La déubiquitinase BRCA-associated protein 1 (BAP1) est un suppresseur de tumeurs chez l’homme, dont l’activité enzymatique est inactivée dans une variété de cancers. Les modèles actuels proposent que BAP1 forme un complexe de plusieurs méga daltons avec des protéines associées à la chromatine, et que ces protéines et les modifications post-traductionnelles (PTM) facilitent sa fonction de suppresseur de tumeurs en agissant sur la chromatine. Il a été démon-tré que les facteurs de transcription FOXK1 et FOXK2 recrutent BAP1 pour cibler des gènes et réguler la transcription. Cependant, comment FOXK1/2 sont régulés dans le complexe BAP1 reste inconnu. FOXK1/2 sont récemment apparus comme des régulateurs clés du métabolisme et de la prolifération cellulaire dans des conditions normales et de stress. Les observations dans les can-cers humains suggèrent que FOXK1, et non FOXK2, possède des propriétés oncogéniques. En effet, une expression élevée de FOXK1 est associée à une prolifération accrue, ainsi qu’à une invasion et des métastases plus importantes. Cependant, les mécanismes moléculaires exacts de la dérégulation de FOXK1 restent méconnus. Nos analyses sur la survie des patients montrent qu’une forte expression du transcrit de FOXK1 diminue significativement la survie par rapport aux patients présentant de faibles taux du transcrit de FOXK1, ce qui n’est pas observé avec FOXK2. Pour mieux comprendre les fonctions de FOXK1 et FOXK2, nous avons surexprimé ses protéines dans des fibroblastes humains normaux. Cela nous a conduits à découvrir que les pro-priétés oncogéniques de FOXK1 agissent en partie par l’induction de la voie des E2Fs. Contrai-rement à FOXK2, la surexpression de FOXK1 dans les fibroblastes humains normaux favorise la prolifération cellulaire et retarde l’induction de la sénescence. Nous avons également constaté que lorsque la surexpression de FOXK1 était combinée à d’autres oncogènes, sa capacité à transformer les fibroblastes était significativement augmentée. Ces résultats suggèrent que FOXK1 et FOXK2 jouent différents rôles dans les cellules et qu’un mécanisme peut réguler leur activité différemment. De manière intéressante, nous avons découvert que FOXK1, et non FOXK2, est modifié par O-GlcNAcylation, une modification post-traductionnelle unique connue pour être étroite-ment régulée par les fluctuations du métabolisme cellulaire. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que la O-GlcNAcylation est un mécanisme important de régulation de l’activité transcriptionnelle de FOXK1. L’identification des sites modifiés sur FOXK1 nous a permis de créer des mutants déficients en O-GlcNAcylation de ce facteur. Alors que la perte de la O-GlcNAcylation n’impacte pas sur le recrutement de FOXK1 à la chromatine, nous avons décou-vert que la O-GlcNAcylation régule les propriétés oncogéniques de FOXK1. En effet, l’absence de la O-GlcNAcylation de FOXK1 diminue la capacité proliférative des cellules ainsi que la crois-sance tumorale. De plus, nos analyses de génomiques nous ont permis de mettre en évidence que la O-GlcNAcylation régule le recrutement de BAP1 sur la chromatine. La diminution de la O-GlcNAcylation sur FOXK1 entraîne une réduction du recrutement de BAP1, ce qui est associé à une augmentation des niveaux de H2AK119Ub, une marque de répression génique ciblée par la déubiquitinase BAP1, ainsi qu’à une diminution de la marque d’activation H3K4me1. Nous proposons un modèle dans lequel la O-GlcNAcylation régule les fonctions biolo-giques de FOXK1 et promeut la croissance tumorale en pilotant les propriétés oncogéniques de ce facteur. Nos analyses suggèrent que la O-GlcNAcylation de FOXK1 est importante pour le bon fonctionnement des complexes sur la chromatine. Comprendre comment FOXK1 et FOXK2 régu-lent BAP1 pourrait nous aider à mieux définir les fonctions de suppression tumorale de BAP1 et comment la dérégulation des facteurs de transcription contribue au développement du cancer. / The deubiquitinase BAP1 (BRCA-associated protein 1) is a tumor suppressor in humans, whose enzymatic activity is inactivated in a variety of cancers. Current models suggest that BAP1 forms mega dalton complex with chromatin-associated proteins, and that these proteins and post-translational modifications (PTMs) facilitate its tumor suppressor function by acting on chromatin. It has been shown that the transcription factors FOXK1 and FOXK2 recruit BAP1 to target genes and regulate transcription. However, how FOXK1/2 are regulated within the BAP1 complex remains unknown. FOXK1/2 have recently emerged as key regulators of metabolism and cell proliferation under normal and stress conditions. Observations in human cancers suggest that FOXK1, and not FOXK2, has oncogenic properties. Indeed, high expression of FOXK1 is associated with increased proliferation, as well as greater invasion and metastasis. However, the exact molecular mechanisms of FOXK1 deregulation remain unknown. Our analyses of patient survival show that high expression of FOXK1 transcript significantly reduces survival compared to patients with low levels of FOXK1 transcript, which is not observed with FOXK2. To better understand the functions of FOXK1 and FOXK2, we overexpressed their proteins in normal human fibroblasts. This led us to discover that the oncogenic properties of FOXK1 act in part by inducing the E2F pathway. Unlike FOXK2, overexpression of FOXK1 in normal human fibroblasts promotes cell proliferation and delays the induction of senescence. We also found that when overexpression of FOXK1 was combined with other oncogenes, its ability to transform fibroblasts was significantly increased. These results suggest that FOXK1 and FOXK2 play different roles in cells and that a mechanism may regulate their activity differently. Interestingly, we discovered that FOXK1, and not FOXK2, is modified by O-GlcNAcylation, a unique post-translational modification known to be tightly regulated by fluctuations in cellular metabolism. Consequently, we hypothesized that O-GlcNAcylation is an important mechanism for regulating the transcriptional activity of FOXK1. Identifying the modified sites on FOXK1 allowed us to create mutants deficient in O-GlcNAcylation of this factor. While the loss of O-GlcNAcylation does not affect the recruitment of FOXK1 to chromatin, we discovered that O-GlcNAcylation regulates the oncogenic properties of FOXK1. Indeed, the absence of O-GlcNAcylation of FOXK1 reduces the proliferative capacity of cells as well as tumor growth. Moreover, our genomic analyses have allowed us to highlight that O-GlcNAcylation regulates the recruitment of BAP1 to chromatin. Loss of FOXK1 O-GlcNAcylation leads to a reduction of BAP1 recruitment to chromatin, which is associated with an increase in the levels of H2AK119Ub, a gene repression mark targeted by the deubiquitinase BAP1, as well as a decrease in the activation mark H3K4me1. We propose a model in which O-GlcNAcylation regulates the biological functions of FOXK1 and promotes tumor growth by driving the oncogenic properties of this factor. Our analyses suggest that O-GlcNAcylation of FOXK1 is important for the proper functioning of complexes on chromatin. Understanding how FOXK1 and FOXK2 regulate BAP1 could help us better define the tumor-suppressing functions of BAP1 and how the deregulation of transcription factors contributes to cancer development.

Le trouble bipolaire est une maladie invalidante caractérisée par une alternance d’épisodes maniaques et dépressifs. Malgré des efforts de recherche notables, la physiopathologie et les mécanismes d’action des traitements du trouble bipolaire demeurent peu connus. La protéine kinase C (PKC) est récemment apparue comme une cible moléculaire potentielle pour le traitement du trouble bipolaire. Dans ce travail de thèse, nous avons cherché à étudier le rôle de la PKC dans les phases maniaque et dépressive du trouble bipolaire. Nous avons montré que l’inhibition de la PKC a un effet antimaniaque non seulement chez le rat naïf, mais aussi dans un modèle de manie basé sur une privation de sommeil, que nous avons validé au cours de notre étude. De plus, les inhibiteurs de la PKC sont capables de rétablir les déficits de prolifération cellulaire hippocampique que présentent les rats privés de sommeil. Ces effets prolifératifs et antimaniaques seraient indépendants, puisque le blocage de la prolifération cellulaire n’abolit pas l’efficacité antimaniaque des inhibiteurs de la PKC dans le modèle de privation de sommeil. En parallèle, nous avons montré que l’activation de la PKC a un effet antidépresseur chez le rat naïf, alors que son inhibition provoque un phénotype pseudodépressif qui s’accompagne d’une diminution de la prolifération cellulaire hippocampique. L’ensemble de ces données révèle une implication de la PKC dans les deux phases du trouble bipolaire, et soutient l’hypothèse qu’une suractivation du système PKC serait à l’origine des perturbations de neuroplasticité associées à la manie. / Bipolar disorder is a devastating long-term disease characterized by alternate episodes of mania and depression. Despite extensive research, the molecular and cellular underpinnings of bipolar disorder remain to be fully elucidated. Protein kinase C (PKC) has emerged as a potential molecular target for the treatment of bipolar disorder. The present study investigated the role of PKC in manic- and depressive-like behaviors. Our results showed that PKC inhibition produced an antimanic-like effect not only in naive rats, but also in an animal model of mania based on sleep deprivation, that we have validated in our study. Interestingly, PKC inhibitors rescued the hippocampal cell proliferation deficits displayed by sleep-deprived animals. These proliferative and antimanic effects were independent, since blockade of cell proliferation did not abolish the antimanic efficacy of PKC inhibitors in the sleep deprivation model. At the same time, we showed that PKC activation had an antidepressant-like effect in naive rats, whereas its inhibition caused a depressive-like phenotype accompanied by a decrease in hippocampal cell proliferation. Taken together, our results demonstrate the involvement of the PKC system in regulating opposite facets of bipolar disorder, and support the hypothesis that an overactivation of the PKC signaling system may be crucial for the deficits of neuroplasticity associated with mania.

L’enzyme méthionine synthase (MTR) catalyse la reméthylation de l’homocystéine en méthionine, le précurseur du donneur universel de groupe méthyle S-Adenosylmethionine (SAM), impliqué dans des mécanismes de régulations épigénétiques. Des polymorphismes de MTR sont associés à des défauts métaboliques et des défauts de développement embryonnaire. Afin d’étudier les conséquences d’une déficience en MTR, nous avons généré des modèles murins d’invalidation conditionnelle du gène MTR de manière constitutive ou inductible dans le foie et dans le cerveau. L’invalidation constitutive ou inductible ciblée dans le foie pendant l’embryogenèse n’est pas viable, suggérant un rôle limitant de la méthionine synthase sur le développement précoce et l’organogenèse en lien probable avec les conséquences sur la prolifération cellulaire. Dans les périodes post-natales, nous avons utilisé le modèle inductible complété par une hépatectomie pour étudier les altérations de la régénération hépatique liée aux effets sur le stress cellulaire ainsi que l’expression et l’activation des cyclines. Le KO dans le cerveau induit principalement une perte des fonctions de mémorisation de l’apprentissage hippocampo-dépendant. Au total, nos résultats illustrent les effets différents de l’invalidation de MTR en fonction de l’organe considéré. Le foie est un organe très plastique avec une capacité de régénération très importante. Les effets sur les étapes de l’organogénèse et sur l’inhibition de la régénération confirment l’hypothèse du rôle majeur et limitant de la méthionine synthase dans la régulation du cycle cellulaire. Le modèle d’invalidation au niveau du cerveau confirme le rôle très important de la voie de reméthylation de l’homocystéine catalysée par la méthionine synthase, rôle qui a déjà été illustré par d’autres travaux sur les rats carencés en donneur de méthyle et sur la souris transgénique KO cd320 / The enzyme methionine synthase (MTR) catalyzes the remethylation of homocysteine to methionine, the precursor of the methyl donor S-universal Adenosylmethionine (SAM), involved in epigenetic regulation mechanisms. We generated mouse models with conditional invalidation of the mtr gene in a constitutive or inducible manner to delete the gene expression specifically in the liver and brain. Constitutive invalidation during embryonic life is not sustainable when targeted to the liver, suggesting a limiting role of methionine synthase in early organogenesis and probably on cell proliferation. We performed hepatectomy to study regeneration-related effects on the cellular stress and found dramatic effects on cell proliferation through altered expression and activation of cyclins. The constitutive model in brain highlighted the behavioral anomalies related to a loss of learning and memory. This suggested major effects in the hippocampus. Overall, our findings highlighted the specific effects of the invalidation of methionine synthase in both organs. The liver is a plastic member with a very high regenerative capacity. The effects on organogenesis and inhibition of regeneration confirm the hypothesis for a major role of methionine synthase in cell cycle regulation. The invalidation model in the brain confirms the important role of the remethylation pathway catalysed by methionine synthase, a role which has been shown by other studies in rats deprived in methyl donors and in cd320 KO transgenic mice

L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie qui touche les articulations principalement chez les personnes âgées. Il devient capital de mieux cerner cette pathologie à cause des coûts économiques qu’elle engendre mais surtout à cause du vieillissement de la population. Cette maladie se caractérise par une dégradation du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, une inflammation de la membrane synoviale ainsi que la présence d’ostéophytes. L’étiologie de cette pathologie est restée nébuleuse car la recherche sur la maladie touchait principalement le cartilage articulaire. Toutefois, le rôle clé de l’os sous-chondral dans l’OA est maintenant reconnu. L’obésité étant un facteur de risque de l’OA, nous avons émis l’hypothèse que la leptine, une adipocytokine clé dans l’obésité, joue un rôle important dans l’OA. En effet, la leptine modifie le phénotype des ostéoblastes (Ob) normaux humain et puisque les Ob OA humains ont un phénotype altéré, notre objectif était de déterminer le rôle potentiel de la leptine dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons préparé des cultures primaires d’Ob issus de la plaque sous-chondral du plateau tibial de patients OA et d’individus normaux (N). L’expression de la leptine et de son récepteur actif (OB-Rb) ont été mesurées par RT-PCR en temps réel, et leur production a été mesurée par ELISA et immunobuvardage (IB). La prolifération des Ob OA a été déterminée par incorporation de BrdU. La phosphorylation de p42/44 MAPK dans les Ob OA a été déterminée par IB. Le phénotype des Ob fut déterminé par la mesure de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) et la sécrétion d’ostéocalcine (OC), en présence ou non de leptine. De plus, les effets des ARNs d’interférences (SiRNA) anti-leptine et anti OB-Rb sur le phénotype des Ob OA furent déterminés via leur impact sur l’activité de l’ALP et sur la sécrétion d’OC. L’effet dose-réponse de la leptine sur les expressions d’OB-Rb, du facteur de croissance TGF-1 ou encore sur sa propre expression furent déterminées par RT-PCR en temps réel. Pour terminer, la signalisation de la leptine a été étudiée en évaluant l’effet dose réponse de celle-ci sur la production des protéines JAK2 et STAT3 phosphorylées par IB. Les résultats obtenus ont montrés que les Ob OA expriment et produisent plus de leptine que les Ob N. Au niveau phénotypique, ces Ob OA possèdent une activité de l’ALP ainsi qu’une sécrétion d’OC plus importante que celles observées chez les Ob N. L’ajout d’anticorps inactivant l’interaction leptine et OB-Rb ou d’inhibiteurs chimiques comme tyrphostin ou piceatannol diminuèrent l’activité de l’ALP ainsi que la sécrétion d’OC dans les Ob OA. Par contre, l’ajout de leptine exogène aux Ob OA augmenta l’activité de l’ALP sans pour autant faire varier la sécrétion d’OC. La leptine à des doses de 1ng/ml à 10mg/ml stimula la prolifération des Ob OA ainsi que la phosphorylation de p42/44 MAPK. La leptine exogène diminua l’expression de TFG-1 tandis qu’elle stimula la phosphorylation de JAK2 et STAT3 ou encore sa propre expression de manière dose-dépendante. Cependant, l’expression d’OB-Rb diminua de manière dose-dépendante. Enfin, le traitement des Ob OA avec des Si leptine ou Si OB-Rb diminua l’activité d’ALP, la sécrétion d’OC, l’expression de la leptine, l’expression d’OB-RB ainsi que l’expression du facteur TGF-1. L’ensemble de ces données démontre que la leptine endogène des Ob OA est sous contrôle des facteurs de croissance et qu’elle contribue à maintenir le phénotype anormal de l’os sous-chondral OA. De plus, ceci suggère que la leptine serait un acteur important dans la régulation du remodelage osseux. / Osteoarthritis (OA) is a disease which mainly affects the joints in the elderly. It becomes essential to better understand this disease because of the economic costs it brings, but mainly because of population aging. This disease is characterized by a deterioration of cartilage, bone sclerosis, inflammation of the synovial membrane and the presence of osteophytes. The knowledge of its etiology has remained incomplete because research on this disease focused mainly on the articular cartilage. However, the key role of subchondral bone in OA is now recognized. Obesity is a risk factor for OA, then we hypothesized that leptin, a key adipocytokine in obesity plays an important role in OA. Indeed, leptin alters the phenotype of osteoblasts (Ob) and human Ob has altered phenotype in OA patients, our objective was to determine the potential role of leptin in OA Ob. To do this, we prepared primary cultures of Ob from the sub-chondral plate of the tibial plateaus of OA patients and normal individuals (N). The expression of leptin and its receptor active (OB-Rb) were measured by RT-PCR in real time, and their production was measured by ELISA and western blot (WB). The proliferation of Ob OA was determined by BrdU incorporation. The phosphorylation of p42/44 MAPK was evaluated by WB. The phenotype of Ob was determined by measuring the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the secretion of osteocalcin (OC), in the presence or absence of leptin. Moreover, the effects of small interference RNAs (siRNAs) anti-leptin and anti OB-Rb on the phenotype of OA Ob were determined through their impact on the activity of the ALP and the secretion of OC. The dose-response effect of 1eptin on its own expression or the expressions of OB-Rb, the growth factor TGF-β1 were determined by RT-PCR in real time. Finally, signalisation of leptin in OA Ob was studied by evaluating the dose-response effect of this on the production of JAK2 and STAT3 protein phosphorylated by WB. The results showed that the OA Ob express and produce more leptin than N. Moreover, these Ob OA have an activity of the ALP and a secretion OC higher than those observed in N Ob. The addition of antibodies inactivating interaction leptin and OB-Rb or chemical inhibitors such as tyrphostin or piceatannol diminished the activity of the ALP and the secretion of OC in OA Ob against by the addition of exogenous leptin to Ob OA increased the activity of the ALP without influencing the secretion of OC. Leptin at doses of 1ng/ml to 10mg/mL stimulated the proliferation of OA Ob and the phosphorylation of p42/44 MAPK. Exogenous leptin decreased the expression of TGF-β1 while it stimulated the phosphorylation of JAK2 and STAT3 and expression of its own in dose-dependent manner. However, the expression of OB-Rb decreased in dose-dependent. Finally, the treatment of OA Ob with Si leptin or Si OB-Rb decreased activity of ALP, the secretion of OC, the leptin expression, expression of OB-Rb and the expression of TGF-β1 factor. All these data show that endogenous leptin Ob OA controls the growth factors and contributes to maintaining the abnormal phenotype of the subchondral bone OA. Moreover, this suggests that leptin is an important player in the regulation of bone remodelling

Il est connu qu'une consommation modérée de vin rouge protégerait contre de nombreuses pathologies, du fait notamment de ses polyphénols. Nous avons étudié en particulier l'effet de ces polyphénols sur le cancer colorectal, l'un des cancers les plus fréquents dans les pays industrialisés. Certains polyphénols purifiés de vin rouge, comme le resvératrol et la quercétine, montrent des effets antiprolifératifs contre les cellules de cancer colorectal.Notre première approche a consisté à utiliser des extraits polyphénoliques de vins rouges de Bourgogne. Nous avons alors étudié d'une part, leurs effets in vitro sur la prolifération cellulaire de lignées tumorales colorectales humaines SW480 et les interactions entre ces polyphénols et le transport et le métabolisme du resvératrol ; et d'autre part, les effets in vivo chez la souris CF-1 d'une consommation régulière de ces polyphénols dans l'alimentation sur la survenue de lésions pré-néoplasiques chimio-induites par l'azoxyméthane au niveau du colon.Notre deuxième approche s'est orientée vers les modifications de la structure chimique du resvératrol. Par l'ajout de groupements méthoxyles et hydroxyles, et par l'isomérisation de sa structure (cis ou trans), nous avons cherché à dégager des relations structures-fonctions du resvératrol et à créer des dérivés plus bioactifs.Nous montrons que les polyphénols du vin rouge inhibent la prolifération de cellules cancéreuses coliques, en bloquant le cycle cellulaire. Certains polyphénols du vin tel que la quercétine sont capables d'augmenter la capacité des cellules SW480 à accumuler le resvératrol. [Nous montrons que] chez les souris, la prise régulière de polyphénols de vin rouge dans l'alimentation diminue le nombre global de lésions pré-néoplasiques, et surtout les lésions de grande taille dont dérivent les polypes intestinaux. Les modifications chimiques de la structure du resvératrol montrent que les analogues méthoxylés du cis-resvératrol sont de puissants antiprolifératifs par blocage de la mitose, alors que le mécanisme d'action des dérivés du trans-resvératrol bloque le cycle cellulaire au niveau de la phase S.Ce travail supporte l'idée que le recours aux polyphénols du vin dans la prévention des adénocarcinomes coliques est possible et que ce champs de recherche est une voie prometteuse. Concernant des visées thérapeutiques, la recherche d'analogues du resvératrol présentant une biodisponibilité accrue est une piste à poursuivre

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Les maladies dégénératives de la rétine sont une des causes principales de cécité. Parmi différentes stratégies thérapeutiques actuellement étudiées, notre équipe s’intéresse au potentiel régénératif de la rétine. Une source cellulaire d'intérêt sont les cellules de Müller, principal type de cellules gliales de la rétine, capables de se réactiver en cas de dégénérescence et d’adopter certaines caractéristiques de cellules souches. Elles entrent alors dans un état appelé gliose réactive. Tandis que chez certaines espèces comme le poisson, elles permettent la régénération de la rétine, elles ont des capacités régénératives très limitées et inefficaces chez les mammifères. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires régissant la gliose réactive des cellules de Müller est donc essentielle si l’on veut identifier des cibles thérapeutiques capables de stimuler le potentiel de régénération de ces cellules. Dans ce contexte, le but de mon projet de thèse a été d’étudier le rôle du co-facteur de transcription YAP dans la réactivation des cellules de Müller. Cette protéine est l’effecteur de la voie de signalisation Hippo, connue pour son implication dans la régulation des cellules souches et la régénération de certains organes.Dans un premier temps, nous avons réalisé une analyse transcriptomique qui a montré que la voie Hippo/YAP est une des principales voies dérégulées dans un modèle de dégénérescence rétinienne chez la souris. Nous avons ensuite montré que la protéine YAP est spécifiquement exprimée dans les cellules de Müller et que son expression et son activité transcriptionnelle sont augmentées au cours de la dégénérescence lorsque les cellules de Müller deviennent réactives. Ces données suggèrent pour la première fois un lien entre YAP et la gliose réactive dans la rétine. Par conséquent, dans un second temps, mon projet de thèse a consisté en l’étude fonctionnelle de YAP dans les cellules de Müller. Dans ce but, nous avons généré par croisements chez la souris un modèle inductible de délétion du gène Yap spécifiquement dans ces cellules. Ce modèle a permis de montrer qu’en absence de Yap en conditions physiologiques, plusieurs gènes spécifiques des cellules de Müller sont dérégulés, suggérant un dysfonctionnement de ces cellules. L’étude phénotypique a permis de révéler que ces dérégulations moléculaires conduisent à un vieillissement prématuré des cellules de Müller et à une baisse de la vision chez les souris âgées. Ces données suggèrent que YAP est requis pour le fonctionnement normal des cellules gliales de Müller. Nous avons ensuite examiné l’impact de la perte de Yap dans les cellules de Müller en conditions de dégénérescence des photorécepteurs. Une analyse transcriptomique a permis de montrer que différents aspects de la réponse moléculaire des cellules de Müller réactives sont affectés. Parmi les processus biologiques dérégulés, nous nous sommes intéressés à la régulation de la prolifération cellulaire. Nous avons montré que YAP est nécessaire à l’augmentation de l’expression de gènes associés à la réentrée dans le cycle cellulaire de la glie de Müller. Par ailleurs, nos résultats suggèrent que des composants de la voie de signalisation EGFR, connue pour son rôle central dans la réactivation des cellules de Müller, sont régulés par YAP.Dans l’ensemble, ces résultats révèlent l’importance de YAP (i) dans le fonctionnement des cellules de Müller en conditions physiologiques pour maintenir l’homéostasie rétinienne, et (ii) dans la régulation des processus de réactivation de ces cellules en conditions dégénératives. De plus, ces données permettent de proposer un modèle selon lequel YAP serait impliqué dans le contrôle de la réentrée des cellules de Müller dans le cycle cellulaire via une interaction avec la voie de signalisation EGFR. Ce travail a donc contribué à approfondir nos connaissances du réseau de signalisation impliqué dans la réactivation des cellules de Müller de la rétine des mammifères. / Retinal dystrophies are one of the main causes of blindness. Among the different therapeutic strategies currently studied, our team is interested in the regenerative potential of endogenous retinal cells. A cellular source of interest are Müller cells, which are the main type of glial cells in the retina. These cells are able to reactivate in case of retinal degeneration and adopt various characteristics of stem cells. They enter a state called reactive gliosis. While in some species such as the fish, they allow the complete regeneration of the retina, they have very limited and ineffective regenerative capacities in mammals. Increasing our knowledge of the complex molecular response of Müller cells to retinal degeneration is thus essential for the development of promising new therapeutic strategies. In this context, the aim of my thesis project was to study the role of the co-transcription factor YAP in Müller cells reactivation. This protein is the main effector of the Hippo signaling pathway which is a crucial player in the field of stem cell biology and regeneration.As a first step, we performed a transcriptomic analysis, which revealed that the Hippo/YAP pathway is one of the main signaling deregulated in a mouse model of photoreceptor degeneration. In particular, we found that YAP is specifically expressed in Müller cells and strongly upregulated upon retinal degeneration, when these cells are reactivated. We thus uncovered for the first time a link between the Hippo/YAP pathway and reactive gliosis in the retina. Consequently, the second part of my thesis project was to undertake a functional study of YAP in Müller cells. For this purpose, we generated, by crossing, a mouse model allowing for Yap conditional knockout specifically in these cells. This model allowed us to show that Yap deletion leads to deregulation of several Müller cell specific genes. A phenotypic analysis revealed that these molecular deregulations lead to premature aging of Müller cells and visual defects in old mice. These results suggest that YAP is required for normal function of Müller glial cells. We then studied the impact of Yap deletion in Müller cells under degenerative conditions. A transcriptomic analysis revealed that various aspects of the molecular response of reactive Müller cells are affected in the absence of Yap. Among the deregulated biological processes, we focussed in particular in the regulation of cell proliferation. We found that YAP is required to trigger cell cycle gene upregulation that occurs in Müller glial cells following photoreceptor cell death. Furthermore, our results suggest that some components of the EGFR signaling pathway, which is known for its central role in the reactivation of Müller cells in pathological conditions, are regulated by YAP in Müller cells.Taken together, these results highlight the importance of YAP (i) in Müller cell function under physiological conditions to maintain retinal homeostasis, and (ii) in the regulation of Müller cell reactivation process under degenerative conditions. Moreover, these data allow us to propose a model in which YAP would be involved in the control of Müller glia cell cycle re-entry through its interaction with the EGFR signaling pathway. Therefore, this work has contributed to increase our knowledge of the signaling network involved in the reactivation of Müller cells in the mammalian retina.

Protein SUMOylation is a highly dynamic and reversible post-translational modification that targets lysine residues on a wide range of proteins involved in several essential cellular events, including protein translocation and degradation, mitotic chromosome segregation, DNA damage response, cell cycle progression, cell proliferation, and migration. Protein SUMOylation is an ATP-dependent enzymatic process that involves an E1 activating enzyme SAE1/2, a E2 conjugase UBC9, and usually facilitated by SUMO E3 ligases. The SP-RING family is the largest family of SUMO E3 ligases, encompassing seven mammalian protein inhibitor of activated STAT (PIAS) proteins. PIAS family was originally identified as specific inhibitors for signal transducer and activator of transcription (STAT), which involves gene transcriptional regulation. Recent studies showed that PIAS proteins also play important roles in the regulation of protein stability and signal transduction through the SUMOylation of target substrates. In addition, PIAS-mediated protein SUMOylation is also involved in several cellular processes, including DNA damage repair, immune response, cellular proliferation, and motility. Most notably, PIAS proteins are highly expressed in different cancer types and have been implicated in tumorigenesis. Several reports suggest that PIAS proteins could promote cancer cell growth and progression by regulating the SUMOylation of different substrates. To date, a number of substrates of PIAS ligases have been identified from several individual studies, and hundreds of specific SUMO E3 ligase substrates were identified from a human proteome microarray-based activity screen. However, how these substrates are selected, and which SUMOylation sites are targeted by these PIAS are still unknown. To answer these questions, I started my investigation with PIAS1, one of the most well studied SUMO E3 ligases. By changing the expression level of PIAS1 in HeLa cells using gene overexpression or CRISPR/Cas9 gene knockout, I found PIAS1 had a physiological impact on cell proliferation and migration. I took advantage of the previously developed SUMO proteomics workflow to quantitatively profile global SUMOylome changes upon PIAS1 overexpression in a site-specific manner. I identified 983 SUMO sites on 544 proteins, of which 62 proteins were assigned as putative PIAS1 substrates. In particular, Vimentin (VIM), a type III intermediate filament protein involved in cytoskeleton organization and cell motility, was identified as PIAS1 substrates. Two SUMOylation sites mediated by PIAS1 at Lys-439 and Lys-445 residues were further evaluated and found to be necessary for dynamic disassembly and assembly of vimentin intermediate filaments, which further regulates cell migration and motility. In the second study, I extended my investigation to all PIAS ligases and further found that all PIAS proteins impact cell proliferation and migration of breast cancer cell MDA-MB-231 after CRISPR/Cas9 gene knockout. I further optimized my SILAC-based quantitative SUMO proteomics approach and combined it with transcriptomics to gain a system-level understanding of the functional components involved in PIAS regulatory networks. A large subset of proteins/ genes involved in cell proliferation and migration were commonly regulated by all PIAS proteins, suggesting a redundancy of regulation within the PIAS family. In addition, each PIAS regulated a unique pool of substrates/genes involved in different cellular processes, such as DNA damage repair, chromatin remodeling, and SUMO chain formation, suggesting that each PIAS specifically regulates cellular functions. The trans-scale analyses between proteomics and transcriptomics shed light on the comprehensive pictures of the regulation networks by PIAS proteins beyond their direct enzymatic activity. Overall, the quantitative SUMO proteomics approach provided a robust method for identifying substrates of PIAS SUMO E3 ligases. The combination of proteomic and transcriptomic analyzes made it possible to draw up a global portrait of the regulatory mechanisms governed by the PIAS proteins. / La SUMOylation des protéines est une modification post-traductionnelle se produisant sur des lysines d’un large éventail de protéines cellulaires. Cette modification est dynamique et régit plusieurs évènement cellulaires essentiels, dont la translocation et la dégradation des protéines, la ségrégation chromosomique mitotique, la réparation de l'ADN, la progression du cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et la migration. La conjugaison de la protéine SUMO sur son substrat se produit grâce à une triade enzymatique regroupant l’enzyme d’activation E1 SAE 1/2, la conjugase E2 UBC9 et dans la plupart des cas une ligase SUMO E3. Cette cascade enzymatique nécessite une source d’ATP pour son initiation. Parmi la famille des ligases SUMO E3, on retrouve un domaine spécifique nommé SP-RING présent chez une sous population de celles-ci. Parmi ces ligases on retrouve 7 protéines inhibitrices des protéines STAT activées regroupees sous le nom de PIAS. Les ligases PIAS ont été identifiées à l'origine comme des inhibiteurs spécifiques des protéines STAT responsable du signal de transduction et de l’activation de la transcription génique. Des études récentes ont montré que les protéines PIAS jouent également un rôle important sur la stabilité de leurs substrats et la transduction de leur signal. De plus, les substrats SUMOylés par les PIAS sont impliqués dans plusieurs processus cellulaires, notamment la réparation des dommages à l'ADN, la réponse immunitaire, la prolifération et la motilité cellulaire. Ces divers processus cellulaires peuvent être déréglés et entrainer le développement du cancer. Il s’avère que les protéines PIAS sont fortement exprimées dans divers types de cancer et sont impliquées dans la tumorigenèse. Plusieurs rapports suggèrent que les protéines PIAS pourraient favoriser la croissance et la progression des cellules cancéreuses en régulant le niveau de SUMOylation de plusieurs substrats. Initialement, les substrats des ligases PIAS ont été identifiés à partir de plusieurs études individuelles et plus récemment, des centaines de substrats spécifiques de la SUMO E3 ligase ont été identifiés à partir de criblage de micropuces à protéines interrogeant le protéome humain. Cependant, la manière dont ces substrats sont sélectionnés et quels sont les sites de SUMOylation ciblés par ces PIAS demeurent encore méconnus. Afin d’aborder ces questions, j’ai commencé mon étude avec PIAS1, l'une des ligases SUMO E3 les plus étudiées. Pour ce faire, j’ai varié le niveau d'expression de PIAS1 dans des cellules iv HeLa selon l’approche CRISPR/Cas9. Ainsi, deux modèles ont été construit, soit via une surexpression du gène ou via un knockout du gène. Ces mutants ont permis de constater que PIAS1 avait un impact physiologique sur la prolifération et la migration des cellules. J’ai tiré avantage d’une méthode protéomique précédemment développé sur les peptides SUMO pour déterminer les changements de SUMOylation lors de la surexpression de PIAS1. J’ai identifié 983 sites SUMO sur 544 protéines, dont 62 protéines ont été identifiées comme substrats potentiels de PIAS1. Parmi celles-ci, la vimentine (VIM), une protéine de la famille des filaments intermédiaire de type III impliquée dans l'organisation du cytosquelette et la motilité cellulaire, a été reconnu comme un substrat de PIAS1. Afin de valider le rôle de la SUMOylation des lysines Lys-439 et Lys-445 de VIM j’ai effectué des études fonctionelles de motilité cellulaire avec les mutants où ces sites ont été substitués en arginine. Ces expériences m’ont permis de constater que la SUMOylation de VIM aux sites Lys-439 et Lys-445 est nécessaire à l’assemblage et désassemblage dynamique des filaments intermédiaires de VIM, lesquels regulent la migration et la motilité cellulaire. Dans la deuxième étude, j’ai élargi mon recherche sur toutes les ligases PIAS et avons découvert que ces dernières avaient toutes un impact sur la prolifération cellulaire et la migration des cellules du cancer du sein MDA-MB-231 suite à un knockout de ces gènes par CRISPR / Cas9. De plus, j’ai optimisé mon approche de protéomique quantitative SUMO via SILAC et l'avons complémenté d’une analyse transcriptomique. Cette combinaison a permis d’acquérir une compréhension des composants fonctionnels impliqués dans les réseaux de régulation PIAS. Il s’avère qu’un grand sous-ensemble de gènes / protéines impliqués dans la migration et la prolifération des cellules sont régulés par tous les membres de la famille PIAS, et suggère une certaine redondance fonctionnelle parmi ces ligases. De plus, chaque PIAS régule un ensemble unique de substrats / gènes impliqués dans plusieurs processus cellulaires différents, tels que la réparation des dommages de l'ADN, le remodelage de la chromatine et la formation de la chaîne SUMO. Ces résultats suggèrent que chacune des PIASs régule de façon spécifique les fonctions cellulaires. La combinaison des analyses protéomiques et transcriptomiques ont permi de dresser un portrait global des mécanismes de régulation régit par les protéines PIAS et ce au-delà de leur activité enzymatique directe.

Staufen1 (STAU1) est une protéine de liaison à l’ARN essentielle dans les cellules non-transformées. Dans les cellules cancéreuses, le niveau d’expression de la protéine est critique et étroitement lié à des évènements d’apoptose et des altérations dans la prolifération cellulaire. Le dsRBD2 de STAU1 lie des facteurs protéiques qui sont fondamentaux pour les fonctions de la protéine, telles que la liaison aux microtubules qui garantit sa localisation au fuseau mitotique et l’interaction avec les coactivateurs de l’E3 ubiquitine-ligase APC/C, ce qui garantit la dégradation partielle de STAU1 en mitose. Nous avons cartographié un nouveau motif F39PxPxxLxxxxL50 (motif FPL) dans le dsRBD2 de STAU1. Ce motif est fondamental pour l’interaction de la protéine avec les co-activateurs de l’APC/C, CDC20 et CDH1, et sa dégradation subséquente. Nous avons ensuite identifié un total de 15 protéines impliquées dans le processus inflammatoire qui partagent cette séquence avec STAU1. Nous avons prouvé, par des essais de co-transfection et de dégradation, que MAP4K1, l’une des protéines qui partagent ce motif, est aussi dégradé via ce motif FPL. Cependant, le motif de MAP4K1 n’est pas la cible de l’APC/C. Des techniques de biotinylation des protéines à proximité de STAU1 nous ont permis d’identifier TRIM25, une E3 ubiquitine ligase impliquée dans la régulation immunitaire et l’inflammation, comme protéine impliquée dans la dégradation de STAU1 et de MAP4K1 via le motif FPL. Ceci suggère des rôles de STAU1 dans la régulation du processus inflammatoire, ce qui est consistent avec des études récentes qui associent STAU1 à ce processus. Nous considérons que le motif FPL pourrait être à la base de la coordination de la régulation des protéines impliquées dans l’inflammation et la régulation de la réponse immune. Nos études sur l’effet anti-prolifératif de STAU1 lorsque surexprimé dans les cellules transformées ont identifié le domaine dsRBD2 de STAU1 comme responsable de ce phénotype. Des mutants qui miment les différents états de phosphorylation de la serine 20, située dans le domaine dsRBD2, sont à la base des changements dans la régulation de la traduction et la dégradation des ARNm liés à STAU1. Ces changements dans la régulation des ARNm par STAU1 sont associés aux altérations dans la prolifération des cellules transformées observées lors de la surexpression de STAU1. Nous avons aussi découvert que, après la transfection de STAU1, la cellule déclenche rapidement des évènements d’apoptose, et que ces évènements sont aussi dépendants de l’état de phosphorylation de la sérine 20 dans dsRBD2 de STAU1. Ces résultats suggèrent que STAU1 est un senseur qui contrôle la balance entre la survie et la prolifération cellulaire et que l’état de phosphorylation de son dsRBD2 est à la base de ce contrôle. Nos résultats indiquent que le dsRBD2 de STAU1 est le domaine de régulation du niveau d’expression protéique et un modulateurs des rôles de la protéine comme facteur post-transcriptionnel. Nous pensons que cibler la régulation de STAU1 et ses fonctions situées dans son domaine dsRBD2, serait important dans l’étude des maladies qui impliquent des événements d’apoptose, d’inflammation et de prolifération cellulaire telles que le cancer. / Staufen1 (STAU1) is an RNA-binding protein essential in untransformed cells. In cancer cells, the level of expression of the STAU1 protein is critical and it has been closely linked to events of apoptosis and to cell proliferation impairments. STAU1's dsRBD2 binds protein factors that are fundamental for the protein's functions, such as microtubules components that ensure the protein localization to the mitotic spindle and its interaction with E3 ubiquitin-ligase APC/C coactivators, which guarantees the partial degradation of STAU1 during mitosis. By mapping a novel F39PxPxxLxxxxL50 motif (FPL motif) in the dsRBD2 of STAU1, responsible of the interaction with the co-activators of APC/C, CDC20 and CDH1, and its subsequent degradation, we were able to identify a total of 15 proteins mostly involved in the inflammatory process that share this sequence with STAU1. We proved, by co-transfection and degradation assays that, MAP4K1, one of the proteins that shares this motif, is also degraded via this FPL motif. However, we demonstrated that this motif on MAP4K1 is not the target of APC/C. Biotinylation techniques of proteins near STAU1 allowed us to identify TRIM25, an E3 ubiquitin ligase involved in immune regulation and inflammation, as a protein involved in the degradation of STAU1 and MAP4K1 via the FPL motif. This suggests roles of STAU1 in the regulation of the inflammatory events, which is consistent with recent studies that associate STAU1 with this process. We consider that the FPL motif could be at the basis of the coordination of the regulation of proteins involved in inflammation and the regulation of the immune response. Our studies on the anti-proliferative effect of STAU1 when overexpressed in transformed cells identified the domain dsRBD2 of STAU1 as responsible for this phenotype. Mutants 8 that mimic different phosphorylation states of serine 20, located in dsRBD2, underlie changes in the regulation of translation and degradation of STAU1-linked mRNAs. These STAU1-dependent changes in mRNA regulation are associated with the proliferation impairment of transformed cells that is observed upon overexpression of STAU1. We also discovered that, after STAU1 transfection, the cell rapidly triggers apoptotic events, and that these events are also dependent on the phosphorylation state of serine 20 in dsRBD2 of STAU1. These results suggest that STAU1 is a sensor that controls the balance between cell survival and cell proliferation and that the state of phosphorylation of its dsRBD2 is the basis of this control. Our results indicate that the dsRBD2 of STAU1 is the regulatory domain of the level of protein expression and a modulator of the protein roles as a post-transcriptional factor. We believe that targeting the regulation of STAU1 and its functions located in its dsRBD2 domain, would be important in the study of diseases that involve apoptosis, inflammation and cell proliferation events such as cancer.