Les cellules microgliales, sont les macrophages résidents du système nerveux central (SNC), et sont issues principalement des macrophages du sac vitellin, générés dès les premiers stades du développement embryonnaire. À leur arrivée dans le SNC, ces cellules subissent une phase de prolifération massive, permettant l'établissement de la population microgliale et la colonisation du SNC. Cette phase de prolifération revêt une importance capitale pour le processus de développement normal du cerveau, car les cellules microgliales interviennent dans la régulation de divers processus neurodéveloppementaux. Après cette phase de prolifération, une densité stable de cellules microgliales est atteinte, et est maintenue tout au long de la vie adulte grâce à un faible taux de prolifération qui favorise le renouvellement de la population. De plus, la prolifération des cellules microgliales constitue également un élément central dans la réponse du SNC face aux infections, aux traumatismes, et à la neurodégénérescence. Dans ces contextes de neuroinflamamtion, l'activationmicrogliale est accompagnée par l'expansion de la population microgliale, principalement par la prolifération de ces cellules. Cette expansion microgliale a pour but d'assurer un nombre suffisant de cellules pour protéger et restaurer l'homéostasie du SNC. La prolifération microgliale est donc une composante importante du développement du SNC et de la réponse immunitaire, ce qui en fait un processus complexe finement orchestré par une cascade d'événements transcriptionnels régissant l'expression ou la suppression de gènes spécifiques. Effectivement, la régulation transcriptionnelle est influencée par une variété de facteurs, incluant des molécules régulatrices qui déclenchent l'activation de différentes voies de signalisation essentielles, qui coordonnent l'activité de plusieurs facteurs de transcription nécessaires à la prolifération. De plus, la régulation de la transcription est également conditionnée par des interactions complexes entre les facteurs de transcription et les éléments régulateurs de la transcription, les promoteurs et les éléments amplificateurs. Cependant, malgré les progrès réalisés, notre compréhension des mécanismes qui régulent la prolifération des cellules microgliales au niveau transcriptionnel reste largement incomplète. Ainsi, il est essentiel de définir une signature génique spécifique des cellules microgliales en phase de prolifération et de déterminer les programmes d'expression génique qui coordonnent cette prolifération dans divers contextes physiologiques et pathologiques. En outre, il est important d'identifier les facteurs de transcription responsables de la coordination de ces programmes transcriptionnels et de caractériser leurs interactions avec les éléments régulateurs de la transcription. Nous avons donc analysé la prolifération des cellules microgliales pendant le développement postnatal et dans un modèle de déplétion-repopulation microgliale. Cette analyse nous a permis de mettre en évidence l'existence d'un programme transcriptionnel essentiel pour une prolifération efficace des cellules microgliales. Ce programme s'intègre à divers autres programmes transcriptionnels actifs dans un contexte spécifique, et est influencé par le microenvironnement cérébral. Par ailleurs, nous avons identifié deux mécanismes distincts de la régulation transcriptionnelle de la prolifération : le premier induit une augmentation de l'expression des gènes déjà présents dans les cellules microgliales non prolifératives (gènes C1), tandis que le second favorise l'expression de nouveaux gènes associés aux différentes phases du cycle cellulaire (gènes C2). Ces mécanismes sont régulés par une combinaison de facteurs de transcription généraux et spécifiques. Enfin, il a été déterminé que la régulation de l'expression génique pendant la prolifération microgliale est principalement axée sur les promoteurs, avec une contribution moindre des éléments amplificateurs de la transcription. / Microglial cells are the resident macrophages of the central nervous system (CNS) and primarily originate from yolk sac macrophages, generated in theearly stages of embryonic development. Upon their arrival in the CNS, these cells undergo a phase of massive proliferation, allowing for the establishment of the microglial population and colonization of the CNS. This proliferation phase is of crucial importance for the normal brain development process, as microglial cells play a role in regulating various neurodevelopmental processes. Following this proliferation phase, a stable density of microglial cells is achieved and maintained throughout adulthood due to a low proliferation rate that promotes population renewal. Moreover, the proliferation of microglial cells also constitutes a central element in the CNS response to infections, injuries, and neurodegeneration. In these contexts of neuroinflammation, microglial activation is accompanied by the expansion of the microglial population, primarily through the proliferation of these cells. This microglial expansion aims to ensure enough cells to protect and restore CNS homeostasis. Therefore, microglial proliferation is an important component of CNS development and immune response, orchestrated by a cascade of transcriptional events governing the expression or suppression of specific genes. Transcriptional regulation is influenced by various factors, including regulatory molecules that trigger the activation of different essential signalling pathways, coordinating the activity of several transcription factors necessary for proliferation. Additionally, transcriptional regulation is conditioned by complex interactions between transcription factors and regulatory elements such as promoters and enhancers. However, despite progress, our understanding of the mechanisms regulating microglial cell proliferation at the transcriptional level remains incomplete. Thus, it is essential to define a specific gene signature of proliferating microglial cells and determine the gene expression programs coordinating this proliferation in various physiological and pathological contexts. Additionally, it is important to identify the transcription factors responsible for coordinating these transcriptional programs and characterize their interactions with transcriptional regulatory elements. Therefore, we analyzed the proliferation of microglial cells during postnatal development and in a microglial depletion-repopulation model. This analysis revealed the existence of an essential transcriptional program for efficient microglial cell proliferation. This program integrates with various other transcriptional programs active in specific contexts and is influenced by the cerebral microenvironment. Moreover, we identified two distinct mechanisms of transcriptional regulation of proliferation: the first induce an increase in the expression of genes already present in non-proliferative microglial cells (C1 genes), while the second promotes the expression of new genes associated with different phases of the cell cycle (C2 genes). These mechanisms are regulated by a combination of general and specific transcription factors. Finally, it was determined that the regulation of gene expression during microglial proliferation primarily focuses on promoters, with a lesser contribution from transcriptional enhancers.

Dans le but d'élucider les mécanismes de régulation de la transcription de l'ARN ribosomique et de la biosynthèse des ribosomes, deux facteurs de transcription ribosomique, soit UBF et TTF -l, furent étudiés dans le but de mieux caractériser leurs fonctions in vivo. Un modèle , de désactivation conditionnelle du gène codant pour UBF chez la souris fut élaboré. Après l'inactivation d'un allèle chez des animaux hétérozygotes aucun défaut développemental, physique ou comportemental n'a été observé lors d' investigations préliminaires. Un modèle de diminution inductible de TTF-I par le ciblage par shRNAmir fut développé. Des études de marquage métabolique au tritium ont permis de conclure qu'une diminution de TTF -l avait un effet appréciable sur la transcription ribosomique et un effet encore plus marqué sur la maturation des ARN ribosomiques. On voit une inhibition claire et nette de la maturation des ARN ribosomiques et aucune accumulation appréciable du précurseur ce qui indique aussi un problème de transcription. Des études du cycle cellulaire, effectués par ±fluorescence-assisted cell sorting¿, ont permis de détecter un arrêt partiel en G 1 qui se traduit en une diminution de la vitesse de passage de la phase G 1 à G2/M lors d'une diminution de TTF-I. Finalement, un modèle de récupération fut développé en introduisant un vecteur conditionnel capable d'exprimer la forme pleine longueur de TTF-I dans les cellules de diminution conditionnelle. L'induction double et simultanée d'une forme pleine longueur de TTF-I et du shRNAmir ciblant TTF-I permit la récupération de la diminution de TTF -l chez ces cellules. Ce modèle de récupération permit de confirmer que les effets observés étaient dus à la diminution de TTF -l en excluant des effets secondaires.

L'arthrite est une des principales causes d'invalidité et d'utilisation des soins de santé au Canada. Environ 16 % des Canadiens âgés de 15 ans et plus souffrent d'arthrite et l'incidence devrait atteindre 20 % de la population d'ici 2031. Les médicaments utilisés pour traiter l'arthrite ciblent les médiateurs pro-inflammatoires. Malheureusement, tous les patients ne répondent pas bien à ces médicaments et beaucoup souffrent d'effets secondaires indésirables. L'inflammation étant régulée par un équilibre délicat entre les voies d'inhibition et d'activation des cellules immunitaires, une stratégie thérapeutique alternative consiste à cibler les molécules et les voies de signalisation anti-inflammatoires. Les récepteurs inhibiteurs sont ainsi devenus un sujet d'étude important étant donné leur potentiel thérapeutique. Toutefois, leur fonctionnement et leur rôle dans les maladies inflammatoires demeurent peu connus, nécessitant ainsi leur étude. C'est dans ce but scientifique que cette thèse s'est déroulée. Mes travaux se sont basés sur l'identification du récepteur inhibiteur CLEC12A appartenant à la famille des lectines, dont notre laboratoire a montré qu'il était impliqué dans la pathogenèse de la goutte. Le récepteur CLEC12A est un récepteur inhibiteur exprimé chez les cellules d'origine myéloïde, dont les ligands naturels et la voie de signalisation restent à identifier. Toutefois, CLEC12A possède un motif ITIM ("Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif") caractéristique des récepteurs inhibiteurs. Les motifs ITIM recrutent des phosphatases qui, à leur tour, inhibent les voies de signalisation activatrices des cellules immunitaires et permettent ainsi de moduler leurs fonctions. Cette capacité de modulation négative de l'activation des cellules myéloïdes du récepteur CLEC12A a été observée dans plusieurs études faisant de lui un candidat pertinent à étudier. CLEC12A apparaît notamment comme un facteur commun dans le syndrome de Behçet's, l'arthrite rhumatoïde et la goutte qui sont caractérisés par des épisodes inflammatoires aigus impliquant le neutrophile. Les études montrent que la diminution ou l'altération du récepteur CLEC12A est associée avec une inflammation exacerbée dans ces pathologies. De plus, en absence de CLEC12A, le neutrophile arbore une réponse accrue à des stimuli pro-inflammatoires. De ce fait, le laboratoire a étudié le rôle du récepteur CLEC12A dans la pathologie de la goutte dont l'agent étiologique connu, les cristaux d'urate monosodique (UMS) provoquent une inflammation exacerbée caractérisée par la suractivation des neutrophiles. Les cristaux d'UMS diminuent l'expression de CLEC12A à la surface des neutrophiles ce qui aboutit à une réponse inflammatoire accrue. De plus, nous savons que l'une des molécules (la colchicine) utilisées pour traiter les patients souffrant de la goutte prévient la diminution de l'expression de CLEC12A à la surface des neutrophiles par les cristaux d'UMS. Or, chez le neutrophile, notre laboratoire a démontré qu'en réponse aux cristaux d'UMS CLEC12A régule négativement l'influx de calcium intracellulaire, la phosphorylation des protéines intracellulaires ainsi que la production d'IL-8. Ceci a mené à notre hypothèse que CLEC12A modulerait la réponse des neutrophiles en ciblant les différentes voies de signalisation intracellulaires activées par les cristaux d'UMS. Ainsi, notre premier objectif était de mieux identifier les voies de signalisation modulées par CLEC12A chez le neutrophile en réponse aux cristaux d'UMS. Cependant, le manque de connaissance sur la signalisation du récepteur CLEC12A limitait notre approche afin de comprendre son rôle et les mécanismes altérant son expression dans la pathogenèse de la goutte. Ainsi, notre deuxième objectif était de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la signalisation de CLEC12A. Dans la pathologie de la goutte, nos travaux ont identifié l'axe de signalisation p38-MAPK-PI3K Akt dans la production de l'IL-8 par les neutrophiles en réponse aux cristaux d'UMS. Nous avons démontré la rapide phosphorylation du récepteur CLEC12A par une kinase Src dans les domaines membranaires résistants aux détergents (DRM) enrichies en flotilline-1 en réponse aux cristaux d'UMS, ce qui révèle qu'avant d'être dégradé par les cristaux, le récepteur module l'activation des neutrophiles par l'axe de signalisation p38-MAPK-PI3K-Akt. Afin de pouvoir comprendre les mécanismes dérégulant l'expression de CLEC12A dans la goutte, nos travaux ont identifié des mécanismes de signalisation du récepteur qui étaient encore méconnus. Nos résultats rapportent les premières évidences des mécanismes de signalisation du récepteur CLEC12A. Nous démontrons le rôle des cystéines 118 et 130 de la tige extracellulaire de CLEC12A dans son oligomérisation, expression, et signalisation selon un mécanisme de modification post-traductionnel des cystéines.

La kinase Aurora A est une protéine essentielle au cycle cellulaire et plus particulièrement lors de la mitose. En effet, Aurora A est nécessaire dès l’entrée en mitose et régule sa progression. Elle joue un rôle dans la maturation et la séparation des centrosomes. Elle participe à l’assemblage du fuseau mitotique et du fuseau central pour le rassemblement et l’orientation des chromosomes. Enfin elle est nécessaire à la réussite de la cytodiérèse. Elle est également nécessaire à l’égale répartition des mitochondries dans les cellules filles et joue un rôle dans l’épissage alternatif des ARNm de facteurs apoptotiques. Au delà de ses fonctions mitotiques, plusieurs études récentes indiquent qu’Aurora A présente des fonctions supplémentaires dans les cellules en interphase. Elle est notamment essentielle au désassemblage du cil primaire et joue un rôle dans la dynamique des microtubules et la migration cellulaire. Enfin, une dérégulation de son expression, de sa stabilité et/ou de son activité perturbe le déroulement du cycle cellulaire ce qui conduit à la transformation des cellules et favorise l’apparition de cancers. Ses fonctions normales ainsi que ses fonctions lors de la carcinogenèse sont conduites à travers les nombreux partenaires protéiques qui entrent en interaction avec elle. Ils modulent son activité, sa localisation et sa stabilité. En retour Aurora A phosphoryle un bon nombre d’entre eux régulant ainsi leur activité, localisation et stabilité. Cependant, l’analyse des interactions déjà connues d’Aurora A ne permet pas d’expliquer tous les phénotypes observés lors de sa dérégulation. Afin de mieux comprendre les fonctions d’Aurora A, les mécanismes qui la régulent et mettre en évidence ses multiples rôles au sein de la cellule, j’ai construit puis analysé un interactome d’Aurora A généré à partir d’une méthode de purification d’affinité couplée à la spectrométrie de masse en tandem. J’ai identifié 477 partenaires potentiels dont 180 présentant une forte probabilité d’être des partenaires directs de la kinase. L’analyse bioinformatique approfondie de cet interactome a permis de révéler les partenaires associés à des mécanismes liés à la mitochondrie et l’épissage des ARN messagers mettant en évidence une implication potentielle d’Aurora A dans ces mécanismes. Pour valider cet interactome, j’ai choisi d’étudier plus précisément deux partenaires identifiés dans cette étude : les protéines WDR62 et CEP97. J’ai montré que ces deux partenaires co-localisent avec Aurora A et sont phosphorylés par la kinase. WDR62 est impliquée dans la microcéphalie et est dérégulée dans certains cancers. J’ai montré qu’Aurora A phosphoryle WDR62 en mitose et que cette phosphorylation est nécessaire à sa localisation aux centrosomes. CEP97 est une protéine du cil primaire encore peu caractérisée et des anomalies du cil primaire sont associées aux ciliopathies. Or l’activité d’Aurora A est nécessaire au désassemblage du cil primaire. J’ai montré qu’Aurora A phosphoryle in vitro CEP97 et que l’inhibition de l’activité d’Aurora A dans les cellules perturbe la localisation de CEP97 au niveau des cils et des centrosomes. Ainsi, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence un nombre important de nouveaux partenaires d’Aurora A associés à de nouvelles fonctions. L’étude de ces nouvelles fonctions liées aux mitochondries et à l’épissage des ARN, constitue deux nouveaux projets actuellement menés par des collaborateurs au sein de notre institut. / The serine-threonine kinase Aurora A is an essential mitotic cell cycle protein. Aurora A is necessary for mitotic entry and for the maturation and separation of centrosomes. It participates in mitotic spindle assembly and chromosome biorientation, and it is essential for the completion of cytokinesis. Furthermore, Aurora A activity is necessary for the equal distribution of mitochondria to daughter cells and, through its role in the alternative splicing of mRNA of apoptotic factors, it provides a link between cell cycle control and apoptosis. Beyond its mitotic functions, several recent studies suggest that Aurora A is also important during interphase. Notably, it influences microtubule dynamics, promotes cell migration and polarity control and is essential for primary cilia disassembly. Reflecting the fact that Aurora A is found to be up-regulated in many cancers, deregulation of Aurora A activity can result in an aberrant cell cycle, ultimately leading to malignant transformation of cells. The crucial regulation of Aurora A’s numerous functions is achieved through its interaction with several protein partners, which modulate its activity, localisation and stability. Aurora A in turn phosporylates a number of them, thus regulating their activity, localisation and stability. However, the known interactions of Aurora A cannot explain all the phenotypes that have been described of its deregulation. To better understand the functions of Aurora A, the regulation mechanisms governing it, and to expose its multiple roles in the cell, I have built and analysed an Aurora A interactome using tandem affinity purification coupled with mass spectrometry. This resulted in the identification of 477 potential interacting partners, of which, 180 were determined to have a high probability of interacting directly with the kinase. In-depth bioinformatic analysis of this interactome has revealed the associated partners to be related to mitochondria and mRNA splicing, highlighting the potential involvement of Aurora A in these mechanisms. To validate the interactome, two of the proteins identified in this study, WDR62 and CEP97, were examined in detail. Here I show that these two proteins colocalise with Aurora A, and are phosphorylated by the kinase. WDR62 is implicated in microcephaly and is deregulated in certain cancers. I have shown that Aurora A phosphorylates WDR62 during mitosis, and that this phosphorylation is necessary for its localisation to the centrosomes. CEP97 is a poorly charactarised protein of the primary cilium, abnormalities of which are associated with ciliopathies. I have shown that Aurora A phosphorylates CEP97 in vitro, and that the inhibition of Aurora A activity in vivo perturbs the localisation of CEP97 to cilia and centrosomes. This study has identified a number of new Aurora A-interacting proteins, implicating the kinase with novel functions. These functions, related to mitochondria and mRNA splicing have opened up a new area for further investigation.

Le genre Leishmania regroupe des parasites protozoaires transmis par piqûre d’un insecte vecteur et qui sont responsables des leishmanioses. Le cycle de Leishmania alterne entre promastigotes dans l’appareil digestif de l’insecte et amastigotes dans les phagolysosomes des macrophages d’un hôte mammifère. Les delta-amastines sont une famille de protéines membranaires qui jouent potentiellement un rôle dans la virulence. L’expression exclusivement au stade intracellulaire de l’un de ces gènes est permise par une accumulation préférentielle de l’ARNm et la stimulation de la traduction, toutes deux chez les amastigotes. L’objectif de cette thèse est de caractériser les mécanismes permettant l’expression différentielle de l’ARNm de la delta-amastine. Ces organismes ont divergé rapidement des autres eucaryotes, ce qui engendre plusieurs différences fonctionnelles, dont notamment l’absence de régulation transcriptionnelle. Notre hypothèse est que la présence d’une région riche en uridines (URE) dans l’extrémité 3’ non traduite (3’UTR) du transcrit peut être impliquée dans la dégradation de l’ARNm. Nous démontrons que le URE est responsable d’une dégradation du transcrit au stade promastigote, par un phénomène indépendant de la déadénylation. Nous avons identifié une protéine à domaine Alba, LiAlba20, liant l’ARNm de la delta-amastine dans une région proche de l’URE. La suppression de cette protéine réduit l’accumulation du transcrit au stade amastigote. Ainsi, deux mécanismes complémentaires sont responsables de l’expression différentielle de ce transcrit. Le génome de Leishmania code pour une seconde protéine à domaine Alba, LiAlba13. Ces protéines interagissent ensemble, mais LiAlba13 n’affecte pas l’abondance de l’ARNm de la delta-amastine. Les protéines Alba ont une évolution exceptionnelle puisqu’elles stabilisent l’ADN chez les Archaea, et sont retrouvées dans les complexes RNase P/MRP chez les eucaryotes supérieurs. Nos résultats montrent qu’elles régulent l’expression de protéines spécifiques du stade amastigote, ce qui concorde avec les récents travaux chez d’autres parasites protozoaires. Ces protéines sont cytoplasmiques dans les deux stades de développement. Cependant, pendant la différenciation, elles s’accumulent dans le flagelle et le nucléole, respectivement décrits comme senseur et coordinateur de la réponse au stress. Nos travaux suggèrent donc l’implication du flagelle et du nucléole dans la coordination de la régulation de facteurs de virulence pendant la différenciation du parasite. / The Leishmania genus encompasses protozoan parasites which are transmitted through the bite of an insect vector and are responsible for leishmaniasis. The Leishmania life cycle alternates between promastigote forms within the gut of the insect vector and amastigotes which multiply in the phagolysosomal vacuoles of the mammalian host’s macrophages. Delta-amastins are part of a multigenic family of membrane proteins that potentially act in parasite virulence. One of the delta-amastin's exclusive expression in the intracellular stage is mediated by mRNA accumulation and translation stimulation, both taking place in the amastigote stage. The aim of this thesis is to characterize the mechanisms implicated in the differential expression of delta-amastin mRNA. Leishmania splits early in evolution from other eukaryotes and this split correlates with many functional differences, including the absence of transcriptional control of gene expression. Our hypothesis is that the presence of a uridine-rich element (URE) within the 3’ untranslated region (3’UTR) of the transcript might be implicated in an mRNA decay mechanism. We reveal that the URE is responsible for a fast mRNA decay only in the promastigote stage, performed by an unusual deadenylation-independent pathway. We next identified an Alba domain protein, LiAlba20, which binds to the delta-amastin mRNA in a region flanking the URE. Depletion of this protein leads to a reduced mRNA accumulation in the amastigote stage specifically. Therefore, we identified two complementary mechanisms taking part in the transcript’s differential expression. The Leishmania genome encodes a second Alba domain protein, LiAlba13. These proteins interact together, but LiAlba13 does not affect the delta-amastin mRNA level during the parasite life cycle. Alba domain proteins have a remarkable evolution, being involved in DNA stabilization in Archaea and subunits of the RNAses P/MRP complexes in higher eukaryotes. In addition, our data show that these proteins regulate stage-specific protein expression, which is in agreement with recent works in other protozoan parasites. Alba domain proteins are constitutively expressed in the cytoplasm of both parasite life cycle stages. Nevertheless, during the differentiation, those proteins accumulate in flagellar and nucleolus compartments, respectively described as sensor and stress response coordinators in higher eukaryotes. Our work suggests that the flagellum is implicated in the coordination of stage-specific transcript expression in response to stress in Leishmania.

Lors d'une exposition au VIH-1, bien qu'une seule petite proportion des macrophages soit infectée, il est proposé que ces cellules jouent un rôle important dans l'infection et la propagation du VIH-1. Pour approfondir nos connaissances dans ce domaine, des analyses transcriptomiques et protéomiques ont été effectuées afin de comparer les MDMs (Macrophages Dérivés de Monocytes) infectés aux non infectés. Ces analyses ont mené à la sélection de 50 gènes dont l'expression est modulée chez les cellules infectées pour effectuer un criblage par siRNA pour leurs rôles fonctionnels dans le cycle viral. Huit cibles ont été identifiées comme des régulateurs de l'infection chez les MDMs, mais seulement le gène MDM2 agissait comme un facteur de susceptibilité. Ce gène a donc été l'objet d'études plus approfondies. L'inhibition de l'expression de MDM2 induit une diminution de moitié de l'expression virale. Nos résultats indiquent que la résistance accrue au VIH-1 associée à l’interférence de MDM2 est maintenue même si le niveau d'ARNm est rétabli, suggérant que cette protéine serait impliquée indirectement dans l'infection par le VIH-1. L'identification des cofacteurs viraux régulés par MDM2 mènera à une compréhension des évènements signalétiques contrôlant la réplication du VIH-1 dans les macrophages. / Upon exposure to HIV-1, only a small proportion of macrophages are infected whereas most remain uninfected. It is proposed that these cells play an important role in the establishment and propagation of HIV-1 infection. To further our knowledge in this field, transcriptomic and proteomic comparative analyses of uninfected and HIV-1-infected MDMs (Monocyte-derived macrophages) were performed. These analyses led to the selection of 50 genes that were tested for their functional roles in HIV-1 replication by siRNA screen. Eight genes were identified as regulators of HIV-1 infection in MDMs, but only MDM2 acted as a susceptibility factor. The knockdown of MDM2 decreased HIV-1 expression by two folds. Our results indicate that the resistance to HIV-1 upon MDM2 silencing is maintained in MDMs even if MDM2 mRNA level is restored, thus suggesting that this protein might be indirectly involved in HIV-1 infection. Identification of viral cofactors regulated by MDM2 will bring a new understanding of signaling events controlling HIV-1 replication in macrophages.

HIP1R (Huntingtin interacting protein 1-related) a des rôles dans l’endocytose médiée par la clathrine, l’apoptose et la mitose. Elle induit l’assemblage de la clathrine, régule la polymérisation de l’actine, contribue au clivage de la caspase-9 et aide l’ancrage des chromosomes sur les microtubules lors de la métaphase. Les domaines protéiques responsables de ces contributions et les facteurs permettant à HIP1R de changer de rôle ne sont pas encore bien connus. Nous avons utilisé la technique du knock-down et nous avons réintroduit des versions mutées ou tronquées d’HIP1R pour caractériser ses rôles en modifiant ses liaisons avec ses partenaires. Les résultats indiqueraient qu’HIP1R participe principalement à l’internalisation des plaques de clathrine et qu’HIP1R n’induit pas l’activation de la caspase-3. Finalement, nous avons montré que la liaison d’HIP1R avec la clathrine lui confère son rôle lors de la mitose lui permettant ainsi de se localiser sur les microtubules pendant la métaphase.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2013-2014. / Les récents développements de la recherche ont permis de caractériser le tissu adipeux en tant qu’organe endocrine majeur et à associer l’obésité à un phénotype d’inflammation chronique, surnommé métaflammation. Cette thèse de doctorat s’attarde spécifiquement à une adipokine et son récepteur, la protéine stimulant l’acylation (ASP) et le récepteur C5L2, ainsi qu’à leur relation avec le métabolisme énergétique et la métaflammation. L’ASP dérive du système du complément et ses principaux effets sont liés à la stimulation de l’absorption des acides gras et du glucose par les adipocytes, avec comme résultat net l’entreposage accentué de lipides. L’invalidation génétique de la voie ASP–C5L2 crée un phénotype de résistance à l’obésité et d’hyperphagie, lui conférant un potentiel thérapeutique intéressant. Les travaux décrits dans cette thèse évaluent premièrement chez la souris, de manière successive, (i) les conséquences d’une stimulation aigüe par l’ASP, (ii) le métabolisme des animaux déficients en C5L2 lorsque soumis à une diète diabétogène, (iii) ainsi que la dynamique de signalisation de la voie ASP–C5L2 dans le développement de l’obésité. L’ASP agit de manière aigüe en tant qu’hormone anabolique, stimulant l’absorption de glucose dans les tissus à transport actif. De manière paradoxale, l’ASP crée aussi un état pro-inflammatoire ponctuel, stimulant la synthèse de cytokines ainsi que la migration et l’activation classique des macrophages. La délétion du récepteur C5L2 dans un modèle murin sous diète diabétogène induit des effets énergétiques contraires, poussant le développement de l’insulinorésistance et redirigeant le glucose vers le foie. Un phénotype exacerbé de métaflammation est aussi mesurable, probablement lié à la perte de la seconde fonction du récepteur C5L2, celle de la séquestration de l’anaphylatoxine C5a. Par la suite, dans un modèle d’obésité induite par la diète, le développement d’une résistance à l’ASP est démontré et semble être lié à la diminution de l’expression du récepteur C5L2. L’étude finale de cette thèse (iv) évalue la contribution clinique de l’ASP et du système du complément dans une intervention visant à moduler l’interaction entre le métabolisme énergétique et l’inflammation dans le cadre d’une chirurgie de résection hépatique. Les résultats avancés dans cette thèse permettent de mieux situer la voie ASP–C5L2 à la frontière du métabolisme énergétique et de l’immunité et de clarifier son potentiel thérapeutique. / Recent research findings have characterized adipose tissue as en endocrine organ and have shown that obesity triggers the development of low-grade inflammation, termed metaflammation. This thesis focuses on one adipokine and its receptor, acylation stimulating protein (ASP) and C5L2 receptor, and their relationship with energy metabolism and metaflammation. ASP derives from the complement system and acts on adipocytes by upregulating fatty acid and glucose absorption, resulting in a net increase in lipid storage. Mice genetically deficient in components of the ASP–C5L2 pathway are obesity-resistant but hyperphagic, suggesting that the disruption of this pathway could hold a therapeutical value. This thesis sequentially evaluates in mouse models (i) the consequences of an acute ASP stimulation, (ii) metabolism in C5L2-deficient animals treated with a diabetogenic diet, (iii) and the dynamics of the ASP–C5L2 pathway in diet-induced obesity. ASP acts acutely as an anabolic hormone, stimulating glucose absorption in tissues with active glucose transport. Paradoxically, ASP also generates an acute proinflammatory response with increased cytokine release, macrophage migration and classical activation. The disruption of C5L2 receptor in a murine model treated with a diabetogenic diet induced the opposite effects on energy metabolism, aggravating the development of insulin resistance and rerouting glucose to the liver. A more pronounced phenotype of metaflammation is also measurable in C5L2 knockout mice, probably linked to the second function of the C5L2 receptor, the sequestration of the anaphylatoxin C5a. In a model of diet-induced obesity, the proof-of-concept of ASP resistance is demonstrated and possibly linked with a reduction in C5L2 expression. The final study in this thesis (iv) evaluates the clinical contribution of ASP and the complement system in the outcome of an intervention designed to modulate the interaction between metabolism and immunity in a surgical context of hepatic resection. The results shown in the present work clarify the role and the therapeutical potential of the ASP–C5L2 pathway and describe it as a bridge between inflammation and metabolic homeostasis.

Introduction: Le développement pré-implantatoire et particulièrement la formation d'un blastocyste de qualité constitue l'un des événements les plus importants pour l'implantation et l'induction de la grossesse. In vitro, 30% à 40% seulement des ovocytes aboutissent à la formation de blastocystes et juste une faible proportion de ces derniers, supposés morphologiquement être "en bonne santé" sont capables de réussir le développement post-implantation. Cette limitation pose un grand problème pour les technologies de fécondation in Vitro (FIV) ce qui nécessite le développement d'une bonne approche permettant de se prononcer sur la compétence embryonnaire. La notion de compétence demeure difficile à définir sur des bases morphologiques et cinétiques. Considérant que la sélection d'un blastocyste de qualité est l'un des objectifs majeurs de la FIV chez l'humain et que le bovin représente un très bon modèle pour telle une étude, nous nous sommes fixés comme objectif d'analyser le profil d'expression génique du blastocyste bovin à trois stades de développement (début cavité, en expansion et éclos). Cette étude nous renseignera non seulement sur la régulation moléculaire de l'expansion et l'éclosion du blastocyste mais nous permettra également de définir des marqueurs potentiels de la compétence au développement et d'avoir un outil utile pour caractériser les différentes étapes de ces changements morphologiques (classification) Méthodes: Les blastocystes sont produits in vitro et collectés au stade début cavité (apparition d'une petite cavité), en expansion (diamètre supérieur à une zone pellucide normale) et éclos (sans zone pellucide). Pour procéder à notre étude transcriptomique, l'ARN est extrait, amplifié, marqué puis hybride en "loop design experiment" (biopuce maison ADNc, BlueChip). Pour valider les résultats des biopuces, certains gènes candidats ont été sélectionnés et confirmés par Q-RT-PCR. Résultats: À l'issue de l'analyse des données de biopuces, différents gènes impliqués par exemple dans l'implantation, l'adhésion cellulaire et la digestion de la matrice extracellulaire ont été trouvés comme sur-exprimés au stade éclos. Les blastocystes au stade début cavité, ont été en contre partie plutôt enrichis en gènes dont les produits sont impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, la traduction et la transcription. Les résultats de la Q-RT-PCR ont positivement validé les résultats de biopuce à un taux de 87,5% (7/8). Certains de ces gènes candidats confirmés par Q-RT-PCR (IFNT, PLAC8, SSLP1, AKR1B1, HNRNPA2B1, ARGFX, NANOS et CCNB1) s'avèrent particulièrement intéressants comme marqueurs potentiels de la compétence embryonnaire surtout qu'on a détecté leur expression aussi tôt que le stade blastocyste. Conclusions: Notre étude procure de nouvelles connaissances sur la régulation moléculaire de la formation du blastocyste. D'autres part, la liste des gènes différentiellement exprimés pourra faciliter dans lefutur, le choix et l'étude de marqueurs éventuels de la compétence ainsi que la classification des blastocystes lorsqu'il s'agirait d'investiguer l'effet du traitement sur le développement embryonnaire.

Titre de l'écran-titre (visionné le 26 mars 2024) / La biogenèse des ribosomes est un processus cellulaire important qui se produise dans le nucléole et qui nécessite la participation des trois ARN polymérases nucléaires. L'étape initiale et limitante de ce processus est la transcription de l'ARN ribosomal précurseur (pré-ARNr/47S) contenant les ARN 28S, 18S et 5,8S par l'ARN polymérase I (RPI, également connue sous le nom de Pol1 et POLR1). RPI dispose d'un ensemble dédié de facteurs basaux responsables pour son action : le facteur architectural UBF ou UBTF, le facteur SL1, le facteur d'initiation RRN3 et le facteur de terminaison TTF1. La synthèse de l'ARN ribosomal est étroitement régulée et représente 40 % de la transcription totale des gènes. Le déséquilibre de la synthèse de l'ARN ribosomal a été observé dans de nombreuses maladies comme le cancer. Par conséquent, ce processus est lié à la croissance, la transformation, la prolifération cellulaire et aux actions des suppresseurs de tumeurs et des oncogènes. Par conséquent, l'étude de la régulation transcriptionnelle des ARN ribosomiques revêt une importance cruciale dans la compréhension et le traitement ultérieur de ces maladies. Le génome haploïde humain et murin contient environ 200 copies des gènes de l'ARN ribosomal, l'ADN ribosomal (ADNr). Ces copies d'ADN ribosomique sont disposées en répétitions sur les bras courts des chromosomes acrocentriques. Il est intéressant de noter que seule une fraction des copies d'ADNr est active et qu'un nombre important est épigénétiquement silencieux et hétérochromatique. Cependant, les mécanismes à l'origine de la reconnaissance et de l'inactivation du promoteur de gène de l'ARN ribosomal ne sont pas encore bien compris. Cette thèse propose un modèle d'ajustement induit pour la reconnaissance du promoteur de l'ARN polymérase I et présente les rôles du facteur de terminaison de la transcription I dans la régulation du gène ribosomal. Nous montrons que la coopération entre SL1 et le variant d'épissage UBTF1 génère la spécificité requise pour la reconnaissance du promoteur de l'ADNr dans la cellule. Nous constatons que la suppression conditionnelle de la sous-unité Taf1b de SL1 provoque une déplétion de l'UBTF au niveau des deux promoteurs de l'ADNr, mais pas ailleurs dans l'ADNr. Nous constatons également que même si les variants UBTF1 et -2 se lient dans toute la région exempte de nucléosomes de l'ADNr, seul UBTF1 est présent avec SL1 au niveau des promoteurs. Ainsi, les données suggèrent fortement un modèle d'ajustement induit de reconnaissance du promoteur RPI dans lequel UBTF1 joue un rôle architectural. Parmi les promoteurs ribosomiques, on note la présence du promoteur spacer situé 2 kb en amont du promoteur principal du gène où se lie TTF1. Nous avons montré que cette liaison est importante pour empêcher l'ARN polymérase I de transcrire la région dites « enhancer repeats » interférant ainsi avec l'assemblage du complexe de pré-initiation au niveau du promoteur principal du gène ribosomique via un mécanisme d'occlusion du promoteur induit par un long ARN non codant, inhibant ainsi la transcription de l'ADN ribosomique et cela se produit en réponse à l'activité du suppresseur de tumeur ARF. Le même scénario est observé lors de la différenciation des cellules souches embryonnaires en cellules neuronales où nous avons montré que KLF4 régule la transcription de RPI via la régulation de ses facteurs associés TTF1 et RRN3. En prenant toutes les données ensemble, nous suggérons deux nouveaux mécanismes qui régulent le gène ribosomal : le modèle d'ajustement induit pour la reconnaissance du promoteur RPI et le mécanisme d'occlusion du promoteur induit par un long ARN non codant suite à l'activation du suppresseur de tumeur ARF dans la cellule. / Ribosome biogenesis is an important cellular process occurring in the nucleolus that requires the transcription by all three nuclear RNA polymerases. The initial and rate-limiting step of this process is the transcription of the precursor ribosomal RNA (pre-rRNA/47S) containing the catalytic RNAs 28S, 18S and 5.8S by RNA polymerase I (RPI, also known as Pol1 and POLR1). RPI has a dedicated set of basal factors responsible for its action: the architectural factor UBF or UBTF, the TBP containing factor SL1, the initiation factor RRN3, and the termination factor TTF1. Ribosomal RNA synthesis is tightly regulated and accounts for 40% of total gene transcription. The imbalance of ribosomal RNA synthesis has been observed in many diseases such as cancer. Therefore, this process is linked to cell growth, transformation, proliferation and the actions of tumor suppressors and oncogenes. Consequently, the study of transcriptional regulation of ribosomal RNAs is of crucial importance in the understanding and subsequent treatment of these diseases. The human and mouse haploid genome contain ~200 copies of the ribosomal RNA genes, the ribosomal DNA (rDNA). These ribosomal DNA copies are arranged in tandem repeats on the short arms of acrocentric chromosomes. Interestingly, only a fraction of the rDNA copies is active, and a significant number are epigenetically silenced and heterochromatic. However, the mechanisms behind ribosomal RNA gene promoter recognition and silencing are not yet fully understood. This thesis suggests an induced-fit model for RNA polymerase I promoter recognition and presents the roles played by the transcription termination factor I in regulating the ribosomal gene. We show that cooperation between SL1 and the UBTF1 splice variant generates the specificity required for rDNA promoter recognition. We find that conditional deletion of the Taf1b subunit of SL1 causes a striking depletion of UBTF at both rDNA promoters but not elsewhere across the rDNA. We also find that while both UBTF1 and -2 variants bind throughout the rDNA nucleosome-free region, only UBTF1 is present with SL1 at the promoters. Thus, the data strongly suggest an induced-fit model of RPI promoter recognition in which UBTF1 plays an architectural role. Of the ribosomal promoters, we note the presence of the spacer promoter located 2Kb upstream the main gene promoter where TTF1 binds. We showed that this binding is important to block the RNA polymerase I from transcribing the enhancer repeat region. We further demonstrated that the spacer promoter is the source of a lncRNA that interferes with the assembly of the pre-initiation complex at the main gene promoter via promoter interference or occlusion thereby inhibiting rDNA transcription. The mechanism is proposed to explain the action of the p19ARF tumor suppressor activity in limiting cell growth. The same scenario is observed during ESCs to NPCs differentiation where we showed that KLF4 determines RPI transcription by regulating the genes encoding TTF1 and RRN3. Our data suggest two novel mechanisms that regulate the ribosomal genes: the RPI promoter recognition induced-fit model and the lncRNA-induced promoter occlusion mechanism driven by ARF displacement of TTF1, and further suggests a role for rDNA regulation in differentiation and loss of pluripotency of embryonic stem cells.