Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction :Les rétrovirus infectieux des vertébrés sont regroupés en 7 genres : les Alpharétrovirus, les Bétarétrovirus, les Gammarétrovirus, les Deltarétrovirus, les Epsilonrétrovirus, les Lentivirus et les Spumavirus. Le Human T-cell Leukemia virus (HTLV), un deltarétrovirus, et l'Human Immunodeficiency Virus (HIV), un lentivirus, infectent l'homme. Des cas sporadiques d'infection par des spumavirus (virus Foamy) ont été décrits chez des personnes vivant en promiscuité avec des animaux infectés. Plusieurs éléments sont en faveur de l'existence de rétrovirus humains encore inconnus :-De nouvelles espèces de HTLV ont été découvertes récemment et de nombreux patients séroindéterminés compatibles avec la présence de nouvelles espèces de type HTLV ont été décrits. De plus la découverte d'un hypothétique nouveau rétrovirus le Xenotropic Murine Related retroVirus (XMRV) a recemment été discuté. De nombreuses pathologies humaines dites idiopathiques ont une symptomatologie très proche de maladies rétrovirales décrites chez les mammifères comme des maladies inflammatoires articulaires chroniques, des maladies inflammatoires des systèmes nerveux central et périphérique, des cytopénies, des syndromes myéloprolifératifs et des pathologies malignes. Une étiologie rétrovirale a, par exemple, été évoquée dans le syndrome de Kawasaki ou les anémies hémolytiques, mais sans avoir pu être formellement démontrée.-Le statut de super prédateur de l'homme rend la transmission inter-espèces possible.Toutes les recherches de nouveaux rétrovirus humains faites par le passé étaient basées sur des séquences communes à tous les rétrovirus, le gène de la polymérase ou la partie transmembranaire de la glycoprotéine d'enveloppe (Env). De ce fait, ces recherches ont été le plus souvent « parasitées » par les séquences endogènes rétrovirales ou des rétrovirus « contaminants ». Nous avons souhaité rechercher la présence de rétrovirus dans ces pathologies pédiatriques. Parallèlement, nous nous sommes intéressés aux (retro)virus pouvant se transmettre de la mère à l'enfant lors de l'allaitement. Méthode :Nous avons utilisé 2 méthodes pour rechercher des rétrovirus.1) PCR : Notre démarche cible paradoxalement la région la plus variable du génome des rétrovirus, Env, au niveau du RBD (pour Receptor-Binding Domain), domaine qui lie le récepteur d'entrée dans la cellule. Pour cela nous utilisons une méthode développée au laboratoire, basée sur des PCR dont les amorces sont constituées de courts motifs conservés, délimitant les domaines variables du RBD. Cette approche a déjà permis au laboratoire de mettre en évidence de nouveaux variants des PTLV (HTLV/STLV). Sur ce principe, nous avons ainsi conçu des amorces PCR pour la détection de RBD de deltarétrovirus bovin (Bovine Leukemia Virus) et infectant les primates (Prima T-Leukemia/Lymphoma Virus) ; de bêta rétrovirus infectant la souris (Mouse Mammary Tumor Virus) et des primates (Mason Pfizer Monkey Virus) et de gammaretrovirus infectant les félins/félidés (Feline Leukemia Virus), l'XMRV et un rétrovirus endogène porcin le PERV.2) mesure de l'activité reverse transcriptase de rétrovirus de type C au sein de liquides biologiques de patients malades. Résultats : Nous avons analysé en terme de patients 35 purpura thrombopénique immunologiques, 3 anémie hémolytique, 6 anémie arégénérative, 5 neutropénie, 1 aplasie médullaire idiopathique, 3 thrombocytose, 59 arthrite juvénile, 1 dermatomyosite, 9 purpura rhumatoïde, 4 syndrome de Kawasaki, 5 syndrome neurologique, 13 fièvre atypique, 3 leucose et 5 pathologies autres. Les recherches de rétrovirus par PCR et mesure d'activité reverse transcriptase se sont avérées négatives.Conclusion :Nous n'avons pas retrouvé de séquences rétrovirales au sein des échantillons analysés par ces deux techniques différentes. Cependant, ces résultats n'excluent pas l'hypothèse d'une étiologie rétrovirale. / The infectious mammalian retrovirus constituting seven species: Alpharetroviruses, betaretroviruses, gammaretroviruses, deltaretrovirus, epsilonretroviruses, lentiviruses and, spumaviruses. Human T-cell Leukemia virus (HTLV), a deltaretrovirus, and Human Immunodeficiency Virus (HIV), a lentivirus, infect human. Sporadic cases of spumavirus (virus Foamy) infection have been described in persons living in promiscuity with infected animals. Recent Studies have shown the presence of an hypothetic gammaretrovirus, xenotropic murine leukemia related virus (XMRV), its existence is actually discussed.There are some facts pointing to the existence of human retrovirus not yet known. -New HTLV species have been recently described and a number of sero-indeterminate patients are compatible with the presence of new HTLV species.-Many idiopathic human diseases have clinical presentation close to retroviral mammalian diseases: chronic inflammatory articular diseases, central nervous system inflammatory diseases, cytopenia, myeloproliferative syndromes and malignant pathologies. For example a retroviral aetiology have been discussed in Kawasaki syndrome and autoimmune haemolytic anemia even though a complete proof haven't been found. The super human predatory status makes the interspecies transmission possible. All the research in new human retrovirus done in the past was based in common sequencies of retroviruses like polymerase gene or the transmenbranair part of glycoprotein envelope gene (Env). Thus most of these researches have been compromise by HERV sequences or retroviral contaminants.We research retroviruses in these diseases. We also have been interested by putative (retr)viral itransmission by breast milk.Methodology1)PDR: We design primer based on the most variable region of retroviruses, the RBD (Receptor-Binding Domain), which is the domain of Env that links the cellular receptor responsible of the cellular entry. For this we used a patented method developed in our laboratory based on PCR whose primers are composed of short conservative sequences delimiting variable areas of RBD.This approach has already allowed discovering new PTLV (HTLV/STLV) variants known. As a result, we have designed PCR primers for RBD for all the known deltaretrovirus, Bovine Leukaemia Virus, (BLV) and also for the detection of gammaretrovirus feline leukaemia virus (FeLV), XMRV and Porcine Endogenous Retrovirus (PERV).2)We measure the reverse transcriptase activity to detect Type C retrovirus in body fluid.Results:We analysed in terms of patients 35 Immunologic thrombopenic purpura, 3 hemolytic anemia, 6 aregenerative anemia, 5 neutropenia, 1 aplastic anemia, 3 thrombocytosis, 59 Idiopathic juvenile arthritis, 1 dermatomyositis, 9 Henoch-Scholein diseases, 4 Kawasaki syndrome, 5 neurological diseases, 13 atypic fevers, 3 leukosis and 5 others diseases. We do not found any virus by both methodologies.We do not find viruses by PCR and reverse transcrptase activity measurment however this fact does not exclude viral etiology, further analysis could be done.

Le cancer est l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde avec environ 14 millions de nouveaux cas et 8,2 millions de décès liés aux cancers selon l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé). Le cancer du poumon est le premier cancer diagnostiqué chez l'homme et compte pour 20% du nombre de mort par cancer par an dans le monde. Parmi les cancers pulmonaires, on distingue les cancers à petites cellules et les cancers non à petites cellules. Ce travail a porté sur l'étude des adénocarcinomes pulmonaires lépidiques, un type de cancer non à petites cellules, chez l'homme et l'animal. Chez l'homme, il fait partie des tumeurs pulmonaires rares, pas ou peu lié au tabagisme. Il est similaire cliniquement, radiologiquement et histologiquement à l'adénocarcinome pulmonaire ovin, un cancer du poumon induit par le β-rétrovirus JSRV (Jaagsiekte Sheep RetroVirus) affectant les petits ruminants domestiques. JSRV transforme les cellules épithéliales du parenchyme via son enveloppe oncogénique. Ces tumeurs humaines et animales ne sont pas associées au développement de métastases extra-thoraciques ou pleurales. Le but de notre travail a été d'étudier les évènements moléculaires spécifiques des adénocarcinomes lépidiques humains et animaux par i. l'analyse transcriptomique de l'expression des gènes dans ces deux cancers, ii. la caractérisation de l'adénocarcinome pulmonaire ovin par l'expression des mucines et iii. l'étude d'un rôle putatif des séquences rétrovirales endogènes dans l'induction de l'adénocarcinome lépidique humain. Premièrement, notre étude a porté sur l'analyse en parallèle des mécanismes moléculaires spécifiques des adénocarcinomes lépidiques prédominants par l'analyse des profils d'expression des gènes impliqués dans les voies de signalisation BMI1, NOTCH, Hedgehog et WNT importantes dans le développement du poumon normal et au cours des cancers pulmonaires et dans la voie de l'angiogenèse, permettant la dissémination des cellules tumorales. L'augmentation de l'expression de CDH1 (E-cadherin), acteur crucial de la voie BMI1, et la diminution de l'expression des ligands et récepteurs activateurs de l'angiogenèse VEGF/VEGFR (Vascular Growth Factor), PDGF/PDGFR (Platelet-derived Growth Factor) et ANGPT/TIE (Angiopoietin/Tyrosine kinase with immunoglobulin like and EGF like domains) ont été observées dans ces deux cancers. Lors de l'analyse de l'expression des ARNm et des protéines, nous avons mis en évidence le blocage de la voie principale de l'angiogenèse dans les cancers lépidiques. En effet, l'absence d'expression du ligand VEGFA (Vascular Endothelial Growth Factor A) et de son récepteur VEGFR2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2) a été observée. Ce blocage n'était pas compensé par la surexpression de gènes impliqués dans les voies alternatives d'angiogenèse. Le blocage de la voie de l'angiogenèse explique l'absence de métastases extrathoraciques dans les adénocarcinomes lépidiques chez l'homme et l'animal. Deuxièmement, les adénocarcinomes pulmonaires lépidiques chez l'homme sont subdivisés en deux entités majoritaires : les adénocarcinomes lépidiques prédominants non mucineux et les adénocarcinomes mucineux invasifs. Dans le contexte des analogies entre ces cancers humains et l'adénocarcinome induit par le virus JSRV, nous avons analysé l'expression des mucines dans les cancers animaux. Nous avons montré que sur 37 cancers pulmonaires induits par JSRV, 62% étaient non mucineux, qu'ils sur exprimaient MUC1 (mucin 1, cell surface associated) et que 50% exprimaient MUC5B (mucin 5B, oligomeric mucus/gel-forming). Par ces résultats, nous avons montré que les adénocarcinomes pulmonaires ovins se rapprochaient principalement des adénocarcinomes lépidiques prédominants / Cancer is the main cause of morbidity and mortality worldwide with 14 million new cases and approximately 8.2 million deaths according to the WHO (World Health Organization). Lung cancer is the most diagnosed cancer in men and account for 20% of cancer death in the world annually. Among lung cancers, there are small cell lung cancers and non-small cell lung cancers. My work focused on the lepidic adenocarcinoma, a subtype of nonsmall cell lung cancer, in humans and animals. In humans, it is a rare lung cancer and it is not or rarely linked to tobacco smoking. Lepidic adenocarcinomas share striking clinical, radiological and histopathological similarities with ovine pulmonary adenocarcinomas induced by the β-retrovirus JSRV (Jaagsiekte Sheep RetroVirus) affecting sheep and goats. JSRV transforms epithelial cells of the distal lung through its oncogenic envelope. These human and animal tumors are not associated with pleural or extra thoracic metastases. My work was to study specific molecular events in human and animal lepidic adenocarcinomas by i. a transcriptomic analysis of the gene expression in these two lung cancers, ii. ovine pulmonary adenocarcinoma characterization by mucin expression and iii. the study of a potential role for endogenous retroviral sequences in the induction of human lepidic adenocarcinomas. First, my work focused on the parallel analysis of expression patterns in genes implicated in BMI1, NOTCH, Hedgehog and WNT pathways important for lung development and for lung cancer development and the angiogenesis pathway whose activation leads to cancer cell dissemination. CDH1 (E-cadherin) up regulation and the down regulation of main angiogenic ligand and receptors VEGF/VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor), PDGF/PDGFR (Platelet-derived Growth Factor) and ANGPT/TIE (Angiopoietin/Tyrosine kinase with immunoglobulin like and EGF like domains) were observed. Then, when analyzing lepidic adenocarcinomas mRNA and protein expression, we highlighted the blockade of the main angiogenesis pathway. Indeed, the VEGFA ligand and its receptor VEGFR2 were absent in lepidic adenocarcinomas. Moreover, this blockade was not compensated with angiogenic alternative pathways. These results correlate with the absence of extra thoracic metastases in human and animal lepidic adenocarcinomas. Secondly, human lepidic predominant adenocarcinomas are divided in two groups, non-mucinous lepidic adenocarcinomas and invasive mucinous adenocarcinomas. To characterize ovine pulmonary adenocarcinomas and determine to which one of these two human lepidic adenocarcinomas they are close to, we analyzed mucine expression in animal lung cancer. On 37 JSRV-induced lung cancer, 62% were nonmucinous, 100% expressed MUC1 (mucin 1, cell surface associated) and 50% expressed MUC5B (mucin 5B, oligomeric mucus/gel-forming). These results highlighted that ovine pulmonary adenocarcinomas are closer to non-mucinous lepidic adenocarcinomas

Les rétrovirus sont des virus à ARN, enveloppés présents dans de nombreuses espèces animales de rente, chez les animaux de compagnie et chez l'homme. Une des particularités des rétrovirus concerne l'intégration du génome viral au sein du génome de la cellule infectée; cette intégration est réalisée par une enzyme virale, l'intégrase. Le projet de cette thèse vise à mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme notamment en identifiant des facteurs cellulaires interagissant avec celle-ci, facteurs qui pourraient être des agents favorisant le processus intégratif ou, au contraire, des agents restrictifs. Les intégrases de deux modèles de rétrovirus ont été utilisées dans cette étude : L'intégrase de RAV1, un rétrovirus exogène aviaire du genre des alpharétrovirus appartenant au sous-groupe A de la famille des ASLV. Cette enzyme virale est largement étudiée soit au niveau structural ou fonctionnel, mais les données concernant ses partenaires cellulaires sont rares et insuffisantes. La seconde intégrase est celle du PERV A/C, un rétrovirus endogène porcin du genre gammarétrovirus. Aucune information sur cette enzyme n'a été décrite jusqu'à présent. Ces deux enzymes, en fusion avec une étiquette 6xHistidine, ont été donc produites en bactérie, et en cellules d'insecte puis purifiées sur colonne d'affinité en FPLC. Leurs activités catalytiques ont été testées in vitro. Ces tests permettent de valoriser la capacité de l'intégrase à exercer principalement les 2 fonctions dont elle est responsable in vivo, le clivage en 3' et le transfert de brins, et une activité qu'elle exerce exclusivement in vitro, la désintégration. Les protéines pures et actives ont ensuite servies à la vérification de leur interaction avec une protéine cellulaire, Brd2. La technique 'Far western blot' a ainsi permis de valider l'interaction entre l'intégrase de PERV et la protéine cellulaire, puis d'identifier les domaines de l'intégrase et de Brd2 impliqués dans cette interaction. A terme, l'identification de ce facteur cellulaire et la validation de son rôle dans le processus intégratif permettront de mieux comprendre ce processus particulier développé par les rétrovirus et pourront conduire au développement d'inhibiteurs dirigés contre cette interaction

La domestication des bétails représente une étape importante dans l'histoire de l'humanité. Le mouton était l'un des premiers animaux à être domestiqués dans le croissant fertile. Ces événements de domestication, probablement initiés au début du Néolithique, ont génétiquement construit les races contemporaines du Moyen-Orient mais aussi du monde entier. L'élevage de moutons, principalement mouton de la race Awassi, représente une activité économique essentielle du Liban ; cependant, jusqu'à présent, il n'existe que très peu de données génétiques sur cette race. De nos jours, les outils moléculaires disponibles nous permettent de définir en détail la diversité génétique des populations de moutons et de retracer leur histoire évolutive. Par conséquent, l'objectif principal de mon projet de thèse était de caractériser génétiquement la race Awassi du Liban. Pour cette étude, 277 échantillons d'ADN génomique prélevés des moutons Awassi du Liban (n = 254) et de la Syrie (n = 23) ont été analysés. Au début, nous avons utilisé cinq rétrovirus endogènes (rétrovirus endogène de moutons de Jaagsiekte-enJSRV) qui sont polymorphiques par insertion dans les génomes du mouton domestique (enJSRV-18, -7, -15, -16 et -22) et ont été précédemment considérés comme très informatifs principalement pour distinguer génétiquement les moutons primitifs des races plus modernes (c.-à-d. le dernier issu de l'épisode migratoire impliquant des moutons avec des traits de production améliorés). En utilisant cette approche, nos résultats montrent une prédominance du type R2 (enjSRV-18 seulement) confirmant que le mouton Awassi du Liban est une race moderne. Comme prévu, le rétrotype R4 (à la fois enJSRV-18 et enJSRV-7), une caractéristique commune des populations de moutons du bassin méditerranéen, se trouve également dans le génome des moutons d'Awassi du Liban et plus accentué dans les troupeaux Syriens. Il est intéressant de noter que les populations de moutons d'Awassi situés dans le nord-est du Liban et ayant ainsi un accès plus restreint à la mer Méditerranée que les autres populations (c'est-à-dire en raison de la chaîne de montagne centrale qui coupe le pays sur deux), présentent une faible fréquence de R4. Bien que l'origine des animaux utilisés pour établir les troupeaux analysés au cours de cette étude soit inconnue, nos résultats fournissent également certaines preuves que le mode d'élevage (ouvert ou fermé) peut influencer les rétrotypes observés et en particulier le R4. De manière surprenante, au cours de cette étude, nous avons également dévoilé la présence de soi-disant "Solo-LTR" (c'est-à-dire généré par une recombinaison homologue) pour un autre enJSRV (enJSRV-6) qui prédomine dans deux troupeaux d'une région particulière du Liban (Nabatieh). Et comme approche complémentaire, deux marqueurs mitochondriaux ont été utilisés, le cytochrome b (Cyt-b) et D-Loop, pour étudier l'origine maternelle de cette race et sa relation phylogénétique au sein de la famille Ovis aries. Dans notre étude, le Cyt-b se révèle plus discriminant que le D-Loop. Des mouton d'Awassi analysé, quatre haplogroupes (HPG) du Moyen-Orient ont été trouvés avec l'analyse du Cyt-b : HPG A, B, C et E, ce dernier étant peu fréquent. De même, l’analyse de la super-séquence, alignement Cyt-b_D-Loop, a permis l’identification de l’HPG D, un HPG extrêmement rare et limité jusqu’à présent aux moutons à queue grasse tel que l’Awassi. Enfin, une expansion passée de la population est observée pour les HPG A, B et C (mais pas pour HPG E) avec les distributions incompatibles et des tests de neutralité négatifs significatifs. Dans l'ensemble, les résultats obtenus au cours de cette étude fournissent une caractérisation génétique complète ainsi que quelques idées sur la structure phylogéographique des populations de moutons de la race Awassi au Liban. / Livestock domestication represents a milestone in the history of mankind. Sheep was one of the first animals to be domesticated in the Fertile Crescent. These domestication events, probably initiated in the early Neolithic, have genetically built the contemporary races of the Middle East but also of the whole world. Sheep farming, mainly sheep of Awassi breed, represents an essential economic activity of Lebanon; however, so far, only very few genetic data exist on this breed. Nowadays, the molecular tools available allow us to define in details the genetic diversity of sheep populations and to trace their evolutionary history. Hence, the main objective of my PhD project was to genetically characterize the Awassi breed of Lebanon. For this study, 277 genomic DNA samples collected from Awassi sheep of Lebanon (n=254) and Syria (n=23) were analyzed. Initially, we used five endogenous retroviruses (endogenous Jaagsiekte sheep retrovirus-enJSRV) that are insertionally polymorphic within the genomes of domestic sheep (enJSRV-18, -7, -15, -16 and -22) and have been previously shown to be very informative mainly to genetically distinguish between primitive sheep from more modern breeds (i.e. the latter originating from the migratory episode involving sheep with improved production traits). Using this approach, our results show a predominance of the R2 retrotype (enJSRV-18 only) confirming that the Awassi sheep of Lebanon is a modern breed. As expected, the R4 retrotype (both enJSRV-18 and enJSRV-7), a common feature of the sheep populations present within the Mediterranean area, is also found in the Awassi sheep of Lebanon and to more extend in those of Syria. Interesting, the populations of Awassi sheep located in the northeast of Lebanon and thus having a more restricted access to the Mediterranean Sea than the other populations (i.e. due to the central mountain chain cutting the country in two) present R4 weaklier. Even though the origin of the animals used to establish the herds analyzed during this study is unknown, our results also provide some evidences that the mode of rearing (open or closed) may influence the observed retrotypes and in particular R4. Surprisingly, during this study, we also unveiled the presence of so-called “Solo-LTR” (i.e. generated by homologous recombination) for another enJSRV (enJSRV-6) that are predominant in two herds of a particular region of Lebanon (Nabatieh). As a complementary approach, two mitochondrial markers were used, the cytochrome b (Cyt-b) and D-Loop, to investigate the maternal origin of this breed and its phylogenetic relationship within the Ovis aries family. In our study, the Cyt-b turns out to be more discriminative than the D-Loop. From the Awassi sheep analyzed, four haplogroups (HPGs) of the Middle-East were found with Cyt-b analysis: HPG A, B, C and E, the latter being the least frequent. Also, the super-sequence analysis, Cyt-b_D-Loop alignment, allowed the identification of HPG D, an extremely rare HPG, limited till now to fat-tailed sheep such as Awassi. Finally, a past population expansion is observed for the HPG A, B and C (but not for HPG E) with mismatch distributions and significant negative neutrality tests. Overall, the results obtained during this study provide a comprehensive genetic characterization as well as some insights into the phylogeographic structure of the sheep populations of the Awassi breed in Lebanon.

L'intégrase (IN) du VIH-1 est une enzyme qui catalyse l'intégration du génome du virus dans celui de la cellule infectée. Cette étape d'intégration est cruciale pour le virus pour qu'il puisse se répliquer de manière efficace, l'intégration est donc une cible de choix dans les thérapies antivirales. Comprendre les mécanismes qui participent à l'intégration est donc nécessaire afin de développer des solutions efficaces pour contrecarrer le virus.L’intégration rétrovirale est catalysée par une structure oligomérique d’IN et d’ADN viral bien particulière appelée intasome. Les intasomes rétroviraux catalysent l’intégration préférentiellement sur des nucléosomes, composés d’ADN enroulé de protéines histones, plutôt que sur de l’ADN nu. Ceci est en parti du aux contraintes physiques imposés par la structure de l’intasome, mais également grâce à des facteurs de ciblage cellulaires qui vont interagir avec à la fois l’intasome et des composants du nucléosome.Dans ce projet de thèse, nous avons pu mettre en évidence une nouvelle interaction hôte-pathogène entre l’IN du VIH-1 et la queue d’histone H4 (une des protéines constituant le nucléosome). Ce projet s’est ainsi focalisé autour de cette interaction et a permis de :• Démontrer l’importance de l’interaction entre l’IN du VIH-1 et la queue d’histone H4 lors du cycle viral et plus précisément pour l’étape d’intégration, validant ainsi cette interaction comme une nouvelle interaction hôte-pathogène.• D’identifier que la queue d’histone H4 est un partenaire essentiel de l’intasome du VIH-1 pour qu’il puisse s’ancrer sur le nucléosome.• Développer une nouvelle stratégie antivirale visant à bloquer cette interaction dans les cellules infectées grâce à des composés chimiques. / HIV-1 integrase (IN) catalyzes the insertion of the viral genome into the host cell chromatin. This step is crucial for the virus for its efficient replication, integration is thus of interest to target for antiviral strategies. Understanding the mechanisms involved in integration is important in order to develop efficient tools to fight the virus.Retroviral integration is catalyzed by the intasome, an oligomer of IN and viral DNA. Intasomes integrate onto nucleosomes, composed of DNA wrapped around histone proteins, over naked DNA.In this thesis project, we have identified a new host-pathogen interaction between HIV-1 IN and the H4 histone tail. The topic of the project was then focus on this interaction and has highlighted:• The importance of the HIV-1 IN – H4 histone tail interaction for the viral cycle, especially onto the integration step, validating a new host-pathogen interaction.• The identification of the H4 histone tail as an essential partner for HIV-1 intasome for its anchoring onto nucleosomes.• The development of a novel antiviral strategy aiming to block this interaction in infected cells using chemical compounds

Les rétrovirus murins peuvent causer une grande incidence de leucémies par le processus de mutagenèse insertionelle. L'intégration d'un rétrovirus au niveau du même locus dans plus d'une tumeur définit un site commun d'intégration (CIS). L'identification des nouveaux sites communs d'intégration rétrovirale s'avère un outil important pour identifier de nouveaux gènes pouvant être impliqués dans l'apparition primaire du cancer chez l'être humain. Nous avons adapté une nouvelle technique pour isoler rapidement des sites d'intégration rétrovirale. Cette technique, appelée PCR-splinkerette, permet de mettre en évidence un grand nombre de ces sites et de trouver des nouveaux gènes impliqués dans les leucémies murines causées par le rétrovirus Graffi 1.4. En utilisant cette méthode, il nous a été possible de situer plusieurs intégrations du rétrovirus dans le génome de la souris et de repérer les gènes à proximité de l'intégration, à l'aide de banques de données (ENSEMBL). Nous avons cloné et analysé les séquences de 63 sites d'intégration rétrovirale (RISs) à partir de 12 tumeurs composées par des lymphomes de cellules T, B, myéloïdes, érythrocytaires et mégacaryocytaires, induits par Graffi 1.4. Les gènes Notch1, Ras Grp1, Myc, Ptpn6, Gse1, Lmo2 et Evi1 et Prdm16 dont le rôle est déjà connu dans le cancer, ont été trouvés à proximité de ces sites. Trois régions susceptibles de posséder plus d'une intégration dans le même locus, ont été identifiées sur les chromosomes 17D, 14B, 4E1. Plusieurs gènes trouvés autour de ces régions n'ont pas été rapportés comme étant des oncogènes connus. Une analyse plus profonde de ces sites et des gènes dont l'expression est modifiée dans ces tumeurs permettrait de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du cancer. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Rétrovirus, Rétrovirus Graffi 1.4, Leucémie, Mutagenèse insertionelle, Réaction en chaîne de la polymérase, Splinkerette, Oncogènes, Gènes suppresseurs de tumeurs.

Une grande partie du génome des eucaryotes est constituée d'éléments transposables(ET). Ces séquences d'ADN répétées ont la capacité de se déplacer d'un site chromosomiqueà un autre et de multiplier le nombre de leurs copies, pouvant ainsi être la cause d'uneinstabilité génétique. Face à ce potentiel de mutagénèse, un certain nombre de systèmes ontété sélectionnés dans les génomes eucaryotes qui conduisent à une réduction de l'activité desET. Notamment, chez la drosophile, on a récemment mis en évidence des mécanismes derégulation impliquant les modifications d'histones, et une nouvelle classe de petits ARN,appelés piARN, qui contrôlent spécifiquement les éléments transposables dans les tissusreproducteurs.tirant est un rétrotransposon à LTR de la drosophile, de type Gypsy, isolé au sein dulaboratoire dans les populations naturelles de D. simulans, où le nombre de ses copies estvariable entre populations. Cet ET possède la même structure génomique que les rétrovirus.Dans la première partie de cette thèse, j'ai caractérisé un élément tirant actif dans lespopulations naturelles de D. simulans. Je me suis intéressé en particulier au gène de laprotéine d'enveloppe (env), qui confère le caractère infectieux du rétrovirus. La comparaisondes transcrits et de la protéine du gène env entre populations de D. simulans a montré quetirant est actif dans une population, et cette activation est associée à sa mobilisation, alors quedans les autres populations tirant est présent, mais régulé.Dans la deuxième partie de mon travail, je me suis intéressé à l'étude de l'influence detirant sur la structure de la chromatine au niveau de son site d'insertion et à son influence surl'expression des gènes voisins. J'ai étudié trois modifications d'histones dans troispopulations naturelles, dont une où tirant est inséré dans un intron du gène tkv. Les résultatsobtenus montrent que tirant est capable de modifier la structure de la chromatine au niveau deson site d'insertion, mais aussi en amont, par l'hétérochromatinisation d'un promoteur du gènetkv, en affectant ainsi son taux de transcription.Enfin, je me suis intéressé à la régulation post-transcriptionnelle de tirant par lespiARN. Par l'analyse de croisements intraspécifiques entre des souches contenant ou non descopies de tirant dans l'euchromatine, j'ai montré qu'une régulation post-transcriptionnelle parles piARN germinaux qui contrôle tirant dans les cellules folliculaires de l'ovaire. J'ai aussipu montrer une expression variable entre populations des gènes de la voie piARN.

Le rétrovirus HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus type 1) est l'agent responsable de la leucémie T de l'adulte (ATL) et de la paraparésie spastique tropicale (TSP/HAM). Le HTLV est présent de manière endémique au Japon, en Afrique centrale, en Océanie, en Amérique du sud et aux Caraïbes. Chez les patients, le HTLV est détecté principalement dans les lymphocytes T CD4+. Le récepteur du HTLV est présent chez tous les vertébrés, et toutes les lignées cellulaires de vertébrés semblent l'exprimer in vitro. L'organisation de la glycoprotéine d'enveloppe (Env) du HTLV est similaire à celle des MLV (Murine Leukemia Virus), avec un domaine de liaison au récepteur situé dans la partie N-terminale.<br />Au cours de cette thèse, nous avons dérivés des produits tronqués de l'Env, sur la base de cette organisation, nous permettant de mesurer l'expression de surface du récepteur HTLV. Nous avons ainsi pu mettre en évidence que le récepteur HTLV n'est pas détectable à la surface des lymphocytes T CD4+, mais que son expression est induite par l'activation lymphocytaire. Nous avons également montré qu'un traitement à l'IL-7 des lymphocytes T de sang de cordon, qui provoque la prolifération, induit l'expression du récepteur HTLV. Ces observations nous ont permis de conclure que le récepteur HTLV est un marqueur d'activation des lymphocytes associé à l'état prolifératif.<br />Par la suite, nous avons montré que l'expression de l'Env HTLV induit un blocage de la production de lactate. Nous avons pu établir que ce blocage est dû à l'inhibition par l'Env HTLV du transport de glucose dans la cellule, induisant un blocage de la glycolyse. Ces observations nous ont conduit à évaluer si le principal transporteur du glucose GLUT1 pouvait être un récepteur pour le virus HTLV. Effectivement, nous avons pu démontrer que GLUT1 permet à la fois la liaison à l'Env HTLV et l'entrée de particules virales.<br />Afin de comprendre cette interaction, nous avons construit des molécules chimériques entre GLUT1 et GLUT3. Nous avons ainsi observé que 7 acides aminés de la 6ème boucle extracellulaire de GLUT1 confèrent l'activité de liaison à l'Env. Cependant cette propriété n'est pas suffisante pour permettre l'entrée virale, et la présence concomitante de la 1ère, la 5ème et la 6ème boucle extracellulaire est requise pour permettre l'entrée virale, suggérant l'existence d'une nouvelle activité associée à la notion de récepteur rétroviral.<br />L'ensemble de ces données nous a enfin conduit à proposer de nouveaux modèles de pathogenèse. La prise en compte de l'inhibition de l'activité de transport de GLUT1 par l'Env autorise en effet de nouvelles hypothèses pour expliquer l'émergence de clones leucémiques et la démyélinisation associée à la TSP/HAM.

L'Organisation Mondiale de la Santé estime que le VIH-1 est porté par 40 millions de personnes à travers le monde, et qu'il a causé 3,1 millions de décès et 4,9 millions de nouvelles infections au cours de l'année 2004. Les traitements actuels ciblent principalement la rétrotranscriptase du VIH-1 (RT), qui catalyse le passage de l'ARN viral génomique en ADN double brin, substrat de l'intégrase virale (IN). Les antiviraux dirigés contre la RT et utilisés en thérapie sont soit des terminateurs de chaîne analogues de nucléosides (NRTIs), soit des inhibiteurs non-nucléosidiques (NNRTIs) qui se fixent au niveau d'une poche hydrophobe, à proximité du site de fixation des nucléotides. <br />Dans le cadre du développement de nouveaux inhibiteurs de la RT, nous nous sommes intéressés aux 3,7-dihydroxytropolones (3,7-DHT), qui inhibent l'inositol monophosphatase humaine par chélation de deux ions Mg2+ catalytiques distants de 3,7Å. Or les sites catalytiques polymérase et RNase H de la RT contiennent respectivement deux ions Mg2+ distants de 3,57 et 4Å. En outre, l'IN du VIH-1 possède une plate-forme catalytique proche de celle du site RNase H. Nous avons ainsi entrepris d'étudier l'effet des 3,7-DHT sur les activités de la RT et de l'IN du VIH-1. <br />Nous avons observé une inhibition spécifique de l'une ou l'autre activité de la RT par certaines 3,7-DHT. Des études enzymatiques ont ensuite montré que l'inhibition de l'activité ADN polymérase est non-compétitive vis-à-vis des nucléotides, à l'instar des NNRTIs. Néanmoins, l'étude de RT résistante ou dépourvue du site de fixation des NNRTIs permet d'exclure un mode d'action identique à cette classe d'inhibiteurs. Des expériences de gel-filtration, permettant de suivre l'état d'oligomérisation de la forme active de la RT, hétérodimérique, montrent que les 3,7-DHT ne sont pas capables de la dissocier. L'inhibition des activités de la RT par liaison des 3,7-DHT aux acides nucléiques a été écartée, entre autres, par des expériences de fluorescence. Enfin nous avons montré que les 3,7-DHT n'inhibent pas la polymérisation lors de l'étape de translocation. <br />En revanche, une forte baisse de l'inhibition de la synthèse d'ADN a été mise en évidence lorsque la concentration en Mg2+ diminue, ce qui suggère que les 3,7-DHT ne lient le site actif polymérase qu'en présence des ions Mg2+. L'implication des cations catalytiques dans les mécanismes d'inhibition par les 3,7-DHT a également été étayée par l'observation d'une inhibition des activités de « processing » et de transfert de l'IN, dépendante du cation utilisé.<br />Malheureusement, des cultures cellulaires en présence de 3,7-DHT ont révélé une cytotoxicité importante. Ce résultat était partiellement prévisible, compte tenu de l'existence de nombreuses enzymes bimétalliques cellulaires et de l'utilisation de 3,7-DHT de première génération. Dans l'objectif d'améliorer ces composés, sur la base de leur relation structure/activité, nous avions également pour projet d'obtenir la structure cristallographique d'un complexe ternaire RT/(matrice/amorce)/dNTP, en présence d'une 3,7-DHT. Des cristaux de différents complexes ont été obtenus, mais n'ont pas permis d'obtenir de clichés de diffraction aux rayons X et restent par conséquent à améliorer. <br />Nous avons également étudié l'influence de la concentration en Mg2+ libre sur les activités catalytiques de la RT du VIH-1.<br />En résumé, les résultats obtenus au cours de mon travail de thèse permettent d'élaborer les prémices d'une stratégie de conception « rationalisée » d'inhibiteurs de la RT et de l'IN, dans l'objectif d'obtenir des composés plus spécifiques et plus affins de l'un ou l'autre site catalytique.