G3BP1 and G3BP2 are members of a highly conserved family of multi-functional RNA binding proteins, which appear to co-ordinate signal transduction and post-transcriptional gene regulation. Both proteins are over-expressed in cancer, and G3BP1 promotes cell proliferation and survival. Aberrant expression of various RNA binding proteins is common in cancer, and several of these proteins influence tumorigenesis. Therefore, detailed examination of RNA binding proteins, such as G3BPs, may provide insights into the post-transcriptional mechanisms underlying tumorigenesis. Tumours arise as a consequence of genetic mutation or alteration, which often result from stress-induced DNA damage. Cancer progression is facilitated by various epigenetic stress adaptation mechanisms. Stressful stimuli induce transitory translational shut-off, mediated by phosphorylation of eukaryotic initiation factor alpha;(eIF2alpha;). This phosphorylation event leads to formation of discrete cytoplasmic foci known as stress granules (SGs), which are translationally-silent sites of mRNA sorting. It was initially thought that an RNA-binding protein, T-cell internal antigen 1 (TIA-1), was instrumental in both the formation and functioning of SGs, because over-expression of TIA-1 induces spontaneous SGs and concomitantly causes a decrease in reporter gene expression. It is now clear that SG content can change depending on the type of stress, and that various proteins, including G3BP1, can induce spontaneous SGs. In vitro evidence previously implicated both G3BP1 and G3BP2 as endoribonucleases, so it was suggested that G3BPs act to target mRNA for decay at the SG. This project sought to further investigate this proposal, and in this way gain insight into the specific function of G3BPs in post-transcriptional regulation during tumorigenesis. Characterisation of G3BP1 and G3BP2 expression and localisation patterns in human cells and cancer was necessary before functional analyses in human cell systems could be undertaken. Both proteins were found to be over-expressed in breast cancer, irrespective of cancer stage or grade. G3BP1 and G3BP2 were also expressed in all human cell lines tested, despite previously observed tissue-specific expression. These results support the notion that G3BP expression is switched on in parallel with cell proliferation, and as such, may influence tumorigenesis. The results of further analyses suggested that the diverse functions attributed to G3BP1 and G3BP2 may be facilitated by isoform-specific expression, various post-translational modifications and sub-cellular localisation. Despite the absence of a canonical endoribonuclease domain, it was previously reported that site-specific phosphorylation of G3BP1 enables the protein to degrade a synthetic c-myc RNA substrate in vitro. This finding implicated G3BP in the specific regulation of a proto-oncogene. Tailored reporter assays were thus designed in order to address the in vivo consequences of G3BP's putative endoribonuclease activity. Contrary to expectations, all G3BP family members increased or maintained the expression of a range of reporters, at both the mRNA and protein level, irrespective of the presence of any particular cis-acting element, coding sequence or promoter. These results support the emerging notion that G3BPs positively affect the expression of at least some of their target mRNAs, and may also indirectly promote transcription. In contrast to the theory that G3BPs degrade proto-oncogenic mRNA/s, these findings are consistent with a role for G3BP in promoting cell proliferation and survival. Further analyses showed that G3BP1 and G3BP2 simultaneously increased reporter gene expression and induced SG formation. These findings highlighted the fact that SGs are dynamic sorting stations for mRNAs, and not merely sites of stalled translation. This result also supports the notion that a variety of proteins may be recruited to the SG to facilitate a multitude of mRNA fates. Although the precise role of the SG in stress adapation is not known, it is clear that an appropriate integrated stress response (ISR) is required for cells to survive in sub-optimal conditions. It was found that specific G3BP1 knockdown inhibited SG formation and cell survival, and this appeared to occur downstream of eIF2alpha; phosphorylation. The phosphorylation of eIFalpha; is the only factor known to be necessary for SG formation and cell survival. This data is the first to implicate SG formation itself, downstream of eIF2alpha; phosphorylation, in the survival phase of the ISR. The results also suggest that G3BP1 plays a pivotal role in the post-transcriptional mechanisms underlying stress adaptation. To facilitate future analysis of G3BP roles in the regulation of specific transcripts and in SG biology, a pilot study to identify G3BP RNA ligands was undertaken. Immunoprecipitation of epitope-tagged G3BP1 from stable cell lines facilitated purification and isolation of RNA in association with G3BP1. Specific RNA transcripts were subsequently detected and identified by microarray. Many genes were enriched in the G3BP1 immunoprecipitate. Transcript enrichment in the control immunoprecipitate was comparatively weak and seemingly random, suggesting that several replicates will enable generation of a reliable target list. This work forms a promising basis for further investigations into G3BP functionality, and also provides a platform for broader and more large-scale analyses of the mechanisms of post-transcriptional gene regulation. The work presented in this thesis addressed the potential post-transcriptional mechanisms by which the G3BP family of proteins mediate cell proliferation and survival. Both G3BP1 and G3BP2 were shown to be over-expressed in tumours and each appeared to promote reporter gene expression. G3BP1 was also found to play a pivotal role in stress adaptation. A technique to identify novel RNA ligands was assessed, and it was found that G3BP1 may interact with various mRNA transcripts. It is hypothesised that the G3BP family of proteins, and in particular G3BP1, function to determine the fate of specific RNAs in response to cellular stress and other stimuli. In this way, G3BP proteins may facilitate appropriate responses to extra-cellular stimuli which allow for cell proliferation and survival.

La découverte de l’ARN interférence et des micro-ARN a permis de définir un principe majeur de régulation de l’expression des gènes, et a produit de nouveaux outils pour la médecine. Chez les mammifères, l’étude des fonctions des micro-ARN a été restreinte au cytoplasme, bien qu’ils soient aussi présents dans le noyau.Cette thèse présente une série d’expériences visant à caractériser les facteurs moléculaires requis pour l’activité nucléaire des micro-ARN. Nous avons débuté ce projet en explorant les partenaires ARN-dépendant de la protéine AGO2 par immunoprécipitation et spectrométrie de masse quantitative. Parmi les interactants ARN-dépendants, nous nous sommes concentrés sur trois protéines nucléaires abondantes : SFPQ, PSPC1 et NONO qui forment la famille drosophila behavior and human splicing (DBHS). Nous avons démontré que le complexe RISC nucléoplasmique est associé aux protéines SFPQ, PSPC1 et NONO dans plusieurs lignées cellulaires murines et humaines, d’une manière qui dépend de SFPQ. Des expériences de type HITS-CLIP de la protéine AGO2 et/ou de la protéine SFPQ dans des cellules souches nous ont permis de montrer que SFPQ se lie préférentiellement aux 3’UTR longs en utilisant deux motifs spécifiques. En effet, SFPQ contrôle significativement environ 20% de l’activité de liaison de AGO2, ce qui est répercuté au niveau transcriptomique. Cependant, cette activité concerne uniquement les sites de liaison de SFPQ proches (<500 nucléotides) de AGO2. De plus, nous avons observé que cette régulation s’étend aux ARNm cytoplasmiques. Ce résultat suggère que la liaison et l’agrégation de la protéine SFPQ à l’ARN programme la structure du 3’UTR et donc les possibilités de ciblage par les miARN dans le noyau, et ceci d’une manière qui semble préservée dans le cytoplasme. Enfin, nous avons montré en particulier que l’expression de SFPQ contrôle le programme de ciblage par let-7a, et module la transition des cellules souches vers l’état différencié.
Ces résultats contribuent à la diversité des mécanismes de régulation de l’activité des miARN. Dans la deuxième partie du projet, nous avons exploré les partenaires ARN-indépendant de la protéine nucléaire AGO2. Nous avons découvert que la protéine AGO2 interagit avec le complexe CCR4-NOT1 et l’exosome nucléaire d’une manière indépendante de l’ARN. Nous proposons une série d’expériences visant à confirmer ces résultats. Brièvement, l’hypothèse de travail qui semble la plus cohérente avec les données actuelles est la liaison directe de l’exosome au module CNOT2-CNOT3 du complexe CCR4-NOT1. Ce modèle permettrait d’expliquer le mécanisme d’extinction des gènes par les miARN nucléaires qui reposerait donc sur leur interaction avec les complexes CCR4-NOT1 et exosome. Son mode opératoire comprendrait des protéines de liaison à l’ARN et des micro-ARN pour sélectionner les cibles. / The discovery of RNA interference and micro-RNA has unravelled a fundamental principle of gene expression regulation, and has produced new tools for medicine. In mammals, the study of micro-RNA functions have been confined to the cytoplasm, although there is a growing body of evidence about their presence in the nucleus.This thesis present a set of experiments directed towards understanding the molecular factors required for nuclear miRNA activity.We started this project by exploring the RNA-dependent interactors of AGO2 by immunoprecipitation followed by quantitative mass spectrometry analysis. We focused on three partners: SFPQ, PSPC1 and NONO which are abundant nuclear proteins and belong to the DBHS family (drosophila behavior and human splicing). We demonstrated that the nucleoplasmic RISC complex associates with DBHS proteins in multiple murine and human cell lines in an SFPQ-dependent manner.HITS-CLIP experiments of AGO2 and SFPQ proteins in mouse embryonic stem cells showed that SFPQ preferentially binds long 3’UTR using two specific motifs. Using these motifs, SFPQ significantly controls about 20% of local AGO2 binding activity and target mRNA stability as we observe by transcriptomic analysis. SFPQ mode of action appears to be local and SFPQ motifs are functional only when proximal to AGO2 binding sites in a window of 500 nucleotides.Moreover, although SFPQ is only nuclear, we observe that SFPQ has an effect on cytoplasmic mRNAs, which suggests that SFPQ binding and aggregation to mRNA in the nucleus programs the 3’UTR for miRNA targeting, in a way that appears preserved in the cytoplasm.In particular, we found that SFPQ controls let-7 targeting program and modulates embryonic stem cell differentiation into neuron cells.These results contribute to expand the diversity of miRNA regulatory mechanisms.In the second part of the project, we explored the RNA-independent interactors of AGO2. We discovered that nuclear AGO2 interacts with CCR4-NOT1 complex and the RNA exosome in an RNA-independent manner.We propose a set of experiments to confirm these results, based on a new working model. Briefly, the most likely hypothesis to explain the current data is the direct binding of RNA exosome to the CNOT2-CNOT3 module of CCR4-NOT1 complex.This model would explain the silencing mechanism of genes by nuclear miRNAs, whose activity would depend on the RISC complex interaction with CCR4-NOT1 complex and RNA exosome.Hence, the RNA exosome would use both RNA binding proteins and miRNAs to select targets for degradation, based on CCR4-NOT1 mode of action.

La RNase E chez Escherichia coli est une endoribonucléase essentielle qui joue un rôle important dans la maturation des ARN stables, dans le contrôle qualité des ribosomes, ainsi que dans la dégradation constitutive et régulée des ARN messagers. La séquence de ciblage à la membrane (MTS pour Membrane Targeting Sequence), qui forme une hélice α-amphipatique, ancre la RNase E à la membrane cytoplasmique interne des cellules. La conservation absolue du MTS chez l'ensemble des -protéobactéries suggère un rôle important de la localisation membranaire RNase E dans le métabolisme de l'ARN. Pour élucider la fonction cellulaire de l'association membranaire de la RNase E, nous avons caractérisé la souche rne∆MTS qui exprime une RNase E cytoplasmique. Les résultats de cette étude nous amènent à proposer que l'association membranaire de la RNase E est nécessaire à la stabilité de la RNase E, est impliquée dans des interactions fonctionnelles avec des régulateurs associés à la membrane et protège les transcrits présents dans le nucléoïde en évitant des interactions prématurées avec la RNase E. En particulier, garder la RNase E à la membrane est critique pour la spécificité de la RNase E dans le contrôle qualité des ribosomes. Cette association membranaire est une nouvelle couche de régulation qui permet d’expliquer comment la RNase E, une enzyme avec peu de spécificité de séquence et avec beaucoup de substrat, peut remplir les fonctions de «maturase» et de «dégradase». / RNase E in Escherichia coli is an essential endoribonuclease with important roles in stable RNA maturation, in ribosome quality control and in constitutive and regulated mRNA degradation. The Membrane Targeting Sequence (MTS), which forms an amphipathic α-helix, anchors RNase E on the inner cytoplasmic membrane. The absolute conservation of the MTS among -Proteobacteria suggests an important role for RNase E membrane association in RNA metabolism. To elucidate the cellular function of the membrane association of RNase E, we characterized the rne∆MTS strain expressing cytoplasmic RNase E. The results of this study lead us to propose that RNase E membrane association is necessary for RNase E stability, for functional interactions with membrane-associated regulatory factors and for protecting nascent transcripts in the nucleoid from premature interactions with RNase E. In particular, keeping RNase E to the membrane is critical for the specificity of RNase E in ribosome quality control. Membrane association is a new layer of regulation that can explain how RNase E, an enzyme with little sequence specificity and many substrates, can fulfill both ‘maturase’ and ‘degradase’ functions.

Les ribonucléases et les hélicases à ARN sont des acteurs clé du métabolisme des ARN et jouent donc des rôles cruciaux pour la régulation de l'expression des gènes. Peu de données sont connues concernant ce métabolisme chez les Archées, le troisième domaine du vivant. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse s'intéresse au métabolisme de l'ARN chez les archées et plus particulièrement aux ribonucléases ß-CASP. Dans ce contexte, nous focalisons nos études sur la compréhension physiologique que pourrait jouer les ribonucléases ß-CASP aCPSF1 et aRNase J, orthologue respectivement du facteur de terminaison de la transcription eucaryotes CPSF-73 et RNase J bactérienne. Par analogie avec CPSF-73 et RNase J, qui font partie de complexes multi-protéiques, des indices sur les fonctions des homologues archéens de ces ribonucléases pourraient provenir de l'identification des complexes autour de aCPSF1 et aRNase J. Utilisant des extraits de Pyrococcus abyssi et les protéines recombinantes aCPSF1 et aRNase J comme appâts, nous avons identifié que aRNase J fait partie d'un réseau d'interaction incluant une hélicase de la famille des Ski2-like (ASH-Ski2). En parallèle, des fractionnements d'extrait de P. abyssi sur gradient de saccharose par ultracentrifugation indiquent que aRNase J et ASH-Ski2 sont présentes toutes deux dans les fractions de haut poids moléculaires avec les sous-unités du ribosome et ceux de l'exosome. Nous avons aussi démontré une interaction stable entre aRNase J et ASH-Ski2 ainsi que des motifs impliquées dans cette interaction par des expériences de co- purification par chromatographie d'affinité. De plus, les caractérisations biochimiques de ASH-Ski2 indiquent que cette protéine possède une activité d'hydrolyse de l'ATP dépendant de la présence d'acides nucléiques. ASH-Ski2 possède de plus la capacité d'hybridation et de déroulement de deux brins d'acides nucléiques en présence d'ATP. A notre connaissance, nos résultats sont les premiers à indiquer un complexe contenant une ribonucléase et d'une hélicase à ARN Ski2-like chez les archées. De manière intriguent, aRNase J est orthologue de la RNase J bactérienne et ASH-Ski2 des hélicases Ski2-like des eucaryotes. Cela démontre que les Archées pourraient posséder un système composite impliqué dans le métabolisme des ARN partageant des caractéristiques bactériens et eucaryotes. Ces résultats mettent en lumière l'avantage de l'étude des Archées pour la compréhension des mécanismes moléculaires et évolutives des processus fondamentaux des trois domaines du vivant. / Ribonucleases and RNA helicases are the main actors of RNA processing and have a critical role in gene expression regulation. Little is known about this process in Archaea. Our group focuses in RNA metabolism in Archaea involving ß-CASP ribonucleases. Recently, we published phylogenomic and experimental work demonstrating that archaeal ß-CASP proteins, aCFSF1 and aRNase J, are highly conserved ribonucleases in Archaea. Archaeal aCPSF1, an ortholog of the eukaryal transcription termination factor CPSF73, is ubiquitous in Archaea suggesting an essential conserved function. Archaeal aRNase J, an ortholog of the bacterial ribonuclease RNase J, is conserved through a major phylum of the Archaea, the Euryarchaeota. These findings suggest that the role of these enzymes in RNA processing can be reminiscent of ancient functions that had arisen early in evolution. We now want to focus on understanding the physiological role of aCPSF1 and aRNase J with the hyperthermophilic euryarchaeal Pyrococcus abyssi as model. By analogy to eukaryal CPSF73 and bacterial RNase J, which are part of multiprotein complexes, clues to the function of the archaeal ß-CASP homologs might come from the identification of archaeal multiprotein complex(es) containing aCPSF1 and aRNase J orthologs. Using P. abyssi cell extracts and recombinant aCPSF1 or aRNase J as bait, we have found that aRNase J is a part of protein interaction networks that include Ski2-like RNA helicase (ASH-Ski2). In parallel, fractionation of P. abyssi whole cell extracts in sucrose gradient by ultracentrifugation shows that aRNase J and ASH-Ski2 are present in high sedimentation fractions with ribosomal and exosome sub-units. We also demonstrate a direct interaction of aRNase J with ASH-Ski2 by co-purification affinity chromatography experiments and identify motifs that potentially involve in this interaction. Biochemical characterization of ASH-Ski2 demonstrates a nucleic dependant ATPase activity. ASH-Ski2 also possesses annealing and unwinding activities in presence of ATP. To our knowledge, our results are the first experimental indications of interacting of a complex containing ribonuclease and RNA helicase-like proteins in Archaea. Remarkably, aRNase J is an orthologue of the bacterial RNase J and ASH-Ski2 is an orthologue of the eukaryotic Ski2-like family proteins. This shows that Archaea might possess a composite RNA processing system sharing both eukaryal and bacterial features. This highlights the advantage of an archaeal model to gain further mechanistic and evolutionary information of fundamental processes across the three domains of life.

The life of RNA polymerase II (RNAPII) transcripts is shaped by the dynamic formation of mutually exclusive ribonucleoprotein complexes (RNPs) that direct transcript biogenesis and turnover. A key regulator of RNA metabolism in the nucleus is the scaffold protein ARS2 (arsenic resistance protein 2), that binds to the cap binding complex (CBC) and regulates processing, degradation, and export of RNAPII transcripts. We report here that alternative splicing of ARS2’s intron 5, generates cytoplasmic isoforms that lack 270 amino acids from the N-terminal of the protein and are functionally distinct from nuclear ARS2. ARS2 isoforms distinctive roles are evidenced under physiological conditions and stress. Under physiological conditions, ARS2 isoforms differentially regulate transcript degradation through nonsense mediated decay (NMD). Switching of ARS2 isoforms within the CBC in the cytoplasm has dramatic functional consequences, changing ARS2 from a NMD inhibitor to a NMD promoter that enhances the binding of UPF1 to CBP80 and ERF1, favouring SURF complex formation, SMG7 recruitment and transcript degradation. ARS2 isoform exchange is also relevant during arsenic stress. Cytoplasmic ARS2 is specifically induced during arsenic exposure. It is crucial for arsenic sensitivity, and promotes a global response to arsenic in a CBC independent manner. We propose that ARS2 isoform switching promotes the proper recruitment of RNP complexes during NMD and the cellular response to arsenic stress. The existence of non-redundant ARS2 isoforms is relevant for cell homeostasis, stress response and cancer treatment. / Graduate / 2023-04-14

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La biogenèse des ribosomes est un processus hautement complexe impliquant plusieurs centaines de facteurs de synthèse dont la finalité est la production de toutes les protéines de la cellule. Chaque étapes de la ribogenèse est une source potentielle d’erreur et est vérifiée par des mécanismes de contrôle de qualité redondants et rigoureux. <p><p>Dans la première partie de ma thèse, j’ai collaboré à une meilleure compréhension d’une des voies de la surveillance nucléolaire, celle qui dégrade les pré-ribosomes défectueux recrutée à partir de l’extrémité 3’ des ARN ribosomiques (ARNr). Suite à une erreur d’assemblage, les pré-ARNr sont polyadénylés par le complexe nucléaire TRAMP, ce dernier est recruté cotranscriptionnellement. Les ARNr polyadénylés deviennent alors des substrats pour l’exosome et sont dégradés. <p><p>On ignore comment la synthèse des ARNr, leur maturation et la surveillance nucléolaire sont intégrées mais on suspecte l’existence d’une interface physico-fonctionnelle à l’ADNr. Dans une deuxième partie de ce travail, nous avons testé si des cofacteurs de l’exosome, les protéines Nrd1/Nab3 étaient impliquées dans la surveillance des pré-ARNr. Nous rapportons que, chez la levure S. cerevisiae, le facteur d’élongation Spt5 interagit avec l’ARN polymérase (Pol) I et avec Nrd1. L’interaction entre Spt5 et ces deux protéines requiert la présence d’un domaine particulier situé à l’extrémité C-terminal ressemblant au « Carboxy-terminal domain » (CTD) de la Pol II appelé « Carboxy terminal repeat » (CTR). Spt4/Spt5 et Nrd1/Nab3 interagissent fonctionnellement avec Rrp6, sous-unité catalytique de l’exosome. Ces complexes colocalisent à l’ADNr, comme déterminé par ChIP. Des mutations dans le domaine de liaison à l’ARN (RRM – « RNA recognition motif ») de Nrd1 mais pas dans son domaine de liaison au CTD (CID – « carboxy-terminal interacting domain ») de la Pol II et dans le RRM de Nab3 mènent à l’accumulation de transcrits ribosomiques aberrants polyadénylés. Ceci indique que Nrd1/Nab3 contribue au recrutement de la surveillance nucléolaire à la Pol en cours d’élongation pour « scruter » les transcrits ribosomiques naissants. <p><p>Nous proposons un modèle dans lequel Nrd1/Nab3 sont recrutées à la machinerie d’élongation de la transcription via leur interaction avec Spt5 afin de surveiller la synthèse des transcrits ribosomiques. Si un problème dans la fabrication des transcrits naissants a lieu, des sites de liaison pour Nrd1/Nab3 sur les pré-ARNr normalement recouverts de facteurs de synthèse seraient dénudés. Ceci marquerait les transcrits ribosomiques aberrants et entrainerait leur dégradation par les machineries de dégradation TRAMP et exosome. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La régulation de l’expression génique par des ARNs permet une réponse rapide et polyvalente des cellules à des changements environnementaux. Cependant, elle nécessite souvent des partenaires protéiques. La protéine bactérienne Hfq en est un bon exemple. Facteur de virulence, elle est présente chez une variété de procaryotes et intervient dans nombre de circuits de régulation. Structurellement, Hfq adopte un repliement caractéristique, le repliement Sm. Ainsi, Les feuillets β qui la constituent se regroupent et forment un hexamère toroïdal. Outre cette région N-terminale, il existe aussi parfois une région C-terminale (CTR) de séquence et de longueur variables. Chez E. coli, cette région comprend une trentaine de résidus et est prédite comme non-structurée. Jusqu’à présent, son rôle n’a été que peu étudié.Ce travail de thèse met en lumière de nouvelles pistes quant à la fonction du CTR. Nous avons constaté sa capacité à former des fibres amyloïdes, expliquant la formation de structures auto-assemblées in vivo. De plus, la protéine est capable de lier l’ADN et de le condenser fortement in vitro. Cette compaction est complètement dépendante de la présence du CTR, qui permet de ponter les brins d’ADN. Ce résultat suggère une nouvelle fonction de Hfq dans la structuration du chromosome. Enfin, nous avons démontré que ce domaine permet aussi à Hfq de s’assembler à la surface d’une bicouche lipidique, expliquant sa localisation membranaire. La désorganisation de la membrane qui en résulte pourrait permettre le passage d’ARNs dans le milieu extracellulaire, avec d’importantes implications sur la capacité de la bactérie à interagir avec ses voisines et son environnement. / RNA-based regulations of gene expression allow quick and versatile responses from cells to changing environmental conditions. However, these regulations are often protein-mediated. The bacterial protein Hfq is one of the most studied RNA-based regulation partner. Found in various prokaryotes, it is an important virulence factor involved in many cellular processes. Hfq’s structure resembles a torus, formed by multiple β-sheets. Apart from this N-terminal region (NTR), a supplemental C-terminal region (CTR) with variable lengths and sequences may exist in some species. In E. coli, this specific region measures around 30 residues and is predicted as intrinsically disordered. Few studies focused on Hfq-CTR until recently.This work highlights new potential roles for Hfq-CTR. First, this region is able to self-interact and forms amyloid fibers which explains the self-assembled Hfq superstructures observed in vivo. Second, the protein can bind and efficiently condense DNA in vitro, strengthening the suggested role of Hfq in shaping the bacterial chromosome. This compaction is fully dependent on the CTR which is responsible for DNA bridging. Third, the CTR also gives to Hfq the ability to self-assemble on a lipid bilayer, explaining its membrane-localized fraction observed in vivo. The subsequent membrane reorganization might facilitate the release of RNAs in the extracellular medium, with potential implications on bacterial communication and interaction with surrounding cells and environment.

PPR-Proteine bilden die größte Familie von RNA-Bindeproteinen in Pflanzen und sie werden fast ausschließlich in die Mitochondrien oder Plastiden importiert, wo sie eine wesentliche Rolle im RNA-Metabolismus spielen (Lurin et al., 2004). Doch die Funktionsweise der Proteine ist noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde das plastidäre PPR-Protein PPR5 in Zea mays funktionell charakterisiert, dessen Ortholog in Arabidopsis thaliana essentiell für die Embryogenese ist (Cushing et al., 2005). Mittels PPR5-Immunopräzipitation und einer Analyse der kopräzipitierten RNA konnte in vivo eine spezifische Assoziation mit der ungespleißten tRNA-Glycin (UCC) nachgewiesen werden. Analysen von ppr5-Mais-Mutanten offenbarten einen Stabilitätsverlust dieser RNA. Es wurde gefolgert, dass PPR5 das Transkript vor einem endonukleolytischen Abbau schützt. Die weiteren Projekte der Arbeit widmeten sich der Evolution der Familie. Um Erkenntnisse zur Funktion und Spezifität nahe verwandter PPR-Proteine zu erhalten, wurden die drei nächsten Verwandten von PPR5 identifiziert und Mais-Mutanten isoliert. Weiterhin wurde PPR54 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PPR54 in Mais – wie in Arabidopsis (Tillich, nicht publiziert) – für das Spleißen des ndhA-Introns benötigt wird. Damit wurden erstmalig orthologe PPR-Proteine in einer Mono- und einer Dikotylen funktionell analysiert. Die vorgelegten Analysen mündeten in drei allgemeingültigen Schlussfolgerungen zur Funktion der PPR-Proteine. 1) Plastidäre PPR-Proteine, die in Dikotylen wie Arabidopsis für die Embryogenese notwendig sind, üben eine Funktion in der plastidären Translation aus. 2) Die vorgeschlagene Funktionsweise von PPR5 erfordert nicht die Rekrutierung anderer, katalytisch aktiver Proteine, sondern ihr liegt ein passiver, auf der Bindung einer RNA beruhender Mechanismus zugrunde. 3) Die Funktion orthologer PPR-Proteine ist in Mono- und Dikotylen konserviert, wie am Beispiel von PPR54 experimentell nachgewiesen wurde. / PPR proteins are the largest family of RNA binding proteins in plants and the vast majority of them is localized to mitochondria or chloroplasts, where they are major players in the RNA metabolism of defined transcripts (Lurin et al., 2004). However, the mechanistic function of these proteins is still not clear. In this study, the plastid PPR protein PPR5, whose ortholog in Arabidopsis thaliana is embryo-essential (Cushing et al., 2005), was functionally characterized in Zea mays. By PPR5 immunoprecipitation and analyses of the coimmunoprecipitated RNA, a specific association to the unspliced tRNA glycine (UCC) was shown in vivo. The analysis of ppr5 maize mutants demonstrated a loss of stability of the tRNA precursor in mutants. It was concluded that the interaction with PPR5 protects the unspliced tRNA from endonucleolytic decay. In addition, close relatives of PPR5 were identified in maize (PPR2, PPR50, and PPR51) by phylogenetic means and maize mutants were isolated. A future characterization of four paralogous PPR proteins might answer whether closely related PPR proteins have similar functions or RNA targets. The analysis of PPR54 in maize demonstrated that PPR5 is needed for the splicing of the ndhA intron in maize as it is in Arabidopsis (Tillich, not published). Three important conclusions concerning the function of PPR proteins in general were drawn from the studies of chosen PPR proteins presented here. First, plastid PPR proteins that are essential in embryo development in eudicots like Arabidopsis should be necessary for plastid translation in most cases. Second, the characterization of PPR5 revealed a possibly ancient functional mechanism of PPR proteins which does not invoke the recruitment of additional catalytic factors but relies on the passive binding of RNA elements. Last, the conservation of function of orthologous PPR proteins in monocots and eudicots, which was shown in the case of PPR54, was demonstrated experimentally for the first time.