En réanimation, les facteurs de risque d’infection à bactéries résistantes sont nombreux et il est nécessaire d’instaurer une antibiothérapie rapide et adéquate. Cela conduit donc souvent au choix empirique d’antibiotiques à large spectre. Ce travail de thèse regroupant quatre études porte sur les éléments de ce choix. Dans la première étude, les critères de "pneumopathie associée aux soins" sont discutés. Dans la seconde, il est rapporté que le traitement antibiotique prescrit au début du séjour en réanimation est associé à l’acquisition de Pseudomonas aeruginosa. Dans le diagnostic d’une pneumopathie acquise sous ventilation, la troisième étude décrit une technique rapide d’antibiogramme permettant une désescalade antibiotique plus précoce. La néphrotoxicité des aminoglycosides dans le traitement empirique des patients en sepsis sévère est présentée dans la dernière étude. Ces travaux participent à la bonne gestion des antibiotiques à la phase empirique du traitement des infections sévères en réanimation. / Intensive care units (ICU) are a niche for risk factors of infection due to multidrug resistant bacteria. ICU patients are in a need for a rapid and adequate antibiotic therapy. This leads ICU physicians to use empirical broad spectrum antibiotics. This thesis comprises four studies which focus on the empirical step of the treatment. In the first study, the criteria for "health-care-associated pneumonia" are discussed. The second shows that the antibiotic selection pressure administered early during the ICU stay could lead to Pseudomonas aeruginosa acquisition. In the third study, a rapid direct specimen testing method was assessed for ventilator-associated pneumonia diagnosis in order to hasten antibiotic de-escalation. Finally, a review on aminoglycosides’ nephrotoxicity in the severe sepsis setting represents the fourth study. These studies bring a loop forward into the understanding of the antibiotic stewardship of patients with severe sepsis, with particular focus on the empirical antibiotic treatment.

L’organisation mondiale de la santé estime que le choléra entraîne 100, 000 décès par an pour environ 4 millions de cas recensés, plaçant ainsi cette maladie comme un enjeu de santé publique majeur. Cette infection est causée par Vibrio cholerae, une bactérie à Gram négatif vivant en milieu aquatique. Face à cette agression, l’épithélium intestinal et les bactéries du microbiote agissent comme une barrière, en exprimant notamment des peptides antimicrobiens (PAM). V. cholerae, comme de nombreux pathogènes, montre une résistance accrue aux PAM. Malgré une avancée constante sur la compréhension des mécanismes de résistances bactériens aux PAM, de nombreuses inconnues demeurent, principalement en raison des techniques de mutagénèse aléatoire utilisées pour leur identification. L’objectif de cette étude est d’identifier de nouveaux mécanismes de résistance impliqués dans la résistance de V. cholerae aux PAM. Grâce à des expériences de séquençage par spectrométrie masse suivi d’études bio-informatiques, nous avons identifié les protéines OmpV et Lap comme des candidates intéressantes pour être impliquées dans la résistance de V. cholerae. Alors que la souche V. cholerae A1552 délétée du gène ompV (DompV) ne semble pas présenter de défaut de croissance ou de perméabilité, nos résultats ont montré une diminution des concentrations minimales inhibitrices en différents PAM tels que LL-37. Les tests fonctionnels semblent suggérer l’implication des vésicules de sécrétion dans le mécanisme de d’OmpV face à LL-37 chez V. cholerae. / According to the World Health Organization, cholera remains a significant health problem, causing 100,000 death per 4 millions infections per year. V. cholerae, the etiologic agent of cholera and a Gram-negative bacterium, is generally transmitted via contaminated food or water. During infection, the microbiota and intestinal epithelium acts as a barrier by producing antimicrobial peptides (AMP). Resistance to AMP has emerged as a virulence factor in pathogens and specifically in V. cholerae. As AMP are considered as novel molecular therapeutic agents, it is truly important to better understand strategies of resistance of V. cholerae. The aim of this study is to identify unknown mechanisms involved in V. cholerae resistance to AMP. For this purpose, after protein sequencing by mass spectrometry (MS-MS) and bioinformatics, we identified the OmpV porin, member of the outer membrane protein family and the Lap protease as new protein candidates for strategies of resistance. We characterized the V. cholerae A1552 strain deleted for ompV (DompV). We confirmed OmpV implication in AMP resistance by minimum inhibitory concentration and did not observed any differences in growth or permeability in the presence of AMP between the wild-type (wt) and the (DompV) strains. The work presented here suggest an implication of outer membrane vesicules in V. cholerae resistance mechanisms to some AMP as LL-37.

L’usage excessif d’antibiotiques a provoqué l’émergence de résistance, constituant un problème sanitaire mondial. L’antibiotique triméthoprime (TMP) inhibe l’enzyme dihydrofolate réductase (FolA) des bactéries, interrompant la production d’un précurseur essentiel dans la synthèse des purines et empêchant ainsi la croissance bactérienne. Cependant, certaines bactéries produisent une seconde dihydrofolate réductase : une DfrB, appartenant à une famille d’enzymes hautement résistantes au TMP. Actuellement, dix membres de la famille DfrB ont été identifiés, qui partagent une identité de séquence élevée (74 – 98 %). Les enzymes DfrB sont constituées de domaines identiques de 78 acides aminés, de type ‘SH3-like’, qui s’homotétramérisent afin de former l’enzyme active. Les DfrB ne partagent aucune homologie de séquence ou de structure avec les FolA et aucun antibiotique n’a encore été développé pour contourner la résistance au TMP causée par les DfrB. Afin de mieux comprendre le domaine SH3-like, des homologues (DfrB-H) partageant 10 à 80 % d’identité avec la DfrB1 ont été identifiés et caractérisés. Ils possèdent une activité dihydrofolate réductase (Dfr) et confèrent de la résistance au TMP. De plus, afin de vérifier si les gènes dfrB se retrouvent dans divers environnements, une recherche dans une base de données métagénomiques a été entreprise, permettant de caractériser 10 nouvelles séquences homologues aux DfrB connues. En 2012, le groupe Pelletier a rapporté le premier inhibiteur spécifique d’une DfrB, et plusieurs autres depuis. Seule la DfrB1 a été caractérisée concernant son profil d’inhibition ainsi que sa thermostabilité inhabituelle. Ici, une méthode semi-automatisée sera développée pour caractériser les profils d’inhibition, de thermostabilité, de résistance au TMP et d’activité enzymatique de toutes les DfrB et des homologues identifiés, afin de les comparer à ceux de la DfrB1. Pour atteindre ces objectifs, des nouvelles méthodes à haut débit de détermination d’activité ainsi que des tests de concentration minimale inhibitrice (CMI) furent développés. Ces méthodes ont permis de déterminer que les profils de thermostabilité et d’inhibition de plusieurs DfrB et DfrB-H sont comparables aux profils de la DfrB1. De plus, le criblage de dizaines de composés potentiellement inhibiteurs a été effectué afin de poursuivre la recherche d’inhibiteurs spécifiques aux DfrB. En outre, nous signalons 10 nouvelles séquences homologues de DfrB qui confèrent une résistance élevée au TMP et possèdent une activité Dfr. La caractérisation de tous les membres DfrB et les homologues nous permettra d’acquérir une meilleure connaissance de leur mécanisme de résistance, de leur prévalence dans divers environnements et de soutenir notre développement de nouveaux inhibiteurs des DfrB. / The intensive usage of antibiotics has provoked the emergence of antibiotic resistance, causing a worldwide health issue. The antibiotic trimethoprim (TMP) targets the microbial dihydrofolate reductase enzyme (FolA), abrogating the production of an essential precursor in the synthesis of purines and thus preventing bacterial proliferation. However, some bacteria produce an additional dihydrofolate reductase: the highly TMP-resistant DfrB. Currently, ten DfrB family members have been identified, that share high sequence identity (74 – 98 %). DfrB enzymes consist of identical, 78 amino acid-long SH3-like domains, that homotetramerize to form the active enzyme. DfrB share no sequence or structural homology with FolA and no antibiotic has yet been developed to circumvent the TMP resistance caused by DfrB. In order to gain insight into the SH3-like domain of DfrB, homologues (DfrB-H) sharing 10 to 80 % identity with DfrB1 were identified and characterized, which displayed dihydrofolate reductase (Dfr) activity and conferred high TMP resistance. Also, to investigate if dfrB genes are identified in various environments, a metagenomic database search was undertaken to characterize ten new DfrB1 homologue sequences. In 2012, the Pelletier group reported the first specific inhibitor of a DfrB, and several others since. Only DfrB1 has been characterized regarding its inhibition profile as well as its unusual thermostability. Here, semi-automated methods will be developed to compare the inhibition, thermostability, TMP-resistance and enzymatic activity profiles of all DfrB and DfrB homologues to those of DfrB1. To address this objective, new high-throughput activity assays as well as Minimal Inhibitory Concentration (MIC) assays were developed. Using those methods, we determined that thermostability and inhibition profiles of several DfrB and DfrB-H were comparable to those of DfrB1. Also, a screen of several dozen potential inhibitory compounds was performed, to attempt to identify further specific DfrB inhibitors. In addition, we report 10 new DfrB homologues that confer high TMP resistance and possess Dfr activity. The characterization of all DfrB members and DfrB homologues will allow us to acquire greater knowledge on their antimicrobial resistance mechanism, their prevalence in different environments and support our development of new DfrB-specific inhibitors.

Ces dernières années, l’OMS a émis un signal d’alarme à propos de l’occurrence majeure de résistance bactérienne qui constitue un problème de santé publique global. A ce titre, la recherche de nouvelles cibles enzymatiques et le développement de nouveaux antibactériens ciblant ces dernières de manière sélective constitue alors un enjeu actuel impératif. La mise en évidence d’une nouvelle enzyme de la famille des thymidylates synthases par l’équipe de Myllykallio en 2002 et son étude a permis de faire de cette dernière une cible de choix pour la conception de nouveaux antibactériens par sa présence exclusive chez des bactéries pathogènes pour l’Homme, sa non-similarité structurelle avec l’enzyme thymidylate synthase classique et son mécanisme particulier mettant en jeu un couple de cofacteurs oxydo-réducteurs(NADPH/FAD). Ce manuscrit, divisé en trois grandes parties, s’intéresse dans un premier temps à la synthèse métallo-catalysé de nouveaux analogues nucléotidiques du FAD substitué sur l’azote centrale par une chaîne acyclique de type alkényle phosphonate. Dans un second temps, le manuscrit traite de la translation de cette même chaîne latérale sur l’azote N1 couplée à un large panel de base hétéroaromatiquebicyliques ou tricycliques par deux réactions clés : une alkylation régiosélective en conditions deVorbrüggen et une étape de métathèse croisée. Enfin, la troisième partie porte sur la préparation d’acyclonucléosides comportant un motif d’intérêt de type gem-difluoromethylphosphonate connu comme étant un mime isostérique et isoélectronique du groupement phosphate. L’incorporation de ce motif a permis la synthèse de petite librairie d’ANPs inédits à visée anti-FDTS et anti-virales. / In recent years, WHO has warned against the major occurrence of bacterial resistance as a global public health problem. As such, the search for new enzymatic targets and the development of new antibacterials targeting them selectively is therefore an imperative challenge. The discovery of a new enzyme among the family of thymidylate synthases by Myllykallio’s team in 2002 and its study has made it a prime target for the design of new antibacterials by its sole presence in pathogenic bacteria, its structural dissimilarity with the classical thymidylate synthase enzyme and its singular mechanism involving a pair of oxido-reducingcofactors (NADPH / FAD).This manuscript, divided into three main parts, is initially interested in the metallocatalytic synthesis of new nucleotide analogues of FAD substituted on the central nitrogen by analkenyl phosphonate acyclic chain. In the second part, the manuscript deals with the translation of this same side chain on nitrogen N1 on a large panel of bicylic or tricyclic heteroaromatic base through two keyreactions: a regioselective alkylation under Vorbrüggen conditions and a cross metathesis step. Finally, th ethird part relates to the preparation of acyclonucleosides comprising a gem-difluoromethylphosphonatefunctional group which is known to be an isosteric and isoelectronic mimic of the phosphate group. The incorporation of this moeitie has allowed the synthesis of a small library of novel ANPs for anti-FDTS andanti-viral purposes.

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Les aminoglycosides, des dérivés aminés de saccharides, interfèrent avec le mécanisme de synthèse des protéines chez les bactéries en se fixant au site de décodage de l'ARN de transfert aminoacylé (site A) situé en 3' de l'ARN ribosomique 16S. Au cours de ce travail de thèse, les structures de trois complexes entre des fragments d'ARN incorporant le site A et les aminoglycosides paromomycine, tobramycine et généticine, ont été résolues par cristallographie aux rayons X à 2,40-2,54 Å. L'analyse des structures montre que la reconnaissance et la fixation spécifiques des aminoglycosides au site A font intervenir de nombreuses liaisons hydrogène directes et pontées par des molécules d'eau. Dans ces structures, la partie néamine commune aux aminoglycosides (cycles I et II) s'intercale dans l'hélice de manière similaire : le cycle I (non plan) forme une pseudo paire de bases avec l'adénine 1408 ; la néamine oblige les adénines 1492 et 1493 à pointer hors de l'hélice. La comparaison des structures 3D de ces trois complexes offre des explications moléculaires aux différents résultats de biochimie et de microbiologie, ainsi qu'à certains phénomènes de résistances et de toxicités. Les conformations du site A et des aminoglycosides au sein de ces complexes sont similaires à celles du site A et de la paromomycine au sein de la sous-unité ribosomique 30S. Ainsi, la stratégie développée permet une description des interactions et des modes de fonctionnement des aminoglycosides proche du contexte naturel mais plus précise, essentielle à notre connaissance du système ARN/aminoglycoside. De ces résultats découlent des lignes directrices laissant envisager sous un jour nouveau la conception d'antibiotiques moins sujets aux résistances et moins toxiques.

L'objectif de cette thèse est de développer des outils de modélisation mathématique afin d'étudier la dynamique de transmission des souches de pneumocoque dans la communauté. La dynamique d'émergence et de diffusion de bactéries résistantes dans la population est difficile à anticiper : les phénomènes se produisent à différentes échelles (bactérie, hôte et population) et les bactéries circulent dans des environnements humains complexes (nombreux antibiotiques et vaccins). Dans ce cadre, la formalisation mathématique et la simulation peuvent contribuer à mieux comprendre et anticiper les phénomènes en jeu. Trois questions principales sont posées dans ce travail. Elles portent sur : l'effet d'une modification de l'exposition antibiotique sur la distribution des résistances du pneumocoque ; les conséquences de l'usage de vaccins conjugués sur les distributions de souches ; et l'étude de la dynamique d'incidence des méningites à pneumocoque. Pour y répondre, 4 modèles mathématiques compartimentaux spécifiques sont construits. Les résultats des simulations renforcent l'idée que l'exposition antibiotique est un facteur environnemental majeur pour la sélection des pneumocoques résistants aux antibiotiques. En particulier, ils mettent en évidence l'importance du choix des molécules antibiotiques utilisées et des doses prescrites sur la distribution des résistances dans la population. Ils suggèrent de plus que les virus hivernaux, la consommation antibiotique et l'épidémicité différenciée en fonction de la résistance pourraient expliquer en partie la dynamique des méningites à pneumocoque dans la population.

Le triméthoprime (TMP) est un antibiotique communément utilisé depuis les années 60. Le TMP est un inhibiteur de la dihydrofolate réductase (DHFR) bactérienne chromosomale. Cette enzyme est responsable de la réduction du dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THF) chez les bactéries, qui lui, est essentiel à la synthèse des purines et ainsi, à la prolifération cellulaire. La résistance bactérienne au TMP est documentée depuis plus de 30 ans. Une des causes de cette résistance provient du fait que certaines souches bactériennes expriment une DHFR plasmidique, la DHFR R67. La DHFR R67 n'est pas affectée par le TMP, et peut ainsi remplacer la DHFR chromosomale lorsque celle-ci est inhibée par le TMP. À ce jour, aucun inhibiteur spécifique de la DHFR R67 est connu. En découvrant des inhibiteurs contre la DHFR R67, il serait possible de lever la résistance au TMP que la DHFR R67 confère aux bactéries. Afin de découvrir des inhibiteurs de DHFR R67, les approches de design à base de fragments et de criblage virtuel ont été choisies. L'approche de design à base de fragments a permis d'identifier sept composés simples et de faible poids moléculaire (fragments) inhibant faiblement la DHFR R67. À partir de ces fragments, des composés plus complexes et symétriques, inhibant la DHFR R67 dans l'ordre du micromolaire, ont été élaborés. Des études cinétiques ont montré que ces inhibiteurs sont compétitifs et qu'au moins deux molécules se lient simultanément dans le site actif de la DHFR R67. L'étude d'analogues des inhibiteurs micromolaires de la DHFR R67 a permis de déterminer que la présence de groupements carboxylate, benzimidazole et que la longueur des molécules influencent la puissance des inhibiteurs. Une étude par arrimage moléculaire, appuyée par les résultats in vitro, a permis d'élaborer un modèle qui suggère que les résidus Lys32, Gln67 et Ile68 seraient impliqués dans la liaison avec les inhibiteurs. Le criblage virtuel de la librairie de 80 000 composés de Maybridge avec le logiciel Moldock, et les essais d'inhibition in vitro des meilleurs candidats, a permis d'identifier quatre inhibiteurs micromolaires appartenant à des familles distinctes des composés précédemment identifiés. Un second criblage virtuel, d'une banque de 6 millions de composés, a permis d'identifier trois inhibiteurs micromolaires toujours distincts. Ces résultats offrent la base à partir de laquelle il sera possible de développer iv des composés plus efficaces et possédant des propriétés phamacologiquement acceptables dans le but de développer un antibiotique pouvant lever la résistance au TMP conféré par la DHFR R67. / Trimethoprim (TMP) is a common antibiotic which is used since the 60's. TMP is an inhibitor of the bacterial chromosomal dihydrofolate reductase (DHFR). This enzyme catalyses the reduction of the dihydrofolate (DHF) to tetrahydrofolate (THF) which is essential to the biosynthesis of purines thus to cellular proliferation. Bacterial TMP resistance is documented since about 30 years. One of the cause of this resistance comes from the fact that certain bacteria express a plasmidic DHFR, the R67 DHFR, which confers TMP resistance. The R67 DHFR is not inhibited by TMP and can replace the chromosomal DHFR when the latter is inhibited by TMP. The discovery of R67 DHFR inhibitors would allow to break the trimethoprim resistance granted by R67 DHFR. In order to discover R67 DHFR inhibitors, fragment based design and virtual screening approaches were selected. By fragment based design, seven simple compounds with a low molecular mass which inhibited weakly R67 DHFR (fragments) were identified. From these fragments, more complex and symmetrical compounds inhibiting R67 DHFR in the micromolar range were identified. Kinetic studies showed these inhibitors were competitive and at least two molecules bind simultaneously to the active site of the R67 DHFR. Test of the micromolar inhibitors analog showed that the presence of carboxylate, benzimidazole and the length of the molecule all have an effect on the potency of the inhibitors. Molecular docking of the inhibitors, supported by in vitro data, were used to develop a model which suggest that residue like Lys32, Gln67 and Ile68 would be involved in the binding of the inhibitors to the R67 DHFR. Virtual screening of the 80 000 compound Maybridge library with Moldock software, followed by in vitro test of the best candidate, identified four micromolar inhibitors which are chemically distinct from the inhibitor beforehand identified. A second virtual screening of a 6 million compounds bank identified three micromolar inhibitors which are also distinct from the inhibitor beforehand identified. vi These results offer a basis which will allow further development of more potent inhibitors with more acceptable pharmacologic properties in order to develop an antibiotic which would break the TMP resistance granted by the R67 DHFR.

La dihyrofolate réductase de type II R67 (DHFR R67) est une enzyme bactérienne encodée par un plasmide donc aisément transmissible. Elle catalyse la réaction de réduction du dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THFA) essentiel pour la prolifération cellulaire. La DHFR R67 est une enzyme qui dépend du cofacteur NADPH. La DHFR R67 est différente, structurellement et génétiquement, de l’enzyme DHFR chromosomale présente chez tous les organismes et elle est résistante au triméthoprime (TMP) qui est largement utilisé dans les traitements antibactériens chez l’Homme. Aucun inhibiteur sélectif contre la DHFR R67 n’est actuellement répertorié. Le but de cette étude a été d’identifier des molécules qui pourront inhiber la DHFR R67 sélectivement, sans affecter la DHFR humaine (DHFRh). La vérification de la qualité des essais enzymatiques en conditions déterminées pour le criblage d’inhibiteurs sur plusieurs lectrices à plaques a identifié des appareils appropriés pour l’analyse. L’étude de l’activité enzymatique de la DHFR R67 et de la DHFRh en présence des solvants organiques et liquides ioniques (LIs), comme des co-solvants pour le criblage rationnel d’inhibiteurs, a montré que certains LIs peuvent servir de milieu alternatif pour les essais enzymatiques. Le criblage rationnel basé sur l’approche du design d’un inhibiteur à partir de petites molécules, a révélé des molécules primaires qui inhibent la DHFR R67 de façon faible, mais sélective. Le test des composés biologiquement actifs qui comprennent des petits fragments, a montré l’augmentation de l’affinité entre la DHFR R67 et les composés testés. Trois composés ont été déterminés comme des inhibiteurs sélectifs prometteurs pour la DHFR R67. / Type II R-plasmid encoded dihyrofolate reductase (DHFR), R67 DHFR is a bacterial enzyme that catalyzes the reduction of dihydrofolate (DHF) to tetrahydrofolate (THFA) which is essential for cell proliferation. R67 DHFR is an enzyme that depends on the cofactor NADPH as the hydride donor. R67 DHFR is distinct, structurally and genetically, from E. coli chromosomal DHFR (DHFR Ec) and it provides drug resistance to the widely-administered antibiotic trimethoprim (TMP). No selective inhibitor against R67 DHFR exists currently. The goal of this study was to discover molecules that can selectively inhibit R67 DHFR, without affecting human DHFR (hDHFR). Verification of the quality of enzyme assays under defined conditions for inhibitor screening on plate readers found several appropriate instruments for analysis. The study of the enzymatic activity of R67 DHFR and hDHFR in the presence of organic solvents and ionic liquids (ILs), as co-solvents for rational screening of inhibitors, showed that ILs can provide alternative media for enzymatic assays. Rational screening based on the approach of fragment-based drug design, revealed primary molecules that inhibited DHFR R67 weakly, but selectively. The testing of more complex compounds with known biological activities gave ligands with increased affinity for R67 DHFR. Three compounds were identified as promising selective inhibitors for R67 DHFR.

La dihyrofolate réductase de type II R67 (DHFR R67) est une enzyme bactérienne encodée par un plasmide donc aisément transmissible. Elle catalyse la réaction de réduction du dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THFA) essentiel pour la prolifération cellulaire. La DHFR R67 est une enzyme qui dépend du cofacteur NADPH. La DHFR R67 est différente, structurellement et génétiquement, de l’enzyme DHFR chromosomale présente chez tous les organismes et elle est résistante au triméthoprime (TMP) qui est largement utilisé dans les traitements antibactériens chez l’Homme. Aucun inhibiteur sélectif contre la DHFR R67 n’est actuellement répertorié. Le but de cette étude a été d’identifier des molécules qui pourront inhiber la DHFR R67 sélectivement, sans affecter la DHFR humaine (DHFRh). La vérification de la qualité des essais enzymatiques en conditions déterminées pour le criblage d’inhibiteurs sur plusieurs lectrices à plaques a identifié des appareils appropriés pour l’analyse. L’étude de l’activité enzymatique de la DHFR R67 et de la DHFRh en présence des solvants organiques et liquides ioniques (LIs), comme des co-solvants pour le criblage rationnel d’inhibiteurs, a montré que certains LIs peuvent servir de milieu alternatif pour les essais enzymatiques. Le criblage rationnel basé sur l’approche du design d’un inhibiteur à partir de petites molécules, a révélé des molécules primaires qui inhibent la DHFR R67 de façon faible, mais sélective. Le test des composés biologiquement actifs qui comprennent des petits fragments, a montré l’augmentation de l’affinité entre la DHFR R67 et les composés testés. Trois composés ont été déterminés comme des inhibiteurs sélectifs prometteurs pour la DHFR R67. / Type II R-plasmid encoded dihyrofolate reductase (DHFR), R67 DHFR is a bacterial enzyme that catalyzes the reduction of dihydrofolate (DHF) to tetrahydrofolate (THFA) which is essential for cell proliferation. R67 DHFR is an enzyme that depends on the cofactor NADPH as the hydride donor. R67 DHFR is distinct, structurally and genetically, from E. coli chromosomal DHFR (DHFR Ec) and it provides drug resistance to the widely-administered antibiotic trimethoprim (TMP). No selective inhibitor against R67 DHFR exists currently. The goal of this study was to discover molecules that can selectively inhibit R67 DHFR, without affecting human DHFR (hDHFR). Verification of the quality of enzyme assays under defined conditions for inhibitor screening on plate readers found several appropriate instruments for analysis. The study of the enzymatic activity of R67 DHFR and hDHFR in the presence of organic solvents and ionic liquids (ILs), as co-solvents for rational screening of inhibitors, showed that ILs can provide alternative media for enzymatic assays. Rational screening based on the approach of fragment-based drug design, revealed primary molecules that inhibited DHFR R67 weakly, but selectively. The testing of more complex compounds with known biological activities gave ligands with increased affinity for R67 DHFR. Three compounds were identified as promising selective inhibitors for R67 DHFR.