Com o advento dos estudos moleculares evolutivos baseados nas sequências dos genes de RNAr 16S em cianobactérias, a taxonomia de Anabaena (Cyanobacteria) tem sido amplamente discutida e uma revisão deste gênero faz-se necessária. Os problemas variam desde o nível genérico, tal como o grupo Anabaena Aphanizomenon, até níveis de diferenciação de linhagens (morfoespécies). Estudos moleculares de linhagens de Anabaena isoladas de ecossistemas brasileiros são inexistentes. A fim de se explorar a diversidade, filogenia e diversificação evolutiva de Anabaena isoladas de ambientes brasileiros, estudos fenotípicos e genotípicos foram realizados no presente estudo. Um total de 43 isolados foram obtidos de corpos d´água do Estado de São Paulo (Reservatórios Billings, Santo Grande, Rio Piracicaba e Lago da ESALQ/USP (Engenharia) e do Estado do Ceará (Lagoa do Povoado Nova Aurora e Rio Camarão). As espécies de Anabaena isoladas foram identificadas como A. aphanizomenoides Forti, A. circinalis Rabenhorst ex Bornet et Flahault, A. crassa (Lemmermann) Komárková-Legnerová et Cronberg, A. cf. fallax Komárek et Komárková-Legnerová e A. planctonica Brunnthaler. Os meios de cultura usados no isolamento das cianobactérias foram AA/4, ASM-1 e BGN, este último também nas variantes com 50% de NaNO3 (BG50) e sem nitrato (BGS), com ou sem adição de vitamina B12. O meio ASM-1 não promoveu o crescimento de Anabaena. As espécies A. circinalis e A. crassa não cresceram no meio de culturaBGN com 17,65 mM de NaNO3, apresentando crescimento no meio BG50. A adição de vitamina B12 favoreceu o crescimento de A. circinalis. Os caracteres morfológicos analisados para 23 isolados foram o comprimento (compr) e diâmetro (diam) da célula vegetativa (V), heterócito (HT), acineto (AC), espira (ES), razões (R) comprimento/diâmetro para V, HT e AC e razão diâmetro/comprimento para ES (RES). O diâmetro da bainha (diamBA) foi também avaliado. As análises de componentes principais (ACP) confirmaram que a espira é uma característica importante para separar as morfoespécies A. circinalis, A.crassa e A. cf. fallax. RV e RHT foram diacríticos para diferenciação de A. cf. fallax. O comprimento do acineto (comprAC) foi importante para diferenciar A. aphanizomenoides de A. planctonica. A bainha diferenciou A. crassa das outras morfoespécies. As análises filogenéticas para o RNAr 16S mostraram os isolados brasileiros de A. circinalis, A. crassa, A. planctonica, A. aphanizomenoides e A. cf. fallax em agrupamentos separados, confirmando os resultados dos caracteres morfológicos. Com exceção da A. planctonica, as sequências de RNAr 16S dos isolados brasileiros não agruparam com linhagens relativas provenientes de outros países, indicando que elas são únicas. As análises filogenéticas dos genes RNAr 16S, rpoC1, rbcL, tufA concatenados corroboraram os resultados de filogenia do gene de RNAr 16S e as identificações morfológicas. A tentativa de obtenção de padrões moleculares para as espécies de Anabaena isoladas do Brasil foi feita utilizando a técnica de PCR-DGGE. Os fragmentos da região 359-781 do RNAr 16S apresentaram banda única para A. circinalis, enquanto que mais de uma banda foi verificado nas outras morfoespécies de Anabaena. / The advent of molecular evolutionary studies based on 16S rRNA genes sequences of cyanobacteria, the taxonomy of Anabaena (Cyanobacteria) has been widely discussed and a revision of the genus is required. The problems range from the generic level, such as Anabaena Aphanizomenon group, to levels of strains differentiation (morphospecies). Molecular studies of Anabaena strains isolated from Brazilian ecosystems are lacking. In order to explore the diversity, phylogeny and evolutionary diversification of Anabaena strains isolated from Brazilian environments, phenotypic and genotypic studies were performed. A total of 43 Anabaena isolates were obtained from water bodies of Sao Paulo State (Billings reservoir, Santo Grande reservoir, Piracicaba river and Engenharia pond Esalq) and Ceara State (Povoado Nova Aurora pond and Camarao river). The isolated Anabaena species were identified as A. aphanizomenoides Forti, A. circinalis Rabenhorst ex Bornet et Flahault, A. crassa (Lemmermann) Komárková-Legnerová et Cronberg, A. cf. fallax Lomárek et Komárková-Legnerová and A. planctonica Brunnthaler. The culture media used for cyanobacterial isolation were AA/4, ASM-1 andBGN, the latter also in the variants with NaNO3 50% (BG50) and without nitrate (BGS), with and without addition of B12 vitamin. The ASM-1 medium did not promote the growth of Anabaena. The A. circinalis and A. crassa species had not grown inBGN culture medium with NaNO3 17.65 mM, showing growth in BG50 medium. The addition of B12 vitamin favored the growth of A. circinalis. The morphological characters analyzed for 23 isolates were the length (L) and diameter (D) of vegetative cell (V), heterocyte (HT), akinete (AK), coil (CO), L/D ratio (R) for V, HT and AK, and D/L ratio for CO (RCO). The sheath diameter (SD) was also evaluated. The principal component analysis (PCA) confirmed that the coil is an important feature to separate the morphospecies A. circinalis, A.crassa and A. cf. fallax. RV and RHT were diacritical for differentiation of A. cf. fallax. The akinete length (LAK) was important to differentiate A. aphanizomenoides from A. planctonica. The sheath differentiated A. crassa from other morphospecies. Phylogenetic analyses of 16S rRNA gene placed A. circinalis and A. crassa, A. planctonica, A. aphanizomenoides and A. cf. fallax Brazilian isolates in separated clades in agreement with morphological characters. With the exception of A. planctonica, the 16S rRNA sequences of the Brazilian isolates did not cluster with relative strains originated from other countries, indicating that they are unique. The phylogenetic analysis of concatenated genes16S rRNA, rpoC1, rbcL, tufA corroborated results of 16S rRNA phylogeny and morphological identifications. The attempt to obtain molecular standards for the Anabaena species isolated from Brazil was made using the PCR-DGGE technique. The fragments of the 359-781 region of 16S rRNA showed only one DNA band for A. circinalis, while more than one band was observed in other Anabaena morphospecies.

O desenvolvimento do músculo esquelético em vertebrados é um processo bem organizado que envolve diversos eventos, inicia-se na fase embrionária e continua durante toda a vida. Esse processo biológico requer uma adequada sinalização celular e é regulado por inúmeros genes. Em busca do entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na determinação do desenvolvimento e crescimento do tecido muscular foi acompanhada a expressão gênica dos fatores miogênicos (MyoD, Myf5, Miogenina e MRF4); Pax7; Miostatina; e da via de ação Shh (Shh, Ptch1, Smo, Pka, Sufu, Gli2 e Gli3) na musculatura peitoral de duas linhagens de galinhas de composições genéticas distintas. Uma linhagem de corte, selecionada para maior deposição de massa muscular, e outra de postura, caracterizada pela baixa taxa de crescimento e pouca massa muscular. Foram utilizados 90 animais distribuídos nas duas linhagens e cinco estádios de desenvolvimento: 9 e 17 dias da fase embrionária e 1, 21 e 42 dias da fase pós-eclosão. A expressão gênica foi analisada por PCR quantitativa em tempo real. Os genes Myf5, Miogenina, MRF4, Pax7, Shh e Ptch1 foram diferencialmente expressos na ontogenia e entre as linhagens. Já os genes MyoD, Miostatina, Smo, Pka, Sufu, Gli2 e Gli3 foram diferencialmente expressos somente na ontogenia. Foi possível traçar o perfil de expressão dos genes ao longo das fases de desenvolvimento. Os genes MyoD, Myf5 e Pax7 foram mais expressos na fase embrionária, onde há maior proliferação celular. Durante as fases estudadas, os genes da Miogenina e MRF4 apresentaram uma auto-regulação entre eles, indicando a ocorrência do processo de diferenciação celular. O gene da Miostatina demonstrou estar inibindo o crescimento muscular nos dias que antecedem a eclosão. Os genes da via de ação Shh foram mais expressos nas idades embrionárias, onde esta via age como um fator de sobrevivência e proliferação celular e menos expressos nas idades posteriores a eclosão, provavelmente, para que haja o processo de diferenciação dos mioblastos. Verificou-se que esses genes foram diferencialmente expressos sendo coordenados espaço-temporalmente, permitindo assim um ajuste sutil entre proliferação e diferenciação das células musculares, colaborando para as diferenças fenotípicas observadas entre as linhagens. / The development of skeletal muscle in vertebrates is a well-organized process that involves several events, initiating in the embryonic phase and continuing throughout life. This biological process requires a proper cell signaling and is regulated by numerous genes. Aiming to understand the molecular mechanisms involved in determining the development and growth of muscle tissue, we monitored gene expression of myogenic factors (MyoD, Myf5, Myogenin and MRF4); Pax7; Myostatin; and Shh pathway (Shh, Ptch1, Smo, Pka, Sufu, Gli2 and Gli3) in the pectoralis muscle of two strains of poultry from different genetic compositions. A broiler, selected for increased deposition of muscle mass, and a layer, characterized by slow growth and low muscle mass. We used 90 animals divided into two lines and five stages of development: 9 and 17 days of embryo and 1, 21 and 42 days post-hatching. Gene expression was analyzed by quantitative real-time PCR. The genes Myf5, Myogenin, MRF4, Pax7, Shh and Ptch1 are differentially expressed in ontogeny and among strains. The genes MyoD, myostatin, Smo, Pka, Sufu, Gli2 and Gli3 were differentially expressed only in ontogeny. It was possible to design the gene expression profile throughout the different developmental stages. The genes MyoD, Myf5 and Pax7 were more expressed in the embryo, where there is greater cell proliferation. During the four phases, the genes MRF4 and Myogenin showed self-regulation among them, indicating the occurrence of the cell differentiation process. The myostatin gene proved to be inhibiting muscle growth in the days before hatching. The genes of the Shh action were more highly expressed in embryonic ages, where this pathway acts as a survival factor and cellular proliferation, and less expressed in later times after hatching, probably to allow for the differentiation of myoblasts. We found that these genes were differentially expressed being coordinated in space and time, allowing, thus, a subtle tuning between proliferation and differentiation of muscle cells, contributing to the phenotypic differences observed between strains.

A cana-de-açúcar, é atualmente a cultura mais plantada no estado de São Paulo, apresentando grande importância no setor agrícola. Assim como qualquer outra cultura, é hospedeira de uma série de patógenos que podem limitar sua produção. A bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é o agente causal do raquistismo-das-soqueiras (RSD) em canade- açúcar cujo o principal sintoma é a redução acentuada do crescimento observada em plantas adultas. Essa doença é de difícil diagnose pois a evolução dos sintomas é lenta devido à natureza fastidiosa da bactéria. Lxx pode ser considerada como um endófíto obrigatório que cresce a níveis patogênicos nos tecidos da planta dependendo de estímulos bióticos e abióticos. Devido à importância da cultura e aos danosoCasionados pela Lxx, este trabalho apresentou dois enfoques principais: o primeiro foi o desenvolvimento de um protocolo para quantificação de Lxx em tecido de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real; o segundo foi o estudo da interação entre cana-de-açúcar e Lxx, em busca de uma melhor compreensão da evolução desse processo através da identificação de proteínas que apresentaram alteração em abundância ao longo do tempo em função da colonização pela bactéria em duas variedades de cana (RB835486 e SP80-3280) e em seguida enfatizando o sistema antioxidante nesta relação. Para isso, foram desenvolvidos primers específicos para detecção de Lxx que permitiram quantificar baixos níveis bacterianos em tecido foliar, revelando diferenças entre variedades segundo a cinética do crescimento bacteriano. Plantas com diferentes títulos bacterianos obtidas mediante inoculação artificial ou não foram submetidas à análise proteômica por meio da técnica de 2D-DIGE, uma vez que para o RSD, os danos estão relacionados à alta colonização de Lxx em seus tecidos. Os resultados alcançados com o sequenciamento de proteínas que apresentaram alteração em abundância revelaram que, em plantas da variedade RB835486 observou-se repressão de proteínas da via de estresse oxidativo e metabolismo primário, em contraste com a variedade SP80-3280, que apresentou aumento da abundância de proteínas relacionadas à via de estresse oxidativo, ambas para o mesmo tratamento, em plantas não inoculadas artificialmente. Já em plantas inoculadas com Lxx foram identificadas alteração na abundância de proteínas relacionadas ao crescimento da planta, ciclo celular, vias de sinalização celular e hormonal, esses resultados são consistentes com o principal sintoma da doença, o raquitismo, pois indica que as alterações temporais observadas na expressão de proteínas relacionadas com o aumento do título de Lxx in planta podem resultar em alterações do equilíbrio hormonal e menor crescimento da planta. Alguns resultados observados com a análise bioquímica corroboram com os dados acima descritos, pois a variedade RB835486 apresentou uma resposta precoce ao estresse oxidativo e mostrou maior controle do crescimento bacteriano, o que pode estar relacionado ao balanço de ERO\'s (espécies reativas de oxigênio) utilizadas pelo metabolismo como sinalizador celular na interação planta-patógeno. Em contraste, a variedade SP80-3280, em sua maioria, apresentou indução da atividade de enzimas antioxidantes mais tardiamente, momento em que a bactéria Lxx apresentou os maiores títulos de crescimento. / Sugarcane is currently the most grown crop in the state of São Paulo, with great importance in the agricultural sector. Like every crop, sugarcane is host to a number of pathogens that may limit its production. The fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is the causal agent of ratoon stunting in sugarcane (RSD), which the main symptom is a sharp reduction in growth observed in adult plants, this disease is difficult to diagnose because the evolution is slow due to nature of fastidious bacteria. Lxx can be considered as an obligatory endophyte that grows at pathogen levels in plant tissues depending on biotic and abiotic stimuli. Due to the importance of culture and the damage caused by the Lxx, this work presents two main approaches: the first one was the development of a protocol for the quantification of Lxx in sugarcane tissue by quantitative real time PCR; the second one was to study the interaction between sugarcane and Leifsonia xyli subsp. xyli aiming to a better understanding of the evolution of this process, identifying alterations in abundance of proteins over time depending on the bacterial colonization in the two varieties of sugarcane (RB835486 and SP80-3280) and then, emphasizing the antioxidant system in this relationship. Thus, we developed specific primers that enabled Lxx quantification at low bacterial levels in leaf tissue. The assay showed differences among sugarcane varieties according to the kinetics of bacterial growth. Plants that presented different titers of bacteria were obtained by artificial inoculum or not were selected to proteomic analysis by 2D-DIGE technique, since for RSD, the damage is related to high colonization in plant tissues. The identification of sugarcane proteins revealed that for variety RB835486 were observed a repression of stress proteins and proteins related to primary metabolism, in contrast with SP80-3280 variety, which it was identified high abundance of proteins of oxidative stress pathway, in not inoculated plants, for both varieties. However in inoculated plants it was identified a change in the abundance of proteins related to plant growth, cell cycle, cell signaling and hormonal pathways. These results corroborate with the main symptom of the disease, ratton, and suggest that temporal changes in expression of sugarcane cited proteins by increasing title of Lxx can result in hormonal imbalance and the decrease of plant growth. The major part of biochemistry analyzes corroborate with previous data obtained in proteomic approach. The RB835486 variety showed an early response to oxidative stress and suggests a greater control of bacterial growth in its tissues, which may be related to the balance of ERO\'s in signaling metabolism in plant pathogen interaction. While the SP80-3280, showed a later induction of antioxidant enzymes, when the bacterium Lxx had the highest titer of bacteria.

A esquistossomose é uma doença importante em saúde pública. Dos genes selecionados como diferencialmente expressos em esquistossômulos a partir do transcriptoma do S. mansoni, 56% foram confirmados por RT-PCR em tempo real. Entre eles, a proteína Ly6.5, está presente no tegumento de esquistossômulos e vermes adultos por âncoras de GPI. Não foi detectada a função de inibir o sistema complemento, mas pode estar envolvido na manutenção do tegumento. O gene SmVal7 revelou transcritos nas glândulas esofágicas de vermes adultos por hibridização in situ, enquanto a localização da proteína não está definida. Anexina está associada ao tegumento de esquistossômulos e vermes adultos, de maneira dependente de cálcio. A supressão do gene por RNAi não resultou em alteração fenotípica significativa em esquistossômulos in vitro. Foi observada atividade parcial de inibição de coagulação e potencial atividade de endocitose de anticorpos ligados à superfície. A imunização com rLy6.5, rSmVal7, rAneI-II ou rAneII-III não levou a redução da carga parasitária após desafio. / Schistosomiasis is an important disease in public health. Genes selected from the S. mansoni transcriptome, 56% of them were confirmed as differentially expressed in schistosomula by real time RT-PCR. Among them, the protein Ly6.5 is present in the tegument of schistosomula and adult worms by GPI anchors. The function of inhibiting the complement system was not detected, but it may be involved in maintenance of the tegument. The gene SmVal7 revealed transcripts in the esophageal glands of adult worms by in situ hybridization, while the localization of the protein is not defined. Annexin is associated with the membranes of the schistosomula and adult worms tegument in a calcium-dependent manner. The suppression of the gene by RNAi did not resulted in a significant phenotypic change in schistosomula in vitro. Parcial inhibition of the coagulation activity and potential function of endocytosis of membrane-bound antibodies were observed. Immunization with the rLy6.5, rSmVal7, rAneI or rAneII-II-III did not show reduction in worm burden recovery after challenge.

O presente estudo teve por objetivos caracterizar os vírus Influenza circulantes na cidade de São Paulo e verificar a variabilidade genética do gene da neuraminidase (NA) dos Influenzavírus A. Um total de 3009 amostras de crianças internadas no Hospital Universitário da USP, no período de 1995 a 2006, foram submetidas à duplex RT-PCR para detecção dos Influenzavírus A e B (IA e IB). As amostras positivas para IA foram submetidas à subtipagem pela multiplex RT-PCR. Cento e trinta e três amostras (4,4%) foram positivas, sendo 88,0% (117/133) IA e 12,0% (16/133) IB. Entre as amostras IA, 94 eram H3N2, 7 H1N1 e 16 não foram subtipadas pela multiplex. Um total de 74 amostras (71 H3N2 e 3 H1N1) tiveram o gene da neuraminidase sequenciado (total ou parcialmente). As sequências obtidas foram submetidas à análise filogenética, sendo verificado o agrupamento das cepas circulantes em clusters por ano de isolamento, demonstrando sua evolução temporal. Quando comparadas com as cepas vacinais utilizadas no período, foi verificada uma boa similaridade. / The aim of this study was to characterize Influenza virus circulating in São Paulo city and the neuraminidase (NA) gene sequence of Influenzavirus A in 3009 samples from children hospitalized at USP University Hospital, from 1995 to 2006. Samples underwent duplex RT-PCR for detection and typing of Influenza virus A and B (IA and IB) and also were submitted to multiplex PCR for subtyping of IA. Among 3009 samples, 4.4% were Influenza virus, being 88.0% IA (117/133) and 12.0% IB (16/133). Among samples of IA, 94 were characterized as H3N2, 7 H1N1 and 16 were not subtyped. A total of 74 samples (71 H3N2 and 3 H1N1) had the NA gene sequenced (total or partially). Sequences obtained were compared to sequences of the world and sequences of vaccine strains. Brazilian samples were grouped in clusters with samples isolated in the same year. It was also found a good similarity between circulating strains and vaccine strains.

A Glutamina (Gln) melhora a regeneração hepática em ratos nutridos. Para avaliar o efeito molecular da Gln endovenosa no remanescente hepático, 52 ratos foram classificados em: 1. Nutridos com hepatectomia parcial (HP) e Gln (N-Gln=10) ou prolina (N-Pro=10); 2. Desnutridos com HP: (D-Gln=10) ou (D-Pro=10); 3. Nutridos e Desnutridos sem HP (N-Controle=6) e (D-Controle=6). Após 96 horas da HP os resultados foram: DNA = (D-Gln, D-Pro e D-Controle < N-Gln, N-Pro e N-controle), (N-Gln, N-Pro, D-Gln e D-Pro < N e D-Controle), (N-Gln > D-Gln); RNA= (N-Gln, N-Pro, D-Gln e D-Pro < N e D-Controle), (N-Gln > D-Gln e N-Pro). Não houve diferença nos genes transcritos (GT) para HGF, TGF-a e timidina kinase. Concluímos que: A desnutrição e HP reduzem DNA e RNA; A Gln não altera os GT estudados em ratos desnutridos 96 horas após HP / Glutamine dipeptide (Gln) improve hepatic regeneration of nourished rats. To evaluate molecular effect of Gln on liver remnant 52 rats was classified into: 1. Nourished with partial hepatectomy (PH) and Gln (N-Gln=10) or proline (N-Pro=10); 2. Malnourished (MN) with PH: (MN-Gln=10) or (MN-Pro=10); 3. Nourished and Malnourished rat without PH (N-Control=6) and (MN-Control=6). Results: DNA = (MN-Gln, MN-Pro and MN-Control < N-Gln, N-Pro and N-control), (N-Gln, N-Pro, MN-Gln and MN-Pro < N and MN-Control), (N-Gln > MN-Gln); RNA= (N-Gln, N-Pro, MN-Gln and MN-Pro < N and MN-Control), (N-Gln > MN-Gln and N-Pro). There was no difference on transcript genes (TG) for HGF, TGF-a and thymidine kinase. Conclusions: Malnutrition and PH decrease hepatic DNA and RNA; Gln does not modify TG studied 96 hours after PH in MN rats

S.aureus resistente à meticilina(SARM) é um problema em centros de fibrose cística(FC). Foi desenvolvido um multiplex PCR(mPCR) para detecção do SARM em secreção respiratória de 106 pacientes com FC. Foram usados 3 pares de primers para amplificar os genes: mecA, coa, 16S rRNA. O mPCR detectou até 0,25pg de DNA de SARM e identificou 70/106(66,0%) pacientes com S.aureus e 28/106(26,4%) com SARM. O mPCR mostrou especificidade, sensibilidade, valores preditivos positivo e negativo de 87,8%, 84,4%, 50% e 97,5%, considerando a cultura como padrão-ouro. Os resultados discordantes foram testados com outros primers, confirmando os obtidos pelo mPCR em 82/84. O mPCR mostrou-se método rápido e confiável para detecção de SARM / Methicillin-resistant S.aureus(MRSA) is a significant concern in cystic fibrosis(CF) centers. A multiplex PCR(MPCR) was developed to detect MRSA in respiratory secretion of 106 CF patients. Three pairs of primers were used for amplification of genes: mecA, coa, 16S rRNA. MPCR detected 0.25pg of MRSA DNA and identified 70/106(66.0%) of patients with S.aureus and 28/106(26.4%) with MRSA. MPCR showed specificity, sensitivity, positive and negative predicted values at 87.8%, 84.4%, 50% and 97.5%, considering culture as the gold standard. Discrepant results were retested using different primers, and confirmed MPCR results in 82/84. The developed MPCR was found to be a rapid and reliable method for MRSA detection

A maciez da carne bovina é o resultado do processo de proteólise miofibrilar influenciado pelas calpaínas (CAPN), enzimas ativadas pelo cálcio. A calpastatina (CAST) constitui um regulador das calpaínas, atuando como substrato e degradando-se pela ação da própria calpaína. A suplementação com vitamina D3 na dieta dos animais tem alterado positivamente a maciez da carne, por obter maior absorção e deposição de cálcio nos músculos. Tendo em vista a importância desses genes para a maciez da carne em bovinos e o metabolismo de vitamina D3, o objetivo deste estudo foi verificar a expressão gênica de 1-HYD, 24-HYD, CAPN1 e CAST (Isoformas). Foram utilizados 42 machos castrados da raça Nelore que foram divididos em 6 tratamentos (7 animais por tratamento). Os animais foram alojados em baias individuais e os tratamentos foram: T1) sem suplementação de Vitamina D3 + sem sombrite; T2) sem suplementação de Vitamina D3 + com sombrite filtração de 50% de UV; T3) com 2x106UI de vitamina D3 por dois dias consecutivos pré-abate + sem sombrite; T4) com 2x106UI de vitamina D3 por dois dias consecutivos pré-abate + com sombrite filtração de 50% de UV; T5) com 2x106UI de vitamina D3 por oito dias consecutivos pré-abate + sem sombrite; 6) com 2x106UI de vitamina D3 por oito dias consecutivos pré-abate + com sombrite filtração de 50% de UV. A expressão gênica foi analisada por PCR quantitativa em tempo real. O gene 1-HYD foi mais expresso nos tratamentos com 2 e 8 dias de suplementação com vitamina D3, independente da exposição diferenciada aos raios ultravioleta. O gene 24-HYD foi mais expresso no tratamento com 8 dias de suplementação pré-abate quando comparado ao tratamento controle, não diferindo do tratamento com suplementação por 2 dias consecutivos pré-abate. Portanto os resultados não corroboram com o mecanismo de regulação das atividades das enzimas modulada de forma oposta para regular os níveis circulantes de 1,25-di-hidroxi-vitamina D3 (1,25 D). Quando a concentração de 1,25 D atinge níveis elevados um mecanismo de regulação inativa a 1,25 D e promove a diminuição da expressão de 1-HYD. Assim pode-se inferir que neste estudo esses fatores não exerceram influência sobre o gene 1-HYD que teve um aumento da expressão. A única possibilidade de verificar o aumento da expressão do gene da enzima 1-HYD parece envolver um hiperparatireoidismo secundário decorrente de hipocalcemia em algum momento do experimento. A suplementação com vitamina D3 não exerceu influência na expressão de RNAm da CAPN1, isoforma I e isoforma total da CAST. A isoforma II do gene da calpastatina foi mais expressa no tratamento com 8 dias de suplementação pré-abate, onde parece que o aumento da expressão é devido a uma sinalização intracelular indicando que a calpastatina está sendo degradada pela ativação prolongada das calpaínas, em decorrência do aumento do influxo de cálcio. As análises de associação apontam para um possível descompasso entre abundância de RNAm e atividade da protease do sistema das calpaínas no processo de amaciamento da carne. / The tenderness of beef is the result of the process of myofibrillar proteolysis influenced by calpains (CAPN), enzymes activated by calcium. The calpastatin (CAST) is a regulator of calpains, acting as a substrate and degraded by the action of calpain itself. Supplementation with vitamin D3 in the diet has changed positively on meat tenderness, to obtain greater absorption and calcium deposition in muscle. Given the importance of these genes for meat tenderness in cattle and metabolism of vitamin D3, the objective of this study was to investigate the gene expression of 1-HYD, HYD-24, CAPN1, CAST (isoforms). We used 42 Nellore steers were divided into 6 treatments (seven animals per treatment). The animals were housed in individual pens and treatments were: T1) without vitamin D3 feeding + without shadow; T2) without vitamin D3 feeding + with black - 50% filtration of UV; T3) with 2x106UI of vitamin D3 for two days consecutive slaughter + without shadow; T4) with 2x106UI vitamin D3 for two days consecutive slaughter + with black - 50% filtration of UV; T5) with 2x106UI vitamin D3 for eight days consecutive slaughter + without shading; T6) 2x106UI with vitamin D3 for eight days consecutive slaughter + with black - 50% filtration of UV. Gene expression was analyzed by quantitative real-time. The 1-HYD gene was more expressed in the treatments with 2 and 8 days of supplementation with vitamin D3, independent of differential exposure to ultraviolet rays. The 24-HYD gene was more expressed in the treatment with 8 days of pre-slaughter supplementation compared to control treatment, the treatment did not differ with supplementation for 2 consecutive days pre-slaughter. These findings do not corroborate the mechanism for regulating the activities of enzymes modulated so diametrically opposite to regulate the circulating levels of 1,25- dihydroxy vitamin D3 (1,25 D). When there is an overproduction of 1,25 D regulation mechanism inactivates 1.25 D and promotes the reduction of the expression of 1-HYD. Thus we can infer that in this study, these factors did not influence the 1-HYD gene that had increased expression. The only way to verify the increase of gene expression of the enzyme 1-HYD seems to involve a secondary hyperparathyroidism due to hypocalcemia sometime in the experiment. Supplementation with vitamin D3 did not influence the mRNA expression of CAPN1, isoform I and isoform total of CAST. The isoform II of the calpastatin gene expression was higher in treatment with 8-day preslaughter supplementation, where it appears that increased expression is due to an intracellular signaling indicating that calpastatin is degraded by prolonged activation of calpain as a result of increased influx of calcium. The association analysis point to a possible mismatch between mRNA abundance and activity of the calpain system components in these physiological conditions.

O HBoV é um novo parvovírus que foi isolado pela primeira vez em 2005 nas secreções respiratórias de pacientes humanos que tiveram pneumonia. Desde então, é associado a doenças do trato respiratório superior e doença gastrointestinal em pacientes adultos e pediátricos, desde a sua descoberta na Suécia e posteriormente em diversos países no Mundo. Quase todos os estudos foram realizados em amostras de secreção do trato respiratório, normalmente, de crianças com menos de 2 anos de idade e a maioria com infecção respiratória. As taxas de prevalência variam de 1,5% a 19% nos diferentes países. A Análise filogenética deste novo vírus demonstrou que tratava-se de um parvovirus, mais estreitamente relacionado ao parvovírus bovino e ao minuto vírus canino e por isso foi denominado de Bocavírus Humano. A variabilidade genética do HBoV é baixa e estudos filogenéticos indicam que duas linhagens circulam paralelamente ao redor do mundo. Entretanto, como ainda é um vírus relativamente novo, devem se feitos estudos mais detalhados de suas variantes. Em nosso estudo, com a finalidade de determinar a prevalência e conhecer a variabilidade genética do HBoV circulante, foram analisados de janeiro de 2008 a fevereiro de 2010, 935 amostras de aspirado de nasofaringe de crianças com menos de 2 anos de idade, com doença respiratória aguda, internadas no Hospital da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. Pela técnica de PCR, obtivemos 47 (4,7%) amostras positivas para HBoV e dessas 27 amostras apresentaram coinfecção com outros vírus respiratórios, 45 amostras foram seqüenciadas na região da VP1/VP2 de um fragmento de 658 nt. A análise filogenética, quando comparada com seqüência do genBank representativas de vários países, mostrou a circulação, em nossa amostragem, de grupos de HBoV semelhantes aos que circulam no Japão e Taiwan. A variabilidade genética entre as nossas amostras foram inferiores a 1%, tanto entre si como quando comparadas com as amostras do genBank. / HBoV is a new parvovirus which was first isolated in 2005 from respiratory secretions from human patients who had pneumonia. It has been associated with respiratory and gastrointestinal diseases in adult and pediatric patients since its discovery in Sweden and later in several countries worldwide. Almost all studies were performed on samples of secretions from the respiratory tract, usually in children under 2 years of age. Prevalence rates vary from 1.5% to 19% in different countries. The phylogenetic analysis of this new virus showed that it was a parvovirus, more closely related to bovine parvovirus and canine minute virus, and therefore called Human Bocavirus. The genetic variability of HBoV is low and phylogenetic studies indicate that there are two strains circulating alongside around the world. However, as it is still a relatively new virus, more detailed studies of its variants should be carried out. In our study, 935 samples of nasopharyngeal aspirate from children under 2 years old with acute respiratory disease, patients at Santa Casa de Misericordia Hospital, São Paulo, were analyzed from February 2008 to February 2010 in order to determine the prevalence and genetic variability of HBoV stock. Using the PCR method, we obtained 47 (4.7%) positive samples for HBoV from which 27 showed coinfection with other respiratory viruses; 45 samples from a fragment of 658 nt were sequenced in the VP1/VP2 region. The phylogenetic analysis, when compared with GenBank sequences representing several countries, showed the presence in our samples of groups of HBoV similar to those circulating in Japan and Taiwan. Genetic variation in our samples were below 1%, both among themselves and when compared with samples from GenBank.

Para a execução da etapa inicial da identificação médico-legal de restos humanos (antropometria e exame dos arcos dentários), faz-se necessária uma limpeza prévia da ossada, para a remoção de tecidos moles putrefeitos. Os casos não identificados por esses métodos tradicionais, poderão ser submetidos ao exame de DNA. No entanto, apesar do grande avanço da biologia molecular, utilizando a amplificação de DNA pela PCR, algumas limitações que afetam a habilidade de se obter DNA em restos humanos, permanecem. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi fornecer subsídios morfológicos para os analistas forenses, com ênfase na prática médico-legal, visando uma utilização mais eficiente do DNA obtido de osso compacto de restos humanos em decomposição ou já esqueletizados, sem tecidos moles aderidos. Foi realizado o estudo da microestrutura do tecido ósseo compacto femoral, de restos humanos em decomposição, ainda com tecidos moles, que foram limpos pela fervura em água (n = 7) e ossadas já esqueletizadas pela decomposição natural, que não foram fervidas (n = 8). Destes, seis ossadas foram provenientes de cemitério público regular, após 3 anos de inumação, 1 ossada proveniente da região amazônica, e 1 ossada de origem desconhecida. Estas duas ultimas, apresentado-se porosas ou quebradiças. As análises morfológicas de cortes histológicos foram coradas com hematoxilina e eosina e o DNA amplificado pela PCR para os loci CSF1PO, TPOX, TH01, F13A0, FESFPS, vWA, D16S539, D7S820, D13S317 e amelogenina. Os resultados da análise desses dois grupos foram comparados com os de cadáveres frescos (n = 5) do Serviço de Verificação de Óbitos da Capital. A fervura dos ossos, do modo como é realizada no Instituto Médico Legal de São Paulo, pode aumentar a eosinofilia da matriz óssea e, em alguns casos, pode promover a desagregação dos ósteons. Tal procedimento pode remover células, mas pode também remover possíveis inibidores da PCR, favorecendo a análise do DNA obtido destas amostras. O fator limitante para a obtenção e análise de DNA, em amostras de ossos limpos por fervura, é a quantidade exígua de células. Ossos não submetidos à fervura, após inumação por três anos ou há mais tempo em contato com a terra, podem apresentar alterações da microestrutura. No entanto, a presença de hemácias preservadas e núcleos de osteócitos nestas amostras, indica melhor preservação de células em relação às amostras de ossos fervidos. O fator limitante para a análise de DNA nestas amostras é a presença sugestiva de inibidores da reação de amplificação pela PCR. Restos humanos, sem tecidos moles, macroscópicamente não preservados (porosos e quebradiços), e não submetidos à fervura, apresentam alterações de perda de matriz mineralizada; no entanto, nestas amostras ainda é possível encontrar células preservadas. Os resultados obtidos no neste trabalho permitem traçar algumas estratégias para uma melhor utilização nos protocolos de extração e análise do DNA em osso compacto de restos humanos. / To the first essential step to forensic identification of human remains (anthropological study of race, sex, age, etc) it is necessary a previous cleaning of the bones, to remove decomposing soft tissues. Medico-legal inconclusive or non identified cases, by using these traditional methods, could be subjected to DNA analysis. However, in spite of advances in human identification techniques, specially by PCR amplified DNA, some limitations that affect the ability to obtain DNA in human remains still persist. Therefore, the aim of this study was to provide additional support from morphological analysis, to help forensic analysts personnel to utilise more efficiently the DNA, extracted from compact bones of human remains in decomposition or already skeletonized corpse, it means without soft tissues, with special emphasis in the legal-medicine practice. Femoral compact bones were obtained from: 7 human remains found on the ground, in different degree of decomposition which were cleaned by boiling to remove soft tissues; also studied were collections of bones from 8 corpses having undergone natural decomposition: 6 human remains exhumed after 3 years from a common public cemetery in São Paulo City; 1 case from amazon region and 1 case with no information, both cases remained from long time (more than 3 years) in contact with soil. All eight cases, were not boiled as no soft tissue were adhered. As a control, five cadavers 12 to 16 hours post mortem were also used. The compact bones histological sections were stained by haematoxilin and eosin and the loci CSF1PO, TPOX, TH01, F13A01,FESFPS, vWA, D16S539, D7S820, D13S317 and amelogenin were amplified by PCR.The procedure for boiling the human remains utilised in the Legal Medicine Institute of São Paulo would have increased the eosinophily of bone matrix and, in some cases, promoted the desaggregation of the osteons. In addition these procedures would have removed the cells, but in some cases would have removed possible inhibitors of the PCR, favouring in this way the analysis of DNA obtained from these samples. The limiting factor to obtain successful analysis in bones submitted to boiling seem to be the low quantity of nuclei present in these samples. For the other hand, in bones not cleaned by boiling, the presence of preserved red cells and oscteocyte nuclei inside the lacunae indicates better preservation of cells in relation to those bones cleaned by boiling. The limiting factor to obtain successful DNA analysis in bones exhumed or in contact of soil, is the suggestive presence of inhibitors of PCR. Porous and brittle bones from human remains, without soft tissues that are not processed by boiling, present alterations through loss of mineralised matrix, although it is still possible to found preserved cells in these samples. The results presented in this work clarify concerns about viability of DNA for identification analysis. They also help to establish better strategies for optimisation of DNA extraction and analysis in compact bones of human remains.