A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.

A deficiência de guanidino acetato metiltransferase (GAMT) é um erro inato do metabolismo da creatina caracterizado por hipotonia muscular, movimentos extrapiramidais involuntários e epilepsia. A doença é, bioquimicamente, evidenciada pelo acúmulo de guanidino acetato (GAA) e deficiência de creatina e fosfocreatina nos tecidos dos pacientes afetados. Os mecanismos da disfunção neurológica que ocorrem nessa doença ainda são desconhecidos. A Na+,K+-ATPase, a creatina quinase (CK) e a acetilcolinesterase (AChE) têm um papel fundamental no sistema nervoso central (SNC), e a alteração dessas enzimas, juntamente com a diminuição do metabolimo energético e a indução do estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças que afetam o SNC, como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e isquemia cerebral. Propriedades neurotóxicas do GAA têm sido atribuídas, principalmente, à excitotoxicidade e ao estresse oxidativo. Dessa forma, esse trabalho tem como propósito ampliar o conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos da deficiência de GAMT, investigando o efeito in vitro e in vivo (administração intra-estriatal de GAA), sobre as atividades da Na+,K+-ATPase, CK, AChE, metabolismo energético, bem como a recaptação de glutamato e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) em estriado de ratos. Finalmente, investigamos o efeito da administração intra-estriatal de GAA sobre a memória/aprendizagem em estriado de ratos. Nossos resultados mostraram que a administração intraestriatal de GAA diminui as atividades da Na+,K+-ATPase, CK e complexo II e aumenta o TBARS e a atividade da AChE. Além destes, mostramos que o GAA inibe a recaptação de glutamato e induz estresse oxidativo em estriado de ratos. A administração de GAA, também é capaz de prejudicar a memória de ratos adultos. A inibição das atividades da Na+,K+-ATPase, da CK e do complexo II e o aumento do TBA e da atividade da AChE, causados pela administração intraestriatal de GAA, foram prevenidos pelo pré-tratamento (uma semana) com as vitaminas E e C ou taurina. Considerando os resultados apresentados, propõe-se que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, da CK, do complexo II, bem como da inibição na recaptação de glutamato e de indução de estresse oxidativo causados pelo GAA possam estar envolvidos na disfunção neuronal observada em pacientes com deficiência de GAMT. / Guanidinoacetate methyltransferase deficiency (GAMT-deficiency) is an inborn error of creatine metabolism characterized by muscular hypotonia, involuntary extrapiramidal movements and epilepsy. The disease is biochemically characterized by accumulation of guanidinoacetate and deficiency of creatine and phosphocreatine in tissues of affected patients. However, the mechanisms underlying the neurological dysfunction of GAMTdeficiency patients are not well understood. Na+,K+-ATPase, creatine kinase (CK) and acetylcholinesterase (AChE) play a fundamental role in central nervous system (CNS). Alterations in these enzymes with reduction of energy metabolism and induction of oxidative stress have been associated to neurological diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, Huntington’s disease and brain ischemia. Neurotoxic properties of GAA have been mainly related to excitotoxicity and oxidative stress. In this study we investigated possible pathophysiologic mechanisms of GAMT-deficiency. We studied the in vitro effect of GAA and the effect of GAA intrastriatal administration on Na+,K+- ATPase, CK and AChE activities, on brain metabolism, on glutamate uptake and on reactive oxidative species (ROS) production in striatum of adult rats. Finally, we investigated the effect of intraestriatal administration of GAA on inhibitory avoidance in adult rats. Our results showed that the intrastriatal administration inhibits Na+,K+-ATPase, CK and complex II activities and increases TBARS and AChE activity. We also showed that GAA in vitro inhibits glutamate uptake and induces oxidative stress. GAA administration also impairs memory in adult rats. The inhibition of Na+,K+-ATPase, CK and complex II activities and increase of TBARS production caused by intrastriatal administration of GAA was prevented by vitamins E and C or taurine pretreatment (for one week). Our findings indicate that inhibition of Na+,K+- ATPase, CK and complex II activities and alterations in glutamate uptake and oxidative stress caused by GAA may contribute to the neurological dysfunction characteristic of GAMT-deficiency patients.

A identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento de glioblastomas multiformes (GBMs) se faz necessária devido ao mau prognóstico e ineficiência das terapias associadas a esses tumores. Nesta dissertação, avaliamos o envolvimento do Fator Nuclear kappaB (NFkappaB) e da via da PI3K/Akt no crescimento in vitro de glioblastomas, e o potencial uso dos inibidores de NFkappaB e de PI3K/Akt como possíveis agentes antitumorais. Com esta finalidade foram utilizados os inibidores farmacológicos de NFkappaB (partenolide), e de PI3K/Akt (quercetina e Ly294002), e o inibidor misto de NFkappaB/Akt (curcumina). Os inibidores de NFkappaB causaram uma significativa diminuição na viabilidade dos GBMs quando comparado com os inibidores de outras vias de sinalização (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr e JNK1/2), a qual foi tipo dose resposta. Além disso, os inibidores de NFkappaB apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura e perda de integridade da membrana plasmática que foi vista através da técnica do Iodeto de Propideo (PI). Já os inibidores de PI3K/Akt apresentaram um menor efeito do que o apresentado pelos inibidores de NFkappaB, não demonstrando uma curva do tipo dose resposta, ainda assim, diminuíram a viabilidade dos GBMs. Entretanto, não apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura, e não houve incorporação de PI, mostrando que, diferentemente do que ocorre com os inibidores de NFkappaB, a perda de viabilidade vista nas células tratadas com os inibidores de PI3K/Akt está preponderavelmente relacionada com uma diminuição na proliferação, e não com morte celular. Vimos também que os inibidores foram capazes de alterar o imunoconteúdo de fatores relacionados com morte e sobrevivência celular, tais como caspase 3, LC3 A/B, PARP e Hsp70, assim como o ciclo celular. Portanto, nossos resultados demonstram que a via da PI3K/Akt parece estar preferencialmente relacionada com a proliferação celular, enquanto a via do NFkappaB preferencialmente com sobrevivência. / The identification of new therapeutic targets for treatment of glioblastoma multiforme (GBMs) is necessary due to poor prognosis and ineffective therapies associated with these tumors. In this study we have assessed the role of Nuclear Factor-kappaB (NFkappaB) and the PI3K/Akt pathway in glioblastomas in vitro growth, and their inhibitors as potential antitumor agents. For this we used the pharmacological inhibitors of NFkappaB (Parthenolide), and PI3K/Akt (LY294002 and quercetin), and mixed inhibitor of NFkB / Akt (curcumin). NFkappaB inhibitors yielded a significant decrease in viability of GBMs compared to inhibitors of other signaling pathways (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr and JNK1 / 2), which was dose-dependent. Furthermore, inhibitors of NFkappaB showed LDH releasing in culture medium and membrane integrity losing, evaluated through the Propidium Iodide (PI)-based method. The PI3K/Akt inhibitors showed a smaller effect than NFkappaB inhibitors, also decreasing GBMs viability but playing no dose-dependence response. Despite there was not LDH releasing in culture medium and PI incorporation, showing that the loss of viability observed in cells treated with inhibitors of PI3K/Akt is associated with a decrease in the proliferation, unlike what happens with inhibitors of NFkappaB, no cell death was observed. We have also seen that the inhibitors were able to alter the contents of immune-related factors death and cell survival, such as caspase-3, LC3 A / B, PARP and Hsp70, as well as the cell cycle. Therefore, our results demonstrate that the PI3K/Akt pathway seems to be related to cell proliferation, while the NFkappaB pathway to survival.

Orientador: Carlos Amílcar Parada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prado_FilipeCesardo_M.pdf: 428700 bytes, checksum: 1f8f2df5d5cae548c5b0d1a6a66947f7 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Enquanto a hiperalgesia inflamatória depende da liberação de prostaglandinas e/ou de aminas simpatomiméticas que sensibilizam os neurônios aferentes primários, nosso grupo demonstrou recentemente que o bloqueio do receptor P2X3 no tecido periférico previne a hiperalgesia induzida pela carragenina.. No entanto, o mecanismo pelo qual a ativação dos receptores P2X3 neuronais contribui para a hiperalgesia inflamatória não está completamente estabelecido. O presente estudo verifica se a ativação do receptor P2X3 dos neurônios aferentes primários contribui para a hiperalgesia mecânica induzida pela prostaglandina E2 ou pela dopamine no tecido periférico. A co-administração de A317491 (60 µg / paw), um antagonista seletivo do receptor P2X3, ou o prétratamento com dexametasona (1 mg / mL / kg), preveniu a hiperalgesia mecânica medida 3 horas depois da administraçao de carragenina (300 µg / paw) na pata posterior de ratos. A administração de ??meATP (50 µg /paw) induziu hiperalgesia mecânica 1 hora, mas não 3 horas, depois da sua administração, que foi prevenida pela dexametasona ou pelo A317491. Doses sublimiares de PGE2 (4 ng / paw) ou dopamina (0.4 µg / paw) que não induzem hiperalgesia por si só, induziram hiperalgesia, 3 horas depois, quando administradas logo depois de ??meATP ou carragenina em ratos tratados com dexametasona. Esses estados de hiperalgesia ("priming") revelados pelas doses sublimiares de PGE2 ou dopamine foram prevenidos pelo A317491 ou pelo tratamento com administração intraganglionar (DRG-L5) de ODN antisense, mas não pelo ODN mismatch, contra o receptor P2X3 (40 µg /5µL once a day for 4 days). ODN antisense, mas não o ODN mismatch, reduziu a expressão dos receptores P2X3 no nervo safeno e no DRG-L5. Para verificar se a PKC? media esse estado de hiperalgesia, inibidor de translocação de PKC? (1 µg/paw) foi administrado no tecido periférico 45 minutos antes do ??meATP ou PGE2 (100 ng/paw). O inibidor de PKC? preveniu o estado de hiperalgesia induzido pelo ??meATP ("priming"), mas não a hiperalgesia mecânica induzida pela PGE2 (100 ng/paw). Dessa maneira, os resultados desse estudo sugerem que a hiperalgesia inflamatória depended a ativação dos receptores P2X3 neuronais e da subsequente translocação da PKC? , que aumenta a susceptibilidade dos neurônios aferentes primários (priming) à ação de outros mediadores inflamatórios como a PGE2 e as aminas simpatomiméticas / Abstract: While inflammatory hyperalgesia depends on the release of prostaglandins and/or sympathetic amines that ultimately sensitize the primary afferent neurons, we have recently demonstrated that blockade of P2X3 receptor in the peripheral tissue completely prevents carrageenan-induced hyperalgesia. However, the mechanism by which the activation of neuronal P2X3 receptor contributes to the inflammatory hyperalgesia is not completely clear. The present study verifies whether the activation of P2X3 receptor on primary afferent neurons contributes to the mechanical hiperalgesia induced by prostaglandin E2 or dopamine in the peripheral tissue. Co-administration of A317491(60 µg / paw), a selective P2X3,2/3 receptor antagonist, or pre-treatment with dexamethasone (1 mg / mL / Kg), prevented the mechanical hyperalgesia measured 3 hours after the administration of carrageenan (300 µg / paw) in the rat's hind paw. The administration of ??meATP (50 µg /paw) induced mechanical hiperalgesia 1 hour, but not 3 hours, after its administration, which also was prevented by dexamethasone or A317491. Sub-threshold doses of PGE2 (4 ng / paw) or dopamine (0.4 µg / paw) that do not induce hyperalgesia by themselves, induced maximal hyperalgesia, 3 hours after, when administrated Just following ??meATP or carrageenan in rats treated with dexamethasone. These hyperalgesic states ("priming") revealed by sub-threshold doses of PGE2 or dopamine were prevented by A317491 or treatment with ganglionar administrations (DRG-L5) of ODN antisense, but not ODN mismatch, against P2X3 receptor (40 µg /5µL once a day for 4 days). ODN antisense, but not ODN mismatch reduced the expression of P2X3 receptors in the saphenous nerve and in DRG-L5. To verify whether PKC? mediates this hyperalgesic state, PKC? translocation inhibitor (1 µg/paw) was administrated in peripheral tissue 45 min. before ??meATP or PGE2 (100 ng/paw). PKC? inhibitor inhibited the hyperalgesic state induced by ??meATP ("priming"), but not the mechanical hyperalgesia induced by PGE2 (100 ng/paw). Briefly, the findings of this study suggest that the inflammatory hyperalgesia depends on neuronal activation of P2X3 receptor and the subsequent PKC? translocation, which increases the susceptibility of primary afferent neurons (priming) to others inflammatory mediators such as PGE2 and symphatetic amines / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Orival Andries Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Educação Fisica / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:11:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_AugustoCarvalho_M.pdf: 3471127 bytes, checksum: 926adc0a0aba1c9acdd1491ea87d9ae5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito do treinamento de força específica no desempenho na natação. Para isso 14 nadadores competitivos em nível estadual foram divididos em dois grupos: controle (GC / n=6) e experimental (GE / n = 8). Ambos os grupos realizaram o mesmo treinamento durante seis semanas, cinco dias por semana. Adicionalmente o GE realizou um treinamento de força específica denominado treinamento complexo (MC) três vezes por semana em sessões extras durante o mesmo período. Todos os atletas foram avaliados em pré e pós-treinamento por testes específicos, a saber: nado amarrado (força), 3 x 25m (velocidade) e teste de desempenho da distância e estilo de competição. Este último foi avaliado também com os resultados da principal competição (Final). Durante todo o treinamento experimental foram coletadas amostras de sangue nas segundas e sextas-feiras para avaliar respostas da creatina quinase e uréia. De Pré para Pós foram encontradas alterações significantes apenas para a força (p<0,05). O GE também apresentou alteração significante de Pós para Final no desempenho. Os valores de CK e Uréia não apresentaram diferenças intergrupos. É possível concluir que a carga proposta para o MC é eficiente no implemento da força específica sem apresentar indícios preocupantes de lesão muscular e proteólise. Além disso, alterações no deserijpenho podem estar relacionadas com o efeito posterior duradouro do treinamento (EPDT), devido à melhora significante do desempenho do GE no momento Final / Abstract: The aim of this study was to verify the effect of Complex Training (CT) in swimming performance. Fourteen state competitive swimmers were assigned in two groups: control (CG I n=6) and experimental (EG I n=8). Both groups performed the same training in water during six weeks, five days I week. Additionally, EG performed a high specific strength training called CT three times I week in extra training sessions. The swimmer~ were evaluated in Pre and Post training with specific tests: tethered swimming (strength), 3 x 25m (velocity) and performance test with the same stroke and distance of competition. This last one was also evaluated in the main competition's results (Final). In ali the experimental training blood samples were collected on Mondays and Fridays to evaluated creatine quinase (CK) and urea training responses. Significant differences were found only for strength (p<0,05). EG also presented significant differences in performance from Post to Final. CK and urea did not presented intergroups differences. It can be concluded that the loads used in CT is efficient to strength improvement and it did not show serious differences in muscular soreness and proteolysis. Additionally, performance improvement may be relatéd to posterior effect of training (EPDT), because of the performance improvement in Final moment / Mestrado / Ciencia do Desporto / Mestre em Educação Física

Orientador: Denise Vaz de Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T14:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pimentel_CarlosAlberto_M.pdf: 2804322 bytes, checksum: f3240e0a8b8d538f11e513dc9dc2a3ad (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A prática do futebol requer que os atletas profissionais apresentem níveis ótimos de aptidão física. Para isso são aplicados, durante os treinamentos, estímulos específicos de esforço físico com diferenças na carga, intensidade e volume, garantindo assim, a obtenção das adaptações orgânicas necessárias. No entanto, para que ocorram as adaptações positivas, o treinamento não pode ultrapassar o limite individual de estresse que os atletas conseguem suportar. A técnica Limiar de Estresse propõe o monitoramento da intensidade do treino em atletas, através da análise de biomarcadores sanguíneos de estresse oxidativo e alteração muscular, com o objetivo de exercer uma função profilática, através da modulação da carga de treinamento quando necessário, otimizando, com isso a performance. Nosso objetivo nesse estudo foi aplicar e avaliar a Técnica de Limiar de Estresse em dois períodos preparatórios distintos de equipes de futebol. As sessões de treinos da competição-modelo Dallas Cup foram planejadas de acordo com os princípios metodológicos da concepção clássica, enquanto na competição Taça São Paulo utilizou-se a concepção contemporânea. Os biomarcadores sanguíneos analisados foram as concentrações plasmáticas de ácido úrico, grupamento sulfidrila e proteínas carboniladas e a atividade da enzima creatina quinase; as atividades no hemolisado das enzimas catalase e glutationa redutase, além da determinação do limiar do lactato sanguíneo como parâmetro de performance. Os resultados obtidos apontam aumento nas atividades das enzimas catalase e glutationa redutase em decorrência do treinamento baseado na concepção clássica. Os resultados dos mesmos biomarcadores em decorrência da concepção contemporânea de treinos mostraram aumento na atividade da enzima catalase e queda na atividade da enzima glutationa redutase. A atividade da enzima creatina quinase permitiu, independentemente da concepção adotada, seu uso como um índice de individualização dos treinamentos. O limiar do lactato apresentou valores mais elevados para o treinamento sob a concepção contemporânea. Os demais parâmetros não apresentaram alterações. Concluindo, a técnica Limiar de Estresse mostrou-se sensível e eficaz na modulação dos treinamentos. / Abstract: In order to perform professional football (Soccer), the athlete requires high levels of physical aptitude. To achieve this, it is necessary the application, at training time, of specific stimulus like strength with different degrees of intensity and volumes, to assure the organism reach the adaptations needed. To avoid harm for the athlete during the training process, the Stress Threshold technique proposes the use of biological markers to monitor the blood oxidation stress and anti-oxidation protection. The objective of this study is to monitor and regulate the levels of training, optimize the performance and develop a prophylactic foundation by utilising the Stress Threshold technique, during the teams (football, soccer) preparatory periods. The training sessions at the modelcompetition, Dallas Cup, were planed under the classic concepts, methodological principles, while in the Taça São Paulo were utilised the contemporary concepts. The blood stress markers analysed were: The activity levels of the enzymes creatine kinase; the activity levels of the enzymes catalase and glutathione reductase; the concentration levels of uric acid, sulfidrila groupings and carbolinads proteins; and the determination of the lactate threshold in the blood. The results obtained point towards the increase activity on the enzymes catalase and glutathione reductase as an occurrence of training, based on the classic concepts. The results on the analysis of the same blood markers while under the contemporary concepts training were showing an increase in the activity of the calatase enzyme and a decrease in the glutathione reductase's activity. The activity of the enzyme creatine kinase permitted, independently of known conceptions, to become an index of individualisation of the training disciplines. The threshold of the lactate in the blood was higher while training under the contemporary concepts. All the other parameters did not show any alterations. In conclusion, the Stress Threshold technique did show, itself, to be a sensible valid and accurate way of monitoring training in athletes. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari / Disertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T18:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_ElayneVieira_M.pdf: 1520883 bytes, checksum: 05673dcedfdc35b300eb07144edbd5bb (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O condicionamento clássico aversivo é utilizado para investigar os mecanismos celulares e moleculares na formação da memória em diferentes espécies de animais. Estes envolvem processos sinápticos que desencadeiam mecanismos de sinalização intracelular com ativação de diferentes quinases em momentos específicos. A ativação da PKC é um dos mecanismos moleculares da plasticidade sináptica subjacente à formação de memória. O presente trabalho investigou o envolvimento da PKCá/âIl no condicionamento clássico aversivo em pombos. No Experimento 1, o inibidor da PKC, calfostina C foi administrado i.c.v. em um grupo de pombos (GCdCa, n=6; 5ml de solução 60mg/ml, DMSO 2%), 1h antes do condicionamento. Outro grupo recebeu veículo (GCdVe, n=5; DMSO 2% em salina). A sessão de condicionamento teve 20 min de duração e 3 pareamentos som-choque (treino). O teste ao contexto ocorreu 24h após o treino. O Experimento 2 usou grupos de pombos expostos ao contexto experimental (GCC), som e choque não pareados (GCR) ou som-choque pareados (GCd) para investigar a ativação da PKCá/âII no hipocampo 2h após o treino, por meio de Western blot. No Experimento 3, grupos de pombos não treinados (GC, n=6) ou sacrificados em diferentes tempos após o treino - G1min (n=6), G1h (n=6), G2h (n=6) e G24h (n=6) - foram utilizados para investigar o curso temporal da ativação da PKCá/âII e da fosforilação do substrato da PKC, GAP-43, no hipocampo. Todas as sessões foram gravadas em vídeo para posterior análise dos dados comportamentais. No Experimento 1 o GCdCa teve menor expressão da resposta condicionada de congelamento (freezing) ao contexto em comparação ao GCdVe (p<0,05), indicando que a administração da calfostina C prejudicou a memória aversiva contextual. Não ocorreram diferenças significativas na ativação da PKC á/âII entre os diferentes grupos (Experimentos 2 e 3;p>0,05), mas houve maior imuno-marcação da GAP-43 fosforilada no G1min quando comparado ao GC (Experimento 3; p<0,05). Esses dados indicam o envolvimento da PKC em mecanismos de aprendizagem e memória aversiva em pombos, e sugerem que outras isoformas além da PKCá/âII podem participar desses processos. / Abstract: The classical aversive conditioning is used to investigate cellular and molecular mechanisms of memory formation in different animal species. Those mechanisms involve synaptic processes that trigger intracellular signaling with activation of different kinases at specific time points. The PKC activation is one of the molecular mechanisms of synaptic plasticity underlying memory. This study investigated the involvement of PKCá/âIl in classical aversive conditioning in pigeons. In Experiment 1, the PKC inhibitor, calphostin C was administered i.c.v. in one group of pigeons (GCdCa, n=6; 5ml solution 60mg/ml, DMSO 2%), 1h before the conditioning. Another group received vehicle (GCdVe, n=5; DMSO 2% in saline). The session of conditioning had 20 min duration and 3 tone-shock pairings (training). The test to the context occurred 24h after training. Experiment 2 investigated with Western blot analysis the PKCá/âII activation in the hippocampus 2h after the training in groups of pigeons that were exposed to unpaired (GCR) or paired (GCd) tone-shock presentations or to the experimental context only (GCC). In Experiment 3, groups of pigeons naive (GC, n=6) or sacrificed at different times after the training - G1min (n=6), G1h (n=6), G2h (n=6) and G24h (n=6) - were used to investigate the time course of the PKCá/âII activation and phosphorylation of PKC substrate, GAP-43, in the hippocampus. All sessions were video recorded for analysis of behavioral data. In Experiment 1 GcdCa had lower expression of conditioned freezing response to the context in comparison to GCdVe (p<0.05), indicating that calphostin C administration impaired contextual aversive memory. No significant differences in the PKCá/âII activation were observed among the groups (Experiments 2 and 3; p>0.05) but the immunolabeling of phosphorylated GAP-43 in G1min was higher as compared to GC (Experiment 3; p<0.05). These data indicate the involvement of PKC in mechanisms of aversive learning and memory in pigeons and suggest that other isoforms besides PKCá/âII may play a role in those processes. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-10-03T13:14:42Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Thiago de Jesus Bacha.pdf: 1178554 bytes, checksum: ae11b9a0a5f0b7efe2f4c961a7ca8718 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-10-03T13:14:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Thiago de Jesus Bacha.pdf: 1178554 bytes, checksum: ae11b9a0a5f0b7efe2f4c961a7ca8718 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-10-03T13:15:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Thiago de Jesus Bacha.pdf: 1178554 bytes, checksum: ae11b9a0a5f0b7efe2f4c961a7ca8718 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T13:15:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Thiago de Jesus Bacha.pdf: 1178554 bytes, checksum: ae11b9a0a5f0b7efe2f4c961a7ca8718 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Training and proper nutrition are important things to achieving high levels of military physical performance, but when physical activity is practiced in excess, leads to disruption of muscle fibers, releasing intracellular components to the bloodstream. Those components are used as surrogate markers of smooth skeletal muscle injury. There are several factors that may influence muscle damage and physical performance of any athlete and it is understood that some polymorphisms may also be involved in the improvement or less physical wear. The aim of this study was to evaluate the biochemical and molecular profile of military of Brazilian Army, participants of Operations Course in the Jungle - OCJ. 233 military men and OCJ students were assessed in 2013. Each course lasted three months, during this time 12 blood samples were taken from each military. Were measured levels CK-MM, CK-MB and correlated with polymorphisms of ACTN3 (C1747T), GDF8 (C2T), MLC (C49T), AMPD1 (C34T), FKRP (A19G) MYH9 (A22G), GSTP1 (A341G), GSTP1-1 (C16T). The SNP MLCK was not found in the studied population. SNPs in ACTN3, GDF8, GSTP1 were frequent and when correlated with creatine kinase, fractions and MM-MB, statistically significant (p <0.001). All military carriers of R577X SNP had elevated CK levels, suggesting that carriers of this polymorphism have better physical performance and CK degradation faster, unlike the holders of the SNPs FKRP-A19G and MYH9-A22G, who developed lower physical performance. In this study was demonstrated that the genotypes for ACTN3, GSTM1 and GSTP1/1 corroborate literature data, with high frequencies. Holders of the SNP GDF8-C2T showed levels of CK-MM and CK-MB within baseline limits after high intensity exercise, while carrying the SNP ACTN3-R577X demonstrated high levels. During this study a single case of rhabdomyolysis occurred in a military, but due to cocaine use, with serum levels of creatine kinase MM fraction 99,500 U/L and MB fraction 6,500 U/L. Sodium levels were observed at 1.730 mmol/L, potassium 42.1 mmol/L, phosphorus 48.3 mg/dl, chloro 1.243 mmol/L, magnesium and 36.1 mg/dl; renal disorders, such as urea 302.6 mg/dl and creatinine 11.1 mg/dl. Quality tests, troponin and myoglobin, showed positive results. It is concluded that genetic polymorphisms may influence the increase or decrease in muscle damage and physical performance of military personnel exposed to strenuous physical training. / O treinamento e a nutrição adequada são fundamentais no alcance de altos níveis de desempenho físico militar, porém quando a atividade física é praticada em excesso, leva ao rompimento das fibras musculares, liberando componentes intracelulares para corrente sanguínea. Tais componentes são utilizados como marcadores indiretos de lesão da musculatura esquelética lisa. Diversos são os fatores que podem influenciar no dano muscular e no desempenho físico de qualquer atleta e entende-se que alguns polimorfismos também podem estar envolvidos na melhora ou no menor desgaste físico. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações bioquímicas e perfil molecular de militares do Exército Brasileiro, participantes do Curso de Operações na Selva - COS. Foram avaliados 233 militares do sexo masculino e alunos do COS no ano de 2013. Cada curso teve duração de três meses, onde foram realizadas, no decorrer do curso, doze coletas de sangue venoso de cada militar. Foram realizadas dosagens de CK-MM, CK-MB e correlacionadas com polimorfismos dos genes ACTN3 (C1747T), GDF8 (C2T), MLC (C49T), AMPD1 (C34T), FKRP (A19G), MYH9 (A22G), GSTP1 (A341G), GSTP1-1 (C16T). O SNP MLCK não foi encontrado na população estudada. Os SNPs nos genes ACTN3, GDF8, GSTP1 foram frequentes e quando correlacionados com a creatino quinase, frações-MM e MB, apresentaram significância estatística (p<0,001). Todos os militares portadores do SNP R577X tiveram níveis de CK elevados, sugerindo que os portadores deste polimorfismo possuem melhor desempenho físico e degradação de CK mais rápida, diferente dos portadores dos SNPs FKRP-A19G e MYH9-A22G, que desenvolveram desempenho físico inferior. Foi demonstrado neste estudo que os genótipos para ACTN3, GSTP1 e GSTP1/1 corroboram com dados da literatura, apresentando frequências elevadas. Os portadores do SNP GDF8-C2T apresentaram níveis de CK-MM e CK-MB dentro de limites basais após exercícios físicos de alta intensidade, enquanto portadores do SNP ACTN3-R577X demonstraram níveis elevados. Durante este estudo um único caso de rabdomiólise ocorreu em um militar, mas por consumo de cocaína, com níveis séricos de creatina quinase fração MM 99.500 U/L e fração MB 6.500 U/L. Foram observados níveis de sódio 1.730 mmol/L, potássio 42.1 mmol/L, fósforo 48.3 mg/dl, cloro 1.243 mmol/L e magnésio 36.1 mg/dl; alterações renais, como uréia 302.6 mg/dl e creatinina 11.1 mg/dl. Exames qualitativos, troponina e mioglobina, apresentaram resultados positivos. Conclui-se que os polimorfismos genéticos podem influenciar no aumento ou diminuição de danos musculares e no desempenho físico de militares expostos a treinamentos físicos extenuantes.

Apesar da elevada prevalência dos transtornos depressivos em idosos, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes a estes quadros são pouco conhecidos. Atualmente, o principal foco dos estudos sobre a fisiopatologia da depressão geriátrica são as alterações cerebrovasculares associadas a estes quadros. Outros mecanismos fisiopatológicos têm sido estudados, como as alterações em cascatas neurotróficas e inflamatórias. A enzima glicogênio sintase quinase 3 beta (GSK-3B) tem sido implicada na patogênese de diversos transtornos mentais, em especial os transtornos afetivos (i.e. depressão maior e o transtorno afetivo bipolar) e doenças neurodegenerativas (i.e. doença de Alzheimer). Entretanto, não há estudos que avaliam o papel desta enzima nos pacientes idosos com depressão maior. Desta maneira, o objetivo principal deste trabalho é avaliar a atividade da GSK-3B em pacientes idosos com depressão maior. A hipótese deste estudo é que a atividade enzimática está aumentada nos pacientes idosos deprimidos em relação a idosos saudáveis. Para este estudo, recrutamos 40 idosos com depressão maior (de acordo com os critérios diagnósticos do DSM-IV) e que não estavam em uso de antidepressivos. O grupo comparativo foi constituído por 13 idosos saudáveis, sem evidências de transtornos cognitivos ou do humor. A gravidade da sintomatologia depressiva foi avaliada pela escala de depressão de Hamilton de 21 itens (HAM-D); o desempenho cognitivo dos pacientes e controles foi avaliado pelo teste cognitivo de Cambridge (CAMCOG) e pelo mini-exame do estado mental (MEEM). A expressão da GSK-3B foi determinada em plaquetas através de ensaio imunoenzimático (EIA), sendo estabelecido os níveis totais da GSK-3B (T-GSK-3B) e de sua forma fosforilada (P-GSK-3B), inativa. A atividade enzimática foi inferida indiretamente pela razão P-GSK- 3B / T-GSK-3B. Nos pacientes idosos com depressão maior, observou-se uma redução significante dos níveis P-GSK-3B (p=0,03) e da razão da GSK- 3B (p=0,03). Os pacientes com sintomatologia depressiva mais grave (HAMD > 21) e déficits cognitivos mais intensos (CAMCOG < 86) apresentaram maior atividade enzimática (p=0,03 e teste, p=0,01, respectivamente). Os resultados deste trabalho sugerem que a atividade da GSK-3B está significantemente aumentada em pacientes idosos com depressão maior e que está alteração é mais pronunciada nos pacientes com sintomatologia depressiva e déficits cognitivos mais graves. Neste contexto, a atividade da GSK-3B pode ser considerada um marcador de estado em pacientes idosos com episódios depressivos mais graves e ser um importante alvo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para estes quadros / Despite the high prevalence of depressive disorders in the elderly, its main physiopathological mechanisms are largely unknown. In the recent years, most of the research efforts focused on the association between cerebrovascular changes and geriatric depression. Nonetheless, other mechanisms have been studied, such as changes in neurotrophic and inflammatory cascades. The enzyme glycogen synthase kinase 3 beta (GSK- 3B) has been implicated in many mental disorders, in particular affective disorders (i.e. major depression and bipolar disorder) and neurodegenerative disorders (i.e. Alzheimers disease). However, there is no study so far that addressed the role of this enzyme in elderly patients with major depression. Therefore, the main objective of this study was to evaluate if GSK-3B activity is changed in elderly patients with major. The working hypothesis is that enzyme activity is significantly increased in elderly patients with major depression as compared to elderly controls. We recruited 40 elderly patients with current major depressive episode (according to the DSM-IV criteria) that was not under antidepressant treatment. The comparison group included 13 healthy elderly subjects with no evidence of cognitive impairment or major psychiatric disorder. The severity of depressive symptoms was assessed by the Hamilton Depression Scale 21 items; cognitive performance was assessed by the Cambridge Cognitive test (CAMCOG) and the Mini-mental State Examination (MMSE). The levels of total and phosphorylated GSK-3B (T-GSK-3B and P-GSK-3B, respectively) levels were determined in platelets by immunoenzymatic assay (EIA). Enzyme activity was indirectly inferred by the ratio P-GSK-3B / T-GSK-3B. Elderly patients with major depression had a significant reduction in the P-GSK-3B levels (p = 0.03) and GSK-3B ratio (p= 0.03). The patients with severe depressive episode (HAM-D scores above 21 points) and cognitive impairment (CAMCOG scores below 86 points) presented the more significant reduction of GSK-3B ratio (p = 0.03 and p = 0.01, respectively). These data altogether suggest that GSK-3B activity is significantly increased in elderly patients with major depression, in particular in those with more severe depressive episode and worse cognitive performance. In this context, the increased enzyme activity may be regarded as a state marker of severe depressive episodes and may an important target to the development of therapeutic strategies to this disorder

Em condições patológicas como o câncer, a angiogênese, ou seja, o crescimento de novos vasos a partir de uma rede vascular pré-existente, resulta numa maior oxigenação e nutrição das células e, consequentemente, num rápido crescimento do tumor [1]. Uma variedade de fatores estimulam a angiogênese, entre eles o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e seus receptores (VEGFR). O VEGF é uma proteína homodimérica cujas atividades biológicas são reguladas através da ligação com seu próprio receptor domínio quinase (kinase domain receptor KDR). Dos sete domínios extracelulares de Ig-like no KDR, apenas os domínios dois e três são necessários para uma ligação de alta afinidade com o VEGF. Yamazaki e colaboradores, em 2005, relataram que um componente protéico designado KDRbp (KDR-binding protein) da peçonha da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus liga-se ao domínio extracelular de KDR com alta afinidade, resultando no bloqueio subnanomolar de VEGF. Yamazaki et.al. demonstrou que KDRbp exibe a sequência de aminoácidos da região N-terminal e de fragmentos enzimaticamente digeridos da sequência peptídica de KDR-bp é idêntica a Lys-49-fosfolipase A2, um homólogo inativo da fosfolipase A2, no qual a Lys-49 substitui Asp-49. Diante disso, este trabalho teve por objetivo a síntese funcional de uma sequência de nucleotídeos correspondente aos domínios 2 e 3 do Receptor-2 do Fator do Crescimento Endotelial Vascular in vitro que, ao ser expressa em bactéria Escherichia coli (E.coli), permita aplicações otimizadas de seus códons. O cDNA (HUVEC) de KDR que serviu de molde para a amplificação pela reação em cadeia da polimerase para a obtenção do DNA de 675 pares de bases (pb) que codificam 225 aminoácidos correspondentes aos domínios 2 e 3 de KDR. Visando a otimização do uso de códons da construção do DNA que podem prontamente aperfeiçoar os códons para a expressão da proteína em todo o organismo do hospedeiro, no caso, a bactéria Escherichia coli (E.coli), foi desenhada e sintetizada uma sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR (constructo 2 e 3 do KDR). O constructo 2 e 3 do KDR obtido por PCR foi expresso em E.coli BL21 usando o vetor de expressão pET28a. A técnica de obtenção de uma sequência de nucleotídeos partindo do cDNA correspondente a sequência desejada é bastante utilizada por sua praticidade de manipulação e rapidez no resultado. A ORF (open reading frame) que codifica para a proteína de interesse foi clonada em vetor pET28a e a expressão foi induzida por IPTG. A análise da expressão foi monitorada e observado o sucesso devido a obtenção de proteína de 25 kDa expressos. / In pathologic conditions as cancer, angiogenesis can be stimulated with new blood-vessel formation, oxygenation, and nutrition, leading to a rapid growth of tumor. A variety of factors can stimulate angiogenesis. Among these factors, there is vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors (VEGFR). VEGF is homodimeric protein which biological activities are regulated by their kinase domain receptor KDR. From the seven KDR Ig-like domains, only domains 2 and 3 are necessary for a VEGF high-affinity binding. Yamazaki et.al. 2005, report that a protein component designated as KDR-binding protein (KDR-bp) from the venom of eastern cottonmouth (Agkistrodon piscivorus piscivorus) binds to high affinity extracellular KDR resulting in subnanomolar block of VEGF. Yamazaki et.al. demonstrated that KDR-bp exhibits the N-terminal amino acid sequence region, and enzymatically digested fragments of KDR-bp peptide sequence, which is identical to Lys-49-fosfolipase A2, an inactive homologue of phospholipase A2 where Lys-49 replaces Asp-49. Herein, this work aimed the functional synthesis of a nucleotide sequence corresponding to domains 2 and 3 from Receptor-2 of vascular endothelial growth factor in vitro expressed in Escherichia coli (E.coli), it allows to applications optimized of its códons. The cDNA (HUVEC) of KDR was used as amplification model by polymerase chain reaction to obtain the DNA of 675 base pairs that codify 225 amino acids related to domains 2 and 3 of KDR. A codifying sequence for domains 2 and 3 of KDR (construct 2/3 KDR) was designed and synthesized for optimal use of DNA construction codons, which are readily able to improve the expression codons of the proteins thorough the host organism, in this case bacteria Escherichia coli (E.coli). The construct2/3 KDR obtained by PCR was expressed in E.coli BL21 with expression vector pET28a. The technique to obtain a nucleotide sequence from cDNA related to the desired sequence is largely used due to easy manipulation and rapid time to results. The codifying ORF (open reading frame) for the target protein was cloned in pET28a vector and expression was induced by IPTG. The expression analysis was monitored and success was observed due to 25 kDa of protein expressed.