A esquistossomose é a mais importante das doenças helmínticas humanas em termos de morbidez e mortalidade. A proteína Sm14 de Schistosoma mansoni, que pertence à família de proteínas ligadoras de ácidos graxos (fatty acid-binding proteins, FABPs) (Moser et al., 1991), mostrou um bom nível de proteção (65%) contra a esquistossomose em animais experimentais (Tendler et al., 1996). No presente trabalho foram desenvolvidos sistemas de expressão que possibilitará a produção da proteína Sm14 em larga escala em E.coli. Com o intuito de conhecer a estrutura do gene da proteína Sm14, foi clonado um fragmento de DNA genômico de S. mansoni que contém a seqüência codificante da proteína Sm14. Como os outros membros da família gênica das FABP, o gene para a proteína Sm14 contém quatro \"exons\" separados por três \"introns\" de 674, 585 e 42 bp. Esta é a primeira descrição da estrutura gênica de um membro das FABP correspondente a um helminto. A Sm14 é uma proteína que pode ser potencialmente usada como vacina. Estudamos a existência de polimorfismo em duas linhagens de S. mansoni endêmicas do Brasil: LE e BH. Para a análise de polimorfismo, a ORF correspondente à proteína Sm14 foi amplificada por RT-PCR do RNA total de vermes adultos de S. mansoni. Os produtos de amplificação independentes foram clonados no vetor pGEM-T e seqüenciados. As análises de seqüências mostraram duas isoformas principais para a proteína Sm14: Sm14-M20, com seqüência idêntica a proteína Sm14 previamente reportada para a linhagem de Puerto Rico de S. mansoni (Moser et AL., 1991), e Sm14-T20, onde o códon da Met20 (ATG) mudou para o códon de Thr (ACG) (polimorfismo M20T). Dois clones mostraram uma deleção de seqüência de aminoácidos correspondente ao \"exon\" 3 inteiro (clones ΔExon3), gerada por \"splicing\" alternativo. As outras trocas observadas acontecem em posições onde os aminoácidos são menos conservados e estão representados apenas por um único clone que podem ter sido obtidas por mutagênese na PCR. A metionina correspondente à posição 20 na Sm14 é altamente conservada nas FABP dos mais diversos organismos,e não se tem nenhuma outra proteína com treonina nesta posição. Para o estudo da estrutura e função destas isoformas, os cDNAs correspondentes foram subclonados no vetor pAE (desenvolvido no nosso laboratório), assim como o mutante M20A (Sm14-A20) construído para efeitos de comparação. A estabilidade e estrutura das proteínas recombinantes purificadas foram caracterizadas por dicroísmo circular (CD). A comparação da estrutura e termoestabilidade mostrou que as formas Sm14-T20 e Sm14-A20 são menos termoestáveis do que a Sm14-M20 (um ΔTm de aproximadamente 10°C). Porém, todas as formas de Sm14 foram capazes de ligar o DAUDA [ácido 11-(dansylamino) undecanoico] com a mesma afinidade. Para poder diferenciar as propriedades de ligação de ácidos graxos pelas isoformas, experiências de competição do deslocamento do DAUDA por ácidos graxos naturais, foram realizadas. A partir destes dados podemos assumir que a forma Sm14-M20 liga melhor todos os ácidos graxos naturais testados do que a forma Sm14-T20. Porém esta forma mantém a capacidade de ligar ácidos graxos, ao contrario do mutante Sm14-A20. Pode-se deduzir como resultado destas experiências que a proteína Sm14-M20 é mais estável e liga com maior afinidade os ácidos graxos naturais do que a forma Sm14-T20. Pelo visto, a proteína Sm14-T20 tem menos estrutura-β, porém, mantém a capacidade de ligar moléculas hidrofóbicas. Ainda é desconhecido o papel funcional do polimorfismo da proteína Sm14 no metabolismo dos vermes de S. mansoni. Problemas de estabilidade da proteína Sm14 recombinante, durante seu transporte e armazenamento, comprometem sua viabilidade como vacina. Com o intuito de melhorar a estabilidade desta proteína, foi feita uma mutagênese no único resíduo de cisteína presente na Sm14 na posição 62. Este resíduo é responsável pela formação de dímeros, o que é relacionado a estabilização da perda de estrutura-β e precipitação da proteína. Esta cisteína foi trocada por serina (C62S) e por valina (C62V) por mutagênese sítio dirigida, resultando nas proteínas Sm14-M20S62 e Sm14-M20V62. As formas mutantes não apresentaram maior termoestabilidade, mas a renaturação após o aquecimento a 80°C atingiu quase 100%, diferentemente das proteínas com Cys62. As proteínas com o resíduo de cisteina trocado foram as únicas formas que conservaram a estrutura de β-barril após 3 meses de armazenamento a 4°C, como mostram as análises de dicroísmo circular, sendo a forma mais estável a proteína Sm14-M20V62. Após estes estudos, a isoforma Sm14-M20 com a mutação C62V (Sm14-M20V62) mostrou-se como a melhor alternativa ao antígeno Sm14-T20 usado até agora como modelo de vacina experimental para S. mansoni. Esta indicação deve ser confirmada em ensaios de imunização e posterior desafio com cercárias de S. mansoni. / The schistosomiasis is the most important human helmintic disease in terms of morbidity and mortality. The Sm14 protein of Schistosoma mansoni belongs to the family of fatty acid-binding proteins (FABPs) (Moser et aI. , 1991) and showed a good protection level as vaccine antigen against the schistosomiasis in experimental animals (Tendler et al., 1996). In the present work were developed systems for the expression of Sm14 protein that will facilitate its large scale production in E.coli.. In order to know the gene structure of the Sm14 protein, we amplified by PCR a genomic DNA fragment of S. mansoni that contains the coding sequence for the Sm14 protein. As the other members of the FABP family, the Sm14 gene contains four exons separated by three introns of 674,585 and 42 bp, respectively. This is the first detailed description of the genomic structure for a member of FABPs corresponding to a helmint. We also studied the existence of polymorphisms within two Brazilian endemic strains of S.mansoni: LE and BH. For the polymorphism analysis, the ORF corresponding to the Sm14 protein was amplified by RT-PCR from total RNA of S. mansoni adult worms. The independent amplified products were cloned into pGEM-T vector and sequenced. The sequence analyses showed two main isoforms: Sm14-M20, with identical sequence to that previously reported Sm14 protein from the Puerto Rican strain of S. mansoni (Moser et al., 1991), and Sm14-T20, where the codon for Met20 (ATG) was changed for the Thr codon (ACG) (M20T polymorphism). Two clones showed the same amino acid sequence deletion corresponding to the whole third exon (ΔExon3 clones), generated by alternative splicing. The other observed changes occurred in positions where the amino acids were less conserved and were just represented by only one clone that could be obtained by PCR mutagenesis. The methionine corresponding to the position 20 in Sm14 is highly conserved among FABPs and no other related protein has threonin in this position. To study the structure and function of these amino acid in the isoforms, the corresponding cDNAs were subcloned in to the pAE vector (developed in our laboratory), as well as the mutant M20A (Sm14-A20). The stability and structure of the purified recombinant proteins were characterized by circular dicroism (CD). The comparison of their structure and thermo stability showed that the forms Sm14-T20 and Sm14-A20 are less thermostable than Sm14-M20 (ΔTm around 10ºC). However, all of the Sm14 forms were capable to bind the DAUDA [11- (dansylamine) undecanoic acid] with similar affinities. To differentiate the fatty acid binding properties of Sm14 isoforms, displacement experiments of DAUDA with natural fatty acid were performed. From these data we can assume that the Sm14-M20 form binds better than the Sm14-T20 and Sm14-A20 forms of all natural fatty acid assayed. This suggests that the Sm14-20 protein is most stable and binds better the natural fatty acids than the Sm14-T20 form. Although the Sm14-T20 protein has less structure, it maintains the capacity to bind fatty acids. It is still unknown the functional role of this Sm14 protein polymorphism in the metabolism of S. mansoni worms. Stability problems of the recombinant Sm14 protein during its transport and storage, could hamper its use as vaccine. With the aim to improve the stability of this protein, it was made a mutagenese at the unique cysteine residue present in Sm14 at the position 62. This residue is responsible for the dimer formation and is related the loss of the terciary structure and precipitation of the protein. This cysteine was changed by serine (C62S) and for valine (C62V) by site directed mutagenesis, resulting in the proteins Sm14-M20S62 and Sm14-M20V62. The mutant forms did not present a higher thermal stability but the renaturation after heating at 80°C almost reached 100%, in contrast to Sm14 proteins with Cys62. These mutants conserved the β-barrel structure after 3 months of storage at 4°C, in contrast to proteins with Cys62, as shown by circular dicroism analyses. After these studies, the Sm14-M20 isoform with the C62V mutation (Sm14-M20V62) was considered the best alternative to the antigen Sm14-T20 used up to now as the model for an experimental vaccine for S. mansoni. This indication should be confirmed by immunization and posterior challenge with S. mansoni cercaria.

Atualmente, o Brasil encontra-se na privilegiada posição de maior produtor e exportador mundial de carne bovina, tornando a pecuária uma das atividades nacionais mais importantes e rentáveis. Este dado enfatiza a importância de pesquisa e desenvolvimento em reprodução bovina, especialmente em hormônios estimuladores da ovulação, tais como a gonadotrofina coriônica equina (eCG). Os produtos comerciais à base de eCG comercialmente disponíveis são purificados a partir do sangue de éguas gestantes, apresentando variabilidade de lote para lote e presença de contaminantes. Estes fatos, juntamente com a limitação do material de partida (sangue equino), enfatizam a necessidade de haver um sistema de expressão de eCG recombinante passível de ser explorado comercialmente. Neste quesito, as células de mamíferos se mostram um sistema robusto para tal finalidade, visto que são capazes de adicionar modificações pós-traducionais às cadeias polipeptídicas, tais como a glicosilação, o que é essencial para o correto dobramento, maturação e montagem das duas subunidades, além de interferir diretamente com a meia-vida, o reconhecimento do receptor, a solubilidade e a atividade biológica das proteínas. No entanto, mesmo entre os sistemas de expressão heteróloga em células de mamífero, encontra-se muita variabilidade nos padrões de glicosilação adicionado. No presente trabalho, foi realizado um estudo comparativo através da clonagem e expressão de uma forma fusionada de eCG (reCGβα) em duas linhagens celulares diferentes: (1) CHO-DG44, um dos sistemas de expressão mais utilizados pelas indústrias farmacêuticas, capaz de adicionar N-glicanos complexos; e (2) 293T, uma linhagem humana capaz de produzir glicoproteínas carreando oligossacarídeos complexos e sialilados. Os resultados de atividade biológica (in vitro e in vivo) apontam uma maior atividade de reCG produzido por células CHO-DG44. O perfil de N-glicosilação de reCG produzido pelas células CHOD-G44 assemelhou-se mais à eCG selvagem, quando comparado a reCG produzido por células 293T. Por fim, estudos clínicos foram realizados com reCG produzido em meio livre de soro fetal bovino e parcialmente purificado, onde atividade específica de reCG produzido por células CHO-DG44 mostrou-se similar ao produto comercial selvagem. / Brazil is currently the major beef producer and exporter, rendering to livestock one of the country´s most economically relevant activities. This emphasizes the importance of research and development in bovine reproduction, especially at ovulation-stimulatory hormones, such as equine gonadotropin (eCG). The commercially available eCG-based products are purified from blood of pregnant heifers, presenting batch-to-batch variability and the presence of contaminants. These facts, together with the limitation of the bulk material (equine blood), emphasize the need of an eCG expression system able to be commercially explored. In this aspect, mammalian cells are a robust system, capable of add post-translational modifications to polypeptide chains, such as glycosylation, which is essential for the correct folding, maturation and assembly of both eCG subunits. In addition, glycosylation directly interferes with the protein half-life, receptor recognition, solubility and biological activity. In the present work, a comparative study was carried out by cloning and expressing a fusion form of eCG (reCGβα) in two different mammalian cell lines: (1) CHO-DG44, one of the most used by pharmaceutical companies expression systems, capable of add complex-type N-glycans; and (2) 293T, a human cell line capable of produce glycoproteins carrying complex and sialylated oligosaccharides. The in vitro and in vivo biological activity results show a higher potency of reCG produced by CHO-DG44 cells. The N-glycosylation pattern produced by CHO-DG44 cells was more similar to native eCG in comparison to the N-glycosylation produced by 293T cells. Finally, clinical studies were performed with serum absent media produced and partially purified reCG, showing that the specific activity of reCG produced by CHO cells was similar to the commercial wild type product.

Tesis por compendio / [ES] El diagnóstico de alergias a antibióticos ß-lactámicos incluye el uso de pruebas in vivo no satisfactorias ya que consumen mucho tiempo y conllevan el riesgo de provocar una nueva reacción alérgica. Por otro lado, los métodos in vitro basados en la inmunodetección de IgE alérgeno-específica generan una información muy valiosa, confirmando o descartando la alergia y postulándose como una alternativa de diagnóstico segura. A pesar de ello, las pruebas in vitro actuales carecen de sensibilidad y exactitud, con un 81% de falsos negativos, lo que limita su uso diagnóstico. Esto ha desencadenado una creciente demanda de nuevas pruebas in vitro basadas en la inmunodetección de IgE, el biomarcador presente en suero más estudiado en alergia. Sin embargo, la falta de estándares de referencia de IgE alérgeno-específica ha imposibilitado la validación y estandarización de los métodos, lo que hace que los resultados de las distintas pruebas no sean comparables. Además, dicha falta de estándares de referencia hace que las concentraciones de IgE específica se calculen a partir de una curva de calibración de IgE total mediante una interpolación heteróloga, lo que ha demostrado no ser totalmente correcto. Por los motivos mencionados, en esta tesis doctoral se plantea como objetivo principal el diseño, obtención y caracterización de proteínas recombinantes con reactividad frente a antibióticos ß-lactámicos. Esta investigación comienza con la puesta a punto de un inmunoensayo en placa ELISA con detección quimioluminiscente para la cuantificación de IgE específica. El ensayo desarrollado permitió determinar IgE específica por debajo de 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), permitiendo así la identificación de pacientes alérgicos con una mayor sensibilidad, utilizando solo 25 ¿L de muestra (suero). El inmunoensayo mostró una buena sensibilidad (64.6%), así como una excelente especificidad (100%), que mejoran significativamente el carácter predictivo de las pruebas in vitro existentes. A continuación, se abordó la obtención y caracterización de proteínas recombinantes similares a las IgE específicas de los ß-lactámicos utilizando la metodología Phage Display. La primera aproximación se trata de una proteína formada por dos nanoanticuerpos que mimetiza el comportamiento de una IgE específica. De esta manera, se obtuvieron proteínas recombinantes en las que uno de los nanoanticuerpos reconoce selectivamente un determinante antigénico de un antibiótico ß-lactámico, mientras que el otro reconoce específicamente al parátopo de un anticuerpo detector anti-IgE. Estas construcciones resultaron ser estables y funcionales. El papel de estas proteínas recombinantes como calibrador homólogo se estudió determinando la concentración de IgE específica a penicilina G presente en suero mediante un ensayo quimioluminiscente. El método desarrollado duplicaba la sensibilidad clínica (66%) frente al método de referencia (28%), mientras que mantenía una especificidad clínica del 100%. Alcanzado este punto, la tesis se centró en la producción de IgE específica recombinante utilizando como material de partida el ADN de un paciente alérgico a amoxicilina y penicilina G. A partir del material genético aislado, mediante Phage Display, ingeniería de anticuerpos y métodos de expresión en células de insecto se consiguió producir una IgE específica recombinante. De esta manera, se obtuvo un producto biológico que cumple con los requisitos para su adopción como material de referencia en ensayos in vitro. Igualmente, se utilizó como calibrador homólogo para la determinación de IgE específica a amoxicilina. Se alcanzó un límite de detección de 0.05 IU/mL con el que se conseguía un aumento de la sensibilidad clínica (73%) que cuadruplicaba al método de referencia (16%), manteniendo la especificidad clínica en el 100%. / [CA] El diagnòstic d'al·lèrgies a antibiòtics ß-lactàmics inclou l'ús de proves in vivo no satisfactòries, ja que consumeixen molt de temps i comporten el risc de provocar una nova reacció al·lèrgica. D'altra banda, els mètodes in vitro basats en la immunodetecció d'IgE al·lergen-específica generen una informació molt valuosa, confirmant o descartant l'al·lèrgia i postulant-se com una alternativa de diagnòstic segura. Tanmateix, a les proves in vitro actuals hi ha una manca de sensibilitat i exactitud, amb un 81% de falsos negatius, cosa que en limita l'ús diagnòstic. Tot això ha desembocat en una demanda creixent de noves proves in vitro basades en la immunodetecció d'IgE, el biomarcador present en sèrum més estudiat en al·lèrgia. No obstant això, la manca d'estàndards de referència d'IgE al·lergen-específica ha impossibilitat la validació i estandardització dels mètodes, cosa que fa que els resultats de les diferents proves no siguen comparables. A més, aquesta manca d'estàndards de referència fa que les concentracions d'IgE específica es calculen a partir d'una corba de calibratge d'IgE total mitjançant una interpolació heteròloga, un mètode que ha demostrat no ser totalment correcte ja que no es pren en consideració la interacció entre el determinant antigènic i la IgE específica. Pels motius mencionats, en aquesta tesi doctoral es planteja com a objectiu principal el disseny, l'obtenció i la caracterització de proteïnes recombinants amb reactivitat davant dels antibiòtics ß-lactàmics. Aquesta investigació comença amb la posada a punt d'un immunoassaig en placa ELISA amb detecció quimioluminiscent per a la quantificació d'IgE específica. L'assaig desenvolupat va permetre determinar IgE específica per baix de 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), el que permet la identificació de pacients al·lèrgics amb més sensibilitat, utilitzant només 25 ¿L de mostra (sèrum). L'immunoassaig mostra una bona sensibilitat (64.6%), així com una excel·lent especificitat (100%), que milloren significativament el caràcter predictiu de les proves in vitro existents. A continuació, es va abordar l'obtenció i la caracterització de proteïnes recombinants similars a les IgE específiques dels ß-lactàmics utilitzant la metodologia Phage Display. La primera aproximació és una proteïna formada per dos nanoanticossos que mimetitza el comportament d'una IgE específica. D'aquesta manera, es van obtenir proteïnes recombinants en què un dels nanoanticossos reconeix selectivament un determinant antigènic d'un antibiòtic ß-lactàmic, mentre que l'altre reconeix específicament el paràtop d'un anticòs detector anti-IgE (Omalizumab). Aquestes construccions van resultar estables i funcionals. El paper d'aquestes proteïnes recombinants com a calibrador homòleg es va estudiar determinant la concentració d'IgE específica a penicil·lina G present en sèrum mitjançant un assaig quimioluminiscent. El mètode desenvolupat duplicava la sensibilitat clínica (66%) respecte del mètode de referència (28%), mentre que mantenia una especificitat clínica del 100%. Assolit aquest punt, la tesi es va centrar en la producció d'IgE específica recombinant utilitzant com a material de partida l'ADN d'un pacient al·lèrgic a amoxicil·lina i penicil·lina G. En combinació amb la metodologia Phage Display, enginyeria d'anticossos i mètodes d'expressió en cèl·lules d'insecte, es va aconseguir produir una IgE específica recombinant. D'aquesta manera, es va obtenir un producte biològic que compleix els requisits per ser adoptat com a material de referència en assajos in vitro. Igualment, es va utilitzar com a calibrador homòleg per a la determinació d'IgE específica a amoxicil·lina. Es va assolir un límit de detecció de 0.05 IU/mL amb què s'aconseguia un augment de la sensibilitat clínica (73%) que quadriplicava al mètode de referència (16%), mantenint l'especificitat clínica al 100%. / [EN] The diagnosis of ß-lactam antibiotics allergy involves using unsatisfactory in vivo tests that are time-consuming and carry the risk of triggering a new allergic reaction. On the other hand, in vitro methods based on allergen-specific IgE immunodetection generate precious information, confirming or ruling out allergies and postulating themselves as a safe diagnostic alternative. Despite this, current in vitro tests lack sensitivity and accuracy, with 81% false negatives limiting their diagnostic use. This has led to a growing demand for new in vitro tests based on the immunodetection of IgE, the most studied biomarker in serum allergy. However, the lack of reference standards for allergen-specific IgE has made it impossible to validate and standardize methods, which means that the results of the different tests are not comparable. Furthermore, this lack of reference standards means that specific IgE concentrations are calculated from a total IgE calibration curve by heterologous interpolation, which has been shown not to be entirely correct. For the reasons mentioned above, the main objective of this doctoral thesis is to design, obtain and characterize recombinant proteins with reactivity against ß-lactam antibiotics. This research begins with developing an ELISA immunoassay with chemiluminescent detection for quantifying specific IgE. The assay developed allowed the determination of specific IgE below 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), thus allowing the identification of allergic patients with greater sensitivity, using only 25 µL of sample (serum). The immunoassay showed good sensitivity (64.6%) and excellent specificity (100%), significantly improving the predictive character of existing in vitro tests. Next, the obtaining and characterizing recombinant proteins similar to ß-lactam-specific IgE was approached using the Phage Display methodology. The first approach deals with a protein consisting of two single-domain antibodies that mimics the behavior of a specific IgE. In this way, recombinant proteins were obtained in which one of the nanobodies selectively recognizes an antigenic determinant of a ß-lactam antibiotic, while the other specifically recognizes the paratope of an anti-IgE detector antibody. These constructs were found to be stable and functional. The role of these recombinant proteins as a homologous calibrator was studied by determining the concentration of penicillin G-specific IgE present in serum by employing a chemiluminescent assay. The developed method doubled the clinical sensitivity (66%) compared to the reference method (28%), while maintaining a clinical specificity of 100%. At this point, the thesis focused on the production of recombinant specific IgE using as starting material the DNA of a patient allergic to amoxicillin and penicillin G. in combination with the Phage Display, antibody engineering and expression methods in insect cells, a recombinant-specific IgE was produced. In this way, a biological product was obtained that meets the requirements for its adoption as reference material in in vitro assays. Likewise, it was used as a homologous calibrator for the determination of specific IgE to amoxicillin. A detection limit of 0.05 IU/mL was achieved, which increased clinical sensitivity (73%) fourfold compared to the reference method (16%), while maintaining clinical specificity at 100%. / This work was supported by CSIC 2007-348, ANII FMV 2019_156321, and ANII FMV 2018_148245. P.Q.-C. acknowledges financial support from Generalitat Valenciana through the research staff training program (GVA ACIF/2018/173). This research was also funded by Agencia Estatal de Investigación (PID2019-110713RB-I00, FEDER), program UPV-La FE 2019 (P105 VALBIOAL), and PROMETEO/ 2020/094 / Quintero Campos, P. (2022). Diseño, obtención y caracterización de proteínas recombinantes a partir de determinantes antigénicos asociadas a reacciones alérgicas a ß-lactámicos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191429 / Compendio

Tesis por compendio / [ES] Enmarcada en la línea de investigación de nuestro laboratorio sobre señalización por nitrógeno principalmente en la cianobacteria Synechococcus elongatus PCC7942, con esfuerzos centrados en las proteínas PII y PipX y su red de señalización, esta Tesis amplía el espectro de moléculas investigadas en relación con dicha red. Estudia y caracteriza el miembro no canónico de la superfamilia de la proteína PII denominado CutA, generalmente anotado como de protección frente a metales divalentes, altamente conservado en todos los dominios de la vida (incluidos animales y el ser humano). En ella examinamos la posible protección frente a metales provista por CutA en dos bacterias muy distantes, Escherichia coli y Synechococcus elongatus, usando knockouts para ambas del gen que codifica para CutA. Ni los estudios de complementación en E. coli del gen silvestre ni los observacionales de sensibilidad a metales en S. elongatus han dado soporte a la función anotada para CutA, a pesar de que demostramos mediante seguimiento turbidimétrico que el Cu2+ hace agregar a la proteína CutA pura de S. elongatus (producida recombinantemente) y por tanto se une a ella, aunque con una afinidad baja por comparación con las concentraciones tóxicas de este metal para dicha cianobacteria. Buscando profundizar en el conocimiento de CutA, hemos determinado a muy alta resolución mediante difracción de rayos X la estructura de esta proteína de S. elongatus, sin evidenciar complejo alguno con cobre, pero demostrando que los tres bolsillos intersubunidades en el homotrímero de CutA son capaces de transportar moléculas orgánicas (en nuestro caso Bis-Tris). Estos resultados apoyan una posible función de CutA basada en la unión a estos bolsillos de biomoléculas neutras o positivamente cargadas y capaces de formar varios puentes de hidrógeno con las paredes de potencial negativo y fuerte carácter polar de estos bolsillos. También hemos estudiado la proteína PipY de S. elongatus, identificada recientemente como pareja funcional de la antes mencionada PipX, determinando sus propiedades espectroscópicas, unión de piridoxal fosfato (PLP) y resolviendo su estructura mediante difracción de rayos X. Probamos que PipY es monomérica y que tiene PLP unido. Su estructura no apoya que sea un enzima, siendo aparentemente apropiada para ejercer una posible función en la homeostasis de PLP. Dado que muy recientemente se ha descrito una epilepsia genética humana dependiente de vitamina B6 debida a mutaciones en el gen humano ortólogo de pipY, PROSC (ahora llamado PLPBP; codifica la proteína PLPHP), usamos inicialmente PipY de S. elongatus y luego PROSC humana como banco de pruebas de la patogenicidad de las mutaciones que se han asociado a esta epilepsia, utilizando para ello mutagénesis dirigida y producción de las formas silvestre y mutantes de estas proteínas, comparando sus propiedades. Estos estudios han demostrado la patogenicidad y establecido mecanismos para la misma para cada una de las mutaciones de cambio de sentido de PROSC descritas hasta ahora en esta epilepsia. Nuestros estudios han representado un importante avance en la comprensión de las proteínas de tipo PipY y de la epilepsia asociada a la forma humana de las mismas. / [CA] Emmarcada en la línia d'investigació del nostre laboratori de senyalització per nitrogen principalment en el cianobacteri Synechococcus elongatus PCC7942, amb esforços centrats en les proteïnes PII i PipX i la seua xarxa de senyalització, esta Tesi amplia l'espectre de molècules investigades en relació amb la dita xarxa. Estudia i caracteritza el membre no canònic de la superfamília de la proteïna PII denominat CutA, generalment anotat com de protecció a metalls divalents, altament conservat en tots els dominis de la vida (inclosos animals i l'ésser humà). En ella examinem la possible protecció front a metalls proveïda per CutaA en dos bacteris molt distants, Escherichia coli i Synechococcus elongatus, usant knockouts del gen que codifica CutA per a ambdues. Ni els estudis de complementació en E. coli del gen silvestre ni els observacionals de sensibilitat a metalls en S. elongatus han donat suport a la funció anotada per CutA, tot i que vam demostrar mitjançant seguiment turbidimétric que el Cu2 + fa agregar a la proteïna CutA pura de S. elongatus (produïda de forma recombinant) i per tant s'uneix a ella, encara que amb una afinitat baixa per comparació amb les concentracions tòxiques d'aquest metall per a aquest cianobacteri. Buscant aprofundir en el coneixement de CutA, hem determinat a molt alta resolució mitjançant difracció de raigs X l'estructura d'aquesta proteïna de S. elongatus, sense evidenciar cap complex amb coure, però demostrant que les tres cavitats formades entre les subunitats del homotrimer de CutA són capaços de transportar molècules orgàniques (en el nostre cas Bis-Tris). Aquests resultats donen suport a una possible funció de CutA basada en la unió a aquestes cavitats de biomolècules neutres o positivament carregades i capaços de formar diversos ponts d'hidrogen amb les parets de potencial negatiu i fort caràcter polar d'aquestes cavitats. També hem estudiat la proteïna PipY de S. elongatus, identificada recentment com a parella funcional de l'abans esmentada PipX, determinant les seves propietats espectroscòpiques, unió de piridoxal fosfat (PLP) i resolent la seva estructura mitjançant difracció de raigs X. Vam provar que PipY és monomèrica i que té PLP unit. La seva estructura no recolza que sigui un enzim, sent aparentment apropiada per a exercir una possible funció en l'homeòstasi de PLP. Atès que molt recentment s'ha descrit una epilèpsia genètica humana dependent de vitamina B6 deguda a mutacions en el gen humà ortòleg de pipY, PROSC (ara anomenat PLPBP; codifica la proteïna PLPHP), fem servir inicialment PipY de S. elongatus i després PROSC humana com banc de proves de la patogenicitat de les mutacions que s'han associat a aquesta epilèpsia, utilitzant mutagènesi dirigida i produint les formes silvestre i mutants d'aquestes proteïnes, comparant les seves propietats. Aquests estudis han demostrat la patogenicitat i establert mecanismes per a la mateixa per a cadascuna de les mutacions de canvi de sentit de PROSC descrites fins ara en aquesta epilèpsia. Els nostres estudis han representat un important avanç en la comprensió de les proteïnes de tipus PipY i de l'epilèpsia associada a la forma humana de les mateixes. / [EN] In the context of research of our laboratory on nitrogen signaling mainly in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC7942, with efforts focused on the PII and PipX proteins and their signaling network, this Thesis extends the spectrum of molecules investigated in relation to such network. It studies and characterizes the non-canonical member of the PII protein superfamily named CutA, a highly conserved protein in all domains of life (including animals and humans) which is generally annotated as protecting against divalent metals. We examine the possible protection provided by CutA against metals, using knockouts for the CutA-encoding gene of two phylogenetically distant bacteria, Escherichia coli and Synechococcus elongatus PCC7942. Neither complementation studies in E. coli by the wild-type gene, nor observational studies of sensitivity to metals in the S. elongatus knockout have supported the function annotated for CutA, although we show by turbidimetric monitoring that Cu2+ causes aggregation of pure S. elongatus CutA (produced recombinantly) and therefore binds to it, although with a low affinity by comparison with the concentrations of this metal that are toxic for this cyanobacterium. Aiming at getting further insight into CutA, we have determined at very high resolution, by X-ray diffraction, the structure of this protein of S. elongatus, failing to observe Cu2+ bound in this structure, but showing that the three pockets formed at intersubunit boundaries in the CutA homotrimer are capable of transporting organic molecules (in our case Bis-Tris) without inducing conformational changes in the protein. This finding supports a possible function of CutA based on the binding to these pockets of neutral or positively charged biomolecules capable of forming several hydrogen bonds with the pocket walls, which are endowed with negative potential and have a strong polar character. We have also studied the PipY protein of S. elongatus, recently identified as a functional partner of the aforementioned PipX, determining its spectroscopic properties, binding of pyridoxal phosphate (PLP) and solving its structure by X-ray diffraction. We prove that PipY is monomeric and has PLP attached. Its structure does not favor an enzymatic role of PipY, being more appropriate for exerting a possible function in the homeostasis of PLP. Given the very recent description of a human vitamin B6-dependent genetic epilepsy associated to mutations in the human orthologue of the pipY gene, PROSC (now called PLPBP, encoding the PROSC protein, now named PLPHP), we used first S. elongatus PipY and afterwards and more extensively human PROSC to test by site-directed mutagenesis the pathogenicity of the mutations that have been associated with this epilepsy. These studies have demonstrated the pathogenicity and established mechanisms for this pathogenicity for each of the missense mutations reported thus far in patients with PROSC-associated epilepsy. Our studies represent an important advance in the understanding of PipY-like proteins and of epilepsy associated with the human form thereof. / Para la realización de esta Tesis, Lorena Tremiño Agulló ha disfrutado de una Beca de Formación de Personal Investigador (FPI) (BES-2012-058304) otorgado por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. El trabajo se ha llevado a cabo en el grupo 739 del CIBERER-Instituto de Salud Carlos III (IP, V. Rubio) y se ha enmarcado dentro de los proyectos: -“Luz estructural sobre señalización y regulación por nitrógeno y sobre biosíntesis de arginina/urea, sus errores congénitos, y su conexión con biología del envejecimiento”, (BFU2011-30407) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal,V. Rubio). -“Una mirada molecular al control de la detoxificación de amonio y a sus patologías y errores congénitos, y a la señalización por amonio. En busca del papel de la proteína CutA”, (BFU2014-58229) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal, V. Rubio). -"BioMeder. Genes, proteínas y rutas de señalización en enfermedades raras" (PrometeoII/2014/029) de la Conselleria d'Educació de la Generalitat Valenciana (investigadores, P. Sanz, A. Marina y V. Rubio). / Tremiño Agulló, L. (2019). Bases estructurales de la señalización y regulación por nitrógeno y procesos asociados [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/117999 / Compendio

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3α e MSP-3β foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo α-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3α (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3α and MSP-3β were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of α-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3α (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3α and MSP-3β can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3950.pdf: 2965296 bytes, checksum: 1e00d517bd464f272b8c1a2c9f67ca9c (MD5) Previous issue date: 2011-10-11 / Valée S.A. / Swine erysipelas is among the diseases that causes great economic losses in swine cultures worldwide. The disease is caused by the bacterium Erysipelothrix rhusiopathiae, and the surface protein SpaA is one of its main antigens. Herein, we report studies concerning the development of recombinant vaccines against swine erysipelas based on the SpaA antigen. Protein production for a subunit vaccine formulation was studied in shaken flasks and 5.0 L bioreactors. For this propose, a 1026 bp fragment of the spaA gene was cloned in Escherichia coli cells under the lac promoter control. The recombinant organism (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) was cultivated in fed batch using complex medium with glycerol as carbon source. Nonconventional induction strategies were evaluated and high protein yield (198 mgprot/gDCW) and productivity values (0.4 gprot/L.h) were reached. The same antigen was cloned for expression and secretion in attenuated Salmonella typhimurium cells to obtain a live bacterial vector for the SpaA antigen. The recombinant lineage was able to express and secrete the SpaA fragment fused to the alpha-hemolysin secretion signal both in vitro and in vivo. High plasmid maintenance was observed in both conditions. The vaccinal vehicle showed to be able to colonize the Peyer patches and to invade the gut epithelial barrier in the inoculated animals. Immunization tests in murine model showed that the recombinant antigen delivered by Salmonella cells inoculated by oral route induced the production of seric IgG antibodies anti-SpaA. According to the literature, these antibodies must be able to promote pathogen opsonization in case of infection, contributing to confer a protective immunity against swine erysipelas to the vaccinated animals. In summary, this work presents contributions to development of subunit vaccines against swine erysipelas, in the form of recombinant protein formulations, or SpaA antigen delivery by attenuated S. typhimurium cells. / A erisipela suína é uma das enfermidades que causam grandes prejuízos na suinocultura em todo o mundo. A doença é causada pela bactéria Erysipelothrix rhusiopathiae, e a proteína de superfície SpaA desse microrganismo é um de seus principais antígenos. Neste trabalho, estudou-se o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a erisipela suína a partir do antígeno SpaA. Avaliou-se a produção de uma vacina de subunidade composta pelo antígeno recombinante, a qual foi estudada em frascos agitados e em biorretores de bancada de 5,0 L. Para isso, um fragmento de 1026 pb do gene spaA foi clonado em células de Escherichia coli sob controle do promotor lac e o organismo recombinante (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) foi cultivado em batelada alimentada, utilizando-se meio complexo contendo glicerol como fonte de carbono. Estratégias não convencionais de indução foram avaliadas e altos valores de rendimento (198 mgprot/gDCW) e produtividade (0,4 gprot/L.h) da proteína recombinante foram alcançados. O mesmo antígeno foi clonado em um plasmídeo que possibilita a expressão e secreção da proteína recombinante em Salmonella typhimurium atenuada, a fim de se obter um vetor bacteriano vivo para o antígeno em questão. A linhagem recombinante foi capaz de expressar e secretar o fragmento da proteína SpaA fusionado ao sinal de secreção da alfa-hemolisina tanto in vitro quanto in vivo, apresentando alta taxa de manutenção plasmidial nas duas condições. Além disso, o veículo vacinal se mostrou capaz de colonizar as placas de Peyer e de invadir a barreira epitelial do intestino dos animais inoculados. Ensaios de imunização em modelo murino mostraram que a veiculação do antígeno pelas células de Salmonella inoculadas por via oral induziu a produção de anticorpos IgG séricos anti-SpaA, que de acordo com a literatura, devem ser capazes de promover a opsonização do patógeno em caso de infecção, contribuindo para conferir uma imunidade protetora contra a erisipela suína aos animais vacinados. Em suma, este trabalho apresenta contribuições para o desenvolvimento de vacinas de subunidade contra a erisipela suína na forma de uma vacina de proteína recombinante, ou por veiculação do antígeno SpaA por linhagens atenuadas de S. typhimurium.

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3α e MSP-3β foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo α-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3α (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3α and MSP-3β were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of α-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3α (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3α and MSP-3β can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.