DUTRA, Luana Leticia Alves. Avaliação dos genes AURKA e AURKB em pacientes pediátricos portadores de leucemia linfóide aguda. 2015. 71 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-11-19T13:04:41Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_lladutra.pdf: 2557352 bytes, checksum: e975042e7681efc6efceafbfb84d43f4 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-11-19T13:32:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_lladutra.pdf: 2557352 bytes, checksum: e975042e7681efc6efceafbfb84d43f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-19T13:32:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_lladutra.pdf: 2557352 bytes, checksum: e975042e7681efc6efceafbfb84d43f4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common malignancy of childhood. It is a hematologic malignant neoplasm derived from undifferentiated young lymphoid lineage cells that accumulate and replace the normal population of blood cells. The Aurora kinase genes A, B and C are involved in cell cycle and encode proteins of great importance in the regulation of the mitosis process - separation of sister chromatids during metaphase / anaphase. The aim of this study was to evaluate the AURKA and AURKB genes in pediatric patients with ALL-B treated at Hospital Infantil Albert Sabin (HIAS). This was a cross-sectional, observational and analytical study and 30 patients were enrolled. The sex, age, and laboratory data profile were obtained from medical records of patients diagnosed at HIAS. The analysis of mutations in AURKA and AURKB genes was performed by the fluorescence in situ hybridization technique (FISH) using probes specific for each gene. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5 and used 5% significance level for all tests. Of all children 53.33% were male and 46.67% female, with age ranging from 1 to 16, and average of 7.1 years. Using the FAB classification, 86.67% of patients had ALL-L1 and 13.33% had ALL-L2. According to the EGIL classification, 33.33% were pre-B ALL and 66.67% were common ALL. The mean hemoglobin levels, hematocrit, white blood cells and platelet counts were, respectively, 7.50 g/dL, 22.80%, 69.494/mm3 and 56.439,64/mm3. 73.33% of the children studied had some type of numerical or structural karyotipic abnormality. Regarding the risk classification, 26.67% were favorable, 40% intermediate and 33.33% unfavorable risk. Patients with unfavorable karyotype had a higher white blood cell count (p = 0.0025), and the analysis of other parameters was not significant. Monosomy and polysomy of AURKA gene and polysomy of AURKB gene were observed. Some kind karyotypic change was observed in approximately 50% of cases, the more frequent change was in AURKB. Most patients with abnormal AURKB gene presented a favorable karyotype, and white blood cell and platelet counts less altered. The study of AURKA and AURKB genes showed that these genes may be markers of genomic instability and that AURKB seems more involved in the pathogenesis of childhood ALL, being also a good prognostic factor. / A leucemia linfóide aguda (LLA) é a neoplasia mais frequente na infância. É uma neoplasia hematológica maligna derivada de células linfocitárias indiferenciadas com acúmulo de células jovens e substituição da população normal de células sanguíneas. Os genes Aurora quinase A, B e C estão envolvidos no ciclo celular e codificam proteínas de grande importância na regulação do processo de mitose - separação das cromátides irmãs durante a metáfase/anáfase. O objetivo desse estudo foi avaliar os genes AURKA e AURKB em pacientes pediátricos portadores de LLA-B tratados no Hospital Infantil Albert Sabin (HIAS). Tratou-se de um estudo transversal, observacional e analítico. A amostra utilizada no estudo foi de 30 pacientes. O perfil de sexo, idade e dados laboratoriais foi obtido em prontuários dos pacientes e no serviço de diagnóstico do HIAS. A análise de mutações nos genes AURKA e AURKB foi pela técnica de Fluorescência por Hibridização in Situ (FISH), com o uso de sondas específicas para cada gene. A análises estatística foi realizada no GraphPad Prism 5 e teve nível de significância de 5% para todos os testes. Do total de crianças 53,33% foram do sexo masculino e 46,67% do sexo feminino, com faixa de idade variando de 1 a 16 anos, e média de 7,1 anos. Quanto a classificação FAB, 86,67% dos pacientes eram portadores de LLA-L1 e 13,33% de LLA-L2. Na classificação EGIL, 33,33% eram LLA pré-B e 66,67% eram LLA-comum. Os valores médios de hemoglobina, hematócrito, leucócitos e plaquetas foram, respectivamente, 7,50 g/dL, 22,80%, 69.494/mm3 e 56.439,64/mm3. O cariótipo de 73,33% das crianças estudadas apresentou algum tipo de alteração numérica ou estrutural. Em relação à classificação de risco, 26,67% foram favoráveis, 40% intermediários e 33,33% desfavoráveis. Na relação entre parâmetros hematológicos e classificação de risco, pacientes com cariótipo desfavorável apresentaram leucometria mais elevada (p=0,0025), as análises com os outros parâmetros não foram significantes. No estudo de AURKA e AURKB foi possível observar monossomia e polissomia do gene AURKA e polissomia do gene AURKB. Dos pacientes com algum tipo de alteração no cariótipo, foi observada alteração em algum dos genes em aproximadamente 50% dos casos, sendo a alteração no AURKB mais frequente. A maioria dos pacientes com alteração no gene AURKB apresentou cariótipo favorável, assim como leucometria e contagem de plaquetas menos alteradas. O estudo dos genes AURKA e AURKB mostrou que esses genes podem ser iniciadores no processo de instabilidade genômica das células leucêmicas e que a AURKB parece estar mais envolvida na patogênese da LLA infantil, assim como fator de bom prognóstico.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-08-23T14:10:57Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1554288 bytes, checksum: 92b63f252bea1ea664382e7aee322330 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-23T14:10:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1554288 bytes, checksum: 92b63f252bea1ea664382e7aee322330 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O crescimento e o desenvolvimento vegetal são controlados por uma complexa rede metabólica controlada por fatores ambientais, incluindo a disponibilidade de água, nutrientes e luz, e por várias vias de sinalização. Uma das mais importantes vistas de sinalização, conservada em eucariotos, é a kinase Target of Rapamycin (TOR). Várias linhas de evidência demonstram que TOR exerce um papel fundamental no balanço de carbono e nitrogênio, agindo como um regulador essencial do metabolismo central, controlando o crescimento e a produção de biomassa. O amido é a principal forma de armazenamento de carbono e seu conteúdo é correlacionado negativamente com crescimento. Linhas transgênicas com expressão reduzida do gene TOR ou dos componentes do complexo apresentam um claro fenótipo de acúmulo de amido. No entanto, ainda não é elucidado se o acúmulo de amido é devido a um aumento na síntese, decréscimo na degradação ou ambos. Neste trabalho, plântulas de Arabidopsis tratadas com o inibidor químico específico de TOR AZD-8055, que age no sítio de ligação do ATP no domínio quinase de TOR, mostraram um fenótipo de acúmulo de amido logo após 4 horas de tratamento e este acúmulo é devido a um aumento nas taxas de síntese deste polímero. Além disso, plântulas onde TOR estava inibida apresentaram um aumento em torno de 30-40% em seu conteúdo de amido em comparação ao controle. Análise de perfil metabólico em plântulas com inibição de TOR apresentaram mudanças nos níveis de sacarose, frutose, glicose, maltose, manose e fosfato inorgânico. Todos estes metabólitos estão correlacionados direta ou indiretamente com o metabolismo de amido. Uma correlação entre o teor de manose, fosfato inorgânico e aumento de amido foi notável em plantas tratadas com AZD-8055. Análise de expressão gênica de subunidades da AGPase apresentou mudanças significativas nos pontos 18 e 24 horas após o tratamento com o inibidor. Atividade catalítica máxima da AGPase foi determinada nos pontos 2, 4, 6, 10 e 24 horas após a administração de AZD-8055. No entanto, a atividade só foi estatisticamente diferente entre tratamentos nos pontos 4 e 24 horas. Immunoblotting para esta enzima mostrou que após 4 horas de inibição da via TOR, o conteúdo de AGPase em sua forma dimérica tendeu a ser maior em plantas controle. Além disso, o teor total de AGPase e seu conteúdo na forma monomérica foram maiores em plantas tratadas com AZD-8055 após 6 horas de tratamento na luz. Sabendo que várias enzimas relacionadas ao metabolismo do amido são reguladas pelo potencial redox da célula, os níveis de glutationa foram mensurados para verificar o potencial redox celular. Plantas tratadas com AZD-8055 apresentaram mudanças na quantidade total de glutationa, pincipalmente na sua forma reduzida e o potencial redox da célula tendeu a ficar mais reduzido. Em conjunto, estes resultados indicam a participação de TOR no metabolismo do amido, mas o exato mecanismo por trás disso ainda está longe de ser elucidado. / Plant growth and development are maintained by a complex network controlled by environmental factors including the availability of water, light and nutrients and by several signaling pathways. One of the most important signaling pathways, conserved in eukaryotes, is the kinase Target of Rapamycin (TOR). Various lines of evidence point out that TOR plays a fundamental role in carbon and nitrogen balance, acting as an essential regulator on central metabolism by controlling growth and biomass production. Starch is the major form of carbon storage and its content is negatively correlated with growth. Transgenic lines with reduced expression of TOR gene or components of the TOR complex present a clear starch excess phenotype. However, it remained to be elucidated whether the accumulation of starch is due to increased synthesis, impaired degradation or both. In this work, Arabidopsis seedlings treated with the specific ATP-competitive inhibitor of TOR kinase AZD-8055 showed a starch excess phenotype right after 4 hours of treatment and the accumulation of starch was proved to be due to an augmentation in the rate of starch synthesis. Furthermore, TOR- inhibited plants presented an average increase of 20-30% in their starch content at the end of day when compared to control. Metabolite profiling analysis showed that TOR– inhibited plants exhibited broad changes in the levels of sucrose, fructose, glucose, maltose, mannose and orthophosphate, which are associated directly or indirectly with starch metabolism. In addition, a correlation between the amount of mannose, orthophosphate and increased starch content was noticed in AZD-treated plants. Gene expression analysis of AGPase subunits showed significant changes only from 18 and 24h after treatment. Although TOR inhibited plants displayed higher content of the active form of AGPase (monomer), enzymatic activity assays revealed that changes in AGPase activity might occur as secondary effect of TOR inhibition and might be not related to the starch excess phenotype observed 4 hours after AZD-treament. Since several enzymes related to starch metabolism are subject to redox regulation, the levels of glutathione were measured to verify the redox environment of the cells. TOR- inhibited plants showed changes in the pools of glutathione, mainly in its reduced form, and the redox state of the cells tended to be more reduced. Together, these results indicate the participation of TOR signalling on starch metabolism but the mechanistic behind this process need further studies.

CARVALHO, L. L. Inibição do mTOR agrava a mucosite intestinal induzida por irinotecano. 2016. 118 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-06T15:50:42Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_llcarvalho.pdf: 2848340 bytes, checksum: aaf346e9f648dc008eef1d64977af996 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-06T15:50:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_llcarvalho.pdf: 2848340 bytes, checksum: aaf346e9f648dc008eef1d64977af996 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-06T15:50:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_llcarvalho.pdf: 2848340 bytes, checksum: aaf346e9f648dc008eef1d64977af996 (MD5) Previous issue date: 2016-10-21 / INTRODUCTION. Colorectal cancer (CRC) is one of the most prevalent neoplasms worldwide, being one of the leading causes of death from cancer. In Brazil, it is the third most frequent cancer in men and second in women. In the last decades new drugs incorporated into the clinical protocols for the treatment of mCRM have provided a significant increase in the survival of patients with this type of malignancy. Among these drugs, irinotecan occupies a prominent place and is commonly used as the first line in the treatment of metastatic RCC. However, since all chemotherapy treatments have a burden, a quarter of patients receiving irinotecan have a severe intestinal mucositis as a more noticeable side effect. Deregulation of cell signaling pathways is certainly one of the main reasons for the development of cancer. The mammalian rapamycin target protein (mTOR) is responsible for cell growth and the PI3K / Akt / mTOR axis is often dysregulated in several types of cancer. Thus, this work focused on investigating the role of mTOR during experimental intestinal mucositis induced by irinotecan. METHODS. C57BL / 6 male mice (n = 6 / group) were given intraperitoneally with saline or irinotecan (75 mg / kg or 45 mg / kg) for four consecutive days and treated with rapamycin or everolimus (mTOR inhibitors, 1.5 mg / Kg and 3 mg / kg, respectively) followed by irinotecan administration. Periodically the body weight variation and scores were evaluated for the degree of diarrhea. After euthanasia of the animals, ileus samples were collected for determination of myeloperoxidase activity (MPO), histopathology and morphometric analysis and cytokine levels measurement [KC (human IL-8 analogue chemokine), IL-1β, TGF-β And IFN-γ]. Gene expression of the mRNA of the PI3K / Akt / mTOR pathway proteins was performed by qRT-PCR. Blood was also collected from the animals to evaluate the total white blood cell count. The ANOVA / Bonferroni or Kruskal-Wallis / Dunn tests were used for statistical analysis. P <0.05 was accepted as significant. The present work was approved by the ethics committee of UFC (protocol number 100/14). RESULTS. Animals injected with irinotecan 75 mg / kg showed an increase in the gene expression of PI3K, Akt and mTOR mRNA evidencing the participation of the pathway in iatrogeny. Irinotecan 75 mg / kg significantly reduced body weight, total leukocyte count, villus / crypt ratio and promoted a characteristic intestinal lesion when compared to the saline control group. In addition, inhibition of mTOR with rapamycin or everolimus generally aggravated most of these parameters, such as weight loss, diarrhea, histopathology, neutrophil infiltration, and inflammatory mediators such as TGF-β and IFN-γ. CONCLUSION. Inhibition of mTOR aggravates irinotecan-induced intestinal mucositis probably by increasing the pro-inflammatory response via TGF-β and IFN-γ with important involvement of Paneth's Cells. Financial support: CNPq. / INTRODUÇÃO. O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o mundo, sendo uma das principais causas de óbito por câncer. No Brasil, apresenta-se como o terceiro câncer mais frequente nos homens e segundo nas mulheres. Nas últimas décadas novas drogas incorporadas à protocolos clínicos para o tratamento do CCRm tem proporcionado um aumento significativo na sobrevida de pacientes com esse tipo de malignidade. Dentre estas drogas o irinotecano ocupa lugar de destaque e é comumente utilizado como primeira linha no tratamento do CCR metastático. Entretanto, como todo tratamento quimioterápico há um ônus, um quarto dos pacientes em tratamento com irinotecano apresentam uma grave mucosite intestinal como efeito colateral mais notório. A desregulação de vias de sinalização celular certamente é uma das principais razões para o desenvolvimento do câncer. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é responsável pelo crescimento celular e o eixo compreendido por PI3K/Akt/mTOR está frequentemente desregulada em vários tipos de câncer. Dessa forma, esse trabalho focou em investigar o papel do mTOR durante a mucosite intestinal experimental induzida pelo irinotecano. MÉTODOS. Camundongos machos C57BL/6 (n=6/grupo) foram administrados intraperitonialmente com salina ou irinotecano (75 mg/kg ou 45 mg/kg) durante quatro dias consecutivos e tratados com rapamicina ou everolimo (inibidores de mTOR, 1,5 mg/kg e 3 mg/kg, respectivamente) seguidos da administração de irinotecano. Periodicamente foram avaliados a variação de peso corpóreo e escores para avaliação do grau de diarreia. Após a eutanásia dos animais, amostras de íleo foram coletadas para determinação da atividade de mieloperoxidase (MPO), histopatologia e análise morfométrica e dosagem dos níveis de citocinas [KC (quimiocina análoga da IL-8 humana), IL-1β, TGF-β e IFN-γ]. A expressão gênica do RNAm das proteínas da via PI3K/Akt/mTOR foi realizada por qRT-PCR. Também foi colhido sangue dos animais para avaliação da contagem total de leucócitos. Os testes de ANOVA/Bonferroni ou Kruskal-Wallis/Dunn foram usados para as análises estatísticas. P<0,05 foi aceito como significativo. O presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética da UFC (número de protocolo Nº100/14). RESULTADOS. Os animais injetados com irinotecano 75 mg/kg apresentaram um aumento na expressão gênica do RNAm de PI3K, Akt e mTOR evidenciando a participação da via na iatrogenia. O irinotecano 75 mg/kg reduziu significativamente o peso corpóreo, contagem total de leucócitos, razão vilo/cripta e promoveu uma lesão intestinal que lhe é característico quando comparado ao grupo controle salina. Além disso, de forma geral, a inibição do mTOR com rapamicina ou everolimo agravou a maioria desses parâmetros, tais como perda de peso, diarreia, histopatologia, infiltração de neutrófilos e mediadores inflamatórios como TGF-β e IFN-γ. CONCLUSÃO. A inibição do mTOR agrava a mucosite intestinal induzida por irinotecano provavelmente pelo aumento da resposta pro-inflamatória via TGF-β e IFN-γ com participação importante das Células de Paneth. Apoio financeiro: CNPq.

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna. Existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB (Akt/ Proteína quinase B) é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. O objetivo do trabalho foi comparar a expressão da Akt/PKB em placentas de pacientes normais e com pré-eclâmpsia estimuladas com insulina. Foram utilizadas amostras de placenta de 12 pacientes normais e de 12 pacientes com PE foram coletadas, estimuladas com insulina e analisadas por Western blot para quantificação da expressão da proteína Akt/PKB basal e fosforilada em serina473. Como resultados, a estimulação das amostras com a insulina foi comprovada quando comparamos grupos estimulados (1,14 ± 0,10) e não estimulados (0,91 ± 0,08), P< 0,001. A atividade da via da Akt/PKB fosforilada em serina473 foi semelhante entre placentas de mulheres normais (1,26 ± 0,16) e com PE (1,01 ± 0,11), P = 0,237. Concluímos que não há diferença de fosforilação na via da Akt/PKB, após estimulação com insulina, em placentas de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar alterações desta via de sinalização na PE sem analisarmos os substratos da Akt/PKB quando estimulados. / Preeclampsia (PE) is an important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB pathway is stimulated by insulin and performs several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate stimulates expression of Akt/PKB pathway in the placenta, of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 12 normal patients and 12 PE patients, stimulate and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression in signaling of Akt/PKB. Results: stimulation of insulin samples was confirmed when comparing stimulated groups (1.14 ± 0.10) and non-stimulated (0.91 ± 0.08), P <0.001. The Akt/PKB phosphor (Ser473) was not different in placenta of the normal (1.26 ± 0.16) and PE (1.01 ± 0.11) groups, with P = 0.237. Conclusions: there was no difference of phosphorylation in Akt/PKB pathway, after stimulation with insulin, in placentas of normal and PE patients. However, we cannot discard effects in this signaling pathway as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze the substrates stimulation of this pathway.

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 narayana_fazolini_ioc_dout_2015.pdf: 28846913 bytes, checksum: fb7289feda75ac74ab6ff1cb6771e1e3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A obesidade é uma condição predisponente ao desenvolvimento de câncer de cólon, esôfago, pulmão, próstata, dentre outros. Um dos maiores desafios no estabelecimento da ligação de obesidade e o risco de câncer tem sido correlacionar a epidemiologia e sua base biológica, ou seja, o mecanismo pelo qual a obesidade leva ao desenvolvimento de câncer. A leptina é uma adipocitocina, produzida e secretada pelo tecido adiposo que possui além dos efeitos em nível central no controle da saciedade, ações na regulação da resposta imune e inflamatória. Temos por hipótese que os níveis elevados de leptina na obesidade ative vias de sinalização envolvidas na regulação da inflamação, metabolismo lipídico e proliferação celular em células epiteliais. Os corpúsculos lipídicos são organelas dinâmicas envolvidas no metabolismo lipídico e inflamação, e o aumento no número destas organelas foi observado no câncer de cólon humano. A mTOR é uma serina/treonina cinase que está relacionada com o estímulo à tradução de proteínas, proliferação celular e progressão tumoral. Nosso objetivo foi, portanto, estudar o papel da leptina na alteração do metabolismo lipídico e progressão tumoral. Células epiteliais intestinais (IEC-6) não-transformadas de rato foram incubadas com leptina por 6h, na presença ou ausência do inibidor de mTOR, rapamicina. O estímulo com leptina induziu aumento na formação de corpúsculos lipídicos em células IEC-6 quando comparadas às células controle após coloração com tetróxido de ósmio ou ORO. O pré-tratamento com rapamicina inibiu significantemente a indução de corpúsculos lipídicos por leptina, sugerindo um papel de mTOR na sinalização induzida por esta adipocina Nós demonstramos que a leptina aumenta a fosforilação de S6K em um mecanismo sensível à rapamicina. Além, disso, a leptina aumenta a proliferação de células epiteliais de forma dependente da via de mTOR, aumentando o número de células na fase S do ciclo celular. Através de proteoma descritivo de corpúsculos lipídicos de células de adenocarcinoma de cólon, verificamos a presença de 370 proteínas, incluindo diversas proteínas importantes no metabolismo lipídico, tradução de proteínas, sinalização e proliferação celular, sugerindo que estas organelas podem ser sítios de tradução de proteínas e sinalização, e poderiam contribuir para o fenótipo hiperproliferativo observado em tumores. Através de fracionamento subcelular e microscopia confocal, validamos que corpúsculos lipídicos de células de adenocarcinoma de cólon são sítios de localização da proteína S6K e mTOR. O estudo da regulação e ativação de mTOR e outras importantes vias durante processos patológicos como o câncer poderá contribuir para o entendimento dos mecanismos básicos de regulação do metabolismo lipídico e transformação celular de células tumorais. Dessa forma, nossos estudos podem contribuir para a identificação de novos alvos terapêuticos para o tratamento do câncer / Obesity is a predisposing condition to cancer development in colon, esophagus, lung, prostate, among others. One of the greatest challenge in establishing the link of obesity and the risk of cancer has been to establish the mechanism by which obesity leads to the development of cancer. Leptin is a adipocytokine, produced and secreted by adipose tissue that beyond its central effects in the control of satiety, has actions in the regulation of immune and inflammatory response. We hypothesized that elevated levels of leptin in obesity activate signaling pathways involved in the regulation of inflammation, lipid metabolism and cell proliferation in epithelial cells. Lipid droplets are dynamic organelles involved in lipid metabolism and inflammation, and the increase in the number of these organelles was observed in human colon cancer. mTOR is a serine / threonine kinase that regulates protein translation, cell proliferation and tumor progression. Our goal was therefore to study the impact of leptin in changes in lipid metabolism and tumor progression. Non-transformed rat intestinal epithelial cells (IEC-6) were incubated with leptin for 6h in the presence or absence of the mTOR inhibitor, rapamycin. Leptin stimulation induced increase in lipid droplet formation in IEC-6 cells when compared to control cells after staining with osmium tetroxide or ORO Pre-treatment with rapamycin significantly inhibited the induction of lipid droplet by leptin, suggesting a role for mTOR in leptin-induced signaling. Leptin treatment leads to an increase in the phosphorylation of S6K in a rapamycin-sensitive manner. In addition, leptin-induced increase in epithelial cell proliferation is dependent of mTOR. Through descriptive proteomics of lipid droplets from colon adenocarcinoma cells, we identified 370 proteins, several of them involved in lipid metabolism, translation, cell signaling and proliferation, suggesting that these organelles can be sites of protein translation, contributing to the hyperproliferative phenotype observed in tumors. We have also demonstrated by confocal microscopy and subcellular fractionation that the S6K protein and mTOR are located at lipid droplets in colon adenocarcinoma cells. The study of regulation and activation of mTOR and other important pathways for diseases like cancer may contribute to a better understanding of the basic mechanisms involved in lipid metabolism and cell transformation in tumor cells, thus permitting the identification of new therapeutic targets for treatment of cancer / 2017-03-15

Resumo não disponível.

A hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento do músculo cardíaco devido aumento das dimensões dos cardiomiócitos. Em condições fisiológicas ou patológicas a hipertrofia está relacionada com o aumento da força do coração, provocando alterações nas células miocárdicas. O exercício ativa a via da proteína Akt relacionada à sobrevivência celular em resposta ao exercício e atua sobre a proteína quinase mTOR, ocasionando síntese proteica e hipertrofia. A mTOR participa da proliferação e crescimento celular através da regulação da tradução da proteína. Além disso, a mTOR também controla outros processos celulares como autofagia e parece estar relacionada com a sinalização de miostatina. Portanto, quando miostatina aumentada, inibe o crescimento muscular provavelmente através da inibição de mTOR. A autofagia é um mecanismo homeostático com a finalidade de degradação e reciclagem através da ação lisossomal reciclando organelas citoplasmáticas e proteínas a fim de remover esses materiais intracelulares. A ativação da autofagia ocorre em duas situações: uma em baixo nível de fluxo autofágico, devido uma baixa energética a fim de manter a sobrevivência celular e em outra situação há ativação pronunciada a fim de esgotar os elementos celulares culminando em morte celular. Esses dois extremos nas ações autofágicas são mecanismos potenciais pró ou anti-sobrevivência. Estudos mostram uma ativação da autofagia durante o exercício agudo e parece estar relacionado com a repressão da via AKT/mTOR. Por outro lado, no exercício crônico a autofagia é ativada em músculo esquelético através de aumento das proteínas autofágicas. Tal evento é explicado pela mudança do perfil muscular esquelético pós-exercício gerando maior quantidade de metabólitos que são reciclados pelo sistema, porém em músculo cardíaco ainda está sendo estudado. A miostatina é um regulador negativo do crescimento muscular esquelético. Em doenças seu aumento resulta em perda muscular, contudo, na hipertrofia fisiológica a miostatina está reduzida no músculo esquelético e no cardíaco. A miostatina aumentada bloqueia não só Akt, mas também mTOR, favorecendo a via de degradação proteica através da maquinaria autofágica. Assim, a miostatina tem ação na autofagia durante o exercício e essas vias podem estar relacionadas com o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-07-16T21:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 316869.pdf: 2092143 bytes, checksum: f5600ca660b99748d236b4ce50d7fa8a (MD5) / O Trypanosoma rangeli é um protozoário que, embora estreitamente relacionado ao T. cruzi, não é considerado patogênico para o hospedeiro mamífero, no qual sua capacidade de multiplicação é desconhecida. Uma vez que diversos estudos já abordaram esta questão, sem resultados consensuais, o objetivo deste estudo foi investigar marcadores moleculares e estruturais da divisão celular no T. rangeli, como uma estratégia para detectar a multiplicação celular mesmo sem visualização direta do processo. O ciclo celular in vitro das formas epimastigotas proliferativas da cepa Choachí foi estudado, sendo sua duração total calculada em 26,2 horas, sendo 11,91 horas na fase G1, 6,13 horas na fase S, 3,88 horas na fase G2, 1,13 horas na mitose (M) e, por fim, 3,15 horas na citocinese (C). Esta progressão no ciclo pôde ser acompanhada também por citometria de fluxo, por meio da avaliação do conteúdo de DNA, gerando histogramas com um pico referente a parasitos em G1 e outro a parasitos em G2/M/C. Como potenciais marcadores moleculares, foram escolhidos os transcritos para as proteínas Aurora quinase 1, Polo-like quinase, MOB1 e TRACK, as quais já foram associadas à citocinese de outros tripanosomatídeos. Os níveis de transcritos para essas proteínas foram avaliados em epimastigotas em fase exponencial de crescimento por PCR quantitativa em tempo real (qPCR), sendo comparados a parasitos com taxas de multiplicação sabidamente reduzidas - epimastigotas em fase estacionária ou tratados com hidroxiureia - e a parasitos cuja capacidade de multiplicação é desconhecida - os tripomastigotas. Os transcritos para Aurora quinase 1 e, principalmente, Polo-like quinase estiveram fortemente associados a parasitos com altas taxas de divisão celular, ao passo que os transcritos para MOB1 e TRACK tiveram uma variação independente. Em todos os ensaios, Polo-like quinase demonstrou ser o mais promissor marcador molecular da citocinese, apresentando significantes reduções em sua abundância relativa de transcritos nas formas com baixas taxas de multiplicação celular, além de ser detectada como uma proteína de cerca de 70 kDa apenas nas formas epimastigotas em fase exponencial de crescimento. Assim, este estudo demonstrou o potencial da metodologia de qPCR utilizando Polo-like quinase como marcador molecular, bem como da citometria de fluxo, para estudar o comportamento do T. rangeli em seu hospedeiro mamífero, abrindo novas perspectivas para a compreensão do ciclo biológico deste parasito.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli is a protozoan parasite closely related to T. cruzi but considered to be non-pathogenic to the mammalian host, in which its ability to proliferate is unknown. Since several studies have addressed this issue without consensual results, the objective of this study was to investigate structural and molecular markers of cell division in T. rangeli, as a strategy to detect cell multiplication even when direct visualization of this process is not possible. The in vitro cell cycle of strain Choachí proliferative epimastigote forms was studied and revealed a duplication time of 26.2 hours, of which 11.91 hours consist in G1 phase, 6.13 hours in S phase, 3.88 hours in G2 phase, 1.13 hours in mitosis (M) and 3.15 hours in cytokinesis (C). This progression in the cell cycle was also followed by flow cytometry through the evaluation of DNA content, generating histograms with two peaks, the first referring to parasites in G1 and the second to parasites in G2/M/C. The transcripts for proteins Aurora kinase 1, Polo-like kinase, MOB1 and TRACK, which have been previously associated with cytokinesis in other trypanosomatids, were chosen as potential molecular markers. The transcript levels for these proteins were evaluated in exponential growth phase epimastigotes through real time quantitative PCR (qPCR) and compared to parasites with known reduced multiplication rates - stationary phase epimastigotes and parasites treated with hydroxyurea - and to parasites whose ability to multiply is unknown - trypomastigotes. The transcripts for Aurora kinase 1 and specially Polo-like kinase were strongly associated with parasites with high cell division rates, whereas the transcripts for MOB1 and TRACK varied independently. Polo-like kinase was the most promising molecular marker for cytokinesis, presenting a significant reduction in its transcripts relative abundance in parasites with low multiplication rates, being also detected as an approximately 70 kDa protein only in exponential growth phase epimastigotes. Therefore, this study has demonstrated the potential of the qPCR methodology using Polo-like kinase as a molecular marker, as well as the flow cytometry methodology, to study the behavior of T. rangeli in its mammal host, opening new perspectives to the comprehension of its biological cycle.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 319045.pdf: 1219993 bytes, checksum: 465e2e2f85e3782fd5fc2f44033d8bcb (MD5) Previous issue date: 2013 / A incorporação de produtos alimentícios industrializados à dieta causou aumento significativo da quantidade de sal ingerida pela população mundial. No Brasil, cerca de 89% dos homens entre 19 e 59 anos consomem sódio acima do nível seguro de ingestão. Evidências indicam que a ingestão exacerbada de sal pode causar inúmeras doenças. Neste trabalho, avaliamos as alterações causadas pela dieta hipersódica (NaCl 4%) no corpo cavernoso in vitro e na função erétil de ratos. Para isso, ratos Wistar machos, com 60 dias de idade, receberam ração acrescida de 4% de sódio pelo período de 2, 4, 8, 12 ou 24 semanas. Os animais que consumiram sal em excesso pelo maior período de tempo tiveram diminuição do peso testicular e aumento do peso renal, acompanhado de maior produção de urina. Em experimentos in vitro, corpos cavernosos de ratos expostos à dieta hipersódica apresentaram hiper-reatividade quando a contração foi induzida pelo estímulo elétrico de campo. Este efeito foi acompanhado por uma menor sensibilidade ao inibidor de Rho-quinase (composto Y-27632) e evidências funcionais de alterações no influxo de cálcio para o meio intracelular. Nossos resultados sugerem que modificações na recaptação de cálcio para o retículo sarcoplasmático também podem ocorrer. Apesar da dieta não prejudicar o relaxamento mediado pelo óxido nítrico, estabelecido como principal mediador da ereção, ao avaliarmos a função erétil dos animais por meio da administração subcutânea de apomorfina observamos que ratos expostos à dieta hipersódica têm menos ereções que animais da mesma idade que consumiram dieta padrão (controle). Este conjunto de efeitos, in vitro e in vivo, ocorreu de modo independente do aparecimento de hipertensão arterial, a qual até o momento tem sido o principal fator que estabelece alguma relação entre o consumo excessivo de sal e a disfunção erétil. Como conclusão, a ingestão demasiada de sódio pode causar alterações no corpo cavernoso e afetar diretamente a função erétil de ratos, independente da elevação da pressão arterial destes animais. Modificações na funcionalidade da via RhoA/Rho-quinase e mobilização de cálcio parecem contribuir para este efeito. Novos estudos são necessários para esclarecer a importância destas alterações para a disfunção erétil causada pelo consumo de sal. <br> / Abstract: The consumption of processed foods caused a significant increase in salt quantity consumed by the world population. In Brazil, around 89% of men between ages 19-59 ingest sodium above the safe level recommended. Evidence indicates that the heightened intake of salt can cause several diseases. In this study, we evaluated the changes caused by high salt diet (4% NaCl) in corpus cavernosum of rats in vitro, as well as in the erectile function of conscious rats. Wistar male rats (60 days old) received chow added with 4% NaCl for 2, 4, 8, 12 or 24 weeks. Consumption of high salt diet for 24 weeks resulted in decreased testicular weight and increased kidney weight, accompanied by augmented diuresis. When studied in vitro, strips of corpus cavernosum of rats that consumed high salt diet for 24 weeks presented enhanced contractile responses to electrical field stimulation. This effect was accompanied by a decreased susceptibility to the Rho-kinase inhibitor, compound Y-27632, and functional evidence of changes in the influx of calcium into the cytosol, besides impaired calcium uptake into the sarcoplasmic reticulum. Although high salt diet did not affect the relaxation mediated by nitric oxide, the main mediator of erection, we observed that rats exposed to high salt diet have fewer erections induced by subcutaneous injection of apomorphine, when compared with animals of same age fed regular diet (control group). The changes in responsiveness of corpus cavernosum observed in vitro and the reduced number of erection found in vivo in rats fed high salt diet appear to be independent of the influence of salt on the onset of hypertension, since no significant changes on systolic blood pressure were found in these animals. In conclusion, chronic high sodium intake can impair the functionality of corpus cavernosum in vitro and the ability of rats to achieve erections. For the best of our knowledge, this is the first study establishing a relationship between excessive consumption of salt and erectile dysfunction, independently of hypertension. Both modification in the functionality of RhoA/Rhokinase pathway and calcium mobilization appear to contribute to this effect. Further studies are needed to clarify the significance of these changes for erectile dysfunction caused by high salt intake.

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna. Existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB (Akt/ Proteína quinase B) é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. O objetivo do trabalho foi comparar a expressão da Akt/PKB em placentas de pacientes normais e com pré-eclâmpsia estimuladas com insulina. Foram utilizadas amostras de placenta de 12 pacientes normais e de 12 pacientes com PE foram coletadas, estimuladas com insulina e analisadas por Western blot para quantificação da expressão da proteína Akt/PKB basal e fosforilada em serina473. Como resultados, a estimulação das amostras com a insulina foi comprovada quando comparamos grupos estimulados (1,14 ± 0,10) e não estimulados (0,91 ± 0,08), P< 0,001. A atividade da via da Akt/PKB fosforilada em serina473 foi semelhante entre placentas de mulheres normais (1,26 ± 0,16) e com PE (1,01 ± 0,11), P = 0,237. Concluímos que não há diferença de fosforilação na via da Akt/PKB, após estimulação com insulina, em placentas de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar alterações desta via de sinalização na PE sem analisarmos os substratos da Akt/PKB quando estimulados. / Preeclampsia (PE) is an important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB pathway is stimulated by insulin and performs several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate stimulates expression of Akt/PKB pathway in the placenta, of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 12 normal patients and 12 PE patients, stimulate and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression in signaling of Akt/PKB. Results: stimulation of insulin samples was confirmed when comparing stimulated groups (1.14 ± 0.10) and non-stimulated (0.91 ± 0.08), P <0.001. The Akt/PKB phosphor (Ser473) was not different in placenta of the normal (1.26 ± 0.16) and PE (1.01 ± 0.11) groups, with P = 0.237. Conclusions: there was no difference of phosphorylation in Akt/PKB pathway, after stimulation with insulin, in placentas of normal and PE patients. However, we cannot discard effects in this signaling pathway as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze the substrates stimulation of this pathway.