L'analyse cinétique d'interactions de protéines offre une multitude d'informations sur les fonctions physiologiques de ces molécules au sein de l'activité cellulaire, et peut donc contribuer à l'amélioration des diagnostics médicaux ainsi qu'à la découverte de nouveaux traitements thérapeutiques. La résonance plasmonique de surface (SPR) est la technique de biodétection optique de référence pour les études cinétiques d'interaction de molécules biologiques. Si la SPR offre une détection en temps réel et sans marquage, elle nécessite en revanche des équipements coûteux et sophistiqués ainsi que du personnel qualifié, limitant ainsi son utilisation au sein de laboratoires de recherche académiques. Dans ces travaux de thèse, nous avons développé une plateforme de biodétection basée sur l'utilisation de nanofentes biofonctionnalisées combinées avec une détection par microscopie à fluorescence. Ce système permet l'observation en temps réel d'interactions protéines-protéines et la détermination des constantes cinétiques associées, avec des temps de réponse optimisés et une excellente efficacité de capture. La fonctionnalité du système a été démontrée par l'étude des cinétiques d'interaction de deux couples modèles de différentes affinités : le couple streptavidine/biotine et le couple IgG de souris/anti-IgG de souris. Une très bonne cohérence entre les constantes cinétiques extraites, celles obtenues par des expériences similaires réalisées en SPR et les valeurs rapportées dans la littérature montre que notre approche pourrait être facilement applicable pour l'étude cinétique d'interactions de protéines avec une sensibilité allant jusqu'au pM, sur une large gamme de constantes de dissociation. De plus, nous avons intégré un générateur de gradient de concentrations microfluidique en amont de nos nanofentes, permettant ainsi des mesures simultanées de cinétiques d'interactions à différentes concentrations d'analyte en une seule expérience. Ce système intégré offre de nombreux avantages, tels qu'une réduction de la consommation des réactifs et des temps d'analyse par rapport aux approches séquentielles classiques. Cette technologie innovante pourrait ainsi être un outil précieux non seulement pour les domaines du biomédical et de la médecine personnalisée mais aussi pour la recherche fondamentale en chimie et biologie. / Kinetic monitoring of protein-protein interactions offers fundamental insights of their cellular functions and is a vital key for the improvement of diagnostic tests as well as the discovery of novel therapeutic drugs. Surface plasmon resonance (SPR) is an established biosensor technology routinely used for kinetic studies of biomolecular interactions. While SPR offers the benefits of real-time and label-free detection, it requires expensive and sophisticated optical apparatus and highly trained personnel, thus limiting the accessibility of standard laboratories. In this PhD project, we have developed an alternative and cost-effective biosensor platform exploiting biofunctionalized nanofluidic slits, or nanoslits, combined with a bench-top fluorescence microscope. Our approach enables the visualization of protein interactions in real-time with the possibility to determine associated kinetic parameters along with optimized response times and enhanced binding efficiency. We have demonstrated the effectiveness of our devices through kinetic studies of two representative protein-receptor pairs with different binding affinities: streptavidin-biotin and mouse IgG/anti-mouse IgG interactions. Good agreement of extracted kinetic parameters between our device, SPR measurements and literature values indicated that this approach could be readily applicable to study kinetics of protein interactions with sensitivity down to 1 pM on a large scale of dissociation constants. In addition, we have incorporated a microfluidic gradient generator to our validated nanoslit device, which has allowed one-shot parallel kinetic measurements to be realized in a single-experiment. This integrated system provides advantages of diminished material consumption and analysis time over the conventional kinetic assays. We believe that this innovative technology will drive future advancements not only in the discipline of biomedical and personalized medicine, but also in basic chemical/biological research.

Le choc septique est une défaillance circulatoire aiguë déclenchée par un agent infectieux, entraînant des désordres hémodynamiques, métaboliques et viscéraux, en raison notamment de la libération de cytokines proinflammatoires. Le taux de mortalité est élevé (environ 40 %). L’évolution des sepsis sévères est souvent compliquée par des phénomènes thrombotiques qui résultent en partie de l’activation de la coagulation par les agents infectieux, mais aussi de la libération de Neutrophil Extracellular Traps (NETs) par les polynucléaires neutrophiles. Ainsi, chez ces patients, une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) est souvent observée, caractérisée par un état d’équilibre instable, où co-existent un risque thrombotique et un risque hémorragique, dû à la consommation des facteurs de coagulation.Plusieurs études ont suggéré que l’administration d’antithrombine (AT) ou de Protéine C activée diminuait la mortalité, non seulement en diminuant l’activation de la coagulation, mais aussi en ayant des effets cytoprotecteurs et anti-inflammatoires indépendants de leur activité anti-coagulante. Toutefois, leurs effets cytoprotecteurs nécessitent l’administration de doses élevées, responsables d’hémorragies.L’inhibiteur dépendant de la protéine Z (ZPI), appartient à la superfamille des serpines, comme l’AT, mais n’inhibe que les facteurs Xa (FXa) et XIa (FXIa). L’inhibition du FXa est potentialisée par la Protéine Z (PZ), un facteur vitamine K-dépendant, qui circule dans le plasma lié au ZPI. Dans un modèle en sang total, j’ai observé que le ZPI exerce un effet inhibiteur sur la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF-α) en réponse au lipopolysaccharide (LPS). A forte concentration (4 fois la concentration physiologique), l’effet anti-inflammatoire (EAI) du ZPI n’est pas modifié par l’ajout de PZ ou d’héparine non fractionnée, qui majorent l’effet anticoagulant du ZPI. De plus, l’EAI persiste avec un variant de ZPI muté sur son site actif (ZPI Y387A), suggérant que le ZPI possède un EAI indépendant de son activité anticoagulante. In vitro, en sang total, le ZPI augmente précocement la production de CCL-5, une chimiokine ayant des propriétés anti-inflammatoires. Ces observations ont été confirmées dans un modèle d’endotoxinémie in vivo, chez la souris, en injectant par voie intra-péritonéale du LPS. Les souris qui avaient reçu simultanément du ZPI recombinant humain ont un taux plasmatique plus faible d’IL-6 et de TNF α que les souris contrôles et un taux plus élevé de CCL-5 dans le lavage péritonéal.De plus, nous avons mis en évidence, en milieu purifié, que l’élastase neutrophile, une enzyme libérée à la surface des NETs induisait plusieurs clivages du ZPI. Le premier clivage se produit au niveau de la boucle réactive du ZPI, qui perd alors son activité inhibitrice sur les FXa et FXIa. La PZ ne protège pas le ZPI de sa dégradation par l’élastase. La dégradation du ZPI induite par les NETs pourrait participer à leurs propriétés procoagulantes.Enfin, en collaboration avec l’équipe du Service de Réanimation du CHU de Strasbourg, nous avons étudié les variations des taux plasmatiques de PZ et ZPI chez 100 patients atteints de sepsis sévère. Dans les premières 24 heures, nous avons observé une diminution du taux de PZ par rapport à une groupe de sujets sains, et à l’inverse, une augmentation d’environ 2,5 fois du taux de ZPI. Ce taux élevé de ZPI persiste à J3 et J7, alors que le taux de PZ augmente. Les variations de PZ ou ZPI ne sont pas prédictifs de la mortalité à 30 jours ni de l’apparition d’une CIVD.Ces résultats suggèrent que des doses élevées de ZPI (4 fois la concentration physiologique) pourraient constituer un traitement adjuvant du choc septique, en diminuant la production de cytokines pro-inflammatoires, avec un risque hémorragique faible, puisque l’inhibition du FXIa a des activités antithrombotiques dépourvues de risque hémorragique. / Septic shock is an acute circulatory failure caused by an infectious agent, resulting in hemodynamic, metabolic and visceral disorders, in particular due to pro-inflammatory cytokines. The mortality rate is high (about 40 %). Progression of severe sepsis is often complicated by thrombotic events, in part because of a direct coagulation activation by bacteria, but also because of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) released by polymorphonuclear neutrophils. Disseminated intravascular coagulation (DIC) is frequently present in these patients, characterized by an unstable equilibrium, where thrombotic and bleeding risks coexist, due to the consumption of coagulation factors.Several studies suggested that administration of coagulation inhibitors, such as antithrombin (AT) or activated Protein C, decreased mortality, not only by preventing the activation of coagulation, but also through their cytoprotective and anti-inflammatory effects, independent of their anticoagulant activity. However, the cytoprotective effects require the administration at very high doses, leading to a bleeding tendency.The protein Z-dependent protease inhibitor (ZPI) belongs to the serpin superfamily, as AT, but in contrast to AT, inhibits only factors Xa (FXa) and XIa (FXIa) of coagulation. FXa inhibition by ZPI is potentiated by Protein Z (PZ), a vitamin K-dependent factor, which circulates in plasma in a complex with ZPI. In a whole blood model, I observed that ZPI exerts an inhibitory effect on lipopolysaccharide (LPS)-induced pro-inflammatory cytokines production (IL-6 and TNF-α). At high concentration (4 times physiological concentration), ZPI anti-inflammatory effect (AIE) is not modified by PZ or unfractionned heparin, which increase ZPI anticoagulant activity. Moreover, this AIE is still present using a reactive center loop variant of ZPI (ZPI Y387A), suggesting that the AIE of ZPI is independent of its anticoagulant activity. In vitro, in whole blood, ZPI induced an early increased of CCL-5, a chemokine with anti-inflammatory properties. These data are confirmed in vivo in a murine model of endotoxin shock where LPS is injected intraperitoneally. Simultaneously injection of recombinant human ZPI (rhZPI) with LPS led to lower plasma levels of IL-6 and TNF-α than in control mice, whereas higher CCL-5 levels were observed in peritoneal lavages.In addition, using purified proteins, we have shown that neutrophil elastase, an enzyme which decorates NETs, induces several cleavages of rhZPI. A quick and first cleavage is observed on the reactive centre loop of ZPI, inducing a loss of inhibitory activity towards FXa and FXIa. PZ does not protect ZPI from elastase degradation. ZPI proteolysis induced by NETs could contribute to their procoagulant activity.Lastly, in collaboration with the intensive care unit of Strasbourg Hospital, we studied plasma levels of PZ and ZPI in 100 patients with severe sepsis. During the first 24 hours, there was a significant decrease of plasma PZ levels, compared to levels of healthy subjects, whereas an approximately 2.5 times increase was observed for ZPI levels. These high levels of ZPI were still present at D3 and D7, whereas PZ levels regularly increased. Variations of PZ and ZPI levels were not predictive of the 30-day mortality rate, and not associated with DIC development.These results suggest that elevated concentrations of ZPI (4 times physiological concentration) could be an adjuvant therapy to septic shock, by decreasing pro-inflammatory cytokines production, but devoid of bleeding risk, since FXIa inhibition has antithrombotic activity without inducing haemorrhages.

Les interactions protéine-protéine sont souvent contrôlées par de petits domaines protéiques qui régulent les chemins de signalisation au sein des cellules eucaryotes. Les domaines PDZ sont parmi les domaines les plus répandus et les plus étudiés. Ils reconnaissent spécifiquement les 4 à 10 acides aminés C-terminaux de leurs partenaires. Tiam1 est un facteur d'échange de GTP de la protéine Rac1 qui contrôle la migration et la prolifération cellulaire et dont le domaine PDZ lie les protéines Syndecan-1 (Sdc1), Caspr4 et Neurexine. Des petits peptides ou des molécules peptidomimétiques peuvent potentiellement inhiber ou moduler son activité et être utilisés à des fins thérapeutiques. Nous avons appliqué des approches de dessin computationnel de protéine (CPD) et de calcul d'énergie libre par simulations dynamique moléculaire (DM) pour comprendre et modifier sa spécificité. Le CPD utilise un modèle structural et une fonction d'énergie pour explorer l'espace des séquences et des structures et identifier des variants protéiques ou peptidiques stables et fonctionnels. Nous avons utilisé le programme de CPD Proteus, développé au laboratoire, pour redessiner entièrement le domaine PDZ de Tiam1. Les séquences générées sont similaires à celles des domaines PDZ naturels, avec des scores de similarité et de reconnaissance de pli comparables au programme Rosetta, un outil de CPD très utilisé. Des séquences contenant environ 60 positions mutées sur 90, ont été testées par simulations de DM et des mesures biophysiques. Quatre des cinq séquences testées expérimentalement (par nos collaborateurs) montrent un dépliement réversible autour de 50°C. Proteus a également déterminer correctement la spécificité de la liaison de quelques variants protéiques et peptidiques. Pour étudier plus finement la spécificité, nous avons paramétré un modèle d'énergie libre semi-empirique de Poisson-Boltzmann ayant la forme d'une énergie linéaire d'interaction, ou PB/LIE, appliqué à des conformations issues de simulations de DM en solvant explicite de complexes PDZ:peptide. Avec trois paramètres ajustables, le modèle reproduit correctement les affinités expérimentales de 41 variants, avec une erreur moyenne absolue de 0,4~kcal/mol, et donne des prédictions pour 10 nouveaux variants. Le modèle PB/LIE a ensuite comparé à la méthode non-empirique de calcul d'énergie libre par simulations alchimiques, qui n'a pas de paramètre ajustable et qui prédit correctement l'affinité de 12 complexes Tiam1:peptide. Ces outils et les résultats obtenus devraient nous permettre d'identifier des peptides inhibiteurs et auront d'importantes retombées pour l'ingénierie des interactions PDZ:peptide. / Small protein domains often direct protein-protein interactions and regulate eukaryotic signalling pathways. PDZ domains are among the most widespread and best-studied. They specifically recognize the 4-10 C-terminal amino acids of target proteins. Tiam1 is a Rac GTP exchange factor that helps control cellmigration and proliferation and whose PDZ domain binds the proteins syndecan-1 (Sdc1), Caspr4, and Neurexin. Short peptides and peptidomimetics can potentially inhibit or modulate its action and act as bioreagents or therapeutics. We used computational protein design (CPD) and molecular dynamics (MD) free energy simulations to understand and engineer its peptide specificity. CPD uses a structural model and an energy function to explore the space of sequences and structures and identify stable and functional protein or peptide variants. We used our in-house Proteus CPD package to completely redesign the Tiam1 PDZ domain. The designed sequences were similar to natural PDZ domains, with similarity and fold recognition scores comarable to the widely-used Rosetta CPD package. Selected sequences, containing around 60 mutated positions out of 90, were tested by microsecond MD simulations and biophysical experiments. Four of five sequences tested experimentally (by our collaborators) displayed reversible unfolding around 50°C. Proteus also accurately scored the binding specificity of several protein and peptide variants. As a more refined model for specificity, we parameterized a semi-empirical free energy model of the Poisson-Boltzmann Linear Interaction Energy or PB/LIE form, which scores conformations extracted from explicit solvent MD simulations of PDZ:peptide complexes. With three adjustable parameters, the model accurately reproduced the experimental binding affinities of 41 variants, with a mean unsigned error of just 0.4 kcal/mol, andgave predictions for 10 new variants. The PB/LIE model was tested further by comparing to non-empirical, alchemical, MD free energy simulations, which have no adjustable parameters and were found to give chemical accuracy for 12 Tiam1:peptide complexes. The tools and insights obtained should help discover new tight binding peptides or peptidomimetics and have broad implications for engineering PDZ:peptide interactions.

Le réovirus de mammifères est un virus oncolytique à l’étude pour sa capacité à infecter et détruire préférentiellement les cellules cancéreuses. Les liens entre le potentiel oncolytique du réovirus et son induction des voies de signalisation de l’interféron méritent des éclaircissements. Encore à ce jour, les déterminants viraux et les composantes cellulaires impliqués dans la réponse interféron lors de l’infection par ce virus demeurent à être mieux caractérisés. Des virus mutants ont préalablement été générés à partir d’un virus fortement inducteur d’interféron (T3DK) dans le fond génétique d’un virus faiblement inducteur d’interféron (T3DS) afin d’étudier les effets de certains polymorphismes. Cependant, les mécanismes de ces déterminants viraux et comment leurs polymorphismes les modifient pour amplifier ou restreindre l’induction d’interféron sont encore incertains. Notre approche a permis de révéler que les protéines μ2 et λ1 du réovirus modulent les événements précoces menant à la reconnaissance virale et à la réponse interféron. Nous avons découvert que le phénotype d’induction d’interféron sous l’effet de μ2, λ1 ou μ2 et λ1 provenant de T3DK était corrélé entre les niveaux protéiques et transcriptionnels. De plus, la présence simultanée de μ2 et λ1 (de T3DK) avait un effet synergique provoquant des niveaux d’interféron plus qu’additifs par rapport à la présence de μ2 ou de λ1 seuls. D’autre part, la transfection d’ARN extrait tôt de cellules infectées (mais pas celle d’ARN extrait tardivement) provoque une induction d’interféron qui suit cette même tendance. Par conséquent, les résultats démontrent que plusieurs protéines du réovirus pourraient s’acquitter de rôles multiples qui convergent vers la modulation de la réponse interféron. Cela laisse paraître les rôles envisageables de μ2 et λ1 dans le désassemblage, la participation à l’exposition du génome viral et/ou dans la contribution au sein du complexe de transcription viral. L’analyse comparative de virus mutants conçus par génétique inverse et qui sont à même de contrôler la réponse interféron semble une piste intéressante pour mieux appréhender les implications des polymorphismes dont ils sont porteurs. Cette approche pourrait fournir une meilleure compréhension du réovirus et être utile dans la perspective d’optimisation du potentiel oncolytique du réovirus. / The mammalian reovirus is an oncolytic virus under study for its ability to preferentially infect and destroy cancer cells. The links between the oncolytic potential of reovirus and its induction of interferon signaling pathways require clarification. Still to this day, the viral determinants and cellular components involved in the interferon response upon infection with this virus remain to be better characterized. Mutant viruses were previously generated from a high interferon-inducing virus (T3DK) in the genetic background of a low interferon-inducing virus, (T3DS) to study the effect of certain polymorphisms. However, the mechanisms of these viral determinants and how their polymorphism modify them to amplify or limit interferon induction are still unclear. Our approach revealed that the μ2 and λ1 proteins modulate early events leading to viral recognition and interferon response. We found that the phenotype of interferon induction under the effect of μ2, λ1 or μ2 and λ1 from T3DK showed a correlation between protein and transcriptional levels. Furthermore, the simultaneous presence of μ2 and λ1 (from T3DK) had a synergistic effect causing more than additive interferon levels compared with the presence of μ2 or λ1 alone. On the other hand, transfection of RNA extracted from early-infected cells (but not RNA extracted from late-infected cells) caused interferon induction following this same trend. Therefore, the results demonstrate that several proteins from reovirus could have multiple roles that converge to modulate the interferon response. This suggests potential roles for μ2 and λ1 in disassembly, participation in viral genome exposure, and/or contribution within the viral transcription complex. The comparative analysis of mutant viruses engineered by reverse genetics, and which are able to modulate the interferon response, would be an interesting avenue to better understand the implications of the polymorphisms they carry. This approach could provide a better understanding of the reovirus and be useful in the perspective of optimizing the oncolytic potential of this virus.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'algue unicellulaire Gonyaulax polyedra est notre modèle pour l'étude des mécanismes reliant l'horloge interne aux rythmes circadiens observés. La bioluminescence, présente lors de la phase de nuit, ainsi que la division cellulaire observée au début de la phase de jour sont les deux rythmes sur lesquels porte la présente étude. Chez Gonyaulax, la présence des protéines LBP et luciférase, limitée à la phase obscure, permet la production de lumière. Une régulation au niveau de la traduction par une protéine inhibitrice CCTR se fixant en région 3 de l'ARNm LBP permet l'expression cyclique de la protéine LBP in vivo chez Gonyaulax polyedra . La construction d'une banque d'ADNc dans un vecteur d'expression constitutive (le p425 GPD) représente l'outil nécessaire pour l'isolation d'un ADNc codant pour la protéine CCTR. Cette isolation repose sur un mécanisme moléculaire d'interaction in vivo de la protéine CCTR avec la région régulatrice de l'ARNm lbp annexée à un gène létal inductible (le gène GSP1) dans la construction du plasmide pCS7. La transformation de levure possédant le pCS7 avec la banque d'ADNc permettrait la production de CCTR actif dans la levure et ainsi l'inhibition de la traduction de l'ARNm GSP1 par fixation du CCTR à la région régulatrice de lbp. Le criblage d'une banque d'ADNc comportant 2,8 x 105clones a été effectué. La croissance de 127 colonies a été observée lors du premier criblage de la banque. Chaque colonie a été soumise à une extraction d'ADN plasmidique et les plasmides obtenus ont été utilisés pour une seconde transformation dans les levures porteuses du pCS7. Le second criblage nous a permis de constater qu'aucun de ces positifs ne peut produire une protéine CCTR fonctionnelle. Une contamination par des levures d'une autre souche ou par une source de carbone permettant la croissance (telle que le glucose), une présence de "révertants" ou le clonage d'un ADNc codant pour le facteur de sélection du pCS7 peuvent être à l'origine de ces "faux positifs" obtenus. La production de clones supplémentaires afin d'augmenter statistiquement les chances de représentation d'un gène impliqué dans la génération d'un rythme circadien, ainsi que la transformation répétée de la banque dans les mêmes cellules pour permettre de réunir les différentes composantes qui pourraient être nécessaires à la formation d'un CCTR actif, pourraient permettre d'isoler un ADNc codant pour une protéine CCTR active. Chez la majorité des dinoflagellés on observe la présence d'une phase S dans le cycle cellulaire. De plus, chez Gonyaulax, la division cellulaire est limitée à l'aurore. Il est donc probable que la protéine kinase p34œk2qui régule la formation de l'hétérodimère MPF (impliqué dans l'initiation de la division cellulaire) soit également sujette à une régulation par l'horloge circadienne. L'isolation d'un homologue de la protéine kinase p34ede2repose sur une technique de clonage par compensation d'une mutation. Les levures de la souche cdc28 ne peuvent se diviser normalement à température restrictive de 34°C à cause d'une mutation thermosensible de la protéine kinase p34edc2. La transformation de la banque d'ADNc construite dans des levures de cette souche, puis l'incubation à température restrictive, permet le criblage pour un homologue de la p34cdc2. Le premier criblage de la banque a permis la croissance de sept colonies qui ont toutes été soumises à une extraction d'ADN plasmidique puis à une retransformation dans les cellules de la souche cdc28. Aucun des positifs n'a franchi le seuil de ce second test. Le criblage de clones supplémentaires ou encore le criblage pour un homologue de la cycline (la seconde composante du MPF) pourrait permettre d'isoler directement ou indirectement l'homologue de la p34cdc2.

Le vieillissement croissant de la population canadienne aura une incidence, dans les années à venir, sur les risques de fractures ostéoporotiques et autres pathologies de l'os. Parmi ces risques, les fractures avec pertes osseuses présentent des défis considérables et causent un lourd fardeau économique. La société Ostéoporose Canada estime que plus de 30 milliards de dollars seront dépensés pour le traitement de l’ostéoporose et de leurs fractures associées d’ici 2018. La méthode de comblement des pertes osseuses standard actuelle, soit l'autogreffe, est limitée et présente des risques pour le patient. À titre d'alternative, deux stratégies ont été jusqu'à maintenant étudiées: les systèmes de libération de facteurs de croissance (« growth factor delivery systems », GFDS) et le développement de matériaux biomimétiques. Ces deux stratégies ont comme point commun l'utilisation de facteurs de croissance ostéogéniques comme les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs), telles la BMP-2 (référence commerciale) et la BMP-9. Malgré leur effet important, les BMPs restent couteuses à produire. Le laboratoire de N. Faucheux a développé un peptide (pBMP-9) dérivé de la BMP-9 qui possède un effet ostéogénique démontré, mais dont les mécanismes d’action et le comportement en système de libération restent à être étudiés. Les objectifs de ce projet de recherche ont donc porté sur l’étude du comportement de cellules osseuses préostéoblastes murins (MC3T3-E1) face à ces facteurs de croissance ainsi que sur le suivi et la modélisation des cinétiques de libération du pBMP-9 à partir d’une matrice de collagène, utilisée actuellement en clinique. Le mémoire possède ainsi trois volets. Le premier volet de ces travaux a consisté à faire une revue de la littérature sur le processus de régénération osseuse endochondrale afin de bien comprendre le rôle joué par les facteurs de croissance et cerner les défis de conception d’un GFDS utilisé en régénération osseuse. Les nouvelles approches de GFDS ont été revues en détail ainsi que les principaux modèles mathématiques développés et appliqués aux molécules thérapeutiques. Cette revue de la littérature a été publiée dans Journal of Controlled Release. Le second volet de ces travaux s’est penché sur l’étude et la modélisation mathématique des cinétiques de libération du pBMP-9 à partir d’hydrogels de collagène. Les résultats expérimentaux ont mené à la rédaction d’un article qui vient d’être accepté dans la revue Journal of Controlled Release. Cette étude consistait à évaluer les mécanismes de transfert de masse impliqués dans la libération pour différentes concentrations de pBMP-9 à partir d'hydrogels de collagène. Les cinétiques de libération ont été modélisées et ont montré la présence d'interactions importantes entre le pBMP-9 et les fibres de collagène. Le troisième volet a consisté à déterminer l'effet dose de la BMP-9 et de la BMP-2 sur la capacité des MC3T3-E1 à se différencier en présence ou en absence de sérum de veau foetal (« foetal bovine serum », FBS). Ces travaux ont conduit à la rédaction d’un article qui vient d’être accepté dans la revue Tissue Engineering Part A. La BMP-9 étant jusqu'alors mal comprise, l'étude s'est penchée sur cette protéine tout en ayant comme objectif de transposer les connaissances au pBMP-9. Les résultats ont démontré que les mécanismes d'action de la BMP-9 étaient très différents de ceux de la BMP-2 en présence de FBS. Les résultats ont également permis d'établir que, à l'instar de la BMP-2, la présence de FBS potentialise fortement l'effet ostéogénique de la BMP-9. Cet effet a d’ailleurs pu être récréé par l’IGF-2. Les conclusions de ce travail favoriseront le développement de systèmes de libération ostéogéniques plus efficaces.

Dans notre laboratoire, des études antérieures ont montré que la stimulation du récepteur AT[indice inférieur 2] par l'angiotensine II menait à l'activation des p42/p44[indice supérieur MAPK] (GENDRON et al., 1999) par une voie impliquant les protéines Rapt et B-Raf chez les cellules NG108-15 (GENDRON et al., 2003a) et que cette voie était nécessaire à l'élongation neuritique. Parallèlement à l'activation de la voie MAPK, il a été montré que le R-AT[indice inférieur 2] active la voie NOS/GCs/GMPc (GENDRON et al., 2002). Puisqu'il est connu que les protéines kinases C (PKC) participent à la différenciation neuronale dans certains types cellulaires, le but de mon travail a été de déterminer si les PKC pouvaient participer aux mécanismes initiaux menant à l'activation des voies précédemment décrites. Nos résultats indiquent que les isoformes [alpha], [epsilon], [iota] et [zéta] sont exprimées dans cette lignée cellulaire et que l'inhibiteur de PKC[alpha], le Gö6976, induit une élongation neuritique importante en plus d'une diminution de la prolifération. Lors de traitements courts avec l'Ang II, nos données indiquent qu'il y a translocation de PKC[alpha] de la membrane plasmique à la fraction soluble, entraînant ainsi son inactivation. De plus, le traitement des cellules avec le Gö6976 provoque l'inhibition de p21[indice supérieur ras] mais active Rap1 de façon similaire à l'Ang II. Par contre, l'inhibition de PKC[alpha] n'a pas d'effet sur la capacité de l'Ang II à activer les p42/p44 MAPK . L'ensemble de ces résultats indique que PKC[alpha] serait en amont de la cascade de signalisation des p42/p44[indice supérieur MAPK]. Ainsi, l'inhibition de PKC[alpha] mène à la diminution de l'activité de p21 ras et de la prolifération cellulaire, ce qui pourrait contribuer à favoriser l'activation de la voie menant à p42/p44[indice supérieur MAPK] et l'élongation neuritique. Les isoformes PKC[epsilon], et PKC[zéta] seraient impliquées dans des processus différents de PKC[alpha] puisque l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques sélectifs, soit le Gö6983 (inhibe PKC[alpha] et PKC[zéta] ou le GF109203X (inhibe PKC[alpha] et PKC[epsilon]), a montré qu'ils induisent l'élongation neuritique de façon similaire à l'Ang II ou l'inhibiteur de PKC[alpha]. En conditions basales, PKC[zéta] est associée à l'actine tandis que l'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] cause sa relocalisation dans le cytosol. Il pourrait s'agir d'un mécanisme de régulation de la polymérisation de l'actine. Pour sa part, l'isoforme [epsilon] semble impliquée dans la production de GMPc induite par le R-AT[indice inférieur 2]. De plus, la différenciation des cellules avec un traitement de 3 jours avec l'Ang II augmente l'association de PKC[epsilon] avec les microtubules. Cette isoforme pourrait être utile à la régulation de la ramification neuritique des cellules NG108-15. Ces résultats indiquent que les PKC sont impliquées dans la physiologie des cellules NG108-15, chacune ayant un rôle précis et distinct à jouer.

Les patients atteints d'une maladie vasculaire athérosclérotique (MVAS) devant subir une chirurgie vasculaire majeure sont à risque élevé de souffrir d'un évènement cardiaque lors de la période périopératoire. L'estimation de ce risque s'effectue au moyen d'indices cliniques de symptomatologie rarement spécifiques à la chirurgie vasculaire, puisque non valides auprès de cette clientèle. Nous avons investigué si l'évaluation préopératoire du risque de complications cardiaques postopératoires pouvait être améliorée par l'ajout d'un dosage de protéine C réactive (CRP). À partir d'une cohorte de 63 sujets atteints de MVAS et devant subir une chirurgie vasculaire majeure (endartérectomie, pontage des membres inférieurs et résection de d'anévrysme de l'aorte abdominale) élective, nous avons collecté le profil clinique et le profil de risque des individus ainsi que trois dosages sanguins de CRP. Le taux moyen de CRP de ces individus était de 4,91 mg/L ±8,24 [IC 95% 2,83-6,99] avec un taux médian de 2,34 mg/L. Durant la période de suivi allant jusqu'à 60 jours après la chirurgie, aucun décès ni aucun épisode d'angor instable ne furent détectés. Par contre, cinq patients (7,9%) ont souffert d'un infarctus du myocarde, trois patients d'un évènement de nature vasculaire (4,7%) et deux patients d'un évènement de nature neurovasculaire (3,2%). En totalité, l'incidence des complications totales, soit de nature cardiaque, vasculaire et neurovasculaire se chiffre à 15,8%. Selon les analyses univariées, la CRP ne prédit pas la survenue des complications cardiaques ou de toute autre nature (p > 0,05). Par contre, selon un modèle d'analyse par régression logistique, la CRP se voit marginalement significative lorsqu'un ajustement est fait pour le tabagisme, un important confondant tant face à la CRP qu'à la survenue de complications cardiaques (p > 0,05). La distribution de la CRP à l'intérieur de notre cohorte démontre que cette clientèle a un profil inflammatoire variable à considérer avant une chirurgie majeure de revascularisation. La CRP semble ici en mesure d'ajouter aux indices d'évaluation du risque cardiaque préopératoire lorsque le tabac est pris en considération. L'absence d'une forte association semble définitivement reliée à la faible taille de notre échantillon et ainsi, à une puissance insuffisante

De nombreux processus métaboliques nécessitent la présence de fer en tant que cofacteur. Paradoxalement, la surabondance en fer peut contribuer à la formation de dérivés oxygénés hautement réactifs qui sont toxiques pour la cellule. Ceci fait en sorte que sa concentration intracellulaire doit être finement régulée. Chez la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, plusieurs mécanismes participent à l'établissement de l'homéostasie du fer. Parmi ces mécanismes, on y retrouve des protéines de transport du fer à la surface cellulaire, ainsi que d'autres responsables de la séquestration de l'ion à l'intérieur de la vacuole. Un rôle pour la vacuole consiste à emmagasiner le fer afin de détoxifier la cellule s'il est trop abondant. Du même coup, la vacuole sert de réservoir qui pourra redonner le fer plus tard à la cellule si cette dernière croît en condition de rareté pour cet élément. La voie par laquelle le fer peut ressortir de la vacuole n'a cependant pas encore été identifiée. L'objectif de cette étude est d'identifier le transporteur responsable du relâchement du fer de la vacuole vers le compartiment cytosolique. Nos recherches ont permis d'identifier un candidat, un transporteur transmembranaire de type ABC (ATP binding cassette) nommé Abc3, dont l'expression augmente de 16.9 fois en carence de fer selon des études comparatives par biopuces à ADN. Tout d'abord, l'étude de la régulation du gène abc3[indice supérieur +] a été effectuée selon la présence ou non de fer dans le milieu de culture. L'expression du gène abc3[indice supérieur +] a été comparée avec d'autres gènes codant pour d'autres protéines de la même famille. Seul le gène abc3[indice supérieur +] a montré une expression variant selon le statut en fer. Il est réprimé en présence de fer et activé en carence de ce dernier. Par la suite, des éléments en cis du promoteur abc3[indice supérieur +] pouvant être responsables de la régulation selon le statut en fer ont été analysés. Parmi ces derniers, nous avons démontré que seul l'élément de régulation le plus près du cadre de lecture est fonctionnel permettant la répression du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer. Un essai fonctionnel permettant de montrer l'importance de la protéine Abc3 a été mis au point. Ainsi, une souche nulle pour le gène abc3[indice supérieur +] montre une perte de croissance en présence de cérulénine, un antibiotique qui inhibe la biosynthèse des acides gras. La souche abc3[delta] mutante est également sensible à la présence du chélateur de fer, le 2,2-dipyridyl (Dip), lorsque le système de transport de surface constitué de Fio1 et de Fip1 est inactivé. Une protéine Abc3 portant une étiquette fluorescente exprimée sous le contrôle du promoteur endogène abc3[indice supérieur +] a permis de localiser la protéine Abc3-GFP au niveau des vacuoles en carence de fer. Des analyses de profils transcriptionnels ont indiqué que l'expression forcée du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer active le répresseur Fep1. La surexpression du transporteur Abc3 libérerait plus de fer de la vacuole ce qui aurait pour effet d'activer Fep1, résultant en la répression de la transcription des gènes impliqués dans l'acquisition du fer à la surface cellulaire. Les résultats obtenus sur Abc3 suggèrent fortement que cette protéine pourrait être impliquée dans l'exportation du fer de la vacuole vers le cytoplasme de la levure lorsque cette dernière croît en carence de fer.

Le carcinome hépatocellulaire figure parmi les cancers les plus meurtriers et, encore en 2015, les infections aux virus de l'hépatite B et C sont en tête de lice des principales causes d'apparition de cancer du foie. En effet, 80% des cas de carcinomes hépatocellulaires sont attribuables à une infection virale par un de ces deux agents pathogènes. D'un point de vue épidémiologique, le carcinome hépatocellulaire n'est pas celui qui frappe le plus d'individus en Amérique du Nord. En effet, seulement une personne sur 264 sera affectée par ce cancer. Toutefois, il est important de l'étudier en raison de son faible taux de survie, ce qui le classe en cinquième place des cancers les plus meurtriers. Dernièrement, les recherches font mention des modifications dans l'épissage alternatif comme mécanisme d’apparition de plusieurs types de cancer, notamment les cancers du sein, de l'ovaire et de la prostate. C'est pour cette raison que nous avons investigué l'implication des virus de l'hépatite B et C dans l'épissage alternatif de gènes cellulaires, afin de mettre à jour un nouveau mécanisme de carcinogénèse utilisé par les oncovirus pour transformer leurs cellules hôtes. L'étude présentée dans ce mémoire rapporte des changements dans l'épissage alternatif de plusieurs gènes cellulaires, lorsque l’on évalue les patrons d’épissage alternatif des transcrits provenant d’analyse de séquençage d’ARN à haut débit de tumeurs du foie comparativement à des tissus hépatiques sains. Ces analyses ont permis de déterminer certains changements attribuables à la présence de chacun des deux virus hépatotropiques au niveau de l’épissage alternatif, et d’identifier certains changements qui pourraient impliquer la transformation du tissu sain en tissu cancéreux. Il serait intéressant de faire une validation des effets directs d’une protéine virale du virus de l’hépatite B, la protéine trans-activatrice HBx, et de vérifier si la présence de HBx en cellule serait responsable de changements au niveau de l’épissage alternatif de gènes impliqués dans le processus carcinogénique.