O câncer não-melanoma corresponde a 25% de todos os tumores e é caracterizado por uma neoplasia dos queratinócitos. Evidências mostram que a resistência a apoptose é uma das características para o surgimento e evolução dos tumores malignos. A proposta deste trabalho foi estudar quais funções as moléculas BIM, PUMA e Fas desempenham nos queratinócitos quando submetidas à transformações celulares, como UVB e DMBA, e indutores de apoptose. Para isso foi estabelecido cultura primaria de queratinócitos de neonatos das linhagens C57Bl/6 WT; PUMA KO; LPR. As células foram tratadas com AD, VP-16, CHX, UVB e DMBA in vitro. Observamos a expressão de Bid, Bim, Bax no tratamento com UVB. Avaliamos o perfil de desenvolvimento do tumor nesses animais utilizando um modelo de tumorigenese química in vivo. Os queratinócitos deficientes em PUMA e Fas se comportam de maneira semelhante no tratamento com quimioterápicos, no entanto, no tratamento com carcinógenos a molécula Fas desempenha um papel mais relevante na indução de morte celular e no desenvolvimento da carcinogênese. / The non-melanoma cancer accounts for 25% of all tumors and is characterized by a neoplasm of keratinocytes. Evidence shows that apoptosis resistance is one of the characteristics for the emergence and development of malignant tumors. The This study investigated what roles the BIM, PUMA and Fas molecules play in keratinocytes when subjected to cell transformations, such as UVB and DMBA, and apoptosis inducers. For this, keratinocytes primary culture was established from neonatal skin to C57BL / 6 WT; PUMA KO; LPR. The cells were treated with AD, VP-16, CHX, UVB and DMBA in vitro. We observed the expression of Bid, Bim, Bax in treatment with UVB. We evaluated tumor development profile in these animals using a model of chemical tumorigenesis in vivo. PUMA-deficient keratinocytes and Fas mutant have similarly behave in chemotherapy treatment, however, Fas molecule plays a more important role in the induction of cell death with the treatment with carcinogens in the development and carcinogenesis.

Orientadores: Mary Ann Foglio, Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz, João Ernesto de Carvalho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:38:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zago_PatriciaMariaWiziack1982-_D.pdf: 5120519 bytes, checksum: a581f776ecdecf5822427a828d170cc1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Osteonecrose Maxilar Induzida por Bisfosfonatos (OMIB) está associada à terapia com bisfosfonatos como o ácido zoledrônico (ZA), que são medicamentos importantes para o manejo de patologias ósseas. Estudos in vitro demostraram que os bisfosfonatos podem alterar a viabilidade e proliferação de células epiteliais, o que justificaria situações de deficiente cicatrização em feridas de OMIB. Arrabidaea chica (H&B.) Verlot é uma Bignoniaceae com propriedades cicatrizantes, e que apresenta as antocianidinas como principais compostos identificados. Este estudo avaliou a atividade antimicrobiana, citotóxica e citoprotetora, in vitro, do extrato hidroalcoólico de A. chica (AC) na presença de ZA. Foi realizado estudo de estabilidade nas condições de 40 °C e 75% umidade, do extrato microencapsulado em mistura de goma arábica com maltodextrina (1:1) e do extrato livre correspondente. Queratinócitos (HaCaT), fibroblastos (PT64-04HF) e osteoblastos (MC3T3-E1) foram submetidos a 2 protocolos de tratamento: a exposição a ZA 10 µM por 24h e posteriormente AC por 48h e vice-versa; ou o co-tratamento de ambos. Os parâmetros estudados foram viabilidade, ocorrência de apoptose e ativação de caspases 3/7. A viabilidade de células de câncer de próstata (C4-2B) foi avaliada após tratamento com AC. Streptococcus mutans foram submetidos ao co-tratamento ZA e AC. Microcápsulas contendo AC foram produzidas por processamento em spray dryer, aliquotadas e armazenadas em câmara climática para o estudo de estabilidade acelerada, segundo protocolo da ANVISA (RE 01/2005). Os resultados foram submetidos à análise estatística (ANOVA e Teste T de Student, a=0,05). Após 48 h, ZA reduziu a viabilidade de queratinócitos, fibroblastos e osteoblastos em, respectivamente, 34%, 47% e 51%. O co-tratamento ZA e AC 5 µg mL-1 aumentou a viabilidade celular (82%, 83% e 55%), o mesmo ocorrendo para ZA e AC 10 µg mL-1 (69%, 70% e 64%). Após 48 h de tratamento com ZA, não houve apoptose celular ou ativação de caspases em fibroblastos, mas verificou-se a ativação de caspase 3/7 em osteoblastos. As concentrações de 5 e 10 µg mL-1 de AC não alteraram a viabilidade de células C4-2B, porém observou-se uma redução de mais de 40% em concentrações maiores que 10 µg mL-1. O crescimento de S. mutans foi aparentemente aumentado após o tratamento com ZA em concentrações maiores que 50 µM, sem que AC ocasionasse qualquer efeito. Finalmente, o material formador de parede (mistura de goma arábica com maltodextrina 1:1) empregado para microencapsular AC, foi incapaz de inibir a degradação das antocinidinas, cujas concentrações relativas foram reduzidas após 15 dias de incubação. Assim, baixas concentrações de AC (5 e 10 µg mL-1) demostraram promissora atividade citoprotetora contra os efeitos prejudiciais de ZA, em células epiteliais e osteoblastos, sem estimularem o crescimento das células cancerígenas (C4-2B) e de S. mutans. Outros materiais formadores de parede serão avaliados, buscando-se aumentar a estabilidade química de AC. Mais estudos são necessários para a comprovação dos efeitos benéficos de AC como um auxiliar no tratamento de OMIB / Abstract: The bisphosphonate related osteonecrosis of the jaw (BRONJ) is a condition associated to bisphosphonates, medicines used to treat bone disorders, as zoledronic acid. In vitro studies showed epithelial cells viability and growth can be altered by bisphosphonates, and may cause a deficient wound healing in BRONJ. Arrabidaea chica (H&B.) Verlot is a Bignoniaceae with wound healing properties, however, anthocyanidins, the main compounds of the plant extract, can be easily degraded under environmental conditions. This in vitro study aimed to evaluate the antimicrobial, citotoxic and citoprotective actions of A. chica hydroalcoholic extract (AC) in the presence of ZA therapy. Stability studies at 40 °C and 75% humidity conditions, from microencapsulated into arabic gum plus maltodextrin (1:1) and free crude extract samples were conducted. Keratinocytes (HaCaT), fibroblasts (PT64-04HF) and osteoblasts (MC3T3-E1) were submitted to 2 treatment protocols: zoledronic acid 10 µM (ZA) therapy during 24 h and then AC during 48 h and vice-versa; or co-treatment with both. Parameters as viability, apoptosis and caspase 3/7 activation were evaluated. Cancer cells (C4-2B) viability was determined after AC treatment. Streptococcus mutans were submitted to co-treatment with ZA and AC. Microcapsules containing AC were obtained after spray dryer processing, aliquoted and stored into climatic chamber for stability study according to ANVISA protocol (RE 01/2005). ANOVA and T Student test, ?a=0,05, were applied for statistical analysis. After 48 h, ZA treatment decreased viability of keratinocytes, fibroblasts and osteoblasts repectively by 34%, 47% and 51%. Co-treatments ZA and AC 5 µg mL-1 (82%, 83% and 55%), and ZA and AC 10 µg mL-1 (69%, 70% and 64%) increased cell viability. No apoptosis or caspase activation were detected on fibroblasts, however, caspase 3/7 was active on osteoblasts after ZA 48 h treatment. Concentrations higher than 10 µg mL-1 of AC were toxic to cancer cells and showed a decrease by 40% in cell viability, while no effect was seen with AC 5 or 10 µg mL-1. Higher ZA concentrations (50 µM) seemed to induce S. mutans growth, while AC showed no effect on bacteria. Finally, the studied core matherial (arabic gum plus matodextrin 1:1) was ineffective on protecting AC extract against degradation, since anthocyanidins concentration was reduced after 15 days incubation. Therefore, lower AC concentrations (5 and 10 µg mL-1) were promising on treating BRONJ wounds, as they were effective in protect epithelial cells against harmfull effects of ZA, without affecting cancer cells or S. mutans growth. Different types of core matherials must be evaluated for improving AC chemical stability. More studies are required to prove AC beneficial effects on treating BRONJ / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutora em Odontologia

Orientador: Giselle Zenker Justo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T14:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_RodrigoAugustoda_D.pdf: 6436030 bytes, checksum: 9f8fa7c9b01f00bc5d2d2396d4099a1e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A epiderme é constantemente confrontada por inúmeros agentes estressores. Variações na umidade ou exposição à radiação ultravioleta afetam o balanço osmótico e o estado redox celular alterando, assim, as características fisiológicas da pele. Em resposta aos diferentes estímulos os queratinócitos ativam vias distintas de sinalização. Portanto, o balanço entre as vias de sobrevivência e morte determina o destino celular. A fim de se determinar possíveis alvos moleculares associados a morte e sobrevivência de queratinócitos, vias de sinalização celular disparadas pela exposição ao choque hiperosmótico e estresse oxidativo foram investigadas em células HaCaT tratadas com sorbitol e peróxido de hidrogênio (H2O2) respectivamente. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que, em ambos os modelos, a redução da viabilidade celular dependeu da dose e do tempo de exposição ao agente extressor, apresentando valores de IC50 de aproximadamente 1 mol/L de sorbitol e 2 mmol/L de H2O2 após 2 e 4 h de exposição respectivamente. Os danos causados foram irreversíveis e estão associados à ativação da via intrínseca de morte celular apoptótica, acompanhada de perda da integridade da membrana lisossomal, extravasamento de catepsina B para o citosol e alterações morfológicas atípicas no citoesqueleto, principalmente no arranjo dos filamentos de actina. A investigação do status de funcionamento de proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) e do estado redox celular indicou que esses eventos foram mediados por espécies reativas de oxigênio e pela ação da quinase c-Jun N-terminal (JNK). Adicionalmente, a exposição dos queratinócitos aos diferentes estímulos estressores foi acompanhada de ativação da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular (LMWPTP), cuja relevância nos estudos de biologia celular aumentou nos últimos anos. A LMWPTP atua em importantes vias de sinalização que estão associadas à sobrevivência e morte celular. Cientificamente, este estudo é pioneiro ao demonstrar alterações no citoesqueleto e ação de proteínas quinases e fosfatases nos mecanismos que determinam o destino de queratinócitos expostos ao choque hiperosmótico e ao estresse oxidativo. De fato, o melhor conhecimento da relação entre as vias de sobrevivência e morte celular em queratinócitos é fundamental para promover o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas aplicadas às doenças dermatológicas. Desta maneira, o presente trabalho apresenta resultados inéditos, contribuindo no conhecimento da biologia dos queratinócitos e com sua aplicação no desenvolvimento da terapia dermatológica / Abstract: The epidermis is constantly confronted with multiple environmental stressors. Changes in humidity or exposition to UV radiation affect the redox state and osmotic balance, modifying the physiological characteristics of the skin. In response to different stresses, epidermal keratinocytes can activate distinct signaling pathways and the balance between death and life signals will determine the cell fate, leading to programmed cell death or cell survival. In order to determine the possible molecular targets associated to death and survival of keratinocytes, the signaling pathways activated by the exposition of HaCaT cells to sorbitol (hyperosmotic shock) and H2O2 (oxidative stress) were investigated. The results showed that in both models the reduction in cellular viability was time and dose-dependent, displaying IC50 values of 1 mol/L for sorbitol and 2 mmol/L for H2O2 after 2 and 4 h of exposition to the stressors, respectively. The damages caused by the stressors were irreversible and associated to the induction of the intrinsic apoptotic pathway, accompanied by the loss of lisosomal membrane integrity, release of cathepsin B to cytosol and atypical morphological alterations in cytoskeleton, particularly in the arrangement of actin filaments. Analysis of the functional status of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and the cellular redox state showed that such events were mediated by reactive oxygen species and occurred through c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation. Additionally, exposure of keratinocytes to the different stress inducers was followed by low molecular weight tyrosine protein phosphatase (LMWPTP) activation, which is responsible for the regulation of important signaling pathways associated to cell survival and death. It is important to highlight the novelty of these results showing alterations in the cytoskeleton and the action of protein kinases and phosphatases during exposure of keratinocytes to hyperosmotic and oxidative stresses. In fact, the development of more efficacious therapies against skin diseases depends on the establishment of the relationships between the survival and death signaling pathways in keratinocytes. In this direction, this work contributes to a better understanding of the keratinocyte biology and the improvement of traditional dermatological therapies / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, não significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletroporação). Os músculos quadríceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransferência foi realizado comparando a utilização da sequência genômica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasmídeos sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circulação de camundongos lit/scid, por um período de 21 dias. Foram também construídos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que serão utilizados num próximo estudo, tanto para a transdução de queratinócitos, como para a eletrotransferência in vivo. Vetores lentivirais serão de fato necessários para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em comparação com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, têm como meta estabelecer condições para que a terapia gênica seja num futuro próximo uma alternativa viável e segura para o tratamento da deficiência de GH e de outras doenças sistêmicas. / Keratinocytes are very attractive cells for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. In this study, retrovirally transduced keratinocytes with the mouse growth hormone (mGH) gene underwent a treatment for adhesion to collagen and clonal analysis, in order to enrich in stem cells the keratinocyte population. The main result was an in vitro increase of cell viability for treated keratinocytes, which should result in an increase of the in vivo sustainability of hormone secretion, when implanting organotypic cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice. A model for in vivo gene therapy based on the electrotransfer of human growth hormone (hGH)-coding naked DNA in the exposed quadriceps muscle of dwarf (lit/lit) and immunodeficient dwarf (lit/scid) mice was also utilized. Electroporation conditions were optimized, setting up eight 50-V pulses of 20 ms at a 0.5 s interval, using a plasmid containing the ubiquitin C promoter and the genomic hGH sequence. Administration of a single dose of 50 g of this plasmid led, for the first time in the literature, to sustained levels of circulating hGH of the order of 1.5-3 ng/ml, up to 60 days. The DNA-treated animals presented a highly significant weight gain (P<0.001) of 33.1%, compared to a non-significant weight loss of 4.2% for the control group (saline injected mice + electroporation). The injected quadriceps muscles of the DNA-treated mice showed a 48% weight increase, when compared to the control group (P<0.001). Another electrotransfer study was carried out comparing the use of the genomic hGH sequence (gDNA) with the complementary sequence (cDNA), cloned under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. It was observed that hGH was more efficiently expressed in the circulation of lit/scid mice, for 21 days, when injecting cDNA. Lentiviral vectors containing the hGH (cDNA and gDNA) and the mGH (cDNA) genes were also constructed and will be used in a next study, both for the transduction of keratinocytes or for in vivo electrotransfer. Lentiviral vectors will in fact be necessary for future studies, considering their reduced toxicity when compared to retroviral vectors. The results of this work, as well as opening perspectives of new studies, will establish in the near future conditions for gene therapy as a feasible and safe option for the treatment of GH deficiency and other systemic diseases.

Observações feitas pelo próprio autor sugerem potencial ação do Líquido da Castanha de Caju (LCC) na pigmentação da pele, ação esta semelhante a da hidroquinona. O LCC é um líquido contido na casca da castanha de caju, possui característica de resina líquida, bastante viscosa e de odor forte, sua coloração varia de marrom claro, escuro a preto, dependendo do método de extração utilizado, podendo ser denominado de Natural ou Técnico. Este estudo propôs cultivar melanócitos e queratinócitos em cocultura e posteriormente tratálos com LCC. A L-DOPA, agente estimulador da melanogênese, via da produção de melanina, responsável pela pigmentação da pele, foi utilizada na cocultura para avaliar a ação do LCC. A hidroquinona, conhecido inibidor desta via, foi utilizada na cocultura como controle positivo para o LCC, visto que este poderia apresentar ação semelhante a da hidroquinona. Para a utilização do LCC na cocultura, testes de solubilidade do mesmo para posterior dispersão no meio de cultura, foram necessários, bem como a identificação de seu potencial cito e fototóxico in vitro. Para a realização do teste de fototoxicidade foi construída uma câmara específica, atendendo as normas exigidas pelos guias ©ECVAM DB-ALM: INVITTOX protocol e OECD TG-432, sendo esta qualificada por método validado. Os testes realizados com o LCC (natural e técnico) indicaram potencial ação destes na pigmentação da pele, estimulando a proliferação de melanócitos em cocultura. Este perfil apresentado, pelos extratos de LCC, é contrário ao da hidroquinona, e ao esperado inicialmente, sendo necessário aprofundar estes estudos. No entanto, estes resultados são promissores, sugerindo a descoberta de um novo tratamento para hipocromias. / Observations, made by the author, suggest potential action of Cashew Nut Shell Liquid (CNSL) in skin pigmentation, action similar to hydroquinone. The CNSL is a liquid contained inside the shell of the cashew nut, it has features of liquid resin, quite viscous and strong smell. Its color varies from clear or dark brown, to black, depending on the extraction method used, which may be called Natural or Technical. This study aimed to cultivate melanocytes and keratinocytes in co-culture and thus treat them with CNSL. The L-DOPA, stimulating agent of melanogenesis, melanin production pathway, responsible for skin pigmentation, was used to assess the CNSL action in the co-culture. Hydroquinone, known inhibitor of this pathway, was used as positive control for CNSL in the co-culture, since this could provide a similar action to hydroquinone. For use of CNSL in the co-culture, solubility tests, for subsequent dispersion in the culture medium, were necessary, as well as the identification of its cytototoxic and phototoxic potential in vitro. To achievement of the phototoxicity tests a specific chamber was built according to the standards required by the guides ©ECVAM DB-ALM: INVITTOX protocol and OECD TG-432, being qualified by validated method. Tests conducted with the CNSL (natural and technical) indicated their potential actions in skin pigmentation, stimulating the proliferation of melanocytes in co-culture. This behavior presented by the CNSL extracts, is opposite to the hydroquinone, and to the initially expected, being required further studies. However, these results are promising, suggesting the discovery of a new treatment for hypochromia.

Queratinócitos são um veículo bastante atrativo para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. Um eficiente vetor retroviral (LXSN) contendo o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foi utilizado para transduzir queratinócitos humanos primários. Os queratinócitos transduzidos apresentaram um nível de secreção in vitro alto e estável atingindo até 11 g mGH/106 células/dia. Os epitélios formados por estes queratinócitos geneticamente modificados apresentaram, porém, uma queda na taxa de secreção > 80 % quando foram retirados da placa de cultura utilizando um procedimento clássico. A substituição desta metodologia clássica por uma cultura organotípica resolveu completamente este problema. Camundongos anões imunodeficientes (lit/scid) implantados com estes enxertos organotípicos foram acompanhados durante 4 meses, e apresentaram um aumento de peso significativo (P<0,05) nos primeiros 40 dias. Níveis circulatórios de mGH atingiram um pico de 21 ng/mL 1 h após o implante, mas estes níveis rapidamente atingiram níveis basais (~2 ng/mL). Os queratinócitos humanos primários apresentaram portanto altos níveis de expressão in vitro e os maiores níveis circulatórios, porém por um breve período de tempo, reportados até o momento para GH neste tipo de células. Em conjunto com resultados que mostraram uma recuperação considerável da eficiência de secreção de mGH em cultura por enxertos organotípicos retirados dos animais, foram discutidos os fatores que ainda impedem a utilização clínica deste modelo promissor de terapia gênica cutânea. / Keratinocytes are a very attractive vehicle for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. An efficient retroviral vector (LXSN) encoding the mouse growth hormone gene (mGH) was used to transduce primary human keratinocytes. Organotypic raft cultures were prepared with these genetically modified keratinocytes and were grafted onto immunodeficient dwarf mice (lit/scid). Transduced keratinocytes presented a high and stable in vitro secretion level of up to 11 g mGH/106cells/day. Conventional epidermal sheets made with these genetically modified keratinocytes, however, showed a drop in secretion rates of > 80% simply due to detachment of the epithelium from its substratum. Substitution of conventional grafting methodologies with organotypic raft cultures completely overcame this problem. The stable long-term grafting of such cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice could be followed for more than 4 months, and a significant weight increase (P<0.05) over the control group was observed in the first 40 days. Circulating mGH levels revealed a peak of 21 ng/mL just 1h after grafting, but unfortunately these levels rapidly fell to baseline values (~ 2 ng/mL). mGH-secreting primary human keratinocytes presented the highest in vitro expression and peak circulatory levels reported to date for a form of GH with this type of cells. Together with data showing that excised implants can recover in culture a remarkable fraction of their original in vitro mGH secretion efficiency, the factors that might still hamper the success of this promising model of cutaneous gene therapy are discussed. SUMÁRIO

A psoríase é uma doença inflamatória crônica com uma elevada incidência, que afeta a pele. A patogênese da psoríase caracteriza-se pela participação de inúmeras células, incluindo os queratinócitos que são as principais células efetoras da citocina IL-17, críticas para a doença, que produzidas pelas células T. Evidências crescentes sugerem o importante papel da piruvato quinase M2 (PKM2) na regulação da resposta inflamatória, mas o mecanismo subjacente permanece obscuro. Nesse sentido, no presente estudo investigamos o papel da PKM2 no desenvolvimento da psoríase. Observamos o aumento de PKM2 em biópsia humana, em modelo de psoríase induzida por imiquimode e em modelos espontâneos K14-IL-17Aind e DC-IL-17Aind. Em adição, esse aumento observado na enzima foi predominante nos queratinócitos e isso foi associado a marcadores de ativação de queratinócitos. Utilizando o inibidor de PKM2, Shikonin (SKN), como abordagem farmacológica, observamos que o tratamento com esse composto foi capaz de reverter a psoríase experimental e a reduzir marcadores associados a doença como: K17, LCN2, TNF-?, KC, S100A8, S100A9, IL-6 e IL-17A. Associado a isso, observamos a redução na frequência de células T (?? e ??) produtoras de IL-17 e do número de neutrófilos na pele em modelo de imiquimode após inibição da PKM2. O SKN, também, reduziu o número de neutrófilos no modelo DC-IL-17Aind. Em nosso próximo passo, observamos que queratinócitos HACAT estimulados com IL-17A apresentou um aumento da expressão de PKM2 e que a sua inibição foi associada a redução da ativação de queratinócitos e de mediadores inflamatórios como a IL-8. Além disso, a deleção da PKM2, utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, reduziu a expressão do receptor de IL-17. Por fim, o desenvolvimento da psoríase por imiquimode foi atenuada em animais deficientes para PKM2 em queratinócitos (K14-PKM2fl/+), no qual foi observado a redução de neutrófilos na pele e, além disso, evidenciamos a redução da expressão de IL-17A nesses animais. O conjunto de resultados apresentados nesse trabalho demonstram que a PKM2 apresenta um papel crítico no desenvolvimento da psoríase e que a ativação do receptor de IL-17 promove um aumento da PKM2 em queratinócitos e esta contribui para ativação de mediadores que é responsável diretamente para o desenvolvimento da psoríase. Esses resultados, ainda, sugerem a PKM2 como um biomarcador para diagnóstico da psoríase e consequentemente, um potencial alvo terapêutico para tratamento dessa doença e outras doenças inflamatórias. / Psoriasis is a chronic inflammatory skin disease with high incidence in the global population. The pathogenesis of psoriasis is characterized by involvement of many cells, including keratinocytes that are targets for IL-17-producing T cells. Evidences suggests a critical role of pyruvate kinase M2 (PKM2) in inflammatory response, but the underlying mechanism remains unclear. In this context, here we investigated the role of PKM2 in the development of psoriasis. We observed overexpression of PKM2 in psoriatic human skin, imiquimod-induced psoriasis and spontaneous K14-IL-17Aind and DC-IL-17Aind models. In addition, the overexpression of this enzyme was observed in keratinocytes associated with keratinocytes activation markers. Using the PKM2 inhibitor, Shikonin (SKN), as a pharmacological approach, we observed that the treatment with this compound was able to reduce experimental psoriasis and disease-associated markers such as K17, LCN2, TNF-?, KC, S100A8, S100A9, IL-6 and IL-17A. Moreover, we observed reduction of frequency of IL-17-producing T cells (?? and ??) and the number of neutrophils in the skin after imiquimod application plus inhibition of PKM2. SKN, also, reduced the number of neutrophils in the DC-IL-17Aind model. In our next step, we observed overexpression of PKM2 in human keratinocytes HACAT stimulated with IL-17A and that its inhibition was associated with less keratinocytes activation and inflammatory mediators such as IL-8. In addition, deletion of PKM2, using CRISPR/Cas9 technology, reduced IL-17 receptor expression. Finally, the development of imiquimod-induced psoriasis was attenuated in PKM2-deficient mice in keratinocytes (K14-PKM2f/+), with reduction in the number of neutrophils in the skin. In addition, we evidenced the reduction of IL-17A expression these animals. Taken together, these results demonstrate that PKM2 plays a critical role in the development of psoriasis and that IL-17 receptor activation promotes an increase of PKM2 in keratinocytes and this contributes to the release of mediators that is directly responsible for development of psoriasis. These results, suggest PKM2 as a biomarker for the diagnosis of psoriasis and consequently a potential therapeutic target for the treatment of this disease and other inflammatory diseases.

Estudos funcionais in vitro são essenciais para a compreensão do papel de miRNAs, pequenas moléculas de RNA que desempenham papel importante na regulação gênica, no câncer. Neste estudo analisamos a viabilidade de linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP), queratinócitos orais provenientes de culturas primárias e queratinócitos imortalizados, como modelos para estudos funcionais de miRNAs previamente identificados como desregulados nesse tipo de carcinoma: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA- 196a. Com este fim avaliamos inicialmente a expressão dos quatro miRNAs em todos os tipos celulares propostos através de reações em cadeia da polimerase em tempo real específicas. As linhagens celulares de carcinoma epidermoide de boca foram previamente caracterizadas quanto ao seu perfil de sequências de DNA do tipo STR (do inglês Short Tandem Repeats ou repetições curtas em sequência) com o objetivo de confirmar a identidade da linhagem. Foram realizados ensaios para a super-expressão e inibição da expressão destas quatro moléculas na linhagem SCC25 e em queratinócitos orais derivados de cultura primária e, uma vez constatado o sucesso da transfecção, avaliamos, para cada caso, a expressão de alvos (mRNAs) validados na literatura. O impacto destas intervenções em proliferação celular, um importante processo desregulado em câncer, também foi avaliado. Os resultados apontam diferenças significativas na expressão dos miRNAs entre linhagens celulares passíveis de serem utilizadas como modelos para estudos funcionais em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Ressaltam-se diferenças entre linhagens de carcinoma de língua e de faringe, bem como diferenças expressivas entre a linhagem de queratinócitos orais imortalizados e queratinócitos orais normais provenientes de culturas primárias. Conclui-se que cada modelo celular possui características particulares que os tornam mais ou menos adequados para um determinado estudo. A inibição da expressão de genes alvo em função da super-expressão do miRNA regulador foi observada apenas em parte das situações avaliadas. Este resultado decorre do fato que um alvo é regulado por diferentes miRNAs, bem como por diversos outros fatores genéticos e/ou epigenéticos, que podem variar de acordo com modelo estudado. Este resultado ressalta o fato de que seleção cuidadosa das linhagens é fundamental para conclusões precisas em estudos funcionais. A super- expressão de miRNA-10b e miRNA-196a afetou significativamente a progressão do ciclo celular tanto em SCC25 quanto em queratinócitos orais em cultivo, sugerindo um possível papel em CECP relacionado ao controle da proliferação celular. / Functional in vitro studies are fundamental for the comprehension of the role of microRNAs, small noncoding RNA molecules that function as posttranscriptional regulators, in cancer. The aim of this study was to determine the applicability of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human oral keratinocytes as models for functional studies of microRNAs previously identified as deregulated in squamous cell carcinomas of the head and neck: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA-196a. The expression level of the four microRNAs was assessed in cell lines and in primary cultures of oral keratinocytes using specific real-time polymerase chain reactions. The identity of oral squamous cell carcinoma cell lines was confirmed by means of STR (Short Tandem Repeats) profiling. We performed gainof- function and loss-of-function experiments in a HNSCC cell line, SCC25, as well as in normal human keratocytes. After successful transfection, we evaluated the expression of selected target genes. Significant differences in microRNA gene expression were observed between squamous cell carcinoma cell lines, particularly between cells lines from distinct sub-sites, and between primary culture of human keratinocytes and the immortalized keratinocyte cell line. Thus, each cell model possesses a characteristic phenotype; while one may be useful for a particular study, it may be inappropriate for another. The down-regulation of selected target genes was not observed after the over-expression of all miRNAs studied, an expected result since gene targets might be regulated by more than one microRNA, as well as by genetic and epigenetic mechanisms which are not common among all cell types. There is, therefore, an imperative for cautious selection of suitable cell lines for functional studies in cancer. Finally, the over-expression of miR-10b and miR-196a clearly interfered with cell cycle progression, suggesting a possible role in cell proliferation control for these molecules in HNSCC.

Estudos funcionais in vitro são essenciais para a compreensão do papel de miRNAs, pequenas moléculas de RNA que desempenham papel importante na regulação gênica, no câncer. Neste estudo analisamos a viabilidade de linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP), queratinócitos orais provenientes de culturas primárias e queratinócitos imortalizados, como modelos para estudos funcionais de miRNAs previamente identificados como desregulados nesse tipo de carcinoma: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA- 196a. Com este fim avaliamos inicialmente a expressão dos quatro miRNAs em todos os tipos celulares propostos através de reações em cadeia da polimerase em tempo real específicas. As linhagens celulares de carcinoma epidermoide de boca foram previamente caracterizadas quanto ao seu perfil de sequências de DNA do tipo STR (do inglês Short Tandem Repeats ou repetições curtas em sequência) com o objetivo de confirmar a identidade da linhagem. Foram realizados ensaios para a super-expressão e inibição da expressão destas quatro moléculas na linhagem SCC25 e em queratinócitos orais derivados de cultura primária e, uma vez constatado o sucesso da transfecção, avaliamos, para cada caso, a expressão de alvos (mRNAs) validados na literatura. O impacto destas intervenções em proliferação celular, um importante processo desregulado em câncer, também foi avaliado. Os resultados apontam diferenças significativas na expressão dos miRNAs entre linhagens celulares passíveis de serem utilizadas como modelos para estudos funcionais em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Ressaltam-se diferenças entre linhagens de carcinoma de língua e de faringe, bem como diferenças expressivas entre a linhagem de queratinócitos orais imortalizados e queratinócitos orais normais provenientes de culturas primárias. Conclui-se que cada modelo celular possui características particulares que os tornam mais ou menos adequados para um determinado estudo. A inibição da expressão de genes alvo em função da super-expressão do miRNA regulador foi observada apenas em parte das situações avaliadas. Este resultado decorre do fato que um alvo é regulado por diferentes miRNAs, bem como por diversos outros fatores genéticos e/ou epigenéticos, que podem variar de acordo com modelo estudado. Este resultado ressalta o fato de que seleção cuidadosa das linhagens é fundamental para conclusões precisas em estudos funcionais. A super- expressão de miRNA-10b e miRNA-196a afetou significativamente a progressão do ciclo celular tanto em SCC25 quanto em queratinócitos orais em cultivo, sugerindo um possível papel em CECP relacionado ao controle da proliferação celular. / Functional in vitro studies are fundamental for the comprehension of the role of microRNAs, small noncoding RNA molecules that function as posttranscriptional regulators, in cancer. The aim of this study was to determine the applicability of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human oral keratinocytes as models for functional studies of microRNAs previously identified as deregulated in squamous cell carcinomas of the head and neck: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA-196a. The expression level of the four microRNAs was assessed in cell lines and in primary cultures of oral keratinocytes using specific real-time polymerase chain reactions. The identity of oral squamous cell carcinoma cell lines was confirmed by means of STR (Short Tandem Repeats) profiling. We performed gainof- function and loss-of-function experiments in a HNSCC cell line, SCC25, as well as in normal human keratocytes. After successful transfection, we evaluated the expression of selected target genes. Significant differences in microRNA gene expression were observed between squamous cell carcinoma cell lines, particularly between cells lines from distinct sub-sites, and between primary culture of human keratinocytes and the immortalized keratinocyte cell line. Thus, each cell model possesses a characteristic phenotype; while one may be useful for a particular study, it may be inappropriate for another. The down-regulation of selected target genes was not observed after the over-expression of all miRNAs studied, an expected result since gene targets might be regulated by more than one microRNA, as well as by genetic and epigenetic mechanisms which are not common among all cell types. There is, therefore, an imperative for cautious selection of suitable cell lines for functional studies in cancer. Finally, the over-expression of miR-10b and miR-196a clearly interfered with cell cycle progression, suggesting a possible role in cell proliferation control for these molecules in HNSCC.

Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, não significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletroporação). Os músculos quadríceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransferência foi realizado comparando a utilização da sequência genômica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasmídeos sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circulação de camundongos lit/scid, por um período de 21 dias. Foram também construídos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que serão utilizados num próximo estudo, tanto para a transdução de queratinócitos, como para a eletrotransferência in vivo. Vetores lentivirais serão de fato necessários para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em comparação com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, têm como meta estabelecer condições para que a terapia gênica seja num futuro próximo uma alternativa viável e segura para o tratamento da deficiência de GH e de outras doenças sistêmicas. / Keratinocytes are very attractive cells for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. In this study, retrovirally transduced keratinocytes with the mouse growth hormone (mGH) gene underwent a treatment for adhesion to collagen and clonal analysis, in order to enrich in stem cells the keratinocyte population. The main result was an in vitro increase of cell viability for treated keratinocytes, which should result in an increase of the in vivo sustainability of hormone secretion, when implanting organotypic cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice. A model for in vivo gene therapy based on the electrotransfer of human growth hormone (hGH)-coding naked DNA in the exposed quadriceps muscle of dwarf (lit/lit) and immunodeficient dwarf (lit/scid) mice was also utilized. Electroporation conditions were optimized, setting up eight 50-V pulses of 20 ms at a 0.5 s interval, using a plasmid containing the ubiquitin C promoter and the genomic hGH sequence. Administration of a single dose of 50 g of this plasmid led, for the first time in the literature, to sustained levels of circulating hGH of the order of 1.5-3 ng/ml, up to 60 days. The DNA-treated animals presented a highly significant weight gain (P<0.001) of 33.1%, compared to a non-significant weight loss of 4.2% for the control group (saline injected mice + electroporation). The injected quadriceps muscles of the DNA-treated mice showed a 48% weight increase, when compared to the control group (P<0.001). Another electrotransfer study was carried out comparing the use of the genomic hGH sequence (gDNA) with the complementary sequence (cDNA), cloned under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. It was observed that hGH was more efficiently expressed in the circulation of lit/scid mice, for 21 days, when injecting cDNA. Lentiviral vectors containing the hGH (cDNA and gDNA) and the mGH (cDNA) genes were also constructed and will be used in a next study, both for the transduction of keratinocytes or for in vivo electrotransfer. Lentiviral vectors will in fact be necessary for future studies, considering their reduced toxicity when compared to retroviral vectors. The results of this work, as well as opening perspectives of new studies, will establish in the near future conditions for gene therapy as a feasible and safe option for the treatment of GH deficiency and other systemic diseases.