Atualmente, o Brasil encontra-se na privilegiada posição de maior produtor e exportador mundial de carne bovina, tornando a pecuária uma das atividades nacionais mais importantes e rentáveis. Este dado enfatiza a importância de pesquisa e desenvolvimento em reprodução bovina, especialmente em hormônios estimuladores da ovulação, tais como a gonadotrofina coriônica equina (eCG). Os produtos comerciais à base de eCG comercialmente disponíveis são purificados a partir do sangue de éguas gestantes, apresentando variabilidade de lote para lote e presença de contaminantes. Estes fatos, juntamente com a limitação do material de partida (sangue equino), enfatizam a necessidade de haver um sistema de expressão de eCG recombinante passível de ser explorado comercialmente. Neste quesito, as células de mamíferos se mostram um sistema robusto para tal finalidade, visto que são capazes de adicionar modificações pós-traducionais às cadeias polipeptídicas, tais como a glicosilação, o que é essencial para o correto dobramento, maturação e montagem das duas subunidades, além de interferir diretamente com a meia-vida, o reconhecimento do receptor, a solubilidade e a atividade biológica das proteínas. No entanto, mesmo entre os sistemas de expressão heteróloga em células de mamífero, encontra-se muita variabilidade nos padrões de glicosilação adicionado. No presente trabalho, foi realizado um estudo comparativo através da clonagem e expressão de uma forma fusionada de eCG (reCGβα) em duas linhagens celulares diferentes: (1) CHO-DG44, um dos sistemas de expressão mais utilizados pelas indústrias farmacêuticas, capaz de adicionar N-glicanos complexos; e (2) 293T, uma linhagem humana capaz de produzir glicoproteínas carreando oligossacarídeos complexos e sialilados. Os resultados de atividade biológica (in vitro e in vivo) apontam uma maior atividade de reCG produzido por células CHO-DG44. O perfil de N-glicosilação de reCG produzido pelas células CHOD-G44 assemelhou-se mais à eCG selvagem, quando comparado a reCG produzido por células 293T. Por fim, estudos clínicos foram realizados com reCG produzido em meio livre de soro fetal bovino e parcialmente purificado, onde atividade específica de reCG produzido por células CHO-DG44 mostrou-se similar ao produto comercial selvagem. / Brazil is currently the major beef producer and exporter, rendering to livestock one of the country´s most economically relevant activities. This emphasizes the importance of research and development in bovine reproduction, especially at ovulation-stimulatory hormones, such as equine gonadotropin (eCG). The commercially available eCG-based products are purified from blood of pregnant heifers, presenting batch-to-batch variability and the presence of contaminants. These facts, together with the limitation of the bulk material (equine blood), emphasize the need of an eCG expression system able to be commercially explored. In this aspect, mammalian cells are a robust system, capable of add post-translational modifications to polypeptide chains, such as glycosylation, which is essential for the correct folding, maturation and assembly of both eCG subunits. In addition, glycosylation directly interferes with the protein half-life, receptor recognition, solubility and biological activity. In the present work, a comparative study was carried out by cloning and expressing a fusion form of eCG (reCGβα) in two different mammalian cell lines: (1) CHO-DG44, one of the most used by pharmaceutical companies expression systems, capable of add complex-type N-glycans; and (2) 293T, a human cell line capable of produce glycoproteins carrying complex and sialylated oligosaccharides. The in vitro and in vivo biological activity results show a higher potency of reCG produced by CHO-DG44 cells. The N-glycosylation pattern produced by CHO-DG44 cells was more similar to native eCG in comparison to the N-glycosylation produced by 293T cells. Finally, clinical studies were performed with serum absent media produced and partially purified reCG, showing that the specific activity of reCG produced by CHO cells was similar to the commercial wild type product.

Deficiência na enzima lisossomal glucocerebrosidase (GCR) resulta na doença de Gaucher. O tratamento atual consiste na administração da enzima exógena, produzida em células CHO. Porém, o medicamento disponível no mercado é extremamente custoso. Neste trabalho, propusemos a clonagem e a expressão da GCR humana em células CHO, visando a obtenção de um clone celular produtor para viabilizar a produção futura da enzima, a um custo menor, no Instituto Butantan. A expressão estável da GCR recombinante foi obtida a partir da transfecção de células CHO-dhfr- com o plasmídeo pED de expressão em células de mamíferos contendo o cDNA da GCR, seguido de amplificação gênica por MTX. A GCR foi detectada no extrato celular (~ 64 kDa) e secretada para o sobrenadante (63-69 kDa) em ensaios de western blotting, usando o anticorpo policlonal anti-GCR gerado neste trabalho. A enzima secretada hidrolisou o substrato 4-MUG e a sua produtividade foi estimada em 5,14 pg/célula/dia para o melhor subclone produtor, selecionado para a produção futura da GCR em larga escala. / Deficiency of the lysosomal glucocerebrosidase (GCR) enzyme results in Gaucher\'s disease. Current treatment consists on enzyme replacement therapy by the administration of recombinant GCR produced in CHO cells. However, the medicine available in the market is extremely expensive. In this work, we proposed the cloning and expression of human GCR in CHO cells, in order to obtain a productive cellular clone for future production of GCR enzyme at a lower cost at the Butantan Institute. The stable expression of recombinant GCR was obtained after transfection of CHO-dhfr- cells with pED mammalian expression vector containing the GCR cDNA, followed by gene amplification with MTX. The GCR was detected by western blotting analysis, either as cell-associated (~ 64 kDa) or as secreted forms (63-69 kDa), using the anti-GCR polyclonal antibody produced in this work. The secreted enzyme was active on 4-MUG and was produced at a level of about 5,14 pg/cell/day for the best producer subclone, selected for subsequent steps of GCR production on large scale in next future.

O Cancro Cítrico, um dos mais graves problemas fitossanitários da citricultura atual, é uma doença causada pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Um estudo funcional do genoma de Xac foi iniciado com o intuito de identificar interações proteína-proteína envolvidas em processos de patogenicidade de Xac. Através da utilização do sistema duplo-híbrido de levedura, baseado nos domínios de ligação ao DNA e ativação da transcrição do GAL4, nós analisamos os principais componentes dos mecanismos de patogenicidade de Xac, incluindo o Sistema de Secreção do Tipo III (TTSS), Sistema de Secreção do Tipo IV (TFSS) e Sistema de \"Quorum Sensing\" composto pelas proteínas Rpf. Componentes desses sistemas foram utilizados como iscas na triagem de uma biblioteca genômica de Xac. O TTSS é codificado pelos genes denominados hrp (\"hypersensitive response and pathogenicity\"), hrc (\"hrp conserved\") e hpa (\"hrp associated\") localizados no locus hrp do cromossomo de Xac. Esse sistema de secreção é capaz de translocar proteínas efetoras do citoplasma bacteriano para o interior da célula hospedeira. Nossos resultados mostraram novas interações proteínaproteína entre componentes do próprio TTSS além de associações específicas com uma proteína hipotética: 1) HrpG, um regulador de resposta de um sistema de dois componentes responsável pela expressão dos genes hrp, e XAC0095, uma proteína hipotética encontrada apenas em Xanthomonas spp; 2) HpaA, uma proteína secretada pelo TTSS, HpaB e o domínio C-terminal da HrcV; 3) HrpB1, HrpD6 e HrpW, 4) HrpB2 e HrcU e 5) interações homotrópicas envolvendo a ATPase HrcN. Em Xac, foram encontrados dois loci vir que codificam proteínas que possuem similaridade com componentes do TFSS envolvido em processos de conjugação/secreção bacteriana: TFSS-plasmídeo localizado no plasmídeo pXAC64 e TFSS-cromossomo localizado no cromossomo de Xac. O TFSS-plasmídeo, o qual possui maior similaridade com sistemas de conjugação, mostrou interações envolvendo proteínas cujos genes estão localizados na mesma região do plasmídeo pXAC64: 1) interação homotrópica da TrwA; 2) XACb0032 e XACb0033; 3) interações homotrópicas da proteína XACb0035; 4) VirB1 e VirB9; 5) XACb0042 e VirB6; 6) XACb0043 e XACb0021b. O TFSS-cromossomo apresentou interações envolvendo as proteínas: 1) VirD4 e um grupo de 12 proteínas que contém similaridade entre si, incluindo XAC2609 cujo gene encontra-se no locus vir, 2) XAC2609 e XAC2610; 3) Interações homotrópicas da VirB11; 4) XAC2622 e VirB9. A análise do sistema de \"Quorum-Sensing\" composto pelas proteínas Rpf mostrou interações envolvendo componentes do próprio sistema: 1) RpfC e RpfF; 2) RpfC e RpfG; 3) interações homotrópicas da RpfF; 4) RpfC e CmfA, uma proteína similar a Cmf de Dictyostelium discoideum que, neste organismo, é fundamental para processos de \"quorum-sensing\". As interações proteína-proteína encontradas permitiram-nos entender melhor a composição, organização e regulação dos fatores envolvidos na patogenicidade de Xac. / Citrus Canker, caused by the bacterial plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) presents one of the most serious problems to Brazilian citriculture. We have initiated a project to identify protein-protein interactions involved in pathogenicity of Xac. Using a yeast two-hybrid system based on GAL4 DNA-binding and activation domains, we have focused on identifying interactions involving subunits, regulators and substrates of: Type Three Secretion System (TTSS), Type Four Secretion System (TFSS) and Quorum Sensing/Rpf System. Components of these systems were used as baits to screening a random Xac genomic library. The TTSS is coded by the hrp (hypersensitive response and pathogenicity), hrc (hrp conserved) and hpa (hrp associated) genes in the chromosomal hrp locus. This secretion system can translocate efector proteins from the bacterial cytoplasm into the host cells. We have identified several previously uncharacterized interactions involving: 1) HrpG, a two-component system response regulator responsible for the expression of Xac hrp operons, and XAC0095, a previously uncharacterized protein encountered only in Xanthomonas spp; 2) HpaA, a protein secreted by the TTSS, HpaB and the C-terminal domain HrcV; 3) HrpB1, HrpD6 and HrpW; 4) HrpB2 and HrcU; 5) Homotropic interactions were also identified for the ATPase HrcN. Xac contains two virB gene clusters, one on the chromosome and one on the pXAC64 plasmid, each of which codes for a unique and previously uncharacterized TFSS. Components of the TFSS of pXAC64, which is most similar to conjugation systems, showed interactions involving proteins coded by the same locus: 1) Homotropic interactions of TrwA; 2) XACb0032 and XACb0033; 3) XAC0035 homotropic interactions; 4) VirB1 and VirB9; 5) XACb0042 and VirB6; 6) XACb0043 and XACb0021 b. Components of the chromosomal TFSS exhibited interactions involving: 1) VirD4 and a group of 12 uncharacterized proteins with a common C-terminal domain motif, include XAC2609 whose gene resides within the vir locus; 2) XAC2609 and XAC261 O; 3) Homotropic interactions of VirB11; 4) XAC2622 and VirB9. Analysis of Quorum Sensing/Rpf System components revealed interactions between the principal Rpf proteins which control Xanthomonas quorum sensing: 1) RpfC and RpfF; 2) RpfC and RpfG; 3) RpfF homotropic interactions; 4) RpfC and CmfA, a protein that presents similarity with Cmf (conditioned medium factor) of Dictyostelium discoideum, which contrais quorum sensing in this organism. The protein-protein interactions that we have detected reveal insights into the composition, organization and regulation of these important mechanisms involved in Xanthomonas pathogenicity.

A esquistossomose é a mais importante das doenças helmínticas humanas em termos de morbidez e mortalidade. A proteína Sm14 de Schistosoma mansoni, que pertence à família de proteínas ligadoras de ácidos graxos (fatty acid-binding proteins, FABPs) (Moser et al., 1991), mostrou um bom nível de proteção (65%) contra a esquistossomose em animais experimentais (Tendler et al., 1996). No presente trabalho foram desenvolvidos sistemas de expressão que possibilitará a produção da proteína Sm14 em larga escala em E.coli. Com o intuito de conhecer a estrutura do gene da proteína Sm14, foi clonado um fragmento de DNA genômico de S. mansoni que contém a seqüência codificante da proteína Sm14. Como os outros membros da família gênica das FABP, o gene para a proteína Sm14 contém quatro \"exons\" separados por três \"introns\" de 674, 585 e 42 bp. Esta é a primeira descrição da estrutura gênica de um membro das FABP correspondente a um helminto. A Sm14 é uma proteína que pode ser potencialmente usada como vacina. Estudamos a existência de polimorfismo em duas linhagens de S. mansoni endêmicas do Brasil: LE e BH. Para a análise de polimorfismo, a ORF correspondente à proteína Sm14 foi amplificada por RT-PCR do RNA total de vermes adultos de S. mansoni. Os produtos de amplificação independentes foram clonados no vetor pGEM-T e seqüenciados. As análises de seqüências mostraram duas isoformas principais para a proteína Sm14: Sm14-M20, com seqüência idêntica a proteína Sm14 previamente reportada para a linhagem de Puerto Rico de S. mansoni (Moser et AL., 1991), e Sm14-T20, onde o códon da Met20 (ATG) mudou para o códon de Thr (ACG) (polimorfismo M20T). Dois clones mostraram uma deleção de seqüência de aminoácidos correspondente ao \"exon\" 3 inteiro (clones ΔExon3), gerada por \"splicing\" alternativo. As outras trocas observadas acontecem em posições onde os aminoácidos são menos conservados e estão representados apenas por um único clone que podem ter sido obtidas por mutagênese na PCR. A metionina correspondente à posição 20 na Sm14 é altamente conservada nas FABP dos mais diversos organismos,e não se tem nenhuma outra proteína com treonina nesta posição. Para o estudo da estrutura e função destas isoformas, os cDNAs correspondentes foram subclonados no vetor pAE (desenvolvido no nosso laboratório), assim como o mutante M20A (Sm14-A20) construído para efeitos de comparação. A estabilidade e estrutura das proteínas recombinantes purificadas foram caracterizadas por dicroísmo circular (CD). A comparação da estrutura e termoestabilidade mostrou que as formas Sm14-T20 e Sm14-A20 são menos termoestáveis do que a Sm14-M20 (um ΔTm de aproximadamente 10°C). Porém, todas as formas de Sm14 foram capazes de ligar o DAUDA [ácido 11-(dansylamino) undecanoico] com a mesma afinidade. Para poder diferenciar as propriedades de ligação de ácidos graxos pelas isoformas, experiências de competição do deslocamento do DAUDA por ácidos graxos naturais, foram realizadas. A partir destes dados podemos assumir que a forma Sm14-M20 liga melhor todos os ácidos graxos naturais testados do que a forma Sm14-T20. Porém esta forma mantém a capacidade de ligar ácidos graxos, ao contrario do mutante Sm14-A20. Pode-se deduzir como resultado destas experiências que a proteína Sm14-M20 é mais estável e liga com maior afinidade os ácidos graxos naturais do que a forma Sm14-T20. Pelo visto, a proteína Sm14-T20 tem menos estrutura-β, porém, mantém a capacidade de ligar moléculas hidrofóbicas. Ainda é desconhecido o papel funcional do polimorfismo da proteína Sm14 no metabolismo dos vermes de S. mansoni. Problemas de estabilidade da proteína Sm14 recombinante, durante seu transporte e armazenamento, comprometem sua viabilidade como vacina. Com o intuito de melhorar a estabilidade desta proteína, foi feita uma mutagênese no único resíduo de cisteína presente na Sm14 na posição 62. Este resíduo é responsável pela formação de dímeros, o que é relacionado a estabilização da perda de estrutura-β e precipitação da proteína. Esta cisteína foi trocada por serina (C62S) e por valina (C62V) por mutagênese sítio dirigida, resultando nas proteínas Sm14-M20S62 e Sm14-M20V62. As formas mutantes não apresentaram maior termoestabilidade, mas a renaturação após o aquecimento a 80°C atingiu quase 100%, diferentemente das proteínas com Cys62. As proteínas com o resíduo de cisteina trocado foram as únicas formas que conservaram a estrutura de β-barril após 3 meses de armazenamento a 4°C, como mostram as análises de dicroísmo circular, sendo a forma mais estável a proteína Sm14-M20V62. Após estes estudos, a isoforma Sm14-M20 com a mutação C62V (Sm14-M20V62) mostrou-se como a melhor alternativa ao antígeno Sm14-T20 usado até agora como modelo de vacina experimental para S. mansoni. Esta indicação deve ser confirmada em ensaios de imunização e posterior desafio com cercárias de S. mansoni. / The schistosomiasis is the most important human helmintic disease in terms of morbidity and mortality. The Sm14 protein of Schistosoma mansoni belongs to the family of fatty acid-binding proteins (FABPs) (Moser et aI. , 1991) and showed a good protection level as vaccine antigen against the schistosomiasis in experimental animals (Tendler et al., 1996). In the present work were developed systems for the expression of Sm14 protein that will facilitate its large scale production in E.coli.. In order to know the gene structure of the Sm14 protein, we amplified by PCR a genomic DNA fragment of S. mansoni that contains the coding sequence for the Sm14 protein. As the other members of the FABP family, the Sm14 gene contains four exons separated by three introns of 674,585 and 42 bp, respectively. This is the first detailed description of the genomic structure for a member of FABPs corresponding to a helmint. We also studied the existence of polymorphisms within two Brazilian endemic strains of S.mansoni: LE and BH. For the polymorphism analysis, the ORF corresponding to the Sm14 protein was amplified by RT-PCR from total RNA of S. mansoni adult worms. The independent amplified products were cloned into pGEM-T vector and sequenced. The sequence analyses showed two main isoforms: Sm14-M20, with identical sequence to that previously reported Sm14 protein from the Puerto Rican strain of S. mansoni (Moser et al., 1991), and Sm14-T20, where the codon for Met20 (ATG) was changed for the Thr codon (ACG) (M20T polymorphism). Two clones showed the same amino acid sequence deletion corresponding to the whole third exon (ΔExon3 clones), generated by alternative splicing. The other observed changes occurred in positions where the amino acids were less conserved and were just represented by only one clone that could be obtained by PCR mutagenesis. The methionine corresponding to the position 20 in Sm14 is highly conserved among FABPs and no other related protein has threonin in this position. To study the structure and function of these amino acid in the isoforms, the corresponding cDNAs were subcloned in to the pAE vector (developed in our laboratory), as well as the mutant M20A (Sm14-A20). The stability and structure of the purified recombinant proteins were characterized by circular dicroism (CD). The comparison of their structure and thermo stability showed that the forms Sm14-T20 and Sm14-A20 are less thermostable than Sm14-M20 (ΔTm around 10ºC). However, all of the Sm14 forms were capable to bind the DAUDA [11- (dansylamine) undecanoic acid] with similar affinities. To differentiate the fatty acid binding properties of Sm14 isoforms, displacement experiments of DAUDA with natural fatty acid were performed. From these data we can assume that the Sm14-M20 form binds better than the Sm14-T20 and Sm14-A20 forms of all natural fatty acid assayed. This suggests that the Sm14-20 protein is most stable and binds better the natural fatty acids than the Sm14-T20 form. Although the Sm14-T20 protein has less structure, it maintains the capacity to bind fatty acids. It is still unknown the functional role of this Sm14 protein polymorphism in the metabolism of S. mansoni worms. Stability problems of the recombinant Sm14 protein during its transport and storage, could hamper its use as vaccine. With the aim to improve the stability of this protein, it was made a mutagenese at the unique cysteine residue present in Sm14 at the position 62. This residue is responsible for the dimer formation and is related the loss of the terciary structure and precipitation of the protein. This cysteine was changed by serine (C62S) and for valine (C62V) by site directed mutagenesis, resulting in the proteins Sm14-M20S62 and Sm14-M20V62. The mutant forms did not present a higher thermal stability but the renaturation after heating at 80°C almost reached 100%, in contrast to Sm14 proteins with Cys62. These mutants conserved the β-barrel structure after 3 months of storage at 4°C, in contrast to proteins with Cys62, as shown by circular dicroism analyses. After these studies, the Sm14-M20 isoform with the C62V mutation (Sm14-M20V62) was considered the best alternative to the antigen Sm14-T20 used up to now as the model for an experimental vaccine for S. mansoni. This indication should be confirmed by immunization and posterior challenge with S. mansoni cercaria.

O protozoário Neospora caninum é considerado um dos principais causadores de abortos infecciosos na pecuária de corte e de leite no mundo. No Brasil, a presença do parasita varia de acordo com a região do país e com o tipo de rebanho, com perdas maiores na agroindústria do leite que ultrapassam US$ 50 milhões ao ano. A neosporose possui como principal manifestação clínica as perdas fetais ou abortamentos em bovinos, além de comprometimento neuronal esporádico em cães. Apesar da sua importância, a neosporose não possui atualmente tratamento eficaz e as opções de controle envolvem basicamente medidas de prevenção. As vacinas ainda são uma alternativa de desenvolvimento exploradas, sobretudo aquelas que utilizam antígenos recombinantes. Uma dificuldade ao se produzir proteínas recombinantes em sistemas de expressão heterólogos é a formação de corpúsculos de inclusão que são agregados de proteínas insolúveis. Estes agregados devem ser submetidos a processos dispendiosos para tornarem-se ativos, resultando num baixo rendimento da proteína final. Diversos recursos são utilizados para obtenção de proteínas solúveis, desde o emprego de diferentes técnicas de purificação, solubilização até o uso de tags de afinidade. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu e patenteou o vetor pET28/NcMIC2-like1/1081 que possui uma tag rica em ácido glutâmico acoplada, conhecida como Nc1081. Esta tag foi capaz de estimular a solubilidade da proteína micronêmica tipo 2 de N. caninum (NcMIC2-like1) fazendo com que a proteína recombinante (rNcMIC2-like1/1081) fosse expressa na forma solúvel. O presente trabalho procurou dar continuidade ao estudo com a rNcMIC2-like1/1080 e com a tag através da clonagem e expressão de uma outra proteína relacionada à invasão do parasita conhecida como proteína associada à adenil ciclase (NcCAP). A sequência codificadora da proteína foi clonada no vetor contendo a tag Nc1081, a proteína recombinante (rNcCAP/1081) foi expressa com um peso de 38 kDa na forma solúvel em tampão não desnaturante Tris-Cl. No teste de ELISA, as proteínas rNcMIC2-like1 e a rNcCAP acopladas ou não a tag foram detectadas com intensidade semelhante pelos respectivos soros policlonais anti-rNcMIC2-like1 e anti-rNcCAP, demonstrando que a presença da tag não influenciou no reconhecimento das proteínas. As proteínas recombinantes solúveis rNcMIC2-like1/1081 e rNcCAP/1081 ainda foram testadas através de ensaios in vitro de invasão e adesão. No ensaio de invasão, a forma solúvel de NcMIC2-like1 (rNcMIC2-like1/1081) na concentração de 5 ?g/mL, aumentou a invasão das células VERO pelo parasita, enquanto sua forma insolúvel (rNcMIC2-like1) diminuiu a invasão. Já no teste de adesão (binding), foi possível identificar que a rNcMIC2-like1/1081 aderiu à proteína serina treonina fosfatase 2C, ao fator de alongamento alfa 1 e a proteína hipotética identificada ii como NCLIV_029860, enquanto a rNcCAP/1081 aderiu à proteína hipotética NCLIV_041330. O presente trabalho permitiu o início de estudos das propriedades funcionais das proteínas NcMIC2-like1 e NcCAP que seriam inviáveis com suas formas recombinantes insolúveis, demonstrando a aplicabilidade do vetor com a tag 1081. / Neospora caninum parasite is considered as a major cause of infectious abortion in beef and milk cattle in the world. In Brazil, the presence of the parasite varies in dairy or beef herd and according to the region with greater losses in dairy industry that exceed $ 50 million per year. Neosporosis has as main clinical manifestation fetal losses or abortion in cattle, in addition to sporadic neuronal impairment in dogs. Despite its importance, neosporosis has currently no effective treatment and control options rely primarily on preventive measures. Vaccines still represent an alternative explored by the veterinary industry, especially those employing recombinant antigens. The difficulties regarding production of recombinant proteins in heterologous expression systems are formation of inclusion bodies, which are insoluble protein aggregates. These aggregates have to undergo costly procedures to become active, resulting in low yield of final protein. Many techniques are used to obtain soluble proteins ranging from different purification or solubilizing techniques to the use of affinity tags. Our research group has developed and patented a vector pET28/NcMIC2-like1/1081 that has a rich glutamic acid tag attached, known as Nc1081. This tag is capable of stimulating the solubility of the recombinant micronemic protein type 2 like 1 of N. caninum (rNcMIC2-like1), expressingsoluble rNcMIC2-like1/1081. This study aimed to continue the study with rNcMIC2-like1/1080 and the tag by cloning and expressing another protein related to parasite invasion known as cyclase-associated protein (NcCAP). The protein coding sequence was cloned into the vector containing the Nc1081 tag, recombinant protein (rNcCAP/1081) was expressed with a molecular weight of 38 kDa in soluble form in non-denaturing Tris-Cl. In the ELISA test, rNcMIC2- like1 protein and rNcCAP coupled or not with the tag were detected with similar intensities by the respective polyclonal anti-sera rNcMIC2-like1 and antirNcCAP, demonstrating that the tag did not decrease the recognition of the proteins. Soluble recombinant proteins rNcMIC2-like1/1081 and rNcCAP/1081 were also tested in vitro in invasion and binding tests. In the invasion assay, a soluble form of NcMIC2-like1 (rNcMIC2-like1/1081) at a concentration of 5 ?g/mL increased the VERO cell invasion by the parasite, while its insoluble form (rNcMIC2-like1) decreased invasion. In the binding test, the rNcMIC2-like1/1081 bound to protein serine threonine phosphatase 2C, the elongation factor 1 alpha and the hypothetical protein identified as NCLIV_029860, while rNcCAP/1081 bound to the hypothetical protein NCLIV_041330. The current work allowed the initial functional studies of the NcMIC2-like1 and NcCAP proteins, otherwise unfeasible with their insoluble recombinant forms, demonstrating the applicability of the vector with the tag 1081.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1900042 bytes, checksum: b7b1b3c446b79d6611fd389a12e3ffb6 (MD5) Previous issue date: 2013-11-13 / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is responsible for significant economic losses in tropical and subtropical countries around the world. Nowadays, the chemical control for this parasite is affected by the resistance development to several commercial acaricides, which has been reported in many countries. Furthermore, the concerns generated by chemical remains in animal products and the environment makes from this control a problem of high level importance for the public health. Thus, the immunological control becomes a promising alternative because the easy administration, low costs and its contributions to the food security. The objective of this study was to evaluate the lymph nodes response of cattle immunized at field with the peptide rSBm7462 anti Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Fourteen crossbred cattle (Bos taurus x Bos indicus) with degree of blood holstein-zebu and aged 4-10 months were used. The animals were maintained on two farms in the north of Minas Gerais and received three immunizations with the peptide rSBm7462 applied subcutaneously at 30-day intervals. Pre-scapular lymph nodes were collected surgically 15 days after each immunization and fixed in formalin for 18 hours, then they were embedded in paraffin subsequently. Lymph node samples were stained with Hematoxylin-Eosin (HE) for cellular events observation. On the other hand, in order to antigens identifying in immunized animals lymph nodes, the immunohistochemistry (IHC) with peroxidase-anti peroxidase (PAP) method was performed. Lymph node response of cattle inoculated was evaluated by analysis of germinal centers (GC) formation, medullary cords hyperplasia (MC) and antigen rSBm7462 presence in PAP+ cells. This study shows that the recombinant peptide rSBm7462 induces a T-dependent adaptive immune response on lymphoid tissues characterized by the affinity and immunological memory in the secondary lymphoid tissues structure formation. / O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas significativas nos países das regiões tropicais e subtropicais. Atualmente, o controle químico para este parasito é afetado pela geração de resistência aos diversos acaricidas comerciais, ato que tem sido reportado em vários países do mundo. Além disso, a preocupação com os resíduos químicos nos produtos de origem animal e no ambiente é um problema de saúde pública. Portanto, o controle imunológico torna-se uma alternativa promissora devido à sua fácil administração, ser economicamente viável e contribuir na segurança alimentar. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta de linfonodos de bovinos imunizados a campo com o peptídeo rSBm7462 anti Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Foram utilizados 14 bovinos mestiços (Bos taurus x Bos indicus), com grau de sangue variado holandês-zebu, com idades entre 4-10 meses, mantidos em duas propriedades rurais do norte de Minas Gerais. Os animais receberam três imunizações do peptídeo rSBm7462, aplicados por via subcutânea, com intervalo de 30 dias. Após 15 dias de cada imunização, os linfonodos pré-escapulares foram coletados cirurgicamente e fixados por 18 horas em formol. Posteriormente foram incluídos em parafina. As amostras dos linfonodos foram coradas pela técnica hematoxilina-eosina (HE) para a observação de eventos celulares. Para a identificação do antígeno nos linfonodos dos animais imunizados, foi realizada a técnica de imunoistoquimica (IHQ) com o método peroxidase-anti-peroxidase (PAP). A resposta de linfonodos dos bovinos inoculados foi avaliada pelas análises de formação de centros germinais (CG), hiperplasia de cordões medulares (CM) e a presença do antígeno rSBm7462 em células PAP+, demostrando que o peptídeo recombinante rSBm7462 induz uma resposta imune adaptativa T-dependente, caracterizada nos tecidos linfóides secundários pela formação de estruturas que conferem afinidade e memória imunológica.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Toxoplasma gondii is an intracellular parasite that infects virtually all warm-blooded animals, including humans. In human beings, the infection is usually asymptomatic in immunocompetent individuals, but can cause severe clinical manifestations in immunocompromised individuals and in cases of congenital toxoplasmosis. The diagnosis of this infection is usually performed by serological methods that detect IgG, IgM and IgA antibodies in biological samples. The conventional serological assays currently available detect only the exposure to parasite, and there is no serological techniques to accurately estimate the source of infection (oocyst or cyst), which hinders the implementation of prevention and control procedures of this infection. In addition, the serological differentiation between recent and chronic phases of the infection is difficult to achieve in the laboratory routine, making difficult the correct diagnosis of toxoplasmosis, mainly in immunocompromised individuals and pregnant women. In the present study, two recombinant proteins (CCp5A and OWP1) from oocyst/sporozoite of T. gondii were evaluated in serological tests to differentiate infections occurring by ingestion of oocysts or tissue cysts. The reactivity of these two recombinant proteins was assessed, in parallel with soluble Toxoplasma antigen (STAg), against panels of serum samples from animals (chickens, pigs and mice) naturally or experimentally infected by different infective stages of the parasite. Also, we tested sera from humans who have been infected by oocyst during a well-characterized toxoplasmosis outbreak, as well as sera from pregnant women tested IgM+/IgG+ for T. gondii, which source of infection was unknown. Only the sporozoite-specific CCp5A protein was able to differentiate the parasite stage that infected chickens, pigs and mice, with specific reactivity for sera from oocyst-infected animals. Furthermore, this protein showed a preferential reactivity for recent infection by oocyst/sporozoite in pigs and mice. In humans, CCp5A showed higher reactivity with serum samples from the outbreak, compared with serum from pregnant women. Altogether, these findings demonstrate the usefulness of the CCp5A protein as a new tool to identify the parasite stage of T. gondii responsible for the infection (oocyst or tissue cyst). Also, in order to evaluate an alternative antigenic preparation to differentiate the phases of T. gondii infection, whether acute or chronic, a synthetic peptide from the microneme 8 protein (pMIC8) was tested, in parallel with STAg in immunoassays, using serum samples from individuals in different infection phases. Initially, this peptide was used to evaluate the kinetics of IgG antibodies in mice experimentally infected with T. gondii. After, immunoassays using pMIC8 and STAg were conducted to detect IgM, IgA and IgG antibodies in 124 human serum samples divided into five groups, according to the phase of T. gondii infection: Group I (up to 4 months of infection); Group II (5 to 8 months of infection); Group III (9 to 12 months of infection); Group IV (over 12 months of infection); and Group V (seronegative individuals). In the murine model, pMIC8 showed to be a potential marker of recent infection with strong detection of IgG antibodies in the early phase of infection. In humans, IgM and IgA to pMIC8 showed better characterization of the time of T. gondii infection in serum samples from recent phase (up to 12 months of infection), when compared to those tested against STAg. The percentage of IgG detection to pMIC8 was higher in sera from Group I (early acute phase) and lower in sera from Group IV (chronic phase). This pattern was the opposite of those observed to STAg, that showed lower detection percentage in Group I). To underline the differences in IgG detection using pMIC8 and STAg, it was determined a ratio between the ELISA index obtained from both antigenic preparations (STAg/pMIC8), which showed an accurate parameter to differencialte the phases of infection. Overall, these findings suggest that pMIC8 could be a valuable tool to differentiate recent from chronic T. gondii infection. / Toxoplasma gondii é um parasito intracelular que infecta virtualmente todos os animais de sangue quente, incluindo a espécie humana. Nestes hospedeiros, a infecção geralmente é assintomática em indivíduos imunocompetentes, mas em indivíduos imunocomprometidos e em casos de toxoplasmose congênita, as manifestações podem ser graves. O diagnóstico da toxoplasmose é usualmente realizado por métodos sorológicos, com detecção das imunoglobulinas IgG, IgM e IgA em amostras biológicas. As técnicas sorológicas atuais detectam a exposição ao parasito, mas não apresentam capacidade de diferenciar as vias de infecção, as quais podem ocorrer por ingestão de oocistos ou de cistos teciduais, dificultando a implementação de medidas preventivas para controlar e reduzir a infecção por T. gondii. Além disso, tais técnicas sorológicas não apresentam a possibilidade de diferenciar infecção aguda de infecção crônica, o que limita a determinação da fase da infecção, principalmente em indivíduos imunocomprometidos e em gestantes, além dos casos de toxoplasmose congênita. No presente trabalho, as proteínas recombinantes CCp5A e OWP1 de oocistos/esporozoítos de T. gondii foram utilizadas em testes sorológicos com o objetivo de diferenciar infecções via ingestão de oocistos ou cistos teciduais do parasito em amostras de soros de animais e humanos. A reatividade destas proteínas foi analisada, em paralelo com o antígeno solúvel de Toxoplasma (STAg), utilizando-se de um painel de amostras de soros de animais (galinhas, porcos e camundongos) infectados naturalmente ou por meio de protocolos de infecção experimental, a partir de diferentes estágios infecciosos do parasito. Em adição, estas proteínas foram testadas em amostras de soros de pessoas infectadas por via hídrica (via oocisto) em um surto de toxoplasmose e de gestantes soropositivas (IgM+/IgG+) para T. gondii, cuja via de infecção era desconhecida. Em animais, somente a proteína CCp5A foi capaz de diferenciar o estágio infeccioso de T. gondii responsável pela infecção, com reatividade específica para soros de indivíduos infectados por oocistos. Além disso, esta proteína também apresentou maior reatividade em amostras de soros na fase recente de infecção em porcos e camundongos. Em humanos, CCp5A apresentou reatividade preferencial com soros do surto de toxoplasmose, em comparação com soros das gestantes. Esses resultados indicam que a proteína CCp5A pode ser uma nova ferramenta para identificar o estágio infeccioso de T. gondii responsável pela infecção (oocisto ou cisto tecidual). Em uma segunda parte deste trabalho, com o intuito de avaliar outras preparações antigênicas visando a determinação das fases da infecção por T. gondii, se infecção aguda ou crônica, o peptídeo sintético pMIC8 foi testado, em paralelo com STAg, em imunoensaios utilizando-se amostras de soros de indivíduos em diferentes fases da infecção. Inicialmente, tal peptídeo foi utilizado para avaliar a cinética de anticorpos IgG em camundongos experimentalmente infectados com T. gondii. Posteriormente, imunoensaios utilizando pMIC8 e STAg foram realizados para a detecção de anticorpos IgM, IgA e IgG em 124 amostras de soros humanos divididos em 5 grupos, de acordo com a fase da infecção por T. gondii: Grupo I (infecção até 4 meses); Grupo II (infecção entre 5 e 8 meses); Grupo III (infecção entre 9 e 12 meses); Grupo IV (infecção acima de 12 meses); e Grupo V (indivíduos soronegativos). No modelo murino, pMIC8 mostrou-se como um marcador em potencial para a caracterização da infecção recente, demonstrando forte reação com anticorpos IgG na fase precoce da infecção. Em humanos, anticorpos IgM e IgA contra pMIC8 apresentaram melhor caracterização do tempo de infecção em amostras de soros de fase aguda (até 12 meses de infecção), quando comparados aos anticorpos dirigidos contra STAg. Por outro lado, a porcentagem de detecção de IgG contra pMIC8 foi maior nas amostras de soros do Grupo I (fase aguda precoce) e menor nas do grupo IV (fase crônica). Este padrão foi inverso ao observado com STAg, que apresentou menor porcentagem de detecção de IgG no grupo I. Visando caracterizar as diferenças quanto a detecção de IgG quando são utilizadas as preparações antigênicas STAg e pMIC8, foi calculada a razão entre os valores dos Índices ELISA de IgG obtidos nas reações com estes dois antígenos (Razão STAg/pMIC8), que demonstrou ser um parâmetro importante na diferenciação sorológica da fase da infecção. Em síntese, os resultados obtidos neste estudo sugerem que pMIC8 pode ser uma ferramenta relevante na diferenciação entre infecção recente e infecção distante na infecção por T. gondii. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

O Cancro Cítrico, um dos mais graves problemas fitossanitários da citricultura atual, é uma doença causada pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Um estudo funcional do genoma de Xac foi iniciado com o intuito de identificar interações proteína-proteína envolvidas em processos de patogenicidade de Xac. Através da utilização do sistema duplo-híbrido de levedura, baseado nos domínios de ligação ao DNA e ativação da transcrição do GAL4, nós analisamos os principais componentes dos mecanismos de patogenicidade de Xac, incluindo o Sistema de Secreção do Tipo III (TTSS), Sistema de Secreção do Tipo IV (TFSS) e Sistema de \"Quorum Sensing\" composto pelas proteínas Rpf. Componentes desses sistemas foram utilizados como iscas na triagem de uma biblioteca genômica de Xac. O TTSS é codificado pelos genes denominados hrp (\"hypersensitive response and pathogenicity\"), hrc (\"hrp conserved\") e hpa (\"hrp associated\") localizados no locus hrp do cromossomo de Xac. Esse sistema de secreção é capaz de translocar proteínas efetoras do citoplasma bacteriano para o interior da célula hospedeira. Nossos resultados mostraram novas interações proteínaproteína entre componentes do próprio TTSS além de associações específicas com uma proteína hipotética: 1) HrpG, um regulador de resposta de um sistema de dois componentes responsável pela expressão dos genes hrp, e XAC0095, uma proteína hipotética encontrada apenas em Xanthomonas spp; 2) HpaA, uma proteína secretada pelo TTSS, HpaB e o domínio C-terminal da HrcV; 3) HrpB1, HrpD6 e HrpW, 4) HrpB2 e HrcU e 5) interações homotrópicas envolvendo a ATPase HrcN. Em Xac, foram encontrados dois loci vir que codificam proteínas que possuem similaridade com componentes do TFSS envolvido em processos de conjugação/secreção bacteriana: TFSS-plasmídeo localizado no plasmídeo pXAC64 e TFSS-cromossomo localizado no cromossomo de Xac. O TFSS-plasmídeo, o qual possui maior similaridade com sistemas de conjugação, mostrou interações envolvendo proteínas cujos genes estão localizados na mesma região do plasmídeo pXAC64: 1) interação homotrópica da TrwA; 2) XACb0032 e XACb0033; 3) interações homotrópicas da proteína XACb0035; 4) VirB1 e VirB9; 5) XACb0042 e VirB6; 6) XACb0043 e XACb0021b. O TFSS-cromossomo apresentou interações envolvendo as proteínas: 1) VirD4 e um grupo de 12 proteínas que contém similaridade entre si, incluindo XAC2609 cujo gene encontra-se no locus vir, 2) XAC2609 e XAC2610; 3) Interações homotrópicas da VirB11; 4) XAC2622 e VirB9. A análise do sistema de \"Quorum-Sensing\" composto pelas proteínas Rpf mostrou interações envolvendo componentes do próprio sistema: 1) RpfC e RpfF; 2) RpfC e RpfG; 3) interações homotrópicas da RpfF; 4) RpfC e CmfA, uma proteína similar a Cmf de Dictyostelium discoideum que, neste organismo, é fundamental para processos de \"quorum-sensing\". As interações proteína-proteína encontradas permitiram-nos entender melhor a composição, organização e regulação dos fatores envolvidos na patogenicidade de Xac. / Citrus Canker, caused by the bacterial plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) presents one of the most serious problems to Brazilian citriculture. We have initiated a project to identify protein-protein interactions involved in pathogenicity of Xac. Using a yeast two-hybrid system based on GAL4 DNA-binding and activation domains, we have focused on identifying interactions involving subunits, regulators and substrates of: Type Three Secretion System (TTSS), Type Four Secretion System (TFSS) and Quorum Sensing/Rpf System. Components of these systems were used as baits to screening a random Xac genomic library. The TTSS is coded by the hrp (hypersensitive response and pathogenicity), hrc (hrp conserved) and hpa (hrp associated) genes in the chromosomal hrp locus. This secretion system can translocate efector proteins from the bacterial cytoplasm into the host cells. We have identified several previously uncharacterized interactions involving: 1) HrpG, a two-component system response regulator responsible for the expression of Xac hrp operons, and XAC0095, a previously uncharacterized protein encountered only in Xanthomonas spp; 2) HpaA, a protein secreted by the TTSS, HpaB and the C-terminal domain HrcV; 3) HrpB1, HrpD6 and HrpW; 4) HrpB2 and HrcU; 5) Homotropic interactions were also identified for the ATPase HrcN. Xac contains two virB gene clusters, one on the chromosome and one on the pXAC64 plasmid, each of which codes for a unique and previously uncharacterized TFSS. Components of the TFSS of pXAC64, which is most similar to conjugation systems, showed interactions involving proteins coded by the same locus: 1) Homotropic interactions of TrwA; 2) XACb0032 and XACb0033; 3) XAC0035 homotropic interactions; 4) VirB1 and VirB9; 5) XACb0042 and VirB6; 6) XACb0043 and XACb0021 b. Components of the chromosomal TFSS exhibited interactions involving: 1) VirD4 and a group of 12 uncharacterized proteins with a common C-terminal domain motif, include XAC2609 whose gene resides within the vir locus; 2) XAC2609 and XAC261 O; 3) Homotropic interactions of VirB11; 4) XAC2622 and VirB9. Analysis of Quorum Sensing/Rpf System components revealed interactions between the principal Rpf proteins which control Xanthomonas quorum sensing: 1) RpfC and RpfF; 2) RpfC and RpfG; 3) RpfF homotropic interactions; 4) RpfC and CmfA, a protein that presents similarity with Cmf (conditioned medium factor) of Dictyostelium discoideum, which contrais quorum sensing in this organism. The protein-protein interactions that we have detected reveal insights into the composition, organization and regulation of these important mechanisms involved in Xanthomonas pathogenicity.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) de Plasmodium sp tem sido sugerido como candidato a compor uma vacina contra a malária. No presente estudo geramos cinco proteínas recombinantes baseadas em diferentes regiões do ectodomínio de AMA-1 de Plasmodium vivax, o qual compreende os domínios I a III, com intuito de mapear regiões particularmente imunogênicas da proteína. Cada uma das cinco proteínas recombinantes foi expressa em Eschericha coli a partir do vetor pET-28a em fusão com a cauda de histidina e purificadas por cromatografia de afinidade. As diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 100 indivíduos infectados por P. vivax procedentes de áreas endêmicas do Estado do Pará e 32 indivíduos não infectados que relataram terem sido acometidos de mais de 10 episódios prévios de malária procedentes do município de Terra Nova do Norte (MT). As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM foram mais baixas e variaram de 4% (DIII) a 36% (DII-III). Por outro lado, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para DI, DII, DIII, DI-II e DII-III foram 13%, 65%, 12%, 59% e 58%, respectivamente. Podemos observar que as proteínas recombinantes contendo o DII foram particularmente imunogênicas durante a infecção natural. Com o objetivo de avaliar se os epítopos reconhecidos nas cinco proteínas baseadas nos diferentes domínios estão expostos na proteína recombinante correspondente ao ectodomínio (DI-III) gerada previamente, realizamos ensaios de inibição por ELISA utilizando placas sensibilizadas com a proteína DI-III. Nossos resultados sugerem a presença de um maior número de epítopos comuns entre as proteínas recombinantes baseadas nos domínios I-II e ectodomínio de AMA-1. Além disso, observamos que a proporção de indivíduos que apresentaram anticorpos contra DII, DI-II e DII-III aumentou de acordo com o maior número de exposições prévias ao P. vivax. As subclasses de IgG que predominaram contra todas as proteínas foram IgG1, IgG3 e IgG4. Em conjunto, nossos resultados sugerem que as proteínas recombinantes contendo o DII podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não-humanos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) of Plasmodium sp has been suggested as a vaccine candidate against malaria. Herein, to identify novel antigenic epitopes on the Plasmodium vivax AMA-1 ectodomain, we have generated five recombinant proteins, comprising domains I to III. All recombinant proteins were expressed in Escherichia coli using the pET-28a vector system fused to hexahistidine tag for purification by affinity chromatography. Recognition of recombinant proteins by antibodies was evaluated using a panel of sera collected from onehundred P. vivax -infected patients resident in the State of Pará and from thirty-two non-infected individuals, living in the State of Mato Grosso and who have faced a minimum of ten malaria episodes. ELISA analyses demonstrated that protein recognition was highly dependent on IgG antibodies, raging from 13%, 65%, 12%, 59% up to 58%, respectively for DI, DII, DIII, DI-II and DII-III domains. Indeed, we have noticed a lower frequency of recognition, ranging from 4% (DIII) to 36% (DII-III), by sera from those individuals that presented IgM antibodies. Collectively, these data suggest that the DII domain is particularly immunogenic during natural infections. Next, to verify whether the epitopes recognized in these five different recombinant proteins were also expressed in a recombinant protein spanning domains I through III (DI-III), we carried out ELISA inhibition assays using plates coated with the DI-III recombinant protein. Our findings revealed the presence of a higher number of common epitopes among recombinant proteins based on domains I-II and the AMA-1 ectodomain. Moreover, we observed that the proportion of individuals who had presented antibodies against DII, DI-II and DII-III domains increased according to the previous number of P. vivax episodes. Overall, IgG1, IgG3 and IgG4 antibodies were prevalent to all proteins. Taken together, our results demonstrated that DII domain is highly recognized, mainly by IgG antibodies; and open promising perspectives to use this region as an experimental vaccine in non-human primates capable to induce protective immunity against vivax malaria.

Deficiência na enzima lisossomal glucocerebrosidase (GCR) resulta na doença de Gaucher. O tratamento atual consiste na administração da enzima exógena, produzida em células CHO. Porém, o medicamento disponível no mercado é extremamente custoso. Neste trabalho, propusemos a clonagem e a expressão da GCR humana em células CHO, visando a obtenção de um clone celular produtor para viabilizar a produção futura da enzima, a um custo menor, no Instituto Butantan. A expressão estável da GCR recombinante foi obtida a partir da transfecção de células CHO-dhfr- com o plasmídeo pED de expressão em células de mamíferos contendo o cDNA da GCR, seguido de amplificação gênica por MTX. A GCR foi detectada no extrato celular (~ 64 kDa) e secretada para o sobrenadante (63-69 kDa) em ensaios de western blotting, usando o anticorpo policlonal anti-GCR gerado neste trabalho. A enzima secretada hidrolisou o substrato 4-MUG e a sua produtividade foi estimada em 5,14 pg/célula/dia para o melhor subclone produtor, selecionado para a produção futura da GCR em larga escala. / Deficiency of the lysosomal glucocerebrosidase (GCR) enzyme results in Gaucher\'s disease. Current treatment consists on enzyme replacement therapy by the administration of recombinant GCR produced in CHO cells. However, the medicine available in the market is extremely expensive. In this work, we proposed the cloning and expression of human GCR in CHO cells, in order to obtain a productive cellular clone for future production of GCR enzyme at a lower cost at the Butantan Institute. The stable expression of recombinant GCR was obtained after transfection of CHO-dhfr- cells with pED mammalian expression vector containing the GCR cDNA, followed by gene amplification with MTX. The GCR was detected by western blotting analysis, either as cell-associated (~ 64 kDa) or as secreted forms (63-69 kDa), using the anti-GCR polyclonal antibody produced in this work. The secreted enzyme was active on 4-MUG and was produced at a level of about 5,14 pg/cell/day for the best producer subclone, selected for subsequent steps of GCR production on large scale in next future.