Les prostaglandines modulent d’importants rôles physiologiques. Elles sont aussi impliquées dans le développement d’une variété de conditions pathologiques telles l’inflammation, la douleur et le cancer. La prostaglandine PGF2α et son récepteur (récepteur FP) se trouvent impliqué dans la modulation de nombreuses pathologies tels lors de l’accouchement préterme et le cancer colorectal. Récemment, nous avons fait partie d’un groupe de recherche ayant développé des modulateurs allostériques du récepteur FP. Dans une première étude, l’action du PGF2α sur le déclenchement des contractions myométriales a été évaluée, car peu d’information est connue sur la signalisation de cette prostaglandine lors de l’accouchement. Ainsi, nous avons utilisé un peptidomimétique de la deuxième boucle extracellulaire, dénommée PDC113.824. Nos résultats ont démontré que le PDC113.824 permettait de retarder la mise bas chez des souris gestantes, mais agissait de manière différente sur les multiples voies de signalisation de la PGF2α. Ainsi, le PDC113.824 inhibait la voie RhoA-ROCK, dépendante de l’activation de la protéine Gα12 par le. Les protéines RhoA-ROCK sont des acteurs clés dans le remodelage du cytosquelette d’actine et des contractions myométriales lors de l’accouchement. De plus, le PDC113.824 en présence de PGF2α agit comme un modulateur positif sur la voie dépendante de l’activation de la protéine Gαq. Le PDC113.824 serait donc un modulateur allostérique non compétitif possédant des actions à la fois de modulateurs positifs et négatifs sur la signalisation du récepteur FP Dans une seconde étude, des analogues du PDC113.824 ont été conçus et analysés dans un second modèle pathologique, le cancer colorectal. Ce cancer possède de hauts niveaux de récepteur FP. Nous avons donc étudié le rôle du récepteur FP dans le développement et la progression du cancer colorectal et l’effet de modulateurs allostériques. Il est généralement accepté que dans le cancer colorectal, la prostaglandine PGE2 permet la croissance et l’invasion tumorale, ainsi que l’angiogenèse. Toutefois, peu d’informations sont connues sur le rôle du PGF2α dans le cancer colorectal. C’est dans ce contexte que nous avons décidé d’examiner la contribution de ce récepteur dans la progression du cancer colorectal et cherché à déterminer si la modulation des fonctions du récepteur FP a un impact sur la croissance de tumeurs colorectales. Nos recherches ont révélé que l’activation du récepteur FP permet la migration et la prolifération de plusieurs lignées cellulaires humaines et murines d’adénocarcinomes colorectaux. Dans ce contexte, nos expériences ont démontré que la migration des cellules cancéreuses était dépendante de l’activation de la voie Rho. Nos résultats démontrent qu’en effet, l’activation de RhoA, une petite GTPase clé de la voie Gα12, est inhibée de façon sélective par nos composés. De plus, nos molécules allostériques sont également efficaces pour inhiber la voie de signalisation de la ß-caténine, une protéine impliquée dans la genèse du cancer colorectal. In vivo, le traitement de souris avec un des ces modulateurs a permis une inhibition effective de la croissance tumorale. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent donc que les modulateurs allostériques des récepteurs FP pourraient constituer une nouvelle classe de médicaments utilisés pour le traitement du cancer colorectal. / Prostaglandins play many important physiological roles. They are also involved in the development of a variety of pathological conditions such as inflammation, pain and preterm labor. The prostaglandin PGF2α and the FP receptor are implicated in the modulation of many pathological diseases, for example in preterm labor and in colorectal cancer. Our group has recently developed FP receptor allosteric modulators and focused on the role of this receptor and its ligand PGF2α in different models. In a first study, the action of PGF2α on myometrial contraction was evaluated because there is little information about the pathway signalling regulating these contractions. We used a peptidomimectic whose structure is based on the second extracellular loop of the FP receptor and who is an inhibitor of parturition in mice, the PDC113.824. Our results have demonstrated that PDC113.824 is able to delay parturition in mice, affecting multiple pathways activated by the FP receptor and PGF2α. PDC113.824 inhibited the PGF2α mediated activation of the Gα12 dependent activation of the RhoA-ROCK signalling pathway. RhoA and ROCK proteins are keys actors in the remodelling of actin cytosqueleton and in myometrial contractions. Furthermore, PDC113.824 with the presence of PGF2α acted positively by increasing the activation of the Gαq pathway. Our finding suggests that PDC113.824 is an allosteric modulator with dual actions, acting in a positive and negative way on the FP receptor signalling. In a second study, analogues of PDC113.824 were made and analysed in a second pathological model, colorectal cancer development and progression. Colorectal cancer seems to posses high levels of FP receptor but it is generally accepted that PGE2 promotes tumor growth, invasion and angiogenesis. However, little is known about the effect of PGF2α in colorectal cancer and only one report has suggested that this prostaglandin can stimulate motility and invasion. Its in this context, whether modulation of FP receptor function can impact colorectal tumors growth remains to be defined. Using our allosteric modulator, we investigated the contribution of FP receptor in the malignant progression of colorectal cancer. Our findings indicate that activation of FP receptors promote migration and proliferation of different human and murine colorectal cell lines. In this context, we demonstrated that this migration was dependent upon the activation of the Rho signalling pathway. Our results indicate that the activation of RhoA, a key small GTPase of the Gα12/13 pathway, is selectively inhibited by our compounds. We also showed that our allosteric modulator could act negatively on the β-catenin pathway, which is a protein with multiple effects on the progression of colorectal cancer. In vivo, treatment of mice with one this allosteric modulator is effective in inhibiting colorectal tumor growth in a xenograph mouse model. Together these findings suggest that PGF2α and the receptor FP, may play a considerable role in the development and progression of colorectal cancer.

La migration cellulaire est un mécanisme important pour divers processus cellulaires tels que l’embryogenèse et la cicatrisation. De même, elle participe à des processus pathologiques notamment l’invasion des cellules malignes et la formation des métastases cancéreux. La dissémination métastatique est un processus très compliqué. L’acquisition du pouvoir migratoire invasif par la cellule maligne ainsi que son potentiel métastatique est gérée par le cytosquelette qui est dynamiquement modifié et contrôlé par des voies de signalisation intracellulaires. Cependant, la physiologie des cellules métastatiques et les cascades de signalisation qui les poussent à métastaser ne sont toujours pas comprises. Les protéines Ezrine, Radixine et Moésine (ERMs) jouent un rôle important dans l’organisation du cytosquelette au cortex cellulaire et elles sont des déterminantes clés de la migration cellulaire. Ainsi, une dérégulation à ce niveau peut conduire à une migration cellulaire aberrante. D’où l’implication des ERMs dans différents cancers agressifs et invasifs. Les ERMs sont régulées en aval de plusieurs acteurs cellulaires notamment les récepteurs membranaires. Plusieurs études ont rapporté que le récepteur au thromboxane A2 (RTXA2), un récepteur couplé à la protéine G (RCPG) favorise les métastases. Il a été décrit surtout dans le cadre de cancer du sein triple négatif (CSTN), l’un des cancers les plus mortels chez la femme. Les RCPG possèdent un rôle central dans presque toutes les fonctions physiologiques et constituent la plus grande famille des cibles médicamenteuses. D’une manière intéressante, les deux laboratoires de Dr Sébastien Carréno et Dr Michel Bouvier, ont découvert que le RTXA2 active les protéines ERMs à travers la GTPase RhoA. Dans ce projet de recherche on a identifié une nouvelle voie de signalisation liant le RTXA2 aux ERMs à travers la GTPase RhoA et la kinase SLK. Cette voie est impliquée dans la migration des cellules de cancer du sein triple négatif. Ainsi, on a pu démontrer que la moésine et la kinase SLK agissaient en aval du récepteur étudié pour favoriser la vitesse et la directionnalité de la migration des cellules de CSTN. 6 On a montré que la migration cellulaire dirigée en aval du RTXA2 est due à une polarité de la moésine au front de la migration. On a constaté aussi que la moésine est responsable d’une polarité des filaments d’actine au front de la migration suite à une activation du récepteur. Ce travail a mis en évidence une nouvelle cascade de signalisation importante pour la migration des cellules cancéreuses agressives triples négatives du sein ce que pourrait être une nouvelle cible des thérapies anti-métastatiques. / Cell migration is an important mechanism for various cellular processes such as embryogenesis and cicatrization. Likewise, it controls pathological processes including the invasion of malignant cells and the formation of metastases. Metastasis is a very complicated process. The acquisition of invasive migratory power by a malignant cell as well as its metastatic potential is regulated by the cytoskeleton which is dynamically modified and controlled by intracellular signaling pathways. However, metastatic cells physiology and the cascades causing their metastases are not clear yet. Ezrin, Radixin and Moesin (ERMs) proteins have an important role in organizing the cytoskeleton at the cell cortex and they are key determinants of cell motility. Thus, a deregulation at this point may lead to an aberrant cell migration. Hence, the involvement of ERMs in various aggressive and invasive cancers. ERMs are regulated downstream of several cellular actors in particular membrane receptors. Several studies have reported that the thromboxane A2 receptor (TXA2R), a G protein coupled receptor (GPCR) promotes metastasis. It has been described especially in the context of triple negative breast cancer (TNBC), one of the deadliest cancers in women. GPCR have a central role in almost all physiological functions and constitute the largest family of drug targets. Interestingly, the two laboratories of Dr Sébastien Carréno and Dr Michel Bouvier, have discovered that the TXA2R activates ERM proteins through the GTPase RhoA. In this research project, we have identified a new signaling pathway linking the TXA2 receptor to ERMs via RhoA and the kinase SLK. This pathway is involved in the migration of triple negative breast cancer cells. Thus, we demonstrated that moesin and SLK acted downstream of the receptor to promote the speed and directionality of TNBC cells migration. We discovered that the directed cell migration downstream of TXA2R is due to a polarization of moesin at the leading edge. We also observed that moesin is responsible for actin filaments polarity at the leading edge following an activation of the receptor. So, this work has revealed a new signaling cascade important for the migration of aggressive triple negative breast cancer cells which could be a new target for anti-metastatic therapies.

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Les organismes vivants, qu'ils soient simples ou complexes, ont acquis des stratégies pour s'adapter aux changements environnementaux. Ces changements correspondent à un large éventail de signaux chimiques, physiques ou mécaniques qui doivent être transmis en messages intracellulaires. Dans la cellule, des réseaux de signalisation sont modulés avec une grande précision pour transmettre ces messages et générer une réponse cellulaire appropriée. Les protéines d'échafaudage jouent un rôle crucial dans la sélectivité et la modulation spatio-temporelle de la transduction du signal. Par divers mécanismes moléculaires, elles médient l’organisation de complexes multimoléculaires impliqués dans plusieurs processus biologiques. CNK est une protéine d'échafaudage découverte par le biais d’études génétiques chez la drosophile où elle agit comme modulateur positif de la signalisation RAS/MAPK. Cependant, les fonctions physiologiques des homologues de CNK de mammifères (CNK1, CNK2 et CNK3) et leurs contributions aux pathologies humaines sont mal caractérisées. De plus, il existe peu d’évidences rapportant leur implication dans la signalisation RAS/MAPK. Elles ont plutôt été associées à des voies de signalisation contrôlées par les guanosine triphosphatases (GTPases) des familles ARF et RHO. Dans un premier manuscrit, nous avons montré que CNK2 est requise pour la migration et l'invasion des cellules cancéreuses en couplant le récepteur tyrosine kinase (RTK) prométastatique AXL à l'activation de la GTPase ARF6. D'un point de vue mécanistique, la signalisation induite par AXL favorise le recrutement de CNK2 à la membrane plasmique de manière dépendante de PI3K. Ensuite, CNK2 promeut l’activation d’ARF6 via son interaction aux ARF Guanosine exchange factors (GEFs) cytohésines et à la protéine adaptatrice SAMD12. Nous démontrons également qu’ARF6 coordonne l'activité des GTPases RAC1 et RHOA. Enfin, l'ablation génétique de CNK2 ou SAMD12 réduit considérablement les lésions métastatiques hépatiques et pulmonaires dans un modèle de xénogreffe de souris. Dans une série d’expériences de BioID supplémentaires utilisant le mutant gain-de-fonction ARF6 Q67L, nous avons identifié PLD1 et ITGB1 comme candidats potentiels pouvant médier la signalisation RAC1 et RHOA en aval d’ARF6. Dans une autre série d’expériences, nous avons caractérisé l'interaction entre les CNKs et la sous-famille des kinases Misshapen (MSN). Les trois membres de cette sous-famille, MAP4K4, TNIK et MINK1, ont été identifiés comme principaux interacteurs proximaux de CNK2A et CNK3 dans les expériences de BioID. Toutefois, leur interaction ne semble pas être impliquée dans la fonction promigratoire de CNK2A. Par des expériences de cartographie, nous démontrons que les domaines CRIC et DUF1170 de CNK2/3 et la région coiled-coil de MAP4K4 sont importants pour leur interaction. Nos travaux suggèrent également que SAMD10 compétitionne avec MAP4K4 pour se lier à CNK2 et que SAMD10/12 modulent la stabilité de CNK2. Enfin, nos résultats préliminaires suggèrent que MAP4K4 induit la phosphorylation de CNK2/3. Cependant, la pertinence biologique de ces évènements reste à déterminer. Dans l'ensemble, nos travaux révèlent une fonction inattendue de CNK2 dans la régulation de la motilité des cellules cancéreuses et identifient une nouvelle voie de signalisation qui pourrait être ciblée pour limiter les métastases. En outre, nos travaux identifient plusieurs pistes pour approfondir le rôle de CNK dans les cellules de mammifères. / All living organisms, whether simple or complex, have acquired sophisticated strategies to adapt to their changing environment. These environmental changes correspond to a breadth of chemical and mechanical signals that need to be transmitted into intracellular information. In cells, dense signalling networks are put into place and modulated with great precision to transmit messages and generate appropriate cellular responses. Scaffolding proteins play a crucial role in the selectivity and spatiotemporal modulation of signal transduction. Through various molecular mechanisms, they mediate the organization of multimolecular complexes implicated in various biological processes. CNK is a scaffolding protein discovered through genetic studies in drosophila where it acts as an important positive regulator of the highly oncogenic RAS/MAPK pathway. In contrast, the physiological functions of human CNKs and their roles in human diseases are poorly characterized. Moreover, evidence supporting their requirement for RAS/MAPK signalling remains sparse. Rather, they have been linked to signalling pathways controlled by the ARF and RAS homologous (RHO) subfamilies of GTPases. In a first manuscript, we found that mammalian CNK2 promotes cancer cell migration and invasion by coupling the pro-metastatic RTK AXL to downstream activation of ARF6 GTPase. Mechanistically, we showed that AXL signalling induces PI3K-dependent recruitment of CNK2 to the plasma membrane where it stimulates ARF6 via its interaction with the cytohesin ARF GEFs and the adaptor protein SAMD12. We also showed that ARF6 coordinates RAC1 and RHOA GTPase activity. Finally, the genetic ablation of CNK2 or SAMD12 potently reduces liver and lung metastatic lesions in a mouse xenograft model. In a series of supplemental BioID experiments using the gain-of-function ARF6 Q67L mutant, we identified PLD1 and ITGB1 as potential candidates that could mediate RAC1 and RHOA signalling downstream of ARF6. In another study, we characterized the interaction between CNKs and the MSN subfamily of kinases. The three members of this subfamily, namely MAP4K4, TNIK and MINK1, were identified as top proximal interactors of CNK2A and CNK3 in the BioID experiments. However, their interaction does not appear to be involved in the pro-migratory function of CNK2A. Through mapping experiments, we found that the CRIC and DUF1170 domains of CNK2 and CNK3 and the coiled-coil region of MAPK4K4 are important for their interaction. In addition, we found that SAMD10 competes with MAP4K4 for binding to CNK2 and that SAMD10/12 proteins also modulate CNK2 stability. Finally, our preliminary results suggest that MAP4K4 induces CNK2/3 phosphorylation. However, the biological relevance of these interactions and phosphorylation events remains to be addressed. Overall, our work uncovers an unanticipated function of CNK2 in regulating cancer cell motility and identifies a novel signalling pathway that could be targeted to restrain metastasis. Moreover, it identifies several avenues for further study into CNK function in mammalian cells.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Malgré les avancées récentes, le cancer reste la première cause de mortalité en France avec ~ 150000 décès recensés par an (INCa 2012). Notamment, le cancer broncho-pulmonaire est l'un des plus agressifs, avec 29100 décès en 2011. La survie à cinq ans de seulement 10% des patients atteints des cancers du poumon non à petites cellules (NSCLC, 80% des cancers bronchiques), pose un problème d'ordre scientifique, médical et de santé publique. Il est communément admis qu'une sous-population de la tumeur acquiert en raison d'une instabilité génétique de nouvelles propriétés agressives nécessaires à sa dissémination, sa prolifération et une plus grande résistance aux chimiothérapies. Une meilleure compréhension de ces propriétés tumorales constitue un enjeu majeur pour prévenir à terme cette progression maligne. Nous avons axé notre recherche sur la macro-autophagie, un processus catabolique lysosomal essentiel à l'homéostasie cellulaire et sur un de ses substrats SQSTM1 (séquestosome ou p62). Au moment où j'ai initié ma thèse, une relation étroite entre l'autophagie, SQSTM1 et la progression tumorale venait d'être mise en lumière. Plusieurs membres de la machinerie autophagique sont fréquemment mutés/déletés dans les cancers. De façon paradoxale, l'autophagie peut également permettre la survie des cellules tumorales face à l'hypoxie, la carence nutritionnelle ou les chimiothérapies.

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2008. / Title from PDF of title page. Document formatted into pages; contains 201 pages. Includes vita. Includes bibliographical references.

Els factors de transcripció de la família Snail són fonamentals en la "transició epiteli-mesènquima", procés morfogènic essencial en el desenvolupament embrionari i en els fenòmens metastàsics tumorals.En els mamífers l'activitat d'Snail és modulada per dos mecanismes. (i) En el promotor humà es troben regions definides de resposta a factors repressors, predominants en les cèl·lules epitelials, i elements diferenciats de resposta a inductors de la "transició epiteli-mesènquima". (ii) L'activitat d'Snail és condicionada també per la seva localització subcel·lular, modulada per mecanismes no transcripcionals: la fosforilació d'Snail determina si és o no exclós del nucli. Al citosol no pot actuar com a repressor transcripcional però pot interaccionar amb la xarxa microtubular, que estabilitza i en condiciona el dinamisme. Això coincideix amb l'activació de la GTPasa RhoA i la reorientació dels filaments de vimentina, fets associats a l'adquisició de capacitat migratòria. L'efecte com a repressor transcripcional i la modulació del dinamisme microtubular són possiblement esdeveniments coordinats necessaris per al rol biològic d'Snail en mamífers. / Snail family of transcription factors is fundamental to the "epithelial-mesenchymal transition", morphogenic process essential to embryonic development and metastatic phenomena in tumors.Snail's activity is modulated in two ways in mammals. (i) The human promoter harbors definite regions that respond to repressor factors, which prevail in epithelial cells; and differentiated elements that respond to known inducers of the "epithelial-mesenchymal transition". (ii) Snail's activity is also conditioned by its subcellular localization, mechanism not dependent on its transcriptional control: Snail phosphorylation determines whether Snail is excluded or not from the nucleus. When in the cytosol, Snail is unable to act as a transcriptional repressor, but however binds to the microtubular meshwork, which becomes stabilized and whose dynamism is conditioned as a result. This fact coincides with the activation of the RhoA GTPase and reorientation of vimentin filaments, both phenomena being related to the acquisition of cell motility. The transcriptional repressor and the microtubule dynamics effects are probably two coordinated events necessary to Snail's biological role in mammals.