SILVA, Maria Zelandia Rocha. Isolamento em cromatografia de imunoafinidade e atividade antifúngica de osmotinas de fluidos laticíferos. 2015. 85 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-01T19:36:22Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_mzrsilva.pdf: 2515574 bytes, checksum: 4dcf1607c0ce726fde9bddf9f92b2d80 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T20:25:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_mzrsilva.pdf: 2515574 bytes, checksum: 4dcf1607c0ce726fde9bddf9f92b2d80 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T20:25:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_mzrsilva.pdf: 2515574 bytes, checksum: 4dcf1607c0ce726fde9bddf9f92b2d80 (MD5) Previous issue date: 2015 / Plants are constantly exposed to a variety of stresses conditions. However, they react to biotic stresses by triggering a set of defense mechanisms including the synthesis of defensive substances as the pathogenesis-related (PR) proteins. The PR-protein named osmotin can be induced under osmotic stress and water shortage conditions. Osmotin-like proteins have been purified from latex and some of them are related to antifungal activity. The aim of this study was to investigate the osmotin in the following species laticifers: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus and C. papaya to isolate and evaluate its antifungal activities. Immunoaffinity column chromatography with anti-CpOsm antibodies were performed in order to purify these osmotin-like. They were detected in latex of C. grandiflora and P. rubra by immunoassays the ELISA, Dot Blot and Western Blot using anti-CpOsm antibody (the osmotin of C. procera latex). Osmotin of C. procera, C. grandiflora, P. rubra and H. drasticus were identified by mass spectrometry. However, the osmotin from C. procera was co-purified with cysteine proteases. The co-purified cysteine protease from C. procera was identified as Procerain B. The alignment and the 3-D structure analysis of Procerain B and CpOsm revealed the presence of a similar sequence in both proteins. This sequence might be an epitope which allows the anti-antibody recognition. The osmotin from C. grandiflora, and P. rubra did not show antifungal activity against Fusarium solani and Colletotrichum gloesporioides. Since no correlation between the antifungal activity and the presence of these osmotins were found, the proteolytic activities of these latex protein fractions were evaluated in order to correlate with the antifungal activity C. procera and C. grandiflora showed a strong proteolytic activity. In latex, the cysteine proteases are more often related to antifungal activity than osmotin, which might explain, at least in part, the antifungal activity performed by C. grandifora and not for its osmotin. Further studies on the role of osmotin in physiology laticifers plants are needed. / As plantas estão constantemente sujeitas a diversos tipos de estresse, tanto bióticos como abióticos, resultando em respostas de defesa. Decorrente disto, os vegetais sintetizam certas proteínas denominadas de proteínas relacionadas à patogênese (PR proteína). As Pr-proteínas chamadas de osmotinas podem ser induzidas sob condições de estresse osmótico, frio e escassez de água. Osmotinas tem sido purificadas de fluidos laticíferos e algumas delas estão relacionadas com a atividade antifúngica. O objetivo do presente trabalho foi prospectar osmotinas, bem como isolá- las e avaliar suas atividades antifúngicas, nos fluidos laticíferos das seguintes espécies: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus e C. papaya. Nos látex de C. grandiflora e P. rubra foram detectadas osmotinas através de imunoensaios em placa de ELISA, Dot Blot e Westen Blot, utilizando os anticorpos anti-CpOsm (osmotina do látex de C. procera). Cromatografia de imunoafinidade em coluna com anticorpos anti-CpOsm foram realizadas com o intuito de purificar estas osmotinas. Análises por meio de espectrometria de massas, revelaram a presença de osmotina em C. procera, C. grandiflora, P. rubra e H. drasticus. No entanto, a osmotina de C. procera foram co-purificadas com proteases cisteínicas. A protease cisteínica co- purificada no látex de C. procera foi identificada como Proceraina B. O alinhamento e a análise da estrutura tridimensional da Proceraina B e CpOsm revelaram a presença de uma sequência semelhante em ambas as proteínas, que pode ser um epítopo disponível ao reconhecimento do anticorpo anti-CpOsm. As osmotinas isoladas de C. grandiflora e P. rubra não apresentaram atividade antifúngica contra F. solani e C. gloesporioides. Desde que não houve correlação entre a atividade antifúngica e à presença destas osmotinas, as atividades proteolíticas das frações proteicas foram avaliadas a fim de correlaciona-las à atividade antifúngica. Nos fluidos laticíferos, as proteases cisteínicas estão mais frequentemente relacionadas à atividade antifúngica do que as osmotinas. Estudos mais aprofundados sobre a função das osmotinas na fisiologia de plantas laticíferas são necessários.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-01T10:41:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1271654 bytes, checksum: dd5128fca76a05ee58ff9700ec969ce7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-01T10:41:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1271654 bytes, checksum: dd5128fca76a05ee58ff9700ec969ce7 (MD5) Previous issue date: 2013-09-09 / No presente trabalho, foram desenvolvidos snacks expandidos à base de quinoa, pelo processo de extrusão termoplástica. A quinoa (Chenopodium quinoa) é um pseudocereal de importante potencial agronômico e alto valor nutricional, apresentando elevado teor de proteína. As matérias-primas foram caracterizadas quanto a sua composição centesimal e cor. Para verificar quais variáveis influenciariam as propriedades dos snacks expandidos, foi realizado um delineamento composto central rotacional (DCCR) cujas variáveis independentes foram (X1) teor de quinoa; (X2) umidade inicial de mistura e (X3) temperatura da 3a zona de extrusão. As variáveis dependentes avaliadas foram: índice de expansão radial (IER); densidade aparente (DA); dureza; índice se solubilidade em água (ISA); índice de absorção de água (IAA); e as propriedades de pasta, viscosidade máxima (VM) e tendência à retrogradarão (TR). Os resultados foram analisados por metodologia de superfície de resposta. Não se encontraram efeitos significativos para a variável temperatura da 3a zona de extrusão. O baixo conteúdo de umidade, em combinação com baixos teores de quinoa resultaram em produtos de alta expansão e baixa densidade aparente. A diminuição no teor de quinoa e umidade inicial de mistura ocasionaram aumento da dureza do snack. Os valores de ISA estão inversamente relacionados com o teor de quinoa e umidade da mistura, e o maior valor de IAA foi obtido com níveis médios para as variáveis avaliadas, correspondente ao ponto central do delineamento. A VM aumenta quanto maior a umidade inicial da mistura, e os maiores valores para TR foram observados com mais baixo teor de quinoa (36 %) e alta umidade de mistura (16 %). Com base nestes resultados, seis tratamentos foram selecionados e caracterizados quanto a sua composição centesimal e cor e depois submetidos a teste de aceitação sensorial para os atributos sabor, textura e impressão global. Os tratamentos escolhidos contem um alto teor de proteína e lipídeos principalmente, já na composição da cor presentaram tom amarelo e sub-tom vermelho, e a farinha de quinoa se mostrou mais escura que a de milho mas isto não influiu diretamente na luminosidade dos snacks, obtendo-se valores no intervalo de 79,80 a 81,30. Na análise se aceitação sensorial, os tratamentos selecionados receberam notas medias de 5 a 7 na escala hedônica de 9 pontos, localizando-se na categoria “indiferente” a “gostei moderadamente”, sendo o snack de maior aceitação processado com 60% de quinoa, 13% de umidade inicial de mistura e temperatura de 140°C na 3a zona de extrusão. / In the present work, were developed by thermoplastic extrusion process expanded snacks made from quinoa. A Quinoa, (Chenopodium quinoa Willd), is a pseudocereal with important agronomic potential and a high nutritional value, with high protein content. The raw materials were characterized for their chemistry composition and color. To check which parameters influence the properties of snacks expanded, there was a central composite rotational design (DCCR) whose independent variables (X1) content of quinoa ; (X2) initial moisture mixing and (X3) Temperature of the 3 th extruder zone. The dependent variables evaluated were: (i) the radial expansion index (IER) , (ii) the apparent density (DA) ( iii ) hardness (iv) water solubility index (ISA) (v) water absorption index (IAA), and properties of fluids (vi) maximum viscosity (VM) and (vii) set back (TR) . The results were analyzed by response surface methodology. No significant effects were found for the variable Temperature of the 3 th extruder zone. The low moisture content, in combination with low levels of quinoa resulted in high-growth and low density. While a decrement in the content of quinoa and initial moisture mixing caused increasing hardness. ISA values are inversely related to the content of quinoa and initial moisture mix, and the highest value of IAA was obtained with average levels for the variables evaluated , corresponding to the central point of the design. The answer VM increases when the initial moisture mixing increase too, and the highest values for TR were obtained under conditions of low content of quinoa (36 %), and high humidity mixing (16 %). Based on these results, six treatments were selected and analyzed for their chemical composition, color and testing sensory of acceptance for this attributes, flavor, texture and overall impression. The treatments chosen contains a high content of protein and lipids. In your color composition they were tone yellow and sub - tone red, a quinoa flour was more dark than corn but this did not affect directly the luminosity of snacks, getting values were in the range 79,80 to 81,30 . In the analyzing for sensory acceptance, the treatments selected obtained scores 5-7 on a hedonic 9 point scale, locating the category "indifferent " to " like moderately " , and the greater acceptance of snack processed with 60 % of quinoa, 13 % of initial moisture of the mixture and 140 ° C in the 3 th extrusion zone. / Dissertação antiga.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-28T09:22:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 305338 bytes, checksum: ca87830be4b726fa9995d3e191633957 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T09:22:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 305338 bytes, checksum: ca87830be4b726fa9995d3e191633957 (MD5) Previous issue date: 2001-03-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A presente tese foi conduzida com os objetivos de estimar os parâmetros cinéticos da degradação da proteína de vários alimentos utilizando o método dos inibidores; avaliar os parâmetros cinéticos da degradação da proteína por meio da técnica de produção de gás e determinar a degradabilidade ruminal e a digestibilidade intestinal da proteína de vários alimentos utilizando duas técnicas in vitro. Para isso, foram desenvolvidos três experimentos. No primeiro, foram estimadas as taxas de degradação dos compostos nitrogenados de 24 alimentos concentrados e 14 volumosos, utilizando o método de inibidores in vitro. As estimativas das taxas de degradação mostraram que os alimentos promil, caseína, grão de amendoim moído, cama de frango contendo casca de café e a raspa de mandioca possuem proteínas de rápida degradação, sendo as mais lentas degradações observadas para o fubá de milho, a farinha de carne, a cama de frango contendo capim-elefante, a levedura de cana de açúcar e a farinha de penas. Concluiu-se que o método foi eficiente na avaliação da cinética ruminal da proteína dos alimentos concentrados e que as taxas de degradação de alguns alimentos volumosos foram subestimadas. No segundo experimento, realizaram-se determinações químicas e estudos sobre a cinética ruminal dos compostos nitrogenados de 24 alimentos concentrados e 10 volumosos, utilizando as medições das concentrações de nitrogênio solúvel em ácido tricloroacético e a produção de gás. As estimativas de degradação, nos tempos 6 e 12 horas, mostraram que: promil, caseína, grão de amendoim moído, raspa de mandioca, silagem de sorgo com e sem inóculo, silagem de milho e o capim-gordura apresentaram proteínas de rápida degradação. A mais lenta degradação foi observada para os alimentos levedura de cana de açúcar, farinha de penas, farinha de peixe, cama de frango contendo cepilha de madeira e o capim- braquiária. Neste estudo, concluiu-se que as estimativas foram maiores às observadas previamente em alimentos volumosos com o método de inibidores. Sugere-se utilizar o tempo de 12 horas para avaliação dos alimentos concentrados e 6 horas para os volumosos. No terceiro experimento, foram avaliadas a degradabilidade ruminal e a digestibilidade intestinal de 19 alimentos concentrados, 6 rações comerciais e 4 alimentos volumosos, usando o método de inibidores com digestão intestinal, HCL- pepsina-pancreatina, e o método de três estágios. Concluiu-se que a digestibilidade intestinal da proteína não degradada no rúmen dos alimentos avaliados não foi constante. O método dos inibidores estimou melhor a degradabilidade ruminal da proteína e o método de três estágios prediz com eficiência a digestibilidade intestinal da proteína não degradada no rúmen. Sugerem-se mais pesquisas para recomendar a estimativa do NDT(m) dos alimentos através das equações do NRC (2001). / The goals of this work were to evaluate the kinetics parameters of protein degradation for some feedstuffs using an inhibitor in vitro method, estimate the kinetics parameters of crude protein for feedstuffs through the gas production method and to evaluate the ruminal disappearance and intestinal digestibility of feedstuffs protein using an inhibitor in vitro with HCL-pepsin-pancreatin solutions and the three-step methods. Three experiments were carried out. In the first study, there were evaluated the kinetics parameters of protein degradation for twenty four concentrate feedstuffs and fourteen grasses with an inhibitor in vitro method. The data of degradation rates indicated that promil, casein, peanut grain dry grounded, broiler litter using as adsorvent coffee rind, and cassava rasp had the highest rates of protein degradation; the slowly degradation rates were obtained by corn meal, meat meal, broiler litter using an elephant grass as adsorvent, sugar cane yeast and feather meal. It was concluded that this approach offered a rapid and efficient evaluation of nitrogen degradation kinetic for concentrates feedstuffs. Nitrogen degradation rates of some grasses were underestimated. In the second study, chemical determinations and kinetics studies of nitrogen compounds of twenty four concentrate feedstuffs and ten grasses were made using the concentrations of soluble nitrogen in TCA and gas production. The data of degradation rates indicated that promil, casein, peanut grain dry grounded, cassava rasp, sorghum silage with or without inoculum, corn silage and honey grass had the highest degradable proteins; the slowly degradation rates were obtained by sugar cane yeast, feather meal, fish meal, broiler litter using wood rind as adsorvent and signal grass. Estimates of degradation rates of grasses were higher than degradation rates estimated previously by an inhibitor method. It was suggested to use 12 h for incubation of concentrate feedstuffs and 6 h for grasses. On the third experiment, there were evaluated the ruminal disappearance and protein digestibility of nineteen concentrate feedstuffs, six commercial rations and four grasses, using an inhibitor in vitro with HCL-pepsin- pancreatin solutions and the three-step methods. It was concluded that intestinal digestibility of the undegradable rumen protein was not constant. The inhibitor method was more efficient to evaluate and predict kinetic parameters of ruminal degradation and the three-step method for intestinal digestibility of undegradable rumen protein. It was suggested more evaluations to recommend the method of estimation of NDT(m) by the NRC (2001) equations. / Não foi encontrado o cpf do autor.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-08-29T16:38:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 671657 bytes, checksum: f28658698bf95e26a5cf8beb3fc64078 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-29T16:38:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 671657 bytes, checksum: f28658698bf95e26a5cf8beb3fc64078 (MD5) Previous issue date: 1997-07-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A proteína BiP, residente no lúmen do retículo endoplasmático (RE), tem sido descrita como um componente importante no processo de dobramento e montagem de proteínas secretórias recém-sintetizadas. Com base na localização subcelular, identidade imunológica, massa molecular relativa e síntese constitutiva, foi possível identificar o homólogo de BiP da soja, usando-se anticorpos preparados contra BiP do milho. A análise do padrão de acúmulo da proteína BiP revelou que a sua síntese é coordenada, temporalmente, com a síntese de proteínas de reserva na semente. Além disso, a síntese de BiP é correlacionada com a concentração de proteína total acumulada na semente de diferentes variedades de soja. Esses resultados indicam que a proteína BiP é induzida pelo aumento da atividade secretória do cotilédone, associada à síntese ativa de proteínas de reserva. Consistente com sua função de chaperone molecular, BiP é induzida em resposta a diversos estresses fisiológicos que promovem a proliferação do RE e o acúmulo de proteínas mal dobradas nesta organela. Infestação por Tetranichus urticae e infecção por Cercospora sojina Hara induziram a síntese de BiP em níveis comparáveis. Similarmente, sua síntese foi induzida, significativamente, em resposta a estresse nutricional. Ao contrário de BiP de espinafre, BiP de soja é regulada positivamente por estresse hídrico. Esses resultados contraditórios indicam que vias distintas de mecanismos regulatórios controlam a expressão dos genes BiP em plantas. Como membro da família Hsp70, foi demonstrado que a proteína BiP da soja se liga a ATP e associa-se com polipeptídios sintetizados exclusivamente na semente. No entanto, o complexo formado entre BiP e esses polipeptídios é altamente estável e insensível a ATP. A propriedade de BiP de se ligar a ATP foi explorada como meio de purificar essa proteína a partir de extratos protéicos de sementes, usando-se cromatografia de afinidade em resinas de ATP-agarose. Conforme julgado através de géis de acrilamida corados com prata, BiP foi purificada em um nível de homogeneidade em torno de 90%. A identidade da proteína purificada foi confirmada, uma vez que seus anticorpos reconheceram eficientemente a proteína expressa pelo clone cUFVBiP1, que codifica BiP da soja. / The protein BiP, reticulum endoplasmic resident molecular chaperone, has been described as an important mediator of folding and assembly of newly- synthesized proteins. Based on the subcelular localization, immunological identity, relative molecular mass and constitutive synthesis, we have identified the BiP homologue from soybean, using a maize BiP antibody. The pattern of BiP accumulation reveals that its synthesis is temporally coordinated with the seed storage protein synthesis. In addition, the BiP synthesis is correlated with the concentration of total protein in seeds of different soybean varieties. These results suggest that BiP is induced in response to the secretory activity of the cotyledon, which is associated with the active synthesis of storage proteins. As a molecular chaperone, we have found that soybean BiP is induced in response to several physiological stresses which promote the proliferation of the ER and an accumulation of unfolded proteins within the lumen of this organelle. Tetranichus urticae attack and Cercospora sojina infection induced the BiP synthesis to the same extend. Likewise, its synthesis was induced, considerably, in response to nutritional stress. Unlike spinach BiP, soybean BiP is upregulated by water stress. These controversial results suggest that disctint pathways of regulatory mechanisms control the BiP gene expression in plants. As a member of the Hsp70, we have demonstrated that soybean BiP binds to ATP and associates with seed polypeptides. However, these complexes are highly stable and insensitive to ATP. We have taken advantage of the BiP ATP-binding activity as a mean to purify this protein from whole seed protein extracts through affinity chromatography. As judged by silver-staining electrophoresis acrylamide gels, BiP was purified to 90% homogeneity. The identity of the purified protein was further confirmed, since antibodies prepared against it recognize efficiently a recombinant protein expressed by a soybean cDNA.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T14:04:21Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 298819 bytes, checksum: b65668e9242cdad9813138d6fb5444d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T14:04:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 298819 bytes, checksum: b65668e9242cdad9813138d6fb5444d0 (MD5) Previous issue date: 2003-10-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / No Brasil, o feijão é considerado um dos cultivos de maior importância na produção de alimentos básicos para a população. Como o país tem grandes áreas que podem ser aproveitadas para o plantio dessa cultura, pesquisas tornam-se necessárias a fim de preservar a qualidade do grão após a colheita. A qualidade do feijão está relacionada com produção por unidade de área, características de aceitabilidade pelo consumidor e valor nutritivo. Dessa forma, a melhoria da qualidade do feijão será obtida pela interação entre melhoramento agronômico, ciência e tecnologia de alimentos e nutrição. Assim, com o objetivo de avaliar a qualidade da proteína dos cultivares Aporé, Aruã, A774, Carioca, Diamante Negro, Ouro Branco, Ouro Negro, Pérola, RAO 33, Rudá e Vermelho Coimbra, armazenados por 30 dias e fornecidos pela EMBRAPA – Arroz e Feijão, localizada em Goiânia, GO, procedeu-se à avaliação biológica em ratos machos recém-desmamados e determinou-se a digestibilidade verdadeira e aparente, Protein Efficciency Ratio (PER), Net Protein Ratio (NPR) e Net Protein Utilization (NPU). Foram também analisados quatro métodos para ensaio de digestibilidade in vitro, utilizando-se um sistema multienzimático com as enzimas tripsina, quimotripsina e pancreatina. A equação de regressão obtida dos valores in vivo e in vitro foi usada para correlacionar os estudos in vitro com os ensaios in vivo e, dessa forma, predizer a digestibilidade. Utilizaram-se as digestibilidades verdadeira e aparente de todos os feijões de todos os grupos e separadamente do grupo Carioca, obtidos recém-colhidos e armazenados durante 30 dias, para estabelecer-se o melhor coeficiente de correlação das metodologias analisadas. Os resultados obtidos indicaram que as digestibilidades verdadeira e aparente variaram de 77,58 e 76,77% para a variedade Pérola a 87,46 e 86,65% para a variedade Ouro Branco, respectivamente, as quais, como todas as outras variedades, diferiram significativamente do padrão (caseína). Na análise de PER, a variedade Ouro Branco foi a que obteve melhor desempenho nutricional, apresentando valores de PER e RPER significativamente maiores (2,40 e 61,24%), enquanto a variedade Vermelho Coimbra foi a que exibiu menor valor (1,67 e 42,60%), diferindo significativamente das outras variedades analisadas e do valor obtido para caseína. Os valores de NPR e RNPR foram significativamente menores que os encontrados na caseína e situaram-se entre 2,54 e 57,33% na variedade Vermelho Coimbra e entre 3,55 e 80,13% na ‘Ouro Branco’. Os resultados de NPU e RNPU ficaram entre 38,36 e 52,47 e 56,64 e 77,69%. Os valores encontrados nas variedades de feijões armazenadas foram, na sua totalidade, superiores aos da literatura, o que demonstra que, apesar do tempo de armazenamento, essas variedades tiveram aproveitamento nutricional melhor que outras. O método de avaliação da digestibilidade in vitro que obteve maior R 2 e coeficiente de correlação com os ensaios in vivo, utilizando a combinação dos valores das digestibilidades aparente e verdadeira de todas as variedades armazenadas de feijões recém-colhidos, foi o desenvolvido neste trabalho, que apresentou valores que variaram de 0,75 a 0,83 para o R 2 e de 0,87 a 0,91 para o coeficiente de correlação. A diferença entre os valores de digestibilidade in vivo e in vitro, calculados a partir desse método, foi menor nos feijões recém-colhidos e variou de –2,95 a +3,98 e de –2,97 a +2,61, com relação às digestibilidades verdadeira e aparente, respectivamente. Nos feijões armazenados, a diferença foi maior, variando de –9,65 a +1,09 para a digestibilidade verdadeira e de –7,75 a +3,12 para a aparente. Para a combinação dos valores de digestibilidades verdadeira e aparente das variedades do grupo Carioca, o melhor método também foi o desenvolvido neste trabalho para os feijões recém-colhidos. Os valores de R 2 e coeficiente de correlação apresentados foram de 0,90 e 0,95, tanto para a digestibilidade verdadeira quanto para a aparente. Nos caso dos feijões armazenados, os melhores foram os métodos descritos por HSU et al. (1977) para a digestibilidade verdadeira e por SATERLEE et al. (1979) para a digestibilidade aparente. Os valores de R 2 e o coeficiente de correlação apresentados foram 0,90 e 0,95 para a digestibilidade verdadeira e 0,83 e 0,91 para a aparente, respectivamente. As diferenças entre os valores de digestibilidade in vivo e in vitro, calculados a partir desses métodos, para o grupo Carioca, também foram menores nos feijões recém-colhidos e variaram de –2,77 a +4,15 e de –2,78 a +1,83 para as digestibilidades verdadeira e aparente, respectivamente. Nos feijões armazenados, a diferença foi maior, variando de – 6,68 a +2,59 para a digestibilidade verdadeira e de –6,30 a +3,10 para a aparente. Esses resultados evidenciam que o tempo de armazenamento interfere de forma negativa, aumentando a diferença entre os valores absolutos de digestibilidade in vivo e in vitro e diminuindo a correlação entre os estudos. / In Brazil, the bean is considered one of the cultivations of larger importance in the production of basic foods for the population. As Brazil has great areas that can be taken advantage of for the planting of that culture, researches become necessary in order to preserve the quality of the grain after the harvest. The quality of the bean is related with production for unit of area; acceptability characteristics for the consumer and nutritional value. In that way, the improvement of the quality of the bean will be obtained by the interaction of the agronomic improvement, science and technology of food and nutrition. This way, with the objective of evaluating the quality of the protein of the cultivate Aporé, Aruã, A774, Carioca, Diamante Negro, Ouro Branco, Ouro Negro, Pérola, RAO 33, Rudá and Vermelho Coimbra, stored by 30 days and supplied by EMBRAPA – Arroz e Feijão, located in Goiânia-GO. They were sent to be biologicaly evaluated in recently-weaned male mice determined was the true and apparent digestibility, Protein Efficciency Ratio (PER), Net Protein Ratio (NPR) and Net Protein Utilization (NPU). Also analyzed were four methods of digestibility in vitro; being used a multienzymatic system with the enzymes trypsin, chymotrypsin and pancreatin. The obtained equation of regression of the values in vivo and in vitro were used to correlate the studies in vitro with the rehearsals in vivo, and in that way predict the digestibility. The true and apparent digestibility of all the beans from the groups but separated from the group Carioca were used. Beans that were recently harvested and stored for 30 days were obtained to establish the best correlation coefficient of the analyzed methodologies. The obtained results showed that the true and apparent digestibility varied from 77.58% and 76.77% to the variety Pérola to 87.46% and 86.65% for the variety Ouro Branco, respectively, that as all the other varieties, it differed significantly of the pattern (casein). In the analysis of PER, the variety Ouro Branco was the one that obtained better nutritional action, presenting values of PER and RPER significantly larger (2.40% and 61.24%), and the variety Vermelho Coimbra was the one that obtained smaller value (1,67 and 42,60%), differing significantly from the other analyzed varieties and from the value obtained for casein. The NPR and the RNPR were significantly smaller than that found for the casein and they located between 2.54% and 57.33% for the variety Vermelho Coimbra to 3,55 and 80,13% for the variety Ouro Branco. The results of NPU and RNPU, ranged between 38.36% to 52.47% and 56.64% to 77.69%. The values found for the varieties of beans stored, were completely superior to those found in the literature, which demonstrates that in spite of the time of storage, those varieties have a nutritional use better than others. The method of evaluation of the digestibility " in vitro " that obtained larger R 2 and correlation coefficient with the trials in vivo, using the combination of the values for the apparent and true digestibility of all the varieties of recently-harvested and stored beans, was the method developed in this work, and it presented values that varied from 0.75 to 0.83 to R 2 and from 0.87 to 0.91 for the correlation coefficient. The difference between the values of digestibility in vivo and the in vitro, calculated for this method, was smaller for the recently-harvested beans, and it varied from –2.95 to +3.98 and from –2.97 to +2.61, for the true and apparent digestibility, respectively. For the stored beans the difference was larger, varying from –9.65 to +1.09 for the true digestibility and from –7.75 to +3.12 for the apparent. For the combination of the values of true and apparent digestibility of the varieties of the group Carioca, the best method was also the one developed in this work for the recently-picked beans. The values of R 2 and correlation coefficient presented, 0.90 and 0.95 were true for both digestibility and the apparent. For the stored beans, the best were the methods described by HSU et al. (1977), for the true digestibility and SATERLEE et al. (1979), for the apparent digestibility. The values of R 2 and correlation coefficient presented were from 0.90 and 0.95 for the true digestibility and 0.83 and 0.91 for the apparent. The differences between the values of digestibility in vivo and in vitro, calculated from those methods, for the group Carioca, were also smaller for the recently-harvested beans, and it varied from –2.77 to +4.15 and from –2.78 to +1.83, for the true and apparent digestibility, respectively. For the stored beans the difference was larger, varying from –6.68 to +2.59 for the true digestibility and from –6.30 to +3.10 for the apparent. These results show that storage interferes in a negative way increasing the difference between the absolute values of digestibility in vivo and in vitro and reduce the correlation among the studies. / Tese importada do Alexandria.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-06T17:03:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 247331 bytes, checksum: ae57be7c82f87c29d3a84555f4712a48 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-06T17:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 247331 bytes, checksum: ae57be7c82f87c29d3a84555f4712a48 (MD5) Previous issue date: 2004-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O dobramento de proteínas secretórias no lúmen do retículo endoplasmático é altamente facilitado por chaperones moleculares. A proteína BiP é um dos chaperones mais bem caracterizados residentes do RE. BiP tem demonstrado ser um modulador multifuncional de vários processos que ocorrem no retículo endoplasmático. Essa proteína auxilia no dobramento e enovelamento das cadeias polipeptídicas nascentes e exerce papel no controle de qualidade do RE, reconhecendo e direcionando proteínas incorretamente dobradas para degradação. Também funciona como um sensor da via de resposta a proteínas incorretamente enovelada (UPR), regulando indiretamente a atividade da cinase eIF-2 e a sua própria expressão. As proteínas de reserva são sintetizadas em ribossomos associados à membrana do retículo endoplasmático, sendo co-traducionalmente translocadas para o lúmen do RE, onde podem permanecer associadas em corpos protéicos ou ser transportadas, via complexo de Golgi, para vacúolos de proteínas de reserva. Evidências na literatura indicam que BiP associa-se com proteínas de reserva in vitro, e seu acúmulo nas sementes está coordenado com a síntese de proteínas de reserva. Nesta investigação, foram analisados o nível de BiP nos diferentes estádios de desenvolvimento de sementes de soja e a correlação entre as concentrações de BiP e de proteínas de reserva de sementes. Para isso, utilizaram-se sementes de soja das variedades CAC-1 e CC3 com diferentes teores de proteína, determinados pelo método Kjeldahl. BiP acumulou-se predominantemente nos estádios iniciais de desenvolvimento das sementes, coincidindo com a síntese ativa de proteínas de reserva. O acúmulo temporal de BiP foi significativamente superior nas sementes CC3 que apresentam maior teor protéico. A capacidade de BiP associar-se a proteínas de reserva foi funcionalmente avaliada por meio do sistema duplo híbrido. Este ensaio demonstrou que BiP interage eficientemente com a subunidade de - conglicinina em leveduras. A partir desses resultados, surgiu a hipótese de que um aumento da expressão de BiP poderia resultar em elevação do teor de proteína das sementes. O efeito da superexpressão da proteína BiP no teor de proteína total foi diretamente avaliado em sementes de Nicotiana tabacum transgênicas (geração T4) superexpressando o gene BiP da soja. Embora o nível de BiP nas sementes transgênicas, detectado por immunoblotting e quantificado por densitometria, tenha sido maior nas linhagens transgênicas senso em relação às controle e anti-senso, a superprodução constitutiva de BiP não foi correlacionada diretamente com o aumento do teor protéico, determinado pelo método Kjeldahl. Esses resultados sugerem que a capacidade de processamento do retículo endoplasmático em tabaco durante o desenvolvimento da semente não constitui o fator limitante do processo de síntese e acúmulo de proteínas de reserva. / The folding of secretory proteins within the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) is greatly facilitated by molecular chaperones. The binding protein BiP is one of the best characterized ER-resident molecular chaperones. In mammalian cells, BiP has been demonstrated to serve as a multifunctional modulator of various ER-supported processes including regulation of eIF-2 kinase and mRNA translation, regulation of BiP expression, and the catalysis of protein folding, as well as, potentially, the targeting of misfolded proteins for degradation. The storage proteins from soybean are synthesized in ER membrane-bound polyribosomes and through a Golgi-mediated translocation are deposited into specialized vacuoles, designated protein bodies. We have previously demonstrated that BiP associated detectably with storage proteins in vitro and the efficiency of BiP synthesis correlated with the accumulation of seed storage protein, such that soybean cultivars that exhibited a greater content of storage proteins also accumulated higher levels of BiP. In this investigation, we further analyzed the synthesis of soybean BiP during seed development and the naturally occurring correlation between the content of BiP and seed storage proteins. Immunoblottings of total protein extracts from CAC1 (normal protein content) and CC3 (high protein content) cultivars demonstrated that, during the seed development, BiP accumulates to high levels at developmental stages that coincide with the onset of active storage protein synthesis. We further characterized the association of BiP and β-conglycinin storage proteins though the two-hybrid system. In order to understand whether an increase in BiP levels would promote a concomitant increase in seed storage protein accumulation, we obtained tobacco transgenic seeds-overexpressing a soybean BiP gene. The effect of BiP overexpression on total protein accumulation was directly evaluated in Nicotiana tabacum homozygous transgenic seeds (T3 generation). The BiP protein levels detected in the transgenic seeds were significantly higher than those of wild type and antisense BiP-transformed seeds. Nevertheless, total protein from seeds-overexpressing BiP, as determined by Kjeldahl, did not differ significantly from that of wild type and antisense seeds. These results suggest, although do not prove, that the capacity of ER processing during seed development does not constitute a rate limiting process for storage protein synthesis and accumulation. / Dissertação importada do Alexandria

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna. Existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB (Akt/ Proteína quinase B) é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. O objetivo do trabalho foi comparar a expressão da Akt/PKB em placentas de pacientes normais e com pré-eclâmpsia estimuladas com insulina. Foram utilizadas amostras de placenta de 12 pacientes normais e de 12 pacientes com PE foram coletadas, estimuladas com insulina e analisadas por Western blot para quantificação da expressão da proteína Akt/PKB basal e fosforilada em serina473. Como resultados, a estimulação das amostras com a insulina foi comprovada quando comparamos grupos estimulados (1,14 ± 0,10) e não estimulados (0,91 ± 0,08), P< 0,001. A atividade da via da Akt/PKB fosforilada em serina473 foi semelhante entre placentas de mulheres normais (1,26 ± 0,16) e com PE (1,01 ± 0,11), P = 0,237. Concluímos que não há diferença de fosforilação na via da Akt/PKB, após estimulação com insulina, em placentas de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar alterações desta via de sinalização na PE sem analisarmos os substratos da Akt/PKB quando estimulados. / Preeclampsia (PE) is an important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB pathway is stimulated by insulin and performs several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate stimulates expression of Akt/PKB pathway in the placenta, of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 12 normal patients and 12 PE patients, stimulate and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression in signaling of Akt/PKB. Results: stimulation of insulin samples was confirmed when comparing stimulated groups (1.14 ± 0.10) and non-stimulated (0.91 ± 0.08), P <0.001. The Akt/PKB phosphor (Ser473) was not different in placenta of the normal (1.26 ± 0.16) and PE (1.01 ± 0.11) groups, with P = 0.237. Conclusions: there was no difference of phosphorylation in Akt/PKB pathway, after stimulation with insulin, in placentas of normal and PE patients. However, we cannot discard effects in this signaling pathway as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze the substrates stimulation of this pathway.

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa cuja patogenia não é completamente elucidada. Atribui-se ao peptídeo beta-amilóide (A ), em sua forma oligomérica ou fibrilada, um importante papel neste processo. Uma vez que a produção e a fibrilação do peptídeo ocorrem ao nível de membrana neural, sua dinâmica e composição lipídica podem modular a cascata amilóide e/ou interferir na extensão do dano gerado pela mesma. Tendo isto em vista e considerando o potencial sinalizatório dos glicoesfingolipídios, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do peptídeo betaamilóide (A 25-35), em sua forma fibrilada ou não-fibrilada, sobre a biossíntese dos gangliosídios em modelo de cultura organotípica de hipocampo. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar de 6-8 dias, dos quais o hipocampo foi dissecado, fatiado e submetido à cultura. No 28º dia de cultura foi adicionado A 25- 35 (25μM), em sua forma fibrilada ou não fibrilada; após 24h adicionou-se ao meio D- [1-14C]-galactose para avaliar a biossíntese dos gangliosídios; no 30º dia a morte celular foi analisada com iodeto de propídio. A partir das fatias, os gangliosídios radiomarcados foram extraídos, purificados, analisados por HPTLC, fluorografia e densitometria. Nossos resultados demonstraram uma alteração na biossíntese de gangliosídios induzida pelo peptídeo beta-amilóide A 25-35, um efeito que foi dependente de seu estado de fibrilação. Desta maneira, o A 25-35, em sua forma fibrilada, promoveu um aumento na biossíntese de GM3 e uma redução na biossíntese de GD1b, ao passo que o peptídeo não fibrilado levou a um aumento na síntese do gangliosídio GM1. Uma vez que o GM3 é considerado um gangliosídio apoptótico, quando expresso em neurônios adultos, um aumento em sua síntese pode estar relacionado aos eventos tóxicos desencadeados pelo peptídeo beta-amilóide fibrilado. O GM1, por sua vez, ainda não possui um papel suficientemente claro no desenvolvimento da doença de Alzheimer. Uma série de efeitos neuroprotetores são atribuídos a este gangliosídio enquanto fortes evidências sugerem que o GM1 poderia acelerar o processo de fibrilação do beta-amilóide, e assim influenciar a progressão da doença. A fim de investigar o papel do GM1 no presente modelo, realizamos uma série de experimentos com a finalidade de avaliar uma possível ação neuroprotetora deste gangliosídio. Como resultado, um pré-tratamento das fatias hipocampais com GM1(10μM) foi capaz de prevenir a toxicidade induzida pelo peptídeo beta-amilóide em sua forma fibrilada, como demonstram os resultados da captação de iodeto de propídio. Com o intuito de corroborar sua ação neuroprotetora, bem como investigar o mecanismo pelo qual esta neuroproteção seria mediada, analisamos o efeito de um tratamento com GM1 (1h, 6h, 12h ou 24h) sobre as alterações induzidas pelo peptídeo beta-amilóide no estado de fosforilação (ativação/inativação) da GSK3b. Nossos resultados demonstraram um importante efeito neuroprotetor do GM1 após 24 horas de tratamento, uma vez que nestas circunstâncias este gangliosídio foi capaz de reverter a ativação (defosforilação) da GSK3b, uma via de sinalização associada à morte celular programada. Como conclusão, nossos resultados dão suporte a participação dos gangliosídios em modelos de doença de Alzheimer, e sugerem uma ação neuroprotetora do gangliosídio GM1 frente à toxicidade induzida pelo beta-amilóide, o que, no futuro, pode ser explorado como uma alternativa terapêutica ao tratamento do Alzheimer. / Alzheimer disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose pathogenesis is still poorly understood. It is attributed to beta-amyloid peptide, in its fibrillar or nonfibrillar forms, an important role in the disease development and progression. Once the production and fibrillation of beta-amyloid peptide occurs on the neural membrane surface, the lipid dynamic and composition of these membranes could modulate amyloid cascade and/or interfere in the damage triggered by it. Taking this into account, and considering the potential signalling role of glycosphingolipids, the objective of this study was to investigate the effect of fibrillar and non-fibrillar beta-amyloid peptide (Ab25-35) upon ganglioside biosynthesis in a model of organotypic hippocampal culture. In order to do this, we used 6-8 days old Wistar rats, whose hippocampi were dissected, sliced and subjected to culture. On the 28th in vitro day, A 25-35 (25μM) was added to the culture medium, in its fibrillar or non-fibrillar forms. After 24h incubation, D-[1-C14]-galactose was added to the medium with the purpose of labeling ganglioside; on day 30th in vitro day cell death was analyzed by PI uptake. The radiolabeled gangliosides were extracted from the hippocampal slices, purified, and analyzed by HPTLC, fluorography and densitometry. Our results demonstrated an Ab25-35 induced alteration in ganglioside biosynthesis, an effect which seemed to be dependent on the peptide fibrillation state. Furthermore, the fibrillar Ab25-35 caused an increase in GM3 and a reduction in GD1b biosynthesis, whereas the non-fibrillar form of this peptide was able to enhance the synthesis of GM1 ganglioside. Once GM3 is an apoptotic ganglioside, when expressed in adult neurons, an increase in its synthesis could take part of the toxic events triggered by the fibrillar betaamyloid peptide. GM1, in turn, has a still poorly understood participation in Alzheimer development. A sort of neuroprotective effects are attributed to this ganglioside while several evidences suggest that GM1 could accelerate the endogenous fibril formation, and thence influence the disease progression. To further investigate the role of GM1 ganglioside in our model, we have performed some experiments in order to test a possible neuroprotective effect of this gangliosides. As a result, a pre-treatment of the hippocampal slices with 10μM GM1 was able to prevent the toxicity triggered by the fibrillar beta-amyloid peptide, when measured by PI uptake protocol. In order to corroborate its neuroprotective action, as well as to investigate a candidate mechanism by which GM1 could promote neuroprotection, we have analyzed the effect of GM1 treatment (1h, 6h, 12h and 24h) upon the amyloid-induced alterations in GSK3b phosphorylation/dephosphorylation state. Our results demonstrated an important effect of GM1 after 24h incubation, once it was able to reverse the amyloid-induced dephosphorilation (activation) of GSK3b, a signalling pathway involved in apoptosis triggering. Taken together, our results provides new and important support for the ganglioside participation in Alzheimer models, and suggests a protective role of GM1 upon the amyloid induced toxicity, which, in the future, could expand the therapeutic strategy available for Alzheimer disease treatment.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 haroldo_junior_ioc_dout_2015.pdf: 2633312 bytes, checksum: 02a75ad07873abdb519b939eb64b351c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da Hepatite A (HAV) é o principal agente etiológico das hepatites virais agudas e estima-se que ocasione 1,5 milhão de novas infecções no mundo anualmente. Apesar da eficácia apresentada pelas vacinas comerciais, a replicação do HAV em cultura de células é lenta e apresenta baixo rendimento, o que torna a sua produção difícil e dispendiosa. Nesse contexto, o uso de proteínas recombinantes do HAV pode representar uma alternativa ao modelo de vacina existente. O presente trabalho teve como objetivo expressar e avaliar a imunogenicidade das partículas virais destituídas de ácido nucleico (VLPs) e da proteína VP1 do HAV. As VLPs foram geradas a partir do sistema baculovírus/células de inseto através da infecção de células de inseto com baculovírus recombinantes contendo as regiões P1-2A e P3 do genoma do HAV. A poliproteína P1-2A foi expressa, clivada e se organizou em estruturas que continham epitopos conformacionais de neutralização. Partículas com características similares ao HAV foram identificadas por microscopia eletrônica, sugerindo que as proteínas expressas se montaram em VLPs. Em paralelo, a VP1 foi expressa nos sistemas baculovírus/células de inseto e Escherichia coli Níveis mais elevados de expressão foram obtidos em E. coli, o que consequentemente aumentou a taxa de recuperação da proteína purificada. A VP1 derivada de E. coli foi utilizada nos ensaios de antigenicidade e mostrou reatividade frente aos soros de pacientes infectados pelo HAV, o que demonstra seu potencial como um marcador para diagnóstico. Para os estudos de imunogenicidade, a VP1 derivada de E. coli foi combinada a dois adjuvantes, o hidróxido de alumínio (A1(OH)3) e o adjuvante a base de saponina. A formulação VP1+A1(OH)3 induziu polarização da resposta Th2, enquanto que a formulação VP1r+saponina gerou um balanço maior entre as respostas Th1 e Th2. O adjuvante saponina permitiu a administração de uma dose menor da VP1 sem afetar a intensidade da resposta. Resultados preliminares sugerem que os anticorpos anti-VP1 induzidos pela formulação com saponina apresentaram reatividade cruzada com o HAV. Além disso, testes iniciais indicam que os camundongos imunizados com a VP1 em associação com ambos os adjuvantes apresentaram resposta anamnéstica contra o HAV. Os resultados aqui apresentados sugerem que a VP1 e as VLPs podem ser úteis para o desenvolvimento de uma nova vacina contra a Hepatite A / The hepatitis A virus (HAV) is the primary etiological agent of acute viral hepatitis and it is estimated to cause 1.5 million of new infections each year worldwide. Despite the effectiveness of commercial vaccines, the replication of HAV in cell culture is slow and has low yield, which makes it difficult and expensive to manufacture. In this context, the use of recombinant HAV proteins could represent an alternative model to the existing vaccines. This study aimed to express and evaluate the immunogenicity of virus-like-particles (VLPs) and VP1 protein of HAV. The VLPs were generated using the baculovirus/insect cell expression system by the infection of insect cells with recombinant baculovirus containing HAV P1-2A and P3 regions. The P1-2A polyprotein was successfully expressed, cleaved and organized into structures that contained neutralizing conformational epitopes. HAV-like particles were identified by electron microscopy, suggesting that the expressed proteins were assembled into VLPs. In parallel, VP1 was expressed in both baculovirus/insect cell and Escherichia coli expression systems. Higher protein levels were obtained in E. coli, which consequently increased the recovery rate after protein purification. The E. coli-derived VP1 was then used in antigenicity assays and showed reactivity against sera from patients infected with HAV, demonstrating its potential as a diagnostic marker. For immunogenicity studies, the E. coliderived VP1 was combined with two adjuvants, aluminum hydroxide (Al(OH)3) and the saponin-based adjuvant. The VP1+Al(OH)3 induced Th2 polarization, while VP1+saponin generated a Th1 and Th2 balanced immune response. Saponin-based adjuvant formulations allowed the administration of lower dose of VP1 without affecting the intensity of the response. Preliminary results suggest that the anti-VP1 antibodies induced by saponin-based adjuvant showed cross-reactivity with HAV. Furthermore, initial tests indicate that immunization of mice with VP1 in association with both adjuvants generated anamnestic response against HAV. The results presented here suggest that VP1 and VLPs might be useful to develop a new vaccine against hepatitis A. / 2016-07-10

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:55:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 larissa_fontes_ioc_mest_2016.pdf: 4617034 bytes, checksum: eee0cf93cb18ec86d4b978b114c27212 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS \2013 \201CWiskott-Aldrich Syndrome\201D) é uma imunodeficiência primária associada a infecções recorrentes e ao desenvolvimento de doenças autoimunes e linfomas. Essa imunodeficiência se desenvolve em consequência de mutações no gene que codifica a proteína WASP (\201CWAS Protein\201D), expressa em células hematopoiéticas, e com funções reguladoras sobre os rearranjos do citoesqueleto de actina e na ativação de linfócitos T. Nesse sentido, camundongos deficientes em Wasp (Wasp \201Cknockout\201D \2013 WKO) apresentam desregulação de processos centrais para a resposta imunológica, resultando em migração leucocitária aberrante, proliferação linfocitária deficiente, e disfunção de células T reguladoras (Treg). De forma interessante, foi demonstrado que as células Treg, definidas pelo fenótipo CD4+CD25+Foxp3+ e com função imunossupressora, já se encontram em menor número no timo desses animais. Esse dado sugere que a deficiência em Wasp resulta em defeito na geração intratímica de células Treg. Nesse contexto, é importante salientar que a migração do timócito através do microambiente tímico é crucial para a formação das células T e, particularmente, a matriz extracelular exerce uma função determinante para os eventos de adesão e de-adesão da célula migrante. Assim, podemos postular que a matriz extracelular medeia interações cruciais para as células Treg tímicas (tTreg), fornecendo e facilitando o acesso aos diferentes sinais celulares durante o processo de maturação dessas células Nesse projeto, decidimos estudar a participação de ligantes e receptores da matriz extracelular na maturação de células tTreg e o possível envolvimento dessas moléculas na deficiência numérica de células tTreg em camundongos WKO. Foi observada uma diminuição da rede de fibronectina na região medular do timo dos animais WKO em relação ao controle. Além disso, observamos uma redução de células tTreg expressando VLA-4 e VLA-5 nos animais WKO em relação ao controle. As análises de proliferação, ativação e morte demonstraram que as células Treg de animais WKO apresentam alterações em relação às células precursoras (CD4+CD8-CD25+Foxp3-). De forma interessante, as análises de adesão em fibronectina demonstraram que as células Treg dos animais WKO apresentam menos filopódios que as células Treg do controle, e que essa diminuição é proeminente comparando-se às células T CD4 SP. Esses resultados sugerem que a fibronectina tenha importância na diferenciação das células tTreg / Abstract: The Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) is a primary immunodeficiency associated with recurrent infection and development of autoimmune diseases and lymphomas. This immune deficiency develops as a result of mutations in the gene encoding the WASP protein ("WAS protein"), expressed in hematopoietic cells, and with regulatory functions on the actin cytoskeleton rearrangements and activation of T lymphocytes. Accordingly, mice deficient in Wasp (Wasp "knockout" - WKO) present disruption in central processes to the immune response, resulting in aberrant leukocyte migration, impaired lymphocyte proliferation and dysfunction of regulatory T cells (Treg). Interestingly, it was shown that Treg cells defined by the CD4+CD25+Foxp3+ phenotype and immunosuppressive function, already decreased in the thymus of the animals. This suggests that the Wasp deficiency results in defective intrathymic generation of Treg cells. In this context, it is important to note that the migration of the thymocyte through the thymic microenvironment is crucial for the formation of T cells and, particularly, the extracellular matrix has a decisive role in the events of adhesion and de-adhesion of migrant cell Thus, we postulated that the extracellular matrix mediates interactions crucial for thymic Treg cells (tTreg) by providing and facilitating access to different cellular signals during the maturation process of these cells. In this project, we decided to study the role of ligands and receptors of extracellular matrix in the maturation of tTreg cells and the possible involvement of these molecules in numerical deficiency tTreg WKO cells in mice. We observed a decrease in fibronectin network in the medulla of the thymus of WKO animals compared to the control. In addition, a decrease in cells expressing VLA-4 and VLA-5 in WKO animals compared to the control. The analysis of proliferation, activation, and death demonstrated that Treg cells animals in WKO showed changes from precursor cells (CD4+CD8-CD25+Foxp3-). Interestingly, adhesion on fibronectin showed that Treg cells from WKO animals present less filopodia compared to control Treg cells and that this is a marked decrease as compared to the CD4 SP cells. These results suggest an important role for fibronectin in the differentiation of Treg cells