetidos à macro-restrição por XbaI e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Para as caixas de transporte, as contagens médias obtidas para todos os indicadores de higiene e a frequência de amostras positivas para Salmonella spp. não apresentaram diferenças significativas (p < 0,05) entre os matadouros estudados. Observou-se também que não houve diferença significativa (p < 0,05) de contaminação entre as carcaças coletadas nas etapas C1 e C2 para nenhum dos indicadores estudados, nem para Salmonella spp. No entanto, constatou-se que as médias de contaminação bem como a frequência de amostras positivas para Salmonella spp. encontradas nas duas primeiras etapas no Mt1 foram significativamente (p < 0,05) maiores do que aquelas encontradas no Mt2, e ainda houve uma redução significativa dos níveis de contaminação de todos os indicadores de higiene e do patógeno entre as etapas C1-C2 e C3 em ambos os matadouros (p < 0,05). As médias de contaminação para os cortes amostrados foram significantemente maiores em Mt2 do que em Mt1 (p < 0,05), o mesmo ocorrendo para as superfícies amostradas; entretanto, para essas amostras não foram encontradas diferenças significativas (p < 0,05) em relação a frequências de amostras positivas para Salmonella spp. Os resultados obtidos demonstraram a maior contaminação nas etapas iniciais de abate, bem como o maior controle na etapa de pré- resfriamento. Os resultados da macro-restrição para os isolados obtidos de caixas de transporte permitem observar diferentes perfis genéticos, indicando uma contínua inclusão de novas cepas de Salmonella spp. no matadouro proveniente das granjas de produção das aves. Nas etapas de abate, observou-se que isolados obtidos em diferentes etapas e/ou em diferentes lotes apresentaram perfis genéticos idênticos, evidenciando a persistência desses isolados entre os animais obtidos de diferentes granjas. Além disso, demonstrou-se que isolados obtidos na etapa de recepção (caixas de transporte) apresentaram perfis genéticos idênticos a isolados obtidos na etapa de abate e cortes finais. Assim, foi possível identificar as principais etapas da linha de abate e processamento de frangos envolvidas na contaminação por micro-organismos indicadores, e também traçar as possíveis rotas de contaminação por Salmonella spp., o que pode ser útil na determinação de medidas de controle por esses estabelecimentos. / Obtaining feedstuffs with high safety and high microbiological standards is essential since contaminated feedstuffs are commonly involved in cases of foodborne diseases. In this context, the importance of studies regarding hygiene indicator microorganisms is highlighted, as well as pathogens in different stages of the production chain. Research about Salmonella spp. is fundamental during slaughtering and processing of poultry due to the fact that these pathogens are often associated with feed and most cases of gastroenteritis. The aim of this study was to evaluate the microbiological quality of carcasses and cuts of chickens and the slaughtering environment at different points in the processing line at two industrial establishments through the study of hygiene indicator microorganisms and Salmonella spp., as well as to trace the main contamination routes by this pathogen through the identification of the gene profile from the isolates. 277 samples were obtained from two poultry slaughter houses (Mt1 - large size and Mt2 - small size) located in the Minas Gerais state, Brazil, and they consisted of poultry carcasses at three distinct slaughter steps (after de-feathering - C1, after evisceration - C2, after pre-cooling - C3) and final cuts (thigh, wing, breast) using the rinsing methodology; samples were also obtained from the surface (400 cm2) of the shipping boxes of chickens, cutting mats, hands of employees, and knives. The samples were subjected to laboratory analyses for the evaluation of mesophiles, enterobacteria, total coliforms, and Escherichia coli, as well as the detection of Salmonella spp. according to ISO 6975; the suspect isolates were confirmed by PCR through identification of genes ompC and sifB. Furthermore, all isolates that were confirmed as Salmonella spp. were subjected to macro-restriction by XbaI and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). For shipping boxes, the average counts that were obtained for all hygiene indicators and the frequency of positive samples for Salmonella spp. did not present with significant differences (P < 0.05) among the slaughterhouses that were studied. Also, there were no significant differences (P < 0.05) of contamination observed among carcasses that were collected in steps C1 and C2 for any indicator that was studied; the same result was observed for Salmonella spp. However, the average contamination as well as the frequency of positive samples for Salmonella spp. that was found in the two first steps for Sl1 were greater (P < 0.05) than those found for Sl2; also, there was a significant reduction in the contamination levels from all hygiene and pathogen indicators between steps C1-C2 and C3 for both slaughterhouses (P < 0.05). The average contamination for the sampled cuts was greater for Mt2 than Mt1 (P < 0.05), which was similarly observed for the sampled surfaces; although, for these samples, significant differences were not found (P < 0.05) in relation to the frequencies of positive samples for Salmonella spp. The results showed that there was greater contamination in the initial slaughter steps, such that greater control is necessary for the pre-cooling step. PFGE of the isolates that were obtained from the transport cages allowed us to observe different gene profiles, thereby indicating a continuous inclusion of new strains of Salmonella spp. in slaughterhouses from poultry production farms. In the slaughtering steps, the isolates that were obtained in different steps and/or different lots presented with identical PFGE profiles, which was evidence of the persistence of these isolates among animals obtained from different farms. Moreover, the isolates that were obtained in the reception step (shipping boxes) presented with identical PFGE profiles to those that were obtained in the slaughtering steps and end cuts. Therefore, it was possible to identify the main steps during slaughtering and processing of poultry that were involved in the contamination based on the indicator microorganisms and to trace the possible routes of contamination by Salmonella spp., which can be useful to determine control measures for these establishments.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-18T09:04:50Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 658681 bytes, checksum: 11991dd14f8b7cdea12ab42eb1a397f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-18T09:04:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 658681 bytes, checksum: 11991dd14f8b7cdea12ab42eb1a397f1 (MD5) Previous issue date: 2015-07-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Listeria monocytogenes pode contaminar produtos cárneos principalmente através de contaminação cruzada de utensílios expostos a produtos crus. A qualidade destes produtos pode ser ainda estimada através da pesquisa de micro-organismos indicadores de higiene, o que não isenta a pesquisa de patógenos para garantia de inocuidade. A contaminação por L. monocytogenes em ambientes de processamento de alimentos é de difícil controle, devido a sua ampla disseminação e adaptação, o que demanda monitoramento constante e adoção de procedimentos eficientes para eliminação desse patógeno. A primeira etapa deste trabalho identificou as principais fontes de contaminação microbiológica no ambiente de processamento de três açougues, quando amostras superfíciais foram obtidas de mesas, facas, interior do balcão refrigeração, moedores e amaciadores de carne (20 amostras por área) e submetidas à enumeração de micro-organismos indicadores de higiene, e pesquisa de L. monocytogenes, cujos isolados obtidos foram caracterizados quanto aos seus sorogrupos e genes de virulência. Os resultados demostraram que não houve diferenças nos níveis de contaminação por micro-organismos indicadores de higiene entre os três estabelecimentos analisados; as amostras com contagens acima de valores referenciais indicaram ineficiêncianos procedimentos de higienização praticados. 87 amostras apresentaram resultado positivo para Listeria spp. (60,4 %), sendo 22 amostras de mesa, 20 de moedor, 16 de faca, 13 de mão, 9 de amaciador e 7 do balcão de refrigeração. Um total de 31 amostras (21,5 %) foram positivas para L. monocytogenes, indicando a presença do patógeno no ambiente de processamento de produtos cárneos. Na caracterização dos sorotipos, 52 isolados foram caracterizados como pertencentes aos sorogrupos 1/2c ou 3c, e 22 isolados como pertencentes aos sorogrupos 4b, 4d, 4a ou 4c. Na pesquisa dos genes de virulência, todos os 74 isolados apresentaram resultados positivos para os genes hlyA, iap,plcA, actA e para o grupo das internalinas (inlA, inlB, inlC e inlJ). Na segunda etapa do estudo,foi avaliado a ocorrência de L. monocytogenes (ISO 11.290 1/2) em utensílios e ambiente de manipulação em um açougue, e os isolados obtidos foram caracterizados quanto aos seus sorogrupos e genes de virulência e ainda avaliados quanto à capacidade de adesão in vitro e sensibilidade a dois sanitizantes (Mister Max-DG1 ® e B-QUART SEPT ®). Do total de 40 amostras de mesas, facas, interior do balcão refrigeração, moedores e amaciadores de carne, 75 % foram positivas para Listeria spp. e 22,5 % para L. monocytogenes. Todos os isolados obtidos foram caracterizados como sorogrupos 1/2c ou 3c, e apresentaram resultados positivos para todos os genes de virulência analisados. Adicionalmente, todos os isolados apresentaram algum potencial de adesão, em sua maioria apresentando potenciais de adesão variando de fraco a moderado, sendo que somente um isolado apresentou um forte potencial de adesão. Os sanitizantes avaliados apresentaram potencial para inibir da multiplicação dos isolados em diferentes concentrações (1:256 a 1:512 para Mister Max-DG1 ®, e 1:4.096 a 1:16.384 para B- QUART SEPT ®), e interferiram na formação e remoção de biofilmes pelos isolados. Após avaliação, os sanitizantes foram adotados na rotina de higienização do estabelecimento comercial, e após 2 meses, amostras superficiais dos mesmos utensílios e equipamentos foram coletadas e submetidas a análise de L. monocytogenes, e nenhum resultado positivo foi identificado. Os resultados obtidos permitiram caracterizar os sorugrupos dos isolados de L. monocytogenes obtidos bem como a o seu potencial virulento, foi também demostrado o potencial de adesão de L. monocytogenes e a eficiência dos sanitizantes Mister Max-DG1 ® e B-QUART SEPT ® para o controle da contaminação por esse patógeno. Os resultados indicam que o estabelecimento de procedimentos adequados para redução das contagens microbianas e controle da disseminação de L. monocytogenes nas etapas finais da cadeia produtiva da carne é de extrema importância, com reflexos evidentes na qualidade e inocuidade dos produtos cárneos destinados ao consumo humano. Adicionalmente, verificou-se o potencial de adesão de L. monocytogenes e a eficiência dos sanitizantes Mister Max-DG1 ® e B- QUART SEPT ® para o controle da contaminação superficial por esse patógeno. / Listeria monocytogenes can contaminate meat products primarily through cross- contamination of utensils exposed to raw products. The quality of these products can still be estimated through the research of hygiene indicator microorganisms, which does not exclude the research of pathogens to assure the food safety. Contamination by L. monocytogenes in food processing environments is difficult to control due to its wide dissemination and adaptation, which requires constant monitoring and adoption of efficient procedures to eliminate this pathogen. In the first step of this study, we identified the main sources of microbiological contamination in three butchers processing environment by collecting surface samples from the hands of employees, tables, knives, inner of butcher display, grinders and meat tenderizers (24 samples per area). Samples were subjected toenumeration of hygiene indicator microorganisms and detection of L. monocytogenes, being the isolates characterized for their virulence genes and serogroups. The results demonstrated absence of differences in the levels of contamination by hygiene indicators microorganisms analyzed between the three butcher shops; samples with counts higher than reference values indicated inefficiency in practiced hygiene procedures. 87 samples were positive for Listeria spp. (60.4 %), being 22 samples from table, 20 from grinders, 16 from knives, 13 from hands, 9 from meat tenderizers and 7 from the inner of butcher display. 31 samples (21.5 %) were positive for L. monocytogenes, indicating the presence of the pathogen in meat processing environment. 52 isolates were characterized as belonging to serogroup 1/2c or 3c, and 22 isolates belonged to serogroups 4b, 4d, 4a or 4c. All 74 isolates showed positive results for hlyA genes, iap, plcA, actA and the group of internalins (InlA, inlB, inLC and inlJ). In the second step of the study, we evaluated the occurrence of L. monocytogenes in the processing environment of a butcher shop, and the obtained isolates were isolates were characterized as to their serogroups and virulence genes and further evaluated for in vitro adhesion capacity sensitivity to two sanitizers (Mister Max-DG1 ® and B-QUART SEPT ®). Of the total of 40 samples hands of manipulators, tables, knives, inner of butcher display, grinders and meat tenderizers, 75 % were positive for Listeria spp. and 22,5 % for L. monocytogenes. All isolates were characterized as belonging to serogroup 1/2c or 3c, and showed positive results for all virulence genes analyzed. In addition, all isolates showed some potential of adhesion, mostly presenting potential of adhesion ranging from weak to moderate, and only one isolate showed a strong potential. The evaluated sanitizers had potential to inhibit the multiplication of isolates in different concentrations (1: 256-1: 512 for Mister Max-DG1 ® , and 1: 4096-1: 16,384 for B-QUART SEPT ®) , and interfered in the formation and removal of the biofilms. After evaluation, the sanitizers were adoptedby the butcher shop cleaning routine, and after two months surface samples from the same utensils and equipment were collected and subjected to L. monocytogenes analysis, and no positive result was identified. The results allowed to characterize the sorugrupos of L. monocytogenes isolates obtained as well as their virulent potential, it has also demonstrated the potential of adhesion of L. monocytogenes and the effectiveness of sanitizers Mister Max-DG1 ® and B-QUART SEPT ® to control contamination by this pathogen. Results indicate that the establishment of appropriate procedures to reduce microbial counts and controlling the spread of L. monocytogenes in the final stages of meat production chain is of utmost importance, with obvious effects on the quality and safety of meat products for human consumption. Additionally, it was found L. monocytogenes adhesion potential and the efficiency of the sanitizing Mister Max- DG1 ® and B -quart SEPT ® for the control of surface contamination by these pathogens.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-24T11:56:18Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-24T11:56:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) Previous issue date: 2018-07-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os produtos lácteos possuem uma microbiota autóctone bastante diversificada, na qual o grupo das Bactérias Ácido Lácticas (BAL) é de notável relevância devido às suas características benéficas, tecnológicas e bioconservantes, atraindo o interesse para sua utilização em diversos segmentos biotecnológicos, em especial na indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar BAL bacteriocinogênicas de queijos artesanais, caracterizando aspectos ligados à produção e purificação das bacteriocinas, inocuidade, potencial benéfico dos isolados e propriedades inibitórias contra Listeria spp. As cepas bacteriocinogênicas Enterococcus hirae ST57ACC e Pediococcus pentosaceus ST65ACC foram isoladas a partir da técnica de tripla camada e identificadas por metodologias fenotípicas e moleculares. As bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC demostraram estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, e foram inativadas após tratamento com enzimas proteolíticas, comprovando sua natureza proteica. Tratamentos com EDTA, SDS, NaCl e Tween 80 não afetaram a atividade das bacteriocinas. Os sobrenadantes de ambos os isolados foram capazes de inibir Listeria innocua e diversas cepas de L. monocytogenes pertencentes à diferentes sorogrupos e obtidas de fontes distintas, inibindo completamente o desenvolvimento de L. monocytogenes após 12 h. Em co-culturas das cepas bacteriocinogênicas com a cepa indicadora L. monocytogenes 422 em leite desnatado, observou-se que E. hirae ST57ACC foi capaz de controlar a multiplicação do patógeno após 48 h. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus não apresentaram resultados positivos para 25 genes relacionados a bacteriocinas conhecidas, indicando que podem produzir novas bacteriocinas. As cepas de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram também avaliadas quanto ao seu potencial benéfico e segurança: ambos os isolados permaneceram viáveis após tratamento em condições gastrointestinais simuladas, exibindo altos níveis de auto e co-agregação com L. monocytogenes e níveis variados de hidrofobicidade, demonstrando que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC podem prevenir potencialmente o estabelecimento de infecções pelo patógeno. Por meio da metodologia de agar-spot, avaliou-se a possibilidade de interferência de 33 medicamentos comerciais, de diferentes grupos sobre a multiplicação de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC, revelando que apenas antiinflamatórios e medicamentos contendo loratadina e cloridrato de propranolol apresentaram atividade inibitória sobre as cepas. Testes fenotípicos para determinação da susceptibilidade antimicrobiana demonstraram que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram resistentes à vancomicina, oxacilina e sulfa/trimetoprim dentre os 11 antibióticos testados pelo método de disco difusão. Com relação à PCR, poucos genes relacionados à resistência a antibióticos foi foram identificados. Nenhum dos isolados amplificou genes de produção de aminas biogênicas e nem apresentou produção das mesmas. A expressão de diferentes elementos do sistema de transporte ABC e metabolismo de açúcares foi identificada para ambos os isolados. Variações na proporção de inóculo não influenciaram a taxa de multiplicação de E. hirae ST57ACC nem de P. pentosaceus ST65ACC, no entanto, a produção de bacteriocinas foi detectada apenas 9 horas após a inoculação das cepas, quando inoculadas nas proporções de 5% e 10%. Adicionalmente, verificou-se que a densidade celular das cepas bacteriocinogênicas esteve correlacionada à produção de bacteriocinas em sistemas de fermentação tradicional e fermentação com controle de pH a 5,5 e agitação. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram capazes de se multiplicar e produzir bacteriocinas na presença de xilo-oligossacarídeos após 6 horas de incubação, porém em níveis reduzidos quando comparados ao cultivo em meio MRS. Por fim, as bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram purificadas a partir de diferentes metodologias. A bacteriocina produzida por P. pentosaceus ST65ACC foi purificada em duas etapas, com rendimento final de 101,33 revelando- se um peptídeo com massa molecular de 3,5 a 8,5 kDa, determinado por SDS-PAGE. Em contrapartida, um protocolo de três etapas foi empregado na purificação da bacteriocina produzida por E. hirae ST57ACC, com rendimento final de 3,05. Adicionalmente, uma fração semi-purificada foi testada com a linhagem celular HT- 29, demonstrando que a bacteriocina não apresenta efeitos citotóxicos contra células humanas, sendo considerada segura neste aspecto. Os dados obtidos neste trabalho indicam que os isolados E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST57ACC podem ser considerados importantes ferramentas biotecnológicas na produção de bacteriocinas de interesse ao controle de L. monocytogenes e na biopreservação de alimentos. / Dairy products present a rich and diverse autochthonous microbiota, in which Lactic Acid Bacteria (LAB) are relevant, due to their beneficial, technological and biopreservative features, attracting the interest for their biotechnological application, in food industry, pharmaceutic area and human and veterinary medicine fields. The aim of this study was to isolate and to identify bacteriocinogenic LAB from artisanal cheeses, characterizing some aspects linked to bacteriocin production and purification, safety and beneficial potential of the isolates, as well as their inhibitory properties against Listeria spp. Bacteriocinogenic strains Enterococcus hirae ST57ACC and Pediococcus pentosaceus ST65ACC were isolated by using the triple- layer technique and identified by phenotypical and molecular methods. Bacteriocins produced by E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were stable in a wide range of pH and temperature, losing their activity after treatment with proteolytic enzymes, confirming their proteinaceous nature. Treatments with EDTA, SDS, NaCl and Tween 80 did not affect bacteriocin activity. Cell-free supernatants from both isolates were able to inhibit Listeria innocua and several L. monocytogenes strains, from different serogroups obtained from diverse sources, eliminating L. monocytogenes after 12 h. In co-culture experiments conducted in skimmed milk with the bacteriocinogenic isolates and the target strain L. monocytogenes 422, E. hirae ST57ACC controlled the target strain growth after 48 h. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC did not present positive results for 25 known bacteriocin related genes, indicating that they might express new bacteriocins. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC were also evaluated for their beneficial and safety features: both isolates remained viable after treatment replicating gastrointestinal conditions, showing high levels of auto and co-aggregation with L. monocytogenes and diverse levels of hydrophobicity, demonstrating that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC might prevent the establishment of infections caused by this pathogen. Interference of 33 commercial drugs from different groups on growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC was tested by agar-spot method, revealing that only anti-inflammatories and drugs containing loratadine and propranolol hydrochloride influenced the growth of bacteriocinogenic strains. Phenotypical tests employed to determine antibiotic susceptibility have shown that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were resistant to vancomycin, oxacillin and sulfa/trimethoprim out of 11 antibiotics tested by disk-diffusion test, nonetheless low number of antibiotic resistance genes was observed by PCR analysis. None of the isolates amplified biogenic amines encoding genes neither presented phenotypical evidence of their production. Expression of different ABC transporters linked to bacteriocin export and sugar metabolism was detected, for both isolates. Changes in inoculum size did not influenced the growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC; however, bacteriocin production was affected, and bacteriocins were detected only after 9 h with inoculation at 5% and 10% of bacteriocinogenic strains. Additionally, it was observed that cell density of both bacteriocinogenic strains was linked to bacteriocin production in traditional and pH at 5.5 and agitation controlled fermentation continuous. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were capable to grow and produce bacteriocins in the presence of xylo-oligossacharides after 6 h of incubation, but in lower levels than those obtained with cultivation in MRS broth. Finally, E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were purified from different methods. The bacteriocin produced by P. pentosaceus ST65ACC was purified in two-steps, with final yield of 101.33, recognized as a 3.5 to 8.5 kDa peptide, determined by Tricine-SDS-PAGE. In contrast, a three-step-protocol was used to purify the bacteriocin produced by E. hirae ST57ACC, with final yield of 3.05. Moreover, a semi-purified fraction of E. hirae ST57ACC bacteriocin was tested in HT-29 cell-line, demonstrating no-cytotoxic effects in human cells, which means the bacteriocin can be considered safe in this aspect. Obtained data from this study indicate that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST57ACC may be considered as important biotechnological tools for bacteriocin production to control L. monocytogenes and as biopreservatives in food.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2014-07-02T19:06:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EfeitoAdicaoCulturas.pdf: 6018457 bytes, checksum: 7e86795f8b9bfecaac663839815f8da0 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-07-16T12:52:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EfeitoAdicaoCulturas.pdf: 6018457 bytes, checksum: 7e86795f8b9bfecaac663839815f8da0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-16T12:52:36Z (GMT). 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Após reativação, a cultura industrial foi obtida pela transferência do inoculo de 1% (v/v) para frascos de vidros contendo 500 ml de LDR 12% esterilizado, seguida de incubação a 30 °C ± 2 °C até a coagulação do leite, em seguida a cultura (fermento lático) foi adicionada diretamente no tanque de fabricação contendo o leite pasteurizado, mantendo-se a proporção de 1:1. Para avaliação tecnológica foram utilizados as seguintes culturas láticas isoladas de leite cru: Lactococcus lactis ssp. lactis (LL); Lactococcus lactis (atípico) (LLA); Lactococcus lactis ssp. cremoris (atípico) (LLCA); Lactococcus lactis ssp. cremoris (LLC),. As porções de Amostras foram retiradas, colocadas em processador de alimentos e processadas até formar uma amostra. Em seguida, foram acondicionadas em frascos estéreis, identificadas e mantidas em freezer para posterior análises de determinação do extrato seco, umidade (%), extrato seco total (EST), gordura (G), gordura no extrato seco (GES), acidez, pH, cloretos, nitrogênio total (NT), nitrogênio solúvel em pH 4,6, nitrogênio solúvel em TCA 12%. O índice de proteólise ou extensão da maturação foi avaliado pela divisão do NT. Para o teste de aceitação utilizou-se a escala hedônica estruturada de nove pontos, para avaliar o produto quanto ao aroma, aspecto geral, gosto e textura. O teste de fritura de acordo com metodologia descrita por Cavalcante et al., (2007). As análises microbiológicas das amostras de queijos experimentais nos 1º e 30º dia de maturação, encaminhadas ao Laboratório Central – LACEN, Divisão de Análises de Produtos – DEP. E consistiram em Contagem de bactérias Aeróbias Mesófilas, Determinação de Coliformes. Para o teste de fritura não houve análise estatística. O delineamento utilizado foi o Inteiramente Casualisado e foi utilizada a metodologia de modelos mistos para dados longitudinais, com objetivo de modelar a estrutura de (co)variância entre medidas coletadas na mesma unidade experimental em tempos diferentes, por meio do modelo yijk=μ+αi+ δ(i)+βk+ α βik+εijk. Utilizando-se o programa estatístico Statistical Analysis Systems - SAS (SAS INSTITUTE INC., 1992). Os tratamentos LL e LLA foram reprovados no teste de fritura. Houve ligação entre a característica derretimento com a umidade, acidez e proteólise. Os queijos que apresentaram maiores valores de proteólise apresentaram maior capacidade de derretimento. As amostras de queijo coalho tiveram boa aceitabilidade no teste de aceitação. / The objective of this study was to evaluate the characteristics of the curd cheese produced from pasteurized cow's milk, through the use of mesophilic lactic acid bacteria of the genus Lactococcus lactis ssp. cremoris and Lactococcus lactis ssp. lactis specific. The lactic cultures derived from the Bank of lactic acid bacteria from the State University of Ceará were activated at the premises of the Laboratory of lactic acid bacteria of the Federal Rural University of Amazonia-UFRA, Bethlehem Campus lactic cultures were activated for three consecutive days in Reconstituted Skim Milk (LDR) 12% sterilized and incubated at 30 ° C ± 2 ° C, to coagulate the milk. After reactivation, the industrial culture was obtained by transferring the inoculum of 1% (v / v) to glass vials containing 500 ml of sterile 12% LDR, followed by incubation at 30 ° C ± 2 ° C to coagulate the milk, then the culture (lactic yeast) was added directly into the tank containing manufacturing pasteurized milk, keeping the ratio of 1:1. Technology assessment were used for the following lactic cultures isolated from raw milk: Lactococcus lactis ssp. lactis (LL) and Lactococcus lactis (atypical) (ALL), Lactococcus lactis ssp. cremoris (atypical) (LLCA), Lactococcus lactis ssp. cremoris (LLC). The portions of samples were removed, placed in a food processor and processed to form a sample. They were then stored in sterile flasks, labeled and stored in a freezer for later analysis to determine the dry matter, moisture (%), total solids (EST), fat (F), fat in dry matter (GES), acidity, pH, chloride, total nitrogen (TN), pH 4.6-soluble nitrogen, soluble nitrogen in TCA 12%. The rate of proteolysis or extent of maturation was evaluated by dividing the NT. For the acceptance test used the hedonic scale of nine points, to evaluate the product for the aroma, general appearance, taste and texture. The test frying according to the methodology described by Cavalcante et al. (2007). Microbiological analysis of cheese samples in an experimental and 30 days of ripening, referred to the Central Laboratory - LACEN, Analysis Products Division - DEP. It consisted of mesophilic aerobic bacteria count, coliform determination. To test for statistical analysis there was no frying. The experimental design was completely randomized design and the methodology of mixed models for longitudinal data, in order to model the structure of (co) variance between measurements collected in the same experimental unit at different times through the model yijk=μ+αi + ijk ik. ε + β α β j (i) + k + δ . Using the statistical program Statistical Analysis Systems - SAS (SAS Institute Inc., 1992). The treatments LL and ALL failed the test of frying. There was a link between the characteristic melt with moisture, acidity and proteolysis. The cheeses showed higher proteolysis had higher melting capacity. The samples of cheese curd had good acceptance in the acceptance test.

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As amostras de leite cru e água foram coletadas em frascos estéreis e as amostras de mão de ordenhador, balde e teteiras foram coletadas com o auxilio de zaragatoas estéreis. As amostras de leite cru foram submetidas a um pré-enriquecimento em água peptonada tamponada a 4°C durante 30 dias, sendo posteriormente incubadas em caldo PSTA, adicionado de ampicilina, a 28°C durante 48h. As amostras de água foram filtradas em membrana de éster de celulose e incubadas em caldo TSB a 30°C durante 24h. As amostras de leite após incubação em PSTA, as membranas utilizadas na filtragem da água incubadas em TSB, bem como o material de mãos, balde e teteiras coletadas nas zaragatoas, foram semeadas em ágar MacConkey e incubados a 30°C durante 24h, para a obtenção de colônias. Colônias características foram analisadas através de duplex PCR para confirmação da espécie. Os perfis moleculares dos isolados de Y. enterocolitica foram comparados utilizando a técnica de rep-PCR. Y. enterocolitica foi isolada de 9,37% (3/32) das amostras de leite, 6,25% (2/32) das amostras de água e 12,5% (4/32) das amostras de mão. Não houve similaridade no perfil de bandas dos isolados encontrados, entretanto foi identificada a presença de cepas diferentes na mesma amostra, demonstrando uma variedade grande de cepas distribuídas no ambiente. A presença de Y. enterocolitica em leite cru no Brasil é preocupante, já que uma quantidade considerável do produto ainda é comercializado de forma clandestina, expondo o consumidor ao risco de infecção pela bactéria, ao consumi-lo sem tratamento térmico adequado. / This work was performed in order to determine the possible Yersinia enterocolitica contamination sources at different points of the dairy cows milking process in eight properties of Pelotas, RS, over four different periods distributed in a year. Y. enterocolitica is a psychrotrophic bacterium responsible for causing gastroenteritis in humans, especially in infants and children, from the consumption of contaminated water or food, and raw milk. Raw milk samples were analyzed immediately after milking, water of milking parlor, milker’s hands, milk collection bucket and inflator liners. The samples of raw milk and water were collected in sterile bottles and milker hand samples, bucket and liners were collected with sterile swabs. The raw milk samples were subjected to a pre-enrichment peptone water buffered at 4°C for 30 days and subsequently incubated in PSTA broth ampicillin added at 28°C for 48h. Water samples were filtered through cellulose ester membrane and incubated in TSB medium at 30°C for 24h. The milk samples after incubation in PSTA, the TSB where the membranes used in water filtration were incubated and the material of the hands material, bucket and liners collected in the swabs were plated on MacConkey agar and incubated at 30°C for 24h, to obtain colonies. Characteristics colonies were analyzed by duplex PCR to confirm the species. The molecular profiles of Y. enterocolitica isolates were compared using rep-PCR. Y. enterocolitica was isolated from 9,37% (3/32) of milk samples, 6,25% (2/32) of water samples and 12,5% (4/32) of hand samples. There weren’t similarities in the band profile of the isolates found, however showed the presence of different strains of the same sample, demonstrating a variety of strains distributed in the environment. The presence of Y. enterocolitica in raw milk in Brazil is dangerous, considering that the product is sold clandestinely, exposing consumers to the risk of infection by the bacterium, to consume it without proper heat treatment.