O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal vetor da riquétsia Anaplasma marginale, o agente etiológico da anaplasmose, uma doença que acomete os rebanhos e causa sérios prejuízos econômicos à pecuária no Brasil. Estabelecemos em nosso laboratório o cultivo da linhagem de células BME26 que são originárias do R. (B.) microplus e também a infecção dessas células por A. marginale, um patógeno que é naturalmente transmitido pelo carrapato. Detectamos que a expressão gênica da defensina e da ixodidina nas células é aumentada frente à infecção por A. marginale, embora nenhuma alteração da expressão gênica da microplusina foi constatada. As células foram expostas a microorganismos inativados por calor e LPS, sendo que a expressão gênica da microplusina é aumentada frente a todos os estímulos. Na exposição das células BME26 com a bactéria Microccocus luteus, a expressão gênica da defensina e da ixodidina não foi alterada e no estimulo com leveduras a expressão gênica da ixodidina foi reprimida. Frente à infecção por A. marginale detectamos, aumento expressão da defensina e ixodidina. Os genes da microplusina e defensina foram silenciadas por RNAi em células infectadas por A. marginale, mas não houve alteração no número de riquétsias / The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of the rickettsia Anaplasma marginale, the etiological agent of anaplasmosis, a disease that affects cattle and causes serious economic losses to the Brazilian cattle industry. We established in our laboratory the embryonic cell culture line BME26 from R. (B.) microplus and infection by A. marginale, a pathogen naturally transmitted by R. (B.) microplus. We verified that defensin and ixodidin gene expression increased in these cells after an infection by A. marginale and no alteration in microplusin gene expression was detected. The BME26 cells were exposed to heat-inactivated microorganims or to LPS, microplusin gene expression increased after all stimuli. After exposure of BME26 cells to Micrococcus luteus, expression levels of defensin and ixodidin did not change and ixodidin gene expression reduced after exposure of these cells to yeast. In the infection by A. marginale we detected defensin and ixodidin gene expression. Also, microplusin and defensin genes were silenced by RNA interference (RNAi) in A. marginale-infected BME26 cells, but we did not observe alteration in the number of MSP4 rickettsias

O agente etiológico da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (RMSF), conhecida no Brasil como Febre Maculosa Brasileira, é a bactéria Rickettsia rickettsii. Essa bactéria é transmitida ao homem pela picada de diferentes espécies de carrapatos ixodídeos. No Brasil, os vetores são Amblyomma cajennense e A. aureolatum. As taxas de prevalência de R. rickettsii nas populações de carrapatos de áreas endêmicas para RMSF são baixas, em geral abaixo de 1%. Essa baixa prevalência parece estar associada a menores taxas reprodutivas e de sobrevivência de linhagens infectadas, sugerindo que R. rickettsii seja patogênica também para os seus vetores. Infecções experimentais demonstraram que 80-100% dos indivíduos de uma colônia de A. aureolatum mantida em laboratório são infectados por R. rickettsii, enquanto apenas 10-60% de A. cajennense adquirem a bactéria. Esses dados indicam que as respostas dessas duas espécies de carrapatos à infecção sejam diferentes, resultando em diferentes taxas de prevalência da bactéria. Dessa maneira, a caracterização molecular das interações entre carrapatos do gênero Amblyomma e a bactéria R. rickettsii é importante, podendo gerar informações não somente para o esclarecimento acerca dos mecanismos de patogenicidade de R. rickettsii para os carrapatos, mas também para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pela aparente restringência de A. cajennense à infecção. Assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) analisar os efeitos da infecção por R. rickettsii sobre o perfil de expressão gênica de carrapatos A. cajennense por hibridação subtrativa por supressão (SSH), (ii) validar os dados de SSH por reação em cadeia de polimerase quantitativa precedida por transcrição reversa (RT-qPCR) e (iii) caracterizar funcionalmente dois genes com expressão induzida pela infecção por RNA de interferência (RNAi). Após a análise bioinformática dos dados de SSH, 44 sequências únicas foram obtidas, das quais 36 representam genes com expressão induzida e 8 genes com expressão reprimida pela infecção. A indução dos genes codificadores da subunidade I da citocromo c oxidase (COX1), da subunidade IV da NADH desidrogenase, de uma proteína com domínio de inibidor de serina-proteases Kunitz-type (papilina-like), identificados por SSH, e de um peptídeo antimicrobiano (hebraeína), foi confirmada por RT-qPCR. O silenciamento gênico da hebraeína e da papilina-like não teve nenhum efeito na aquisição de R. rickettsii pelo vetor, indicando que, isoladamente, não são responsáveis pela proteção de A. cajennense contra a infecção. Os dados gerados pelo presente estudo abrem perspectivas para que outros genes sejam avaliados quanto ao seu papel na aquisição de R. rickettsii, os quais, no futuro, podem ser considerados como alvos para o desenvolvimento de vacinas. / The etiologic agent of the Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF), also known as Brazilian Spotted Fever in Brazil, is the bacterium Rickettsia rickettsii. This rickettsia is transmitted to humans by the bite of various tick species. In Brazil, Amblyomma cajennense and A. aureolatum are known as vectors. The prevalence rates of R. rickettsii infected ticks in RMSF endemic areas are low, oscillating around 1%. These low prevalence rates seems to be associated with lower reproductive and survival rates of infected ticks, suggesting that R. rickettsii is also pathogenic to its vectors. Experimental infections with R. rickettsii have demonstrated that 80 to 100% of A. aureolatum ticks from a laboratory colony acquire this bacterium, whereas only 10 to 60% of A. cajennense ticks become infected. These results indicate that the responses of these two tick species against infection are different, resulting in different prevalence rates of the bacterium. Therefore, the elucidation of the interactions between ticks of the genera Amblyomma and the bacterium R. rickettsii at a molecular level is important to provide information to better understand the mechanisms of pathogenicity of R. rickettsii against ticks as well as for the elucidation of the mechanisms responsible for the apparent refractoriness of A. cajennense against infection. Therefore, the objectives of the current study were: (i) analyze the effets of the infection with R. rickettsii on the gene expression of ticks A. cajennense by suppression subtractive hybridization (SSH), (ii) validate SSH data by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and (iii) functionally characterize two genes induced by infection using RNA interference (RNAi). After bioinformatics analysis of SSH data, 44 unique sequences were obtained, among which 36 represent genes with expression induced and 8 repressed genes by infection. The induction of genes encoding subunit I of cytochrome c oxidase (COX1), the NADH dehydrogenase subunit IV, a protein containing Kunitz-type inhibitor domain (papilin-like), identified by SSH, and an antimicrobial peptide (hebraein), was confirmed by RT-qPCR. The effects of knockdown of hebraein and papilin-like encoding genes had no effect on the acquisition of R. rickettsii by the vector. Data of the current study may be used to evaluate the role of other genes in acquisition of R. rickettsii, which, in the future, may be considered as target for vaccine development.

O uso da técnica de RNAi vem sendo avaliada em diversos insetos-pragas pois, é uma estratégia inovadora que pode ser integrada no manejo de importantes pragas agrícolas. Os insetos da Ordem Lepidoptera são reconhecidos por apresentarem recalcitrância à técnica de silenciamento utilizando dsRNA. Assim, ajustes devem ser feitos aos métodos de entrega de dsRNA para que haja estabilidade da molécula até atingir o mRNA alvo de silenciamento no inseto. O silenciamento gênico por RNAi possui potencial de uso para o controle da \"traça-do-tomateiro\" Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae), uma das principais pragas do tomateiro no mundo. O objetivo do trabalho foi selecionar e avaliar o silenciamento de genes de T. absoluta, utilizando o método de entrega de dsRNA via bactéria E. coli HT115 (DE3), disponibilizada em dieta artificial. Também, objetivando a aplicabilidade da utilização de bactérias que se desenvolvam no mesmo hábitat de insetos-pragas, estudou-se a colonização das bactérias endofíticas Pantoea agglomerans linhagem 33.1, Burkholderia sp. linhagem SCMS54 e Burkholderia ambifaria linhagem RZ2MS16 em plantas de tomateiro e lagartas de T. absoluta, para posterior transformação e tentativa de utilização como estratégia de entrega de dsRNA para silenciamento de genes alvos de T. absoluta. Foram avaliados, por meio da metodologia de dieta artificial, oito genes de T. absoluta: juvenile hormone inducible protein - JHP; juvenile hormone epoxide hydrolase protein - JHEH; ecdysteroid 25-hydroxylase - PHM; chitin synthase A - CHI; glutathione S-transferase epsilon 2 - GST; carboxylesterase - COE; alkaline phosphatase - AP e; arginine kinase - AK. Por meio de avaliação dos parâmetros biológicos (mortalidade larval; duração da fase larval e peso de pupas) e expressão gênica em cinco períodos de alimentação, comprovou-se a eficiência da metodologia na avaliação do silenciamento gênico por RNAi, sendo possível realizar screening de grande quantidade de genes e avaliar os efeitos do silenciamento gênico no desenvolvimento de T. absoluta. Os genes AK, CHI e JHP apresentaram resultados positivos quanto ao silenciamento gênico e mortalidade larval, sendo promissores para uso de silenciamento por RNAi como estratégia de controle de T. absoluta. Pantoea agglomerans apresentou os melhores resultados de colonização de plantas de tomateiro \"Micro-Tom\" e lagartas de T. absoluta, além de estarem presentes em tecidos preferencialmente utilizados na alimentação das lagartas. Porém, lagartas não apresentaram diferenças na mortalidade larval ao se alimentarem de plantas de tomateiro \"Micro-Tom\" inoculadas com bactérias de P. agglomerans transformadas. / The use of RNAi technique has been evaluated in several insect pests because it is an innovative strategy that can be integrated in the management of important agricultural pests. Insects of the Order Lepidoptera are recognized to present recalcitrance to gene silencing using dsRNA. Thus, adjustments should be done to dsRNA delivery methods to have molecule stability until it reaches the mRNA target for silencing in the insect. Gene silencing by RNAi has potential use to control the tomato leafminer Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae), one of the main insect pests of tomato crop worldwide. The objective of this work was to select and evaluate the silencing of T. absoluta genes using dsRNA delivery method via E. coli HT115 (DE3) bacterium, offered in artificial diet. Also, aiming the applicability of the use of bacteria growing in the same habitat of insect pests, we evaluate the colonization of the endophytic bacteria Pantoea agglomerans strain 33.1, Burkholderia sp. strain SCMS54 and Burkholderia ambifaria strain RZ2MS16 in tomato plants and T. absoluta larvae for further transformation and potential use as dsRNA delivery strategy for silencing target genes of T. absoluta. We evaluated eight genes of T. absoluta: juvenile hormone inducible protein - JHP; juvenile hormone epoxide hydrolase protein - JHEH; ecdysteroid 25-hydroxylase - PHM; chitin synthase A - CHI; glutathione S-transferase epsilon 2 - GST; carboxylesterase - COE; alkaline phosphatase - AP and; arginine kinase - AK. Evaluating biological parameters (larval mortality, larval stage duration and pupal weight) and gene expression in five feeding periods, we proved the efficiency of the methodology in the evaluation of gene silencing by RNAi, and evaluated the effects of gene silencing on the development of T. absoluta. The genes AK, CHI and JHP presented positive results regarding gene silencing and larval mortality, being promising to use RNAi silencing as a strategy to control T. absoluta. Pantoea agglomerans showed good results colonizing \"Micro-Tom\" tomato plants and T. absoluta larvae, besides being present in tissues preferentially used by larvae for feeding. However, larvae did not show differences in larval mortality when feeding on tomato plants inoculated with transformed P. agglomerans.

O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal vetor da riquétsia Anaplasma marginale, o agente etiológico da anaplasmose, uma doença que acomete os rebanhos e causa sérios prejuízos econômicos à pecuária no Brasil. Estabelecemos em nosso laboratório o cultivo da linhagem de células BME26 que são originárias do R. (B.) microplus e também a infecção dessas células por A. marginale, um patógeno que é naturalmente transmitido pelo carrapato. Detectamos que a expressão gênica da defensina e da ixodidina nas células é aumentada frente à infecção por A. marginale, embora nenhuma alteração da expressão gênica da microplusina foi constatada. As células foram expostas a microorganismos inativados por calor e LPS, sendo que a expressão gênica da microplusina é aumentada frente a todos os estímulos. Na exposição das células BME26 com a bactéria Microccocus luteus, a expressão gênica da defensina e da ixodidina não foi alterada e no estimulo com leveduras a expressão gênica da ixodidina foi reprimida. Frente à infecção por A. marginale detectamos, aumento expressão da defensina e ixodidina. Os genes da microplusina e defensina foram silenciadas por RNAi em células infectadas por A. marginale, mas não houve alteração no número de riquétsias / The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of the rickettsia Anaplasma marginale, the etiological agent of anaplasmosis, a disease that affects cattle and causes serious economic losses to the Brazilian cattle industry. We established in our laboratory the embryonic cell culture line BME26 from R. (B.) microplus and infection by A. marginale, a pathogen naturally transmitted by R. (B.) microplus. We verified that defensin and ixodidin gene expression increased in these cells after an infection by A. marginale and no alteration in microplusin gene expression was detected. The BME26 cells were exposed to heat-inactivated microorganims or to LPS, microplusin gene expression increased after all stimuli. After exposure of BME26 cells to Micrococcus luteus, expression levels of defensin and ixodidin did not change and ixodidin gene expression reduced after exposure of these cells to yeast. In the infection by A. marginale we detected defensin and ixodidin gene expression. Also, microplusin and defensin genes were silenced by RNA interference (RNAi) in A. marginale-infected BME26 cells, but we did not observe alteration in the number of MSP4 rickettsias

Submitted by CAMILA LEONEL DA SILVA null (camilaleonels_1@hotmail.com) on 2016-05-02T19:33:26Z No. of bitstreams: 1 TESE - Camila Leonel da Silva.pdf: 12839463 bytes, checksum: a432431aa8b8009a0183a4c0896c3e34 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T19:19:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_cl_dr_sjrp.pdf: 12839463 bytes, checksum: a432431aa8b8009a0183a4c0896c3e34 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T19:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_cl_dr_sjrp.pdf: 12839463 bytes, checksum: a432431aa8b8009a0183a4c0896c3e34 (MD5) Previous issue date: 2016-04-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A transição epitélio-mesenquimal (EMT) é o processo pelo qual as células cancerosas a partir de tumores primários passam por uma conversão fenotípica para invadir e migrar, gerar metástases em tecidos ou órgãos distantes. Este processo pode ser induzido por fatores de crescimento, tais como Fator de Crescimento Transformante beta (TGF-β) e sua alta expressão tem sido implicada na angiogênese tumoral, na migração e invasão celular em muitos tipos de tumores. A expressão de ROCK-1 está associada com a malignidade dos tumores, enquanto a inibição desta molécula resulta em uma supressão significativa de metástases tumorais. A metformina, um fármaco utilizado no tratamento da diabetes, demonstrou inicialmente inibir a EMT e impedir o fenótipo mesenquimal pela repressão transcricional de pontos chave da regulação da EMT (ZEB1, TWIST1, SNAIL2, TGF-β) em células de câncer de mama. Os objetivos foram avaliar a expressão gênica e proteica de marcadores relacionados a metástase, em um estudo in vitro e in vivo, em linhagens de câncer de mama, após o tratamento com metformina, além do silenciamento gênico do TGF-β1 para inibição da transição epitélio-mesenquimal. Foi realizado a transfecção da linhagem celular metastática de tumor mamário canino CF41 de forma estável após a construção de um pequeno RNA de interferência para desenvolver derivados clonais que expressam níveis reduzidos de TGF-β1 (células TGF-β1sh). Este foi subsequentemente combinado com o tratamento com metformina, para analisar os efeitos sobre a migração de células, assim como a expressão dos marcadores de EMT E-caderina e N-caderina, quantificados através de imunofluorescência e do qRT-PCR. As linhagens mamárias humanas MCF-7 (não-metastática) e MDA-MB-231 (metastática) foram tratadas com metformina e inibidor Y27632, após a indução da EMT por TGF-β1 para examinar os efeitos sobre a migração destas células, bem como a expressão proteica dos marcadores ROCK-1, vimentina, E-caderina, CD44 e CD24 por imunocitoquímica. Em um estudo in vivo, as células não modificadas CF41 ou que expressam TGF-β1 shRNA foram injetadas na região inguinal de camundongos fêmea nude atímicos tratados com metformina. Os camundongos foram eutanasiados após o tratamento e os pulmões foram recolhidos para avaliação do número de metástases. As regiões metastáticas foram subsequentemente avaliadas pela expressão de N-caderina, E-caderina, vimentina e claudina-7 através da imuno-histoquímica. Foi possível avaliar que a taxa de migração e invasão foi menor em células TGF-β1sh, em comparação com as células parentais CF41 e esta inibição foi significativa quando combinado com o tratamento com metformina. As análises in vitro demonstraram que o tratamento com metformina reduziu a expressão de N-caderina e aumentou a expressão de E-caderina nas células CF41 e TGF-β1sh. Os resultados demonstram também que após a indução do TGF-β1 nas linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 houve menor expressão das proteínas ROCK-1, vimentina, CD44 e CD24 em ambas as linhagens após tratamento com metformina e Y27632. Nas células MDA-MB-231 a expressão de E-caderina foi maior em todos os grupos de tratamento. O tratamento da linhagems MDA-MB-231 com metformina e Y27632 reduziu significativamente a invasão destas células. O estudo in vivo demonstrou que o tratamento com metformina reduziu o número de metástases pulmonares em animais portadores de tumores induzidos com as células TGF-β1sh. Houve diminuição da expressão de marcadores mesenquimais N-caderina e vimentina, e aumento da expressão de marcadores epiteliais E-caderina e claudina-7 nas metástases pulmonares. Assim, concluimos que este estudo confirma os benefícios do silenciamento do TGF-β1, além do tratamento com metformina e Y27632 como potenciais agentes terapêuticos em tumores de mama, bloqueando o processo de EMT e seu potencial metastático. / Epithelial mesenchymal transition (EMT) is the process by which cancer cells from primary tumors pass through a phenotypic conversion to invade and migrate, generating metastases in organs or tissues distant. This process can be induced by growth factors such as transforming growth factor beta (TGF-β) and its overexpression has been implicated in tumor angiogenesis, cell migration and invasion in many cancers. ROCK-1 expression is associated with the malignant character of tumors, while inhibiting this molecule results in a significant suppression of tumor metastasis. Metformin, a drug use for the treatment of diabetes, was previously shown to inhibit EMT by suppressing expression of key transcription factors in breast cancer cells. The aims were to evaluate the gene expression and protein expression of related markers metastasis, in a study in vitro and in vivo in breast cancer cell lines after treatment with metformin in addition to the gene silencing of TGF-β1 for inhibiting epithelial-mesenquimal transition. These aims were contemplated performing transfected of canine metastatic mammary tumor cell line CF41 with small interfering RNA constructs to develop clonal derivatives expressing reduced levels of TGF-β1 (TGF-β1sh cells). This was subsequently combined with metformin treatment, to look at effects on cell migration, as well as the expression of the EMT markers E-cadherin and N-cadherin, which were quantified by immunofluorescence and qRT-PCR. MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines were treated with metformin and Y27632, after induction of EMT by TGF-β1, to examine the effects on cell migration as well as the protein expression of the ROCK-1 markers, vimentin, E-cadherin, CD44 and CD24 by immunocitochemistry. In an in vivo study, unmodified or TGF-β1 shRNA-expressing CF41 cells were injected in the inguinal region of nude athymic female mice that were treated with metformin. Mice were sacrificed after treatment and the lungs were collected to assess the number of metastases. Metastatic nodules were subsequently assessed for, N-cadherin, E-cadherin, vimentin and claudin-7 expression via immunohistochemistry. With the obtained results it was possible to assess the migration and invasion rate was lower in TGF-β1sh cells as compared to parental CF41 cells and this inhibition was significant when combined with metformin treatment. In vitro analyses demonstrated that metformin treatment reduced n-cadherin expression and increased E-cadherin expression in both CF41 and TGF-β1sh cells. After TGF-β1 induction in MDA-MB231 and MCF-7 cell lines, there was a lower protein expression of ROCK-1, vimentin, CD44 and CD24 in both cell lines after treatment with metformin and Y27632. In MDA-MB-231 cells, E-cadherin expression was increased in all treatment groups. Treatment of MDA-MB-231 cell line with metformin and Y27632 significantly reduced the invasion of these cells. In vivo studies demonstrated that metformin treatment reduced the number of lung metastases in animals bearing TGF-β1sh tumors. This paralleled a decreased expression of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin, and increased expression of epithelial markers E-cadherin and claudin-7 in lung metastases.This study confirms the benefits of TGF-β1 silencing in addition to metformin and Y27632 as potential therapeutic agents in mammary tumors, by blocking EMT process and metastatic potential. / FAPESP: 2012/09778-1

O presente estudo avaliou o papel do receptor AT1 de Angiotensina II no desenvolvimento da hipertrofia dos cardiomiócitos promovida pelo T3, bem como a participação dos mecanismos intracelulares deflagrados pelo receptor AT1 neste modelo de hipertrofia cardíaca. O silenciamento do receptor AT1 com RNA de interferência preveniu totalmente o desenvolvimento da hipertrofia dos cardiomiócitos induzida pelo T3. Os cardiomiócitos tratados com T3 demonstraram uma rápida ativação da via da Akt/GSK-3/mTOR, a qual foi atenuada ou prevenida pelo silenciamento do receptor AT1. Ainda, a expressão de Angiotensina I/II no lisado celular e a expressão do receptor AT1 foram rapidamente aumentados pelo T3. Esses dados demonstram pela primeira vez que o receptor AT1 é um mediador crítico da hipertrofia dos cardiomiócitos induzida pelo T3, bem como para a ativação da via da Akt, sugerindo que a via Ang I/II-AT1-Akt/GSK-3/mTOR corresponde a um potencial mediador dos efeitos tróficos exercidos pelo T3 nessas células. / The present study investigated the role of Angiotensin type 1 receptor (AT1R) in T3-induced cardiomyocyte hypertrophy, as well as the participation of the intracellular mechanisms mediated by AT1R in this cardiac hypertrophy model. The AT1R silencing using small interfering RNA totally prevented the development of T3-induced cardiomyocyte hypertrophy. The cardiomyocytes treated with T3 demonstrated a rapid activation of Akt/GSK-3/mTOR signaling pathway, which was attenuated or prevented by the AT1R silencing. In addition, local Angiotensin I/II (Ang I/II) levels and the AT1R expression were rapidly increased by T3 treatment. These data demonstrate for the first time that the AT1R is a critical mediator to the T3-induced cardiomyocyte hypertrophy, as well as to the activation of the Akt signaling, suggesting that the Ang I/II-AT1R-Akt/GSK-3/mTOR pathway corresponds to a potential mediator of the trophic effect exerted by T3 in cardiomyocytes.

O uso da técnica de RNAi vem sendo avaliada em diversos insetos-pragas pois, é uma estratégia inovadora que pode ser integrada no manejo de importantes pragas agrícolas. Os insetos da Ordem Lepidoptera são reconhecidos por apresentarem recalcitrância à técnica de silenciamento utilizando dsRNA. Assim, ajustes devem ser feitos aos métodos de entrega de dsRNA para que haja estabilidade da molécula até atingir o mRNA alvo de silenciamento no inseto. O silenciamento gênico por RNAi possui potencial de uso para o controle da \"traça-do-tomateiro\" Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae), uma das principais pragas do tomateiro no mundo. O objetivo do trabalho foi selecionar e avaliar o silenciamento de genes de T. absoluta, utilizando o método de entrega de dsRNA via bactéria E. coli HT115 (DE3), disponibilizada em dieta artificial. Também, objetivando a aplicabilidade da utilização de bactérias que se desenvolvam no mesmo hábitat de insetos-pragas, estudou-se a colonização das bactérias endofíticas Pantoea agglomerans linhagem 33.1, Burkholderia sp. linhagem SCMS54 e Burkholderia ambifaria linhagem RZ2MS16 em plantas de tomateiro e lagartas de T. absoluta, para posterior transformação e tentativa de utilização como estratégia de entrega de dsRNA para silenciamento de genes alvos de T. absoluta. Foram avaliados, por meio da metodologia de dieta artificial, oito genes de T. absoluta: juvenile hormone inducible protein - JHP; juvenile hormone epoxide hydrolase protein - JHEH; ecdysteroid 25-hydroxylase - PHM; chitin synthase A - CHI; glutathione S-transferase epsilon 2 - GST; carboxylesterase - COE; alkaline phosphatase - AP e; arginine kinase - AK. Por meio de avaliação dos parâmetros biológicos (mortalidade larval; duração da fase larval e peso de pupas) e expressão gênica em cinco períodos de alimentação, comprovou-se a eficiência da metodologia na avaliação do silenciamento gênico por RNAi, sendo possível realizar screening de grande quantidade de genes e avaliar os efeitos do silenciamento gênico no desenvolvimento de T. absoluta. Os genes AK, CHI e JHP apresentaram resultados positivos quanto ao silenciamento gênico e mortalidade larval, sendo promissores para uso de silenciamento por RNAi como estratégia de controle de T. absoluta. Pantoea agglomerans apresentou os melhores resultados de colonização de plantas de tomateiro \"Micro-Tom\" e lagartas de T. absoluta, além de estarem presentes em tecidos preferencialmente utilizados na alimentação das lagartas. Porém, lagartas não apresentaram diferenças na mortalidade larval ao se alimentarem de plantas de tomateiro \"Micro-Tom\" inoculadas com bactérias de P. agglomerans transformadas. / The use of RNAi technique has been evaluated in several insect pests because it is an innovative strategy that can be integrated in the management of important agricultural pests. Insects of the Order Lepidoptera are recognized to present recalcitrance to gene silencing using dsRNA. Thus, adjustments should be done to dsRNA delivery methods to have molecule stability until it reaches the mRNA target for silencing in the insect. Gene silencing by RNAi has potential use to control the tomato leafminer Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae), one of the main insect pests of tomato crop worldwide. The objective of this work was to select and evaluate the silencing of T. absoluta genes using dsRNA delivery method via E. coli HT115 (DE3) bacterium, offered in artificial diet. Also, aiming the applicability of the use of bacteria growing in the same habitat of insect pests, we evaluate the colonization of the endophytic bacteria Pantoea agglomerans strain 33.1, Burkholderia sp. strain SCMS54 and Burkholderia ambifaria strain RZ2MS16 in tomato plants and T. absoluta larvae for further transformation and potential use as dsRNA delivery strategy for silencing target genes of T. absoluta. We evaluated eight genes of T. absoluta: juvenile hormone inducible protein - JHP; juvenile hormone epoxide hydrolase protein - JHEH; ecdysteroid 25-hydroxylase - PHM; chitin synthase A - CHI; glutathione S-transferase epsilon 2 - GST; carboxylesterase - COE; alkaline phosphatase - AP and; arginine kinase - AK. Evaluating biological parameters (larval mortality, larval stage duration and pupal weight) and gene expression in five feeding periods, we proved the efficiency of the methodology in the evaluation of gene silencing by RNAi, and evaluated the effects of gene silencing on the development of T. absoluta. The genes AK, CHI and JHP presented positive results regarding gene silencing and larval mortality, being promising to use RNAi silencing as a strategy to control T. absoluta. Pantoea agglomerans showed good results colonizing \"Micro-Tom\" tomato plants and T. absoluta larvae, besides being present in tissues preferentially used by larvae for feeding. However, larvae did not show differences in larval mortality when feeding on tomato plants inoculated with transformed P. agglomerans.

O agente etiológico da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (RMSF), conhecida no Brasil como Febre Maculosa Brasileira, é a bactéria Rickettsia rickettsii. Essa bactéria é transmitida ao homem pela picada de diferentes espécies de carrapatos ixodídeos. No Brasil, os vetores são Amblyomma cajennense e A. aureolatum. As taxas de prevalência de R. rickettsii nas populações de carrapatos de áreas endêmicas para RMSF são baixas, em geral abaixo de 1%. Essa baixa prevalência parece estar associada a menores taxas reprodutivas e de sobrevivência de linhagens infectadas, sugerindo que R. rickettsii seja patogênica também para os seus vetores. Infecções experimentais demonstraram que 80-100% dos indivíduos de uma colônia de A. aureolatum mantida em laboratório são infectados por R. rickettsii, enquanto apenas 10-60% de A. cajennense adquirem a bactéria. Esses dados indicam que as respostas dessas duas espécies de carrapatos à infecção sejam diferentes, resultando em diferentes taxas de prevalência da bactéria. Dessa maneira, a caracterização molecular das interações entre carrapatos do gênero Amblyomma e a bactéria R. rickettsii é importante, podendo gerar informações não somente para o esclarecimento acerca dos mecanismos de patogenicidade de R. rickettsii para os carrapatos, mas também para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pela aparente restringência de A. cajennense à infecção. Assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) analisar os efeitos da infecção por R. rickettsii sobre o perfil de expressão gênica de carrapatos A. cajennense por hibridação subtrativa por supressão (SSH), (ii) validar os dados de SSH por reação em cadeia de polimerase quantitativa precedida por transcrição reversa (RT-qPCR) e (iii) caracterizar funcionalmente dois genes com expressão induzida pela infecção por RNA de interferência (RNAi). Após a análise bioinformática dos dados de SSH, 44 sequências únicas foram obtidas, das quais 36 representam genes com expressão induzida e 8 genes com expressão reprimida pela infecção. A indução dos genes codificadores da subunidade I da citocromo c oxidase (COX1), da subunidade IV da NADH desidrogenase, de uma proteína com domínio de inibidor de serina-proteases Kunitz-type (papilina-like), identificados por SSH, e de um peptídeo antimicrobiano (hebraeína), foi confirmada por RT-qPCR. O silenciamento gênico da hebraeína e da papilina-like não teve nenhum efeito na aquisição de R. rickettsii pelo vetor, indicando que, isoladamente, não são responsáveis pela proteção de A. cajennense contra a infecção. Os dados gerados pelo presente estudo abrem perspectivas para que outros genes sejam avaliados quanto ao seu papel na aquisição de R. rickettsii, os quais, no futuro, podem ser considerados como alvos para o desenvolvimento de vacinas. / The etiologic agent of the Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF), also known as Brazilian Spotted Fever in Brazil, is the bacterium Rickettsia rickettsii. This rickettsia is transmitted to humans by the bite of various tick species. In Brazil, Amblyomma cajennense and A. aureolatum are known as vectors. The prevalence rates of R. rickettsii infected ticks in RMSF endemic areas are low, oscillating around 1%. These low prevalence rates seems to be associated with lower reproductive and survival rates of infected ticks, suggesting that R. rickettsii is also pathogenic to its vectors. Experimental infections with R. rickettsii have demonstrated that 80 to 100% of A. aureolatum ticks from a laboratory colony acquire this bacterium, whereas only 10 to 60% of A. cajennense ticks become infected. These results indicate that the responses of these two tick species against infection are different, resulting in different prevalence rates of the bacterium. Therefore, the elucidation of the interactions between ticks of the genera Amblyomma and the bacterium R. rickettsii at a molecular level is important to provide information to better understand the mechanisms of pathogenicity of R. rickettsii against ticks as well as for the elucidation of the mechanisms responsible for the apparent refractoriness of A. cajennense against infection. Therefore, the objectives of the current study were: (i) analyze the effets of the infection with R. rickettsii on the gene expression of ticks A. cajennense by suppression subtractive hybridization (SSH), (ii) validate SSH data by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and (iii) functionally characterize two genes induced by infection using RNA interference (RNAi). After bioinformatics analysis of SSH data, 44 unique sequences were obtained, among which 36 represent genes with expression induced and 8 repressed genes by infection. The induction of genes encoding subunit I of cytochrome c oxidase (COX1), the NADH dehydrogenase subunit IV, a protein containing Kunitz-type inhibitor domain (papilin-like), identified by SSH, and an antimicrobial peptide (hebraein), was confirmed by RT-qPCR. The effects of knockdown of hebraein and papilin-like encoding genes had no effect on the acquisition of R. rickettsii by the vector. Data of the current study may be used to evaluate the role of other genes in acquisition of R. rickettsii, which, in the future, may be considered as target for vaccine development.

INTRODUÇÃO: A exposição a níveis elevados de pressão sonora é a segunda causa mais comum de perda auditiva sensorioneural adquirida. Está relacionada à morte celular por apoptose, necrose e/ou necrose programada (necroptose) devido ao dano mecânico e/ou metabólico, ocasionando a degeneração de estruturas cocleares como células ciliadas, sobretudo externas, células de suporte e de fibras aferentes do nervo coclear. Estudos têm demostrado um aumento na citocina inflamatória TNFa após a exposição ao ruído, bem como a melhoria auditiva relacionada ao uso de etanercepte, que é um bloqueador destacitocina. Neste contexto, este estudo teve por objetivo avaliar o efeito do silenciamento gênico do Tnfa na audição de ratos Wistar, expostos ao ruído branco, e identificar o perfil de expressão gênica na via metabólica desse gene. METODOLOGIA: Foram incluídos ratos Wistar do sexo masculino, jovens com limiar auditivo no Peate clique de 50 dBSPL. Os animais foram submetidos à introdução do siRNA Tnfa em uma orelha, e siRNA scramble na orelha contralateral por via trans-timpânica com posterior exposição à 120 dBSPL de ruído branco por 3h. Foi realizado Peate clique e remoção das cócleas para obtenção do cDNA e avaliação da expressão gênica da via metabólica do Tnfa por meio de qRT-PCR. Um grupo de animais, não submetidos ao silenciamento, foi exposto ao ruído para análise dessa via metabólica. Para o cálculo da expressão gênica relativa (Rq) utilizamos o método do deltaCT comparativo e o teste t-Student pareado para avaliar os parâmetros no Peate clique. RESULTADOS: A taxa de silenciamento observada foi de 74,1%. A média do limiar eletrofisiológico nas orelhas silenciadas foi estaticamente melhor que a orelha scramble (p < 0,001) com valores médios de 49,5 +- 10.5. A amplitude média da onda I em 80 dBSPL e das ondas II e IV em 90 dBSPL foi estatisticamente maior na orelha siRNA Tnfa, sem alteração na latência nas intensidades audíveis,para ambos os lados. A exposição ao ruído promoveu aumento da expressão do gene Tnfa e de seu receptor Tnfrsf1A, 24h após à exposição, associado ao aumento da expressão de genes relacionados à apoptose e diminuição de genes relacionados à sobrevida celular. CONCLUSÃO: O ruído promoveu aumento de expressão do gene Tnfa e de genes envolvidos na apoptose, associado à perda auditiva em modelo experimental. A administração trans-timpânica do siRNA Tnfa promoveu preservação do limiar eletrofisiológico e da amplitude da onda I, II e IV no Peate clique, após exposição ao ruído intenso, sugerindo que a inibição deste pode ser uma estratégia de preservação auditiva promissora. O silenciamento do Tnfa inibiu a disfunção coclear após estímulo acústico, sugerindo que esta proteína é um dos principais agentes envolvidos na perda auditiva induzida pelo ruído, devendo ser considerada como alvo terapêutico na estratégia de preservação auditiva / INTRODUCTION: Exposure to high levels of sound pressure is the second most common cause of acquired sensorineural hearing loss. It is related to cell death through apoptosis, necrosis and/or programmed necrosis (necroptosis) due to mechanical and/or metabolic damage, causing the degeneration of cochlear structures, such as cilliary cells, mainly external, as well as support cells and afferent fibers of the cochlear nerve. Studies have demonstrated an increase in the inflammatory cytokine TNFalfa after exposure to noise, as well as auditory improvement related to the use of etanercept, a cytokine blocker. In this context, this study aimed to evaluate the effect of Tnfa gene silencing on the hearing of Wistar rats exposed to white noise and to identify the expression profile in the metabolic pathway of this gene. METHODOLOGY: Young male Wistar rats with 50 dBSPL threshold in auditory brainstem responses click (ABR) were included in this study and submitted to the introduction of the TnfasiRNA in one ear and the scramble siRNA in the contralateral ear by trans-tympanic route, with subsequent exposure to 120 dB SPL of white noise for 3h. ABR was measured and the cochleae were dissected and used for the extraction of total RNA to obtain cDNA and conduct evaluations of the Tnfa metabolic pathway gene expression by qRT-PCR. A group of animals, not submitted to silencing, was exposed to noise to analyze this metabolic pathway. The relative gene expression (Rq) was calculated by the comparative deltaCT method and the paired Student t-test were applied to evaluate the parameters of the ABR click. RESULTS: The silencing rate was 74.1%. The mean electrophysiological threshold in the silenced ears was statistically higher than the scrambled ear (p < 0.001) with mean values of 49.5 +- 10.5. The mean amplitudes of wave I at 80 dBSPL and waves II and IV at 90dBSPL were statistically higher in the TnfasiRNA ear, with no change in latency at audible intensities for both sides. Noise exposure promoted increased expression of the Tnfa gene and its receptor, Tnfrsf1A, 24h after exposure, associated with increased expression of genes related to apoptosis and decreased expression of genes related to cell survival. CONCLUSIONS: Noise exposure promoted increased in Tnfa gene expression as well as in genes involved in apoptosis, associated with hearing loss in an experimental model. The trans-tympanic administration of TnfasiRNA promotes the preservation of the electrophysiological threshold and the amplitude of wave I, II and IV in the ABR click, after exposure to intense noise, suggesting that this inhibition may be a promising auditory preservation strategy. The Tnfa knockdown inhibited cochlear dysfunction after acoustic injury, suggesting that this protein plays an important role in noise induced hearing loss and should be considered a therapeutic target in auditory preservation strategies

As moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86, expressas na superfície de células dendríticas (DCs), as principais células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs), possuem participação fundamental na indução de resposta e manutenção de tolerância, motivo pelo qual são consideradas alvos terapêuticos promissores. Essas moléculas promovem o segundo sinal necessário à ativação e proliferação dos linfócitos T por meio da ligação ao receptor CD28, ou inibem a resposta por essas células por meio da ligação ao receptor CTLA-4, ambos expressos na superfície dos linfócitos. Muitos são os relatos da literatura indicando diferenças tanto quantitativas quanto qualitativas entre CD80 e CD86 na capacidade de ativação de linfócitos T, os mais relevantes apontando diferenças na capacidade de indução de diferenciação de linfócitos para os padrões Th1 e Th2 de secreção de citocinas. Porém, tais relatos são muitas vezes contraditórios, e o verdadeiro papel funcional dessas moléculas ainda está por ser estabelecido. Assim, propusemo-nos a estabelecer as metodologias necessárias para silenciar as moléculas CD80 e CD86 em células dendríticas (DCs) humanas, derivadas de monócitos do sangue periférico, por meio da tecnologia de RNA de interferência. Isso possibilitaria esclarecer o papel desempenhado por cada uma dessas moléculas na capacidade de ativação de linfócitos T. Para tanto, padronizou-se a transfecção reversa de DCs do quarto dia da cultura com siRNA fluorescente e os agentes de transfecção lipídicos siPORT e iMAX, tendo sido obtidas eficiências de transfecção de 64,7% ± 5,2 e 69,7% ± 14,5%, respectivamente. DCs do quarto dia de cultura foram transfectadas com siRNAs específicos para CD80, e o fenótipo avaliado após 48 horas da transfecção. Foi possível identificar, além do eficiente silenciamento de CD80 por dois dos três siRNAs testados, também uma diminuição, inesperada, de células CD86+. Para o silenciamento de CD86, células CD14+ selecionadas positivamente por beads magnéticas foram transfectadas com siRNAs específicos para CD86, ativadas após 24 horas da transfecção e o silenciamento avaliado após 24 horas da ativação. Embora o silenciamento conseguido por um dos dois siRNAs testados tenha sido muito pequeno, observou-se fenômeno equivalente, com diminuição de células CD80+. Embora inconclusivos, esses dados sugerem a possibilidade de modulação recíproca dessas moléculas. Assim, pudemos obter a transfecção eficiente de DCs com siRNAs de interesse e, através deles, modular a expressão de CD80 e CD86. Com estes instrumentos, portanto, podemos agora desenvolver estudos quanto ao papel de cada uma destas moléculas na fisiologia da apresentação antigênica pelas DCs. / The costimulatory molecules CD80 and CD86, expressed on surface of dendritic cells (DCs), are essential to trigger T cell activation and to maintain self tolerance, indicating that these molecules are promising therapeutic targets. They can either bind to CD28 on T cells, promoting T cell activation and leading to their proliferation and cytokine production, or to CTLA-4, which is expressed following T cell activation, and can inhibit T cell response. Though CD80 and CD86 are thought to provide equivalent T cell costimulation, a growing body of evidence suggests that there are different functional consequences of CD28 engagement by these two molecules. Many reports point to variations in their ability to stimulate different lymphocyte subsets. However, there is still controversy in the literature and the actual role of CD80 and CD86 remains to be elucidated. Therefore, the aim of this study was to establish the methodology necessary to silence, by small interfering RNAs (siRNAs), both CD80 and CD86 expression on monocyte-derived dendritic cells. These findings would be the base of studys that could better elucidate the function of these two coestimulatory molecules in T cell activation. Therefore, transfection of 4th day DCs with fluorescent siRNA and lipidic transfection agents siPORT and iMAX was established, an d transfection efficiency observed was 64,7% ± 5,2 e 69,7% ± 14,5%, respectively. 4th day DCs were transfected with specific CD80 siRNAs and phenotype was observed after 48 hours of transfection. Besides CD80 efficient silencing by two from three siRNAs tested, there was an unexpected decrease in CD86+ cells. To establish CD86 silencing, CD14+ cells were positively selected with magnetic beads and immediately transfected with CD86 specific siRNAs, activated after 24 hours of transfection, and phenotype was observed after 24 hours of activation. Despite the fact that silencing conferred by one of two siRNAs was very low, equivalent phenomenon was observed, with a decrease in CD80+ cells. Although the observed effects were inconclusive, these data suggests a possible reciprocal modulation by these two molecules. Therefore, we were able to obtain efficient DC transfection with siRNAs of interest, as well as modulate CD80 and CD86 expression. With these instruments we can now develop studies regarding the real physiological role of these two costimulatory molecules in DCs antigen presentation.