Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-12T18:05:42Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 338152 bytes, checksum: 098a9757a4e60aaf5a0bf9a4c39d2b20 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T18:05:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 338152 bytes, checksum: 098a9757a4e60aaf5a0bf9a4c39d2b20 (MD5) Previous issue date: 2004-08-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar a influência de quatro níveis de proteína bruta (PB) na dieta sobre a produção e composição do leite, sobre os consumos de matéria seca (MS), matéria orgânica (MO), PB, extrato etéreo (EE), carboidratos totais (CT), fibra em detergente neutro (FDN), carboidratos não fibrosos (CNF) e nutrientes digestíveis totais (NDT) e sobre as digestibilidades aparentes totais e parciais de MS, MO, PB, EE, CT, FDN e CNF. Avaliaram-se também o pH, o conteúdo de amônia na digesta ruminal e a produção e eficiência microbiana pela técnica das bases purinas e pela técnica da excreção urinária de derivados de purinas. Utilizaram-se 16 cabras da raça Alpina em lactação, distribuídas em quatro quadrados latinos 4x4, sendo um deles composto por cabras fistuladas. A dieta foi constituída de silagem de milho (47%) e concentrado (53%) composto por fubá de milho, farelo de soja, uréia e mistura mineral. Foram utilizados níveis crescentes de farelo de soja no concentrado, afim de se obter dietas com 11,5, 13,5, 15,5 e 17,5 de proteína bruta (PB) na matéria seca (MS). Os consumos de MS, MO, PB, FDN e NDT aumentaram linearmente com o aumento do nível de PB na dieta. Os consumos de CT e CNF não foram influenciados (P>0,05) pelo nível de PB da dieta. As digestibilidades aparentes da MS, MO, PB, CT e CNF aumentaram linearmente (P<0,05) com o nível de PB da dieta. O nível crescente de PB na dieta promoveu efeito linear crescente na produção de leite (P<0,1). Obteve-se a seguinte equação para a produção de leite em função do nível de PB da dieta: Ŷ (kg/dia)= 2,001 + 0,0565PB, r 2 = 0,70 P P e P<0,1. O pH da digesta ruminal diminuiu com os tempos de coleta, e manteve-se em faixa adequada, entre 6,2 e 7,0, para a atividade dos microrganismos ruminais. Ocorreu efeito linear crescente do conteúdo de PB da dieta sobre a concentração ruminal de amônia. À medida que houve aumento no consumo de PB, ocorreram aumentos lineares da concentração de N-uréia no soro, da quantidade de N secretado no leite, da uréia no leite, do volume urinário, da excreção de N-total e uréia na urina e do balanço de N. O fluxo de nitrogênio microbiano no omaso das cabras fistuladas não foi influenciado pelo teor de PB dietética (P>0,05). Não foi constatada diferença (P>0,05) entre os resultados obtidos pela técnica das bases purinas no omaso e pela técnica da excreção total de derivados de purinas. O nível de PB na dieta não influenciou (P>0,01) a excreção de creatinina, que foi em média 26,05 mg de creatinina por Kg de peso vivo. A partir da excreção média de creatinina, estimou-se o volume de urina excretado, que não diferiu (P>0,01) do volume de urina total observado. A excreção de derivados de purinas (DP) aumentou com o aumento da PB dietética. Comparando-se as quantidades observadas e estimadas de derivados de purinas excretados, não foi constatada diferença entre a quantidade de derivados de purina observada (coleta total) e estimada (coleta spot). A porcentagem média de alantoína excretada variou de 64,5 a 75,9 % nas amostras de coleta 24 horas e de 73,9 a 85,2 % nas amostras de coleta spot. A proporção média de ácido úrico variou entre 9,6 e 19,9 % e a de xantina e hipoxantina entre 5,2 e 15,6%. A quantidade de purinas absorvidas e fluxo intestinal de MS microbiana e N microbiano apresentaram resposta linear crescente ao conteúdo de PB da dieta. Para o fluxo intestinal de nitrogênio microbiano ajustou-se a equação: Ŷ (g)= 6,223 +0,809 PB, P<0,05, r 2 =0,99, onde P P PB corresponde ao nível de PB da dieta. A eficiência de síntese microbiana, expressa em gramas de proteína bruta microbiana por Kg de nutrientes digestíveis totais (PBM/NDT), quando avaliada a partir de amostras provenientes da coleta total de urina, apresentou resposta linear crescente (P<0,01) ao conteúdo de PB na dieta segundo a equação:Ŷ = 33,721 + 2,997PB, P<0,01, r 2 =0,88. Quando P P utilizou-se amostras spot para a avaliação da eficiência de síntese microbiana (PBM/NDT), não foi detectada diferença estatística entre tratamentos (P>0,05). Donde conclui-se que o nível de 13,5% de proteína bruta pode ser usado em dietas para cabras com produção diária próxima a 2,7 kg de leite e que a técnica dos derivados de purinas pode ser usada para a estimativa da produção microbiana em cabras leiteiras. / This work was conducted with the objective of evaluating the influence of four levels of crude protein (CP) on the milk production and composition, on the intakes of dry matter (DM), organic matter (OM), CP, ether extract (EE), total carbohydrates (TC), neutral detergent fiber (NDF), non structural carbohydrates (NSC) and total digestible nutrients (TDN) and on total and partial apparent digestibility of DM, OM, CP, EE, TC, NDF and NSC. The pH and ammonia concentration in the rumen liquor and the microbial production and efficiency by the techniques of purine bases and urinary excretion of purine derivative were evaluated, too. 16 lactating Alpine goats were used, distributed in four latin squares, one of them was composed by cannulated goats. The diet was constituted of maize silage (47%) and concentrate (53%), which was composed by ground corn, soybean meal, urea and minerals. Crescent levels of soybean meal in the concentrate were used in order to obtain diets with 11,5, 13,5, 15,5 and 17,5% of crude protein (CP) in the dry matter (DM) basis. The intakes of DM, OM, CP, NDF and TDN increased linearly with the increase of the level of dietary CP. The intakes of TC and NSC were not influenced (P>0,05) by the level of CP in the diet. The apparent digestibilities of DM, OM, CP, TC and NFC increased linearly xiv(P<0,05) with the level of CP in the diet. The crescent level of CP in the diet promoted linear crescent effect on the milk production (P<0,1). The following equation for the milk production in accordance with the level of CP in the diet was obtained: Ŷ (kg/d) = 2,001 + 0,0565CP, r 2 = 0,70 and P<0,1. The pH of rumen fluid P P reduced with the sampling time, and was kept in adequate level for the rumen microbes activity, between 6,2 and 7,0. Linear crescent effect of the CP content of the diet on ruminal ammonia concentration occurred. As there was an increase in the intake of CP, there were linear increases of N-urea concentration in serum, of the amount of N secreted in milk, of the urinary excretion of total N and urea, and of the N balance. The flux of microbial nitrogen in the omasum of the cannulated goats was not influenced by the CP content of the diet (P>0,05). No difference was verified between the results obtained by purine bases in the omasum technique and by purine derivative excretion technique. The level of CP in the diet did not influence (P>0,01) the creatinine excretion, which was 26,05 mg of creatinine per kg of life weight in average. From the average creatinine excretion, the volume of urine was estimated, the volume estimated did not differ (P>0,01) from the total urine observed. The purine derivative (PD) excretion increased with the increase of dietary protein. Comparing the observed and the estimated amounts of purine derivatives excreted, no difference was noticed between the amount of purine derivative observed (total collection) and estimated (spot collection). The average percentage of allantoin excreted ranged from 64,5 to 75,9% in the samples of total collection and from 73,9 to 85,2% in the samples of spot collection. The average proportion of uric acid ranged between 9,6 and 19,9% and xanthine and hypoxanthine between 5,2 and 15,6%. The amount of absorbed purines and the xvintestinal flux of microbial DM and microbial N presented linear crescent response to dietary CP content. For the intestinal flux of microbial N, the following equation was adjusted: Ŷ(g)= 6,223 + 0,809 CP, P<0,05, r 2 = 0,99, where CP corresponds P P to the level of dietary CP. The efficiency of microbial synthesis, expressed in grams of microbial CP per kg of total digestible nutrients, when evaluated from samples originated from total collection of urine, presented linear crescent response (P<0,01) to dietary CP content, following the equation: Ŷ = 33,721 + 2,997 CP, P<0,01, r 2 = 0,88. When spot samples were utilized for the evaluation of the P P efficiency of microbial synthesis, no differences (P>0,05) between diets were observed. It was concluded that the level of 13,5% of CP can be used in diets for goats with daily milk production close to 2,7 kg and that the purine derivative technique can be used for estimation of microbial production in dairy goats.

Tesis presentada para optar al Grado de Magíster en Manejo de Suelos y Aguas / On a global scale, natural biogeochemical cycles are being overwhelmed. Fertilizer and atmospheric deposition dominate total anthropogenic nitrogen (N) inputs to the temperate regions as a whole, with fertilizer accounting for roughly two-thirds of the total (Howarth et al., 1996). On agricultural land, crop and livestock production systems are the largest cause of the global N alteration (Bouwman et al., 2011), with most of the N applied in annual production systems being lost (Robertson and Vitousek, 2009). Moreover, N availability to plants is difficult to predict, since organic matter turnover processes and losses influence the availability (Sørensen, 2001).

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This study was carried out to evaluate methods in ruminant nutrition: use of fecal index to estimate intake and use of purine or purine derivatives to estimate rumen microbial protein synthesis. Data from three digestibility trials conducted with castrated male lambs fed ryegrass (Lolium multiflorum, Lam) or Cynodon (Cynodon dactylon var dactylon) at different levels of intake were compiled. Intake data were related to faecal excretion of different chemical compounds through regression analysis. Significant regressions with high R2 were used to calculate estimated intake values, which were compared to observed values by paired t test. Organic matter (OM) intake (g/day) had significant (P<0.01) relation to faecal excretion (g/day) of N and/or acid detergent fiber (ADF) in ryegrass trial (R2 varied from 0.69 to 0.85) while N, ADF and neutral detergent fiber (NDF) had significant (P<0.01) relation to OM intake in Cynodon trials (R2 varied from 0.51 to 0.56). It is concluded that faecal excretion of N and/or ADF had high potential to estimate intake by grazing animals. Rumen microbial protein synthesis estimated either by duodenal purines or urine purines derivatives was different (P<0.01). Moreover, these estimates were highly affected by purines:microbial N proportion used in calculations. / O objetivo deste trabalho foi avaliar métodos em nutrição de ruminantes: o uso de índices fecais para estimar consumo e uso de purinas no duodeno ou de derivados de purinas na urina para estimar a síntese de nitrogênio microbiano ruminal. Foram compilados dados de três ensaios de digestibilidade in vivo utilizando ovinos machos castrados não fistulados ou fistulados no duodeno alimentados com azevém (Lolium multiflorum, Lam) ou capim-paulista (Cynodon dactylon var dactylon) fornecidos verde a diferentes níveis de consumo. Os dados de consumo foram relacionados à excreção fecal de diferentes componentes químicos. As equações de regressão com coeficientes de correlação mais significativos foram utilizadas para calcular consumos estimados, os quais foram comparados pelo teste t para dados pareados com os consumos observados. O consumo de MO foi significativamente (P<0,01) relacionado com a excreção fecal de N e/ou fibra em detergente ácido (FDA) no ensaio com azevém (R2 variou de 0,69 a 0,85) e com a excreção fecal de N, FDA ou fibra em detergente neutro (FDN) nos ensaios com Cynodon (R2 variou de 0,51 a 0,56). Conclui-se que a excreção fecal de FDA e/ou N tem um alto potencial para estimar consumo por animais em pastejo. A síntese de nitrogênio microbiano ruminal estimado pela metodologia das purinas duodenais ou dos derivados de purinas excretados na urina não foi similar (P<0,01). Adicionalmente, estas estimativas foram altamente influenciadas pela relação purinas:N microbiano utilizada nos cálculos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the use of internal markers to estimate duodenal flow of digesta and duodenal microbial protein synthesis in cattle and sheep. Data and samples of in vivo digestibility trials, eight trials with sheep (n=204) and two with cattle (n=31) were used. All animals were cannulated in the duodenum, procedure previously conducted at the Laboratory of Food Science and Ruminants Nutrition at the Federal University of Santa Maria and Laboratory of Animal Nutrition and Food Science at the University of the State of Santa Catarina. Internal markers, acid detergent fiber (ADF) and acid detergent lignin (ADL) were compared to estimate the flow of duodenal digesta. Purines in duodenal digesta were compared with purine derivatives (PD) excreted in urine as markers to estimate the flow of rumen microbial protein in the duodenum. In the latter case, different equations available in literature were tested to estimate the flow of microbial protein from urinary PD. It was concluded that ADF may be used as an internal marker to estimate duodenal flow of digesta in experimental animals cannulated in the duodenum where total fecal excretion is measured, and that the use of DP as a marker of duodenal flow of microbial protein is acceptable for cattle but not for sheep. In sheep, regardless of the equation used, the DP underestimated duodenal availability of rumen microbial protein. / O objetivo do presente estudo foi avaliar o uso de marcadores internos para estimativa de fluxo de digesta duodenal e de síntese de proteína microbiana duodenal em bovinos e ovinos. Foram utilizados dados e amostras de oito ensaios de digestibilidade in vivo com ovinos (n=204) e dois com bovinos (n=31), canulados no duodeno, previamente conduzidos no Laboratório de Bromatologia e Nutrição de Ruminantes da Universidade Federal de Santa Maria e no Laboratório de Nutrição Animal e Bromatologia da Universidade do Estado de Santa Catarina. Para estimativa do fluxo de digesta duodenal, foram comparados os seguintes marcadores internos: fibra em detergente ácido (FDA) e lignina em detergente ácido (LDA). Para estimar o fluxo de proteína microbiana ruminal no duodeno, foi comparado o uso de purinas na digesta duodenal com os derivados de purinas (DP) excretados na urina como marcadores. Neste último caso, foram testadas diferentes equações disponíveis na literatura para estimar o fluxo de proteína microbiana a partir dos DP urinários. Concluiu-se que a FDA pode ser utilizada como marcador interno para estimar o fluxo duodenal de digesta em ensaios com animais canulados no duodeno, onde é medida a excreção total de fezes, e que o uso dos DP como marcadores do fluxo duodenal de proteína microbiana é aceitável em bovinos, mas não em ovinos. Em ovinos, independentemente da equação utilizada, os DP subestimam a disponibilidade duodenal de proteína microbiana ruminal.

Orientador: Marcelo Campos / Banca: Claudiana Lameu Gomes / Banca: Camila Nomura Boscolo / Resumo: O BaP é um contaminante ambiental capaz de causar inflamação e desregulação de vias celulares. Pela ação da CYP1a1 e CYP1b1, é convertido a metabólitos mais reativos. A literatura mostra que o BaP aumenta a expressão de algumas citocinas próinflamatórias, como a IL-1, porém, são bem contraditórios os relatos sobre o efeito do BaP no cFOS, o qual apresenta papel importante na proliferação, na formação de tumores e, possivelmente, na inflamação. O objetivo deste estudo foi de elucidar a participação do receptor purinérgico P2X7 sobre a expressão dos genes IL- 1 e cFOS, durante exposição ao BaP. Foi empregado as técnicas de qPCR para quantificação de expressão gênica, e testes de correlação e regressão entre IL-1 e cFOS. A exposição ao BaP induziu a expressão dos dois genes, além das enzimas do seu metabolismo. Quando bloqueado o receptor P2X7, além de uma menor indução das CYPs, os níveis de IL- 1e cFOS caíram abaixo dos níveis controle, sugerindo a participação do P2X7. Os testes de correlação e regressão mostraram uma relação forte direta entre IL-1e cFOS, reforçando o papel do cFOS na inflamação / Abstract: BaP is an environmental contaminant capable to cause inflammation and impair cellular pathways. CYP1a1 and CYP1b1 convert it to more reactive metabolites. Studies show that BaP enhances some proinflammatory citokines expression, like IL-1, yet reports about BaP affecting cFOS, which plays important role in proliferation, tumor formation and inflammation, are controversial. This work aimed to elucidate whether P2X7 purinergic receptor plays a role in IL-1 and cFOS expression during BaP exposure. We applied qPCR techniques to quantify gene expression, correlation and regression assays. Our results showed that BaP raised both IL-1 and cFOS genes expression, besides CYPs ones. Morevoer, when blocking P2X7 receptor, IL-1 and cFOS expression dropped under normal levels, which suggest P2X7 participation, in addition to a smaller enzymes induction. Correlation and regression assays exhibited a strong straight relationship between IL-1 and cFOS expression, reinforcing the role of cFOS in inflammation / Mestre

Objetivou-se avaliar o efeito da adição de sais de cálcio de ácidos graxos (SCAG) e de diferentes teores de proteína degradável no rúmen (PDR) na dieta de vacas leiteiras sobre: consumo, fermentação e metabolismo de nitrogênio ruminal, desempenho produtivo e balanço de nitrogênio; as estimativas de síntese microbiana utilizando 15N e bases purinas (BP) como indicadores microbianos, a composição dos pellets de bactéria, a recuperação de derivados purina (DP) na urina e a excreção urinária de DP de origem endógena; o fluxo omasal de ácidos graxos, a extensão de bio-hidrogenação e o perfil lipídico das bactérias. Oito vacas em lactação, multíparas e canuladas no rúmen foram usadas em um delineamento em quadrado Latino 4 × 4 replicado, distribuídas em arranjo fatorial 2 × 2 de tratamentos. Os tratamentos foram obtidos pela combinação da adição de SCAG (-SCAG: sem suplementação; e +SCAG: com 3,32% matéria seca (MS) de SCAG) e os teores de PDR (BPDR: baixo PDR, com 9,8% MS de PDR; e APDR: alto PDR: com 11,0% de PDR na MS da dieta). A suplementação lipídica reduziu (P &le; 0,049) o consumo, tendeu (P = 0,076) a aumentar o tempo de ruminação e aumentou (P = 0,015) o pH ruminal. A adição de SCAG diminuiu (P &le; 0,013) a digestibilidade aparente ruminal da MS e matéria orgânica, e tendeu a reduzir (P = 0,096) a digestibilidade ruminal da fibra em detergente neutro (FDN) e reduziu (P = 0,043) o nitrogênio (N) verdadeiramente digerido no rúmen. Apesar de afetar (P = 0,039) negativamente o fluxo de nitrogênio não amoniacal (NNA) associado com as grandes partículas, SCAG não afetou (P &ge; 0,634) o fluxo total de NNA e o fluxo de NNA microbiano, e aumentou (P = 0,032) a eficiência de síntese proteica microbiana. Animais alimentados com SCAG apresentaram maior (P = 0,043) produção de leite, com menor (P &lt; 0,001) teor de gordura, maior (P &lt; 0,001) eficiência alimentar e de uso do N. Animais alimentados com BPDR tenderam (P &le; 0,096) a apresentar maior consumo de proteína bruta e relação entre as concentrações ruminais de acetato e propionato. Ainda, APDR elevou (P &le; 0,048) a digestibilidade aparente total do amido e a digestibilidade ruminal verdadeira do N. O nível de PDR não afetou (P &ge; 0,719) a síntese de proteína microbiana e a eficiência de síntese, enquanto que BPDR aumentou (P &le; 0,055) a produção de leite e reduziu o teor de proteína do leite. O alto nível de PDR tendeu (P &le; 0,088) a reduzir a excreção fecal e o balanço de N, enquanto aumentou (P = 0,021) a excreção urinária relativa ao consumo de N. As bactérias associadas à partícula (BAP) apresentaram menor (P &le; 0,008) enriquecimento com 15N e relação N purinas: N total microbiano do que as bactérias associadas à fase líquida (BAL). A utilização de BP como indicador superestimou (P &le; 0,002) o fluxo microbiano, especialmente de BAL. No entanto, para o fluxo microbiano associado à partícula, houve tendência à interação (P = 0,067) entre os efeitos de indicador e da suplementação lipídica. Na presença de SCAG, BP e 15N apresentaram (P &gt; 0,05) estimativas similares, enquanto que na ausência de SCAG, BP subestimou (P &le; 0,05) o fluxo de BAP, em relação ao 15N. O aumento do nível de PDR da dieta tendeu a reduzir (P = 0,061) o fluxo omasal de BP e reduziu (P = 0,007) a recuperação urinária desta. A recuperação urinária de DP foi extremamente variável (33,9% de coeficiente de variação). As estratégias nutricionais avaliadas não afetaram (P &ge; 0,108) a excreção urinária de creatinina e DP de origem endógena. As excreções diárias de creatinina e DP de origem endógena foram de 0,262 mmol/kg e 640 mmol/kg0,75, respectivamente. O aumento do nível de PDR da dieta resultou na redução (P &lt; 0,001) do consumo dos ácidos graxos C4:0, C12:0, C14:0, C16:0 e C18:0, e tendeu (P = 0,068) a reduzir o consumo de C18:1 trans. Houve interação ou tendência (P &le; 0,095) à interação entre os efeitos do nível de PDR e adição de SCAG sobre o fluxo omasal de ácidos graxos totais e alguns ácidos graxos específicos (C15:0, C16:0, C17:0, C18:0, C18:1 cis-9, C18:2 cis-9 cis-12, C18:3 cis e C22:0). Nas dietas contendo SCAG, nenhum efeito do nível de PDR foi observado sobre o fluxo omasal de ácidos graxos (P &gt; 0,05), enquanto que nas dietas -SCAG, o aumento do nível de PDR aumentou (P &le; 0,05) o fluxo omasal total de ácidos graxos. Consequentemente, o aumento do nível de PDR reduziu (P &le; 0,05) a extensão de bio-hidrogenação do C18:1 cis e C18:3 nas dietas -SCAG, sem efeitos (P &gt; 0,05) nas dietas +SCAG. A adição de SCAG aumentou (P &le; 0,001) a extensão de bio-hidrogenação do C18:2, assim como o teor de AG dos pellets de bactéria. O nível de PDR da dieta não afetou (P &ge; 0,116) o perfil de ácidos graxos dos microrganismos, nem o perfil de ácidos graxos do leite. A adição de SCAG reduziu ou tendeu (P &le; 0,080) a reduzir os teores de C15:0, C16:0, C16:1, C17:0 e C18:0, e aumentou (P &le; 0,005) as concentrações de ácidos graxos insaturados de 18 carbonos nos microrganismos. Além disso, a adição de SCAG reduziu (P &le; 0,009) a concentração de todos os ácidos graxos menores do que 18 carbonos e a razão entre saturados e insaturados na gordura do leite, bem como aumentou (P &le; 0,001) as concentrações dos ácidos graxos com 18 carbonos ou mais e dos ácidos graxos insaturados. Desta forma, a adição de SCAG na dieta reduz o consumo, aumenta o tempo de ruminação, a eficiência microbiana e a produção de leite, sem afetar o fluxo microbiano. O aumento do nível de PDR da dieta reduz as perdas fecais de N e a produção de leite. As BP superestimam o fluxo microbiano, especialmente das BAL, pela presença de BP de origem dietética. A suplementação lipídica afeta a relação entre as estimativas de fluxo de BAP utilizando 15N e BP, levando à baixa correlação entre as estimativas com as duas técnicas. A recuperação urinária dos DP foi extremamente variável e aumentou com o aumento do nível de PDR da dieta. As excreções de creatinina e a excreção endógena de DP não são afetadas pela suplementação lipídica e pelo teor de PDR da dieta. A suplementação lipídica afeta consideravelmente o consumo e fluxo omasal de ácidos graxos, assim como o perfil lipídico dos microrganismos e o perfil de ácidos graxos do leite. Apesar de potencialmente aumentar o fluxo de alguns ácidos graxos insaturados e reduzir a extensão de bio-hidrogenação do C18:1 e C18:3, nas dietas sem SCAG, o nível de PDR tem poucos efeitos sobre o perfil de ácidos graxos das bactérias e do leite. / This study aimed to evaluate the effects of calcium salts of fatty acids (CSFA) addition and different levels of rumen degradable protein (RDP) in the diet of dairy cows on: feed intake, ruminal fermentation and nitrogen metabolism, productive performance and nitrogen balance; microbial protein synthesis estimates using 15N and purines basis (PB) as microbial markers, composition of bacterial pellets, urinary recovery of purines derivatives (PD) and endogenous PD excretion; omasal flow of fatty acids (FA), the bio-hydrogenation extent and FA profile of bacteria. Eight lactating, multiparous and rumen cannulated cows were used in a replicated 4 × 4 Latin square design, with a 2 × 2 factorial arrangement of treatments. The treatments were obtained by the combination of CSFA addition (-CSFA: without supplementation, and +CSFA: with 3.32% CSFA per kg dry matter - DM) and the RDP level (LRDP: low RDP, with 9.8% MS of RDP, and HRDP, high RDP: with 11.0% RDP of diet DM). Fat supplementation reduced (P &le; 0.049) feed intake, while tended (P = 0.076) to increase rumination time, and increased (P = 0.015) ruminal pH. In addition, CSFA supplementation decreased (P &le; 0.013) DM and organic matter ruminal digestibility, and tended (P &le; 0.096) to reduce NDF ruminal digestibility, and reduced (P = 0.043) N truly digested in the rumen. Besides negative effect (P = 0.039) on non-ammonia nitrogen (NAN) associated with large phase, CSFA showed no effect (P &ge; 0.634) on total NAN and microbial NAN flow, and increased (P = 0.032) microbial efficiency. Animals fed CSFA had higher (P = 0.043) milk yield, with lower (P &lt; 0.001) fat content, and improved (P &lt; 0.001) feed efficiency and N usage efficiency, in relation to those animals fed with non-supplemented diets. Animals fed LRDP tended to show higher (P &le; 0.096) CP intake, and acetate to propionate ruminal ratio, in relation to animals fed HRDP. In addition, HRDP increased (P &le; 0.048) starch total tract apparent digestibility and ruminal truly digestibility of N. The level of RDP showed no effect (P &ge; 0.719) on microbial N synthesis and microbial efficiency, and lower RDP level increased (P &le; 0.055) milk yield and decreased milk protein content. Decreased RDP level tended (P = 0.074) to reduce N fecal excretion, and increased (P = 0.021) fractional urinary excretion. Particle-associated bacteria (PAB) showed lower (P &le; 0.008) enrichment with 15N and purines N to total microbial N ratio, than liquid associated bacteria (LAB). Purine basis overestimated (P &le; 0.002) microbial flow, especially LAB flow. However, there was interaction (P = 0.067) between the effects of marker and lipid supplementation on PAB flow. In diets containing CSFA, PB and 15N showed similar (P > 0.05) estimates, whereas in the absence of CSFA, PB underestimated (P &le; 0.05) PAB flow, in relation to 15N. Increased dietary RDP levels tended (P = 0.061) to reduce omasal PB flow and decreased (P = 0.007) it\'s urinary recovery. Urinary recovery of PD was extremely variable (33.9% variation coefficient). Different evaluated factors had no effect (P &ge; 0.108) on urinary excretion of creatinine, and PD of endogenous origin. Daily excretions of creatinine and endogenous PD were 0.262 mmol/kg and 640 mmol/0.75, respectively. Higher RDP level resulted in reduced (P &lt; 0.001) C4:0, C12:0, C14:0, C16:0 and C18:0 FA intake, and tended (P = 0.068) to reduce C18:1 trans intake. There was an interaction (P &le; 0.095) between effects of the RDP and CSFA on the omasal flow of total FA and some specific FA (C15:0, C16:0, C17:0, C18:0, C18:1 cis-9, C18:2 cis-9 cis-12, C18: 3 cis and C22:0). This interaction occurred due to the higher (P &le; 0.05) omasal flow as consequence of increased RDP level, in the diets without CSFA. In diets containing CSFA, no effect (P &gt; 0.05) of the RDP level was observed on the omasal flow of FA. Consequently, the increase of RDP reduced (P &le; 0.05) the bio-hydrogenation extent of these FA in the diets -CSFA, with no effects (P &gt; 0.05) on the diets +CSFA. The addition of CSFA increased (P &le; 0.001) C18:2 bio-hydrogenation extent, as well as FA content of bacterial pellets. Dietary level of RDP had no effect (P &ge; 0.116) on microorganisms and milk FA profile. The addition of CSFA decreased or tended (P &le; 0.080) to decrease the levels of C15:0, C16:0, C16:1, C17:0 and C18:0 FA, while increased (P &le; 0.005) the concentrations of 18-carbon unsaturated fatty acids in the microorganisms. In addition, CSFA reduced (P &le; 0.009) the concentration of all FA lower than 18 carbons, saturated and unsaturated ratio in milk fat, and increased (P &le; 0.001) the concentrations of FA with 18 carbons or more, as well as unsaturated fatty acids. Thus, CSFA dietary addition decreases feed intake, increases rumination time, microbial efficiency, and milk yield. Higher level of RDP reduces N fecal losses and milk yield, and increases urinary losses of N. Purine basis overestimate microbial flow, especially LAB flow, by the presence of PB of dietary origin. Lipid supplementation affects the relationship between PAB flow estimates using 15N and PB, leading to a low correlation between the estimates with the two techniques. The urinary recovery of the PD was extremely variable and increased with the increase of the dietary RDP level. Creatinine excretions and endogenous excretion of PD are not affected by evaluated treatments. Lipid supplementation affects FA intake and omasal flow, as well as microorganisms and the milk FA profile. Although potentially increase the flow of some unsaturated FA and reduce the extent of bio-hydrogenation of C18:1 and C18:3 FA in the diets without CSFA, the level of RDP has no effects on microorganisms and milk FA profile.

O zebrafish (Danio rerio) é uma espécie utilizada como modelo experimental em diversas áreas, tais como neurociências toxicologia. Seu genoma já está praticamente sequenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares aos de mamíferos. Além disso, o zebrafish é um excelente modelo para estudar a função de diferentes sistemas de neurotransmissão. O consumo do etanol exerce diversas mudanças na coordenação motora, percepção sensorial e cognição promovendo um amplo espectro de alterações bioquímicas e fisiológicas nas células nervosas. Aqui, nós investigamos o efeito promovido pela exposição crônica de etanol nos sistemas purinérgico e glutamatérgico, e níveis de BDNF no SNC de zebrafish. Os transportadores de alta afinidade de aminoácidos (EAAT) regulam os níveis extracelulares de glutamato. Nós identificamos e descrevemos o padrão de expressão dos genes relacionados aos transportadores e as propriedades de captação de glutamato nas três importantes estruturas cerebrais de zebrafish (telencéfalo, tecto óptico e cerebelo). As pesquisas nos bancos de dados do seu genoma através de análise filogenética confirmaram a presença de diversos EAATs (EAAT2, EAAT3, três EAAT1 parálogos e duas sequências parálogas para EAAT5). Também, a captação de glutamato dependente de sódio foi significativamente maior no tecto óptico, indicando diferenças funcionais entre as estruturas cerebrais. Os EAATs pertencem à família dos carreadores de soluto 1 (SLC1), que constitui os transportadores de alta afinidade de aminoácidos e transportadores de aminoácidos neutros. Recentemente, foi demonstrada uma análise filogenética e clonagem dos genes SLC1/EAAT identificando distintos membros desta família de transportadores. No sentido de unificar a designação dos genes SLC1/EAAT em zebrafish, foi proposta uma nomenclatura comum para estes grupos. O etanol promoveu uma diminuição significativa na captação de glutamato após 7 e 14 dias de exposição (30% e 54%, respectivamente), enquanto que após 28 dias, não foram observadas alterações. Na,K-ATPase, a enzima responsável pelo controle do gradiente iônico, não teve sua atividade alterada após todos os períodos de exposição testados. Além disso, os peixes expostos ao etanol durante 7 e 14 dias tiveram uma redução nos níveis de mRNA para SLC1A1/EAAT3. Entretanto, a expressão gênica do SLC1A8a,b/EAAT6a,b aumentou após todos os períodos testados, enquanto que SLC1A3a,b/EAAT1b aumentou somente após 28 dias. A prolongada exposição ao etanol não foi capaz de alterar as atividades da glutamina sintetase e glutaminase. Da mesma forma, etanol não alterou a hidrólise de ATP e GTP. Entretanto, foi verificada uma diminuição na hidrólise de ADP (46% e 34%) e GDP (48% e 36%) após 7 e 14 dias respectivamente. Após 7 e 14 dias de exposição ao etanol, também foi observada uma significativa alteração na hidrólise de AMP (48% e 36%), enquanto que a hidrólise de GTP foi inibida somente após 7 dias (46%). Os níveis de transcritos das nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDases) foram alteradas após 7, 14 e 28 dias. Em contraste, a expressão da 5′-nucleotidase não foi alterada. A atividade da adenosina deaminase (ADA) na fração solúvel não foi modificada, mas uma redução da atividade na fração de membrana após 28 dias de exposição ao etanol (44%) foi observada. A análise da expressão gênica demonstrou que ADA1 permaneceu inalterada, enquanto que os transcritos de ADAL, ADA2-2, ADA2-1, e sua isoforma truncada de ―splicing‖ alternativo (ADA2-1/T) foram alteradas após a ação prolongada do etanol. Após 14 e 28 dias, etanol aumentou a expressão gênica do BDNF, mas não alterou os níveis de transcritos para trkB. A determinação da proteína BDNF através dos métodos de ELISA indicou um aumento de (51%), sendo confirmando imunohistioquímicamente. Estes resultados sugerem que a homeostase da função neurotrófica pode ser alterada pelo prolongado consumo de etanol. Esta tembém inclui uma revisão sobre o papel de diferentes neurotransmissores excitatórios e inibitórios em zebrafish, tais como, dopaminérgico, serotoninérgico, colinérgico, glutamatérgico, purinérgico, histaminérgico, nitrérgico, glicinérgico, gabaérgico, enfatizando aspectos farmacológicos e toxicológicos. Em suma, esta tese demonstra o efeito da exposição crônica ao etanol afeta o sistema glutamtérgico e purinérgico, expressão de BDNF em cérebro de zebrafish. O aumento do conhecimento global sobre os sistemas de neurotransmisão em zebrafish e o esclarecimento de efeitos farmacológicos e toxicológicos poderia contribuir para novas estratégias de pesquisa em ciências básicas e biomédicas. / The zebrafish (Danio rerio) is a species used as experimental models in various fields such as neurosciences, toxicology. Its genome has already been sequenced and studies have shown that many genes are similar to those of mammals. Furthermore, zebrafish provides an excellent model to study the function of different neurotransmitter systems. The ethanol consumption exerts several changes in motor coordination, sensory perception and cognition, promoting a wide-spectrum of biochemical and physiological alterations on nervous cells. Here we investigated the effects promoted by chronic ethanol exposure on glutamatergic and purinergic systems, and BDNF levels in zebrafish CNS. High-affinity excitatory amino acid transporters (EAATs) regulate extracellular glutamate levels. We identified and described the expression profile of EAATs-related genes and the functional properties of glutamate uptake in three major brain structures from zebrafish (telencephalon, optic tectum and cerebellum). Searches on zebrafish genome databases and a phylogenetic analysis confirmed the presence of several EAAT-related genes (EAAT2, EAAT3, three EAAT1 paralogs and two EAAT5 sequences). Moreover, the glutamate uptake was significantly higher in optic tectum, which indicates functional differences within zebrafish brain structures. EAATs belong to the solute carrier family 1 (SLC1), that constitute high-affinity glutamate and neutral amino acid transporters. Recently, the phylogenetic analysis and cloning reporting of SLC1/EAAT genes from zebrafish identified distinct members of this transporter family. In order to unify the nomenclature of SLC1/EAAT genes in zebrafish, it was proposed a common nomenclature for these groups. The actions of ethanol on glutamate uptake showed a significant decrease in glutamate transport (30% and 54%) after 7 and 14 days of exposure, whereas after 28 days, no significant changes were detected. Na,K-ATPase, the enzyme responsible to generate ion gradients, did not alter after all exposure periods. Moreover, fish exposed to ethanol during 7 and 14 days exhibit a decrease of mRNA levels for SLC1A1/EAAT3. However, the gene expression of SLC1A8a,b/EAAT6a,b increased after all exposure periods, whereas SLC1A3a,b/EAAT1b increased only after 28 days. The prolonged ethanol exposure did not significantly change the glutamine synthetase and glutaminase activities. In the same way, ethanol did not alter the ATP and GTP hydrolysis. However, a decrease in ADP (46% and 34%) and GDP (48% and 36%) hydrolysis was verified after 7 and 14 days, respectively. After 7 and 14 days of ethanol exposure, a significant decrease in AMP hydrolysis (48% and 36%) was also observed, whereas GMP hydrolysis was inhibited only after 7 days (46%). Furthermore, nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) transcript levels were altered after 7, 14, and 28 days. In contrast, 5′-nucleotidase expression was not altered. Adenosine deaminase (ADA) activity from soluble fraction was not modified, but a decrease of ADA activity in membrane fraction after 28 days (44%) of ethanol exposure was observed. Gene expression analysis demonstrated that ADA1 remained unaltered, whereas ADAL, ADA2-2, ADA2-1 transcripts, and its truncated alternative splice isoform (ADA2-1/T) were altered after prolonged ethanol exposure. After 14 and 28 days, ethanol increased the BDNF gene expression, but did not change the levels of trkB transcripts. The measurement of BDNF protein through ELISA kit anti-BDNF showed increased amounts after 28 days of exposure (51%), which was also confirmed by immunohistochemstry. These results suggest that the homeostasis of neurotrophic functions may be altered by prolonged ethanol consumption. Moreover, we present a review about the role of different excitatory and inhibitory neurotransmitters systems in zebrafish, such as dopaminergic, serotoninergic, cholinergic, glutamatergic, purinergic, histaminergic, nitrergic, glycinergic, and GABAergic systems, emphasizing pharmacological and toxicological aspects. In conclusion, this thesis demonstrates that chronic ethanol exposure affects the glutamatergic and purinergic systems, and BDNF expression in zebrafish brain. The significant increase in the global knowledge about the neurotransmitters systems in zebrafish and the elucidation of pharmacological and toxicological effects could lead to new strategies and appropriate priorities in research in order to support complementary insights on basic sciences and biomedical research.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel dos derivados da guanina na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados desta tese estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental (parte dois) e clínica (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas foi realizada e um novo sistema guanosinérgico foi proposto. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanosina é antinociceptiva em diversos modelos de dor. A administração sistêmica de guanosina causou um aumento significativo nos níveis de guanosina no líquido cefalorraquiano (LCR), demonstrando que este composto penetra ativamente no sistema nervoso central. Diversos testes comportamentais e neuroquímicos demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pela guanosina. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanosina foram investigados através de métodos neuroquímicos e farmacológicos. Guanosina foi escolhida porque tem demonstrado interagir com o sistema glutamatérgico - sabidamente envolvido na transmissão da dor - por estimular a recaptação de glutamato. Guanosina atenuou o comportamento doloroso induzido pela injeção intratecal de glutamato e seus agonistas (AMPA, cainato, trans-ACPD) e hiperalgesia induzida por altas doses de MK-801, um efeito provavelmente relacionado à diminuição das concentrações de glutamato e aspartato no LCR. Guanosina também foi testada em um método para avaliar a captação de glutamato em fatias de cérebro e medula. Nossos resultados demonstraram que a guanosina não alterou a captação basal de glutamato. Entretanto, a guanosina atenuou os efeitos da dor sobre a captação de glutamato. Baseado nestes dados, não é possível estabelecer uma relação causal entre os dados da captação e o comportamento doloroso. Entretanto, podemos argumentar que os efeitos da guanosina sobre a captação de glutamato foram provavelmente produzidos pela modulação do estímulo doloroso e não correspondem a um mecanismo de ação responsável por estas alterações. Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeitos antinociceptivos em camundongos. Este efeito está provavelmente relacionado ao acúmulo de adenosina e guanosina no meio extracelular. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. A terceira parte desta tese demonstra trabalhos sobre o sistema purinérgico em humanos. Estes estudos investigaram a correlação entre a concentração de purinas no LCR e dor aguda ou crônica em humanos. Os resultados demonstram que adenosina, guanosina e inosina correlacionaram-se significativamente com a dor em humanos. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanosina é proposto: a modulação da dor. Guanosina e outras purinas são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema glutamatérgico. / The main aims of this work were the investigation of the role of guanine-based purines on nociception and the understanding of the mechanism of action leading to extracellular effects of these compounds. The results obtained are presented in three distinct parts based on their nature, namely, literature review (part one), experimental (part two) and clinical (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular roles for the purinergic system was performed and a guanine-based purinergic system was proposed. In the second part, experimental procedures in animals demonstrated that guanosine is antinociceptive in several acute or chronic pain models in rodents. Systemic administration of guanosine significantly increased cerebrospinal fluid (CSF) guanosine levels, showing that this compound actively penetrates in the central nervous system. Several behavioral tasks and neurochemical approaches demonstrated that guanosine presents minimal toxic effects. After that, the mechanisms of action underlying the antinociceptive effects of guanosine were investigated, by using pharmacological and neurochemical means. Guanosine was chosen because it has been shown to interact with the glutamatergic system - which is known to be involved in the mechanisms of pain transmission - by promoting astrocytic glutamate reuptake. Guanosine attenuated nociceptive behavior induced by intrathecal administration of glutamate and its receptor agonists (AMPA, kainate, trans-ACPD) and hyperalgesia induced by high-dose MK-801, an effect that seems to be related with the reduction of glutamate and aspartate accumulation in the CSF. Guanosine was tested in a model of glutamate uptake by brain and spinal cord slices from rats and mice. Our results demonstrated that guanosine did not alter basal glutamate uptake at both brain and spinal cord. However, guanosine attenuated effects on glutamate uptake induced by pain behavior in animals. It is not possible to establish whether the changes in the spinal cord glutamate uptake were responsible for nociceptive behavior or it caused the changes. However, we may argue that the changes in the glutamate uptake induced guanosine were probably produced by modulation of nociceptive stimuli rather than an underlying mechanism of action. In the second part of this work, we demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used to treat hyperuricemia, also produced consistent antinociception in mice. This effect was probably related to the accumulation of extracellular adenosine and guanosine. It was therefore concluded that, although is early to propose the use of purines in a clinical setting, allopurinol could be an excellent alternative to test this hypothesis since shows the advantage of be already approved for commercial use, presenting well tolerability and very low cost. The third part of this work presents some results derived from the human models of pain. These studies investigated the correlation between the CSF concentration of purines and acute or chronic pain in humans. Our results show that adenosine, guanosine and inosine were significantly correlated with pain in humans. Altogether these results further demonstrate the role of purines in pain mechanisms and provide a new role for guanosine: pain modulation. Guanosine and other purines presents as a new target for future drug development and might be useful for treat pain related to overstimulation of the glutamatergic system.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-12-13T12:43:30Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 392063 bytes, checksum: 6d044775c102dc09c3ead37086d2b1f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-13T12:43:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 392063 bytes, checksum: 6d044775c102dc09c3ead37086d2b1f2 (MD5) Previous issue date: 2016-04-18 / Esse estudo foi conduzido para estabelecer o perfil nictemeral da excreção urinária de creatinina (CR), uréia (UR), nitrogênio total (NT) e derivados de purina (DP) e as relações UR:CR, NT:CR e DP:CR em vacas leiteiras, com objetivo de reduzir a coleta de 24 para 2h ou indicar o melhor horário para estimar esses compostos por meio de coletas de urina spot. Foram utilizadas quinze vacas Holandesas em sistema de confinamento total em baias individuais. O estudo foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com três tratamentos e cinco repetições. Os tratamentos consistiram de três níveis de produção diária: Alta (31,26 ±2,99 kg), média (22,86 ±1,57 kg) e baixa (14,16 ±0,75 kg). O período experimental teve duração de 27 dias, sendo 14 para adaptação dos animais às condições experimentais e 13 dias para coletas de amostras. As amostras spot de urina foram coletadas de 2h em 2h (2hSp) no 16° e 17° dia experimental. Do 22o ao 25o dia foram obtidas amostras totais de urina a intervalos de duas horas. Não houve diferença entre os horários de coleta e produção de leite (PL) para a excreção diária de creatinina, expressa em mg/kgPC e para relação DP:CR para coleta total de 2h em 2h (2hTL). Houve efeitos dos horários de coleta e PL sobre as relações UR:CR e NT:CR para coleta 2hTL. Os horários representativos para coleta 24h das coletas 2hTL foram 2, 4, 6, 8, 12, 18, 20 ou 24 h para relação UR:CR e 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 22 ou 24 h para relação NT:CR. Não houve diferença entre os horários de coleta e PL para relação DP:CR em coleta 2hSp. Para as coletas 2hSp, os horários indicados para estimação da excreção de NT e UR, foram 10, 18 e 24 h. Conclui-se que a excreção de creatinina, expressa em mg/kgPC, e a relação DP:C não variam ao longo do dia, respaldando a recomendação de que a coleta spot de urina seja efetuada a qualquer horário do dia para estimar a excreção de DP diária. Para coletas de urina spot ou redução do tempo de coleta de 24 para 2h, com objetivo de estimar a excreção de compostos nitrogenados, recomenda-se os horários de 10h, 18h e 24h. Ressalta-se, finalmente, que apesar desses três horários individualmente estimarem adequadamente a produção de compostos nitrogenados e DP, recomenda-se que seja feita coleta nos três horários para reduzir a probabilidade de erros das estimativas. / This study was conducted to establish the diurnal profile of urinary excretion of creatinine (CR), urea (UR), total nitrogen (TN), and purine derivatives (PD) and the UR:CR, TN:CR, and PD:CR ratios in dairy cows, aiming to reduce the collection time from 24 h to 2 h or indicate the best time to estimate these compounds via spot urine collections. Fifteen Holstein cows were used in a total confinement system, housed in individual stalls. The study was undertaken as a completely randomized design with three treatments and five replications. Treatments consisted of three levels of daily milk yield: high (31.26±2.99 kg), medium (22.86±1.57 kg), and low (14.16±0.75 kg). The experimental period lasted 27 days, including 14 days for the adaptation of animals to the experimental conditions and 13 days for sample collections. Spot urine samples were collected every 2 h (2hSp) on the 16th and 17th experimental days. From the 22nd to the 25th days, total urine samples were obtained at two-hour intervals. There was no difference between collection times and milk yield (MY) for the daily excretion of creatinine, expressed in mg/kg BW, and for the PD:CR ratio for total collection performed every 2 h (2hTL). There was an effect of collection times and MY on the UR:CR and TN:CR ratios for 2hTL collection. The representative times for the 24-h collection of 2hTL collections were 2, 4, 6, 8, 12, 18, 20, or 24h00 for UR:CR ratio and 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 22, or 24h00 for TN:CR ratio. There was no difference between collection times and MY for the PD:CR ratio in 2hSp collection. For 2hSp collections, the times indicated for the estimate of TN and UR excretion were 10, 18, and 24 h. In conclusion, creatinine excretion, expressed in mg/kg BW, and PD:CR ratio do not vary throughout the day, corroborating the recommendation that the spot urine collection should be performed at any time of the day to estimate the daily PD excretion. For spot urine collections or to reduce the collection time from 24 to 2 h aiming to estimate the excretion of nitrogen compounds, the times 10h00, 18h00, and 24h00 are recommended. Lastly, we stress that although these three times alone adequately estimate production of nitrogen compounds and PD, we recommend that collection be performed at all three times to reduce the error probability of estimates.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel dos derivados da guanina na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados desta tese estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental (parte dois) e clínica (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas foi realizada e um novo sistema guanosinérgico foi proposto. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanosina é antinociceptiva em diversos modelos de dor. A administração sistêmica de guanosina causou um aumento significativo nos níveis de guanosina no líquido cefalorraquiano (LCR), demonstrando que este composto penetra ativamente no sistema nervoso central. Diversos testes comportamentais e neuroquímicos demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pela guanosina. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanosina foram investigados através de métodos neuroquímicos e farmacológicos. Guanosina foi escolhida porque tem demonstrado interagir com o sistema glutamatérgico - sabidamente envolvido na transmissão da dor - por estimular a recaptação de glutamato. Guanosina atenuou o comportamento doloroso induzido pela injeção intratecal de glutamato e seus agonistas (AMPA, cainato, trans-ACPD) e hiperalgesia induzida por altas doses de MK-801, um efeito provavelmente relacionado à diminuição das concentrações de glutamato e aspartato no LCR. Guanosina também foi testada em um método para avaliar a captação de glutamato em fatias de cérebro e medula. Nossos resultados demonstraram que a guanosina não alterou a captação basal de glutamato. Entretanto, a guanosina atenuou os efeitos da dor sobre a captação de glutamato. Baseado nestes dados, não é possível estabelecer uma relação causal entre os dados da captação e o comportamento doloroso. Entretanto, podemos argumentar que os efeitos da guanosina sobre a captação de glutamato foram provavelmente produzidos pela modulação do estímulo doloroso e não correspondem a um mecanismo de ação responsável por estas alterações. Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeitos antinociceptivos em camundongos. Este efeito está provavelmente relacionado ao acúmulo de adenosina e guanosina no meio extracelular. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. A terceira parte desta tese demonstra trabalhos sobre o sistema purinérgico em humanos. Estes estudos investigaram a correlação entre a concentração de purinas no LCR e dor aguda ou crônica em humanos. Os resultados demonstram que adenosina, guanosina e inosina correlacionaram-se significativamente com a dor em humanos. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanosina é proposto: a modulação da dor. Guanosina e outras purinas são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema glutamatérgico. / The main aims of this work were the investigation of the role of guanine-based purines on nociception and the understanding of the mechanism of action leading to extracellular effects of these compounds. The results obtained are presented in three distinct parts based on their nature, namely, literature review (part one), experimental (part two) and clinical (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular roles for the purinergic system was performed and a guanine-based purinergic system was proposed. In the second part, experimental procedures in animals demonstrated that guanosine is antinociceptive in several acute or chronic pain models in rodents. Systemic administration of guanosine significantly increased cerebrospinal fluid (CSF) guanosine levels, showing that this compound actively penetrates in the central nervous system. Several behavioral tasks and neurochemical approaches demonstrated that guanosine presents minimal toxic effects. After that, the mechanisms of action underlying the antinociceptive effects of guanosine were investigated, by using pharmacological and neurochemical means. Guanosine was chosen because it has been shown to interact with the glutamatergic system - which is known to be involved in the mechanisms of pain transmission - by promoting astrocytic glutamate reuptake. Guanosine attenuated nociceptive behavior induced by intrathecal administration of glutamate and its receptor agonists (AMPA, kainate, trans-ACPD) and hyperalgesia induced by high-dose MK-801, an effect that seems to be related with the reduction of glutamate and aspartate accumulation in the CSF. Guanosine was tested in a model of glutamate uptake by brain and spinal cord slices from rats and mice. Our results demonstrated that guanosine did not alter basal glutamate uptake at both brain and spinal cord. However, guanosine attenuated effects on glutamate uptake induced by pain behavior in animals. It is not possible to establish whether the changes in the spinal cord glutamate uptake were responsible for nociceptive behavior or it caused the changes. However, we may argue that the changes in the glutamate uptake induced guanosine were probably produced by modulation of nociceptive stimuli rather than an underlying mechanism of action. In the second part of this work, we demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used to treat hyperuricemia, also produced consistent antinociception in mice. This effect was probably related to the accumulation of extracellular adenosine and guanosine. It was therefore concluded that, although is early to propose the use of purines in a clinical setting, allopurinol could be an excellent alternative to test this hypothesis since shows the advantage of be already approved for commercial use, presenting well tolerability and very low cost. The third part of this work presents some results derived from the human models of pain. These studies investigated the correlation between the CSF concentration of purines and acute or chronic pain in humans. Our results show that adenosine, guanosine and inosine were significantly correlated with pain in humans. Altogether these results further demonstrate the role of purines in pain mechanisms and provide a new role for guanosine: pain modulation. Guanosine and other purines presents as a new target for future drug development and might be useful for treat pain related to overstimulation of the glutamatergic system.