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L'objectif de cette thèse est d'appliquer la méthode d'identification bactérienne par spectrométrie de masse MALDI-TOF pour une utilisation en routine dans un laboratoire de microbiologie clinique. Dans un 1er temps et de manière prospective, nous avons évalué la performance et le coût-efficacité de l'identification bactérienne de routine par MALDI-TOF par rapport aux techniques conventionnelles d'identification phénotypique. Durant la période des 16 semaines d'étude, nous avons comparé la performance de la technique par MALDI-TOF aux techniques conventionnelles d'identification phénotypique comprenant la coloration de Gram, la galerie API ANA et le Vitek 2. En cas de résultats discordants entre ces deux techniques, l'identification était réalisée par biologie moléculaire. Nous avons montré que le MALDI-TOF est un moyen efficace et rentable pour l'identification des bactéries de routine. Le MALDI-TOF peut être utilisée en 1ère intention dans l'identification bactérienne avant l'ensemble de techniques phénotypiques. Dans un 2ème temps, nous avons évalué rétrospectivement la performance et le coût-efficacité de l'utilisation exclusive de MALDI-TOF en diagnostic bactériologique de routine en comparaison avec les techniques conventionnelles. En analysant les données des 11 dernières années, nous avons montré que le MALDI-TOF est efficace et tout à fait adaptée pour l'identification d'espèce bactérienne en routine. Nous avons également prouvé que MALDI-TOF est un outil puissant pour identifier les espèces bactériennes rarement impliquées dans les infections humaines. Cette technique pourrait être une alternative aux méthodes moléculaires dans le laboratoire clinique. / The objective of this thesis is to apply the method of bacterial identification by MALDI-TOF MS in daily practice in a routine clinical microbiological laboratory. Firstly, we prospectively evaluated the performance and the cost-effective of bacterial identification by MALDI-TOF in comparison with conventional phenotypic identification methods. During a 16-week study, we compared the performance of MALDI-TOF with conventional techniques of identification including Gram staining, API ANA identification strip and automated identification using the Vitek 2. The unmatched identifications between MALDI-TOF and conventional methods were resolved by molecular identification. In this study, we showed that MALDI-TOF was an effective tool and less expensive for the rapid identification of bacterial species in clinical microbiology laboratory. MALDI-TOF can be used in first intention for identification before Gram staining or other phenotypic identification techniques based on physicochemical properties of bacteria. Secondly, we retrospectively evaluated the performance and the cost-effectiveness of the exclusive use of MALDI-TOF in bacteriological diagnosis in comparison with conventional phenotypic identification. 11-year retrospective analysis of data showed that MALDI-TOF was efficient and completely adapted for the routine identification of bacterial species. We also showed that MALDI-TOF had capacity to identify bacterial species that were rarely involved in human diseases. This technique could be an alternative to molecular methods in the clinical laboratory.

Der Klimawandel bedroht Ökosysteme auf der ganzen Welt. Besonders der Anstieg in Länge, Intensität und Häufigkeit von Dürren kann bedeutenden Einfluss auf den globalen Kohlenstoffkreislauf haben. Die Frage, ob Pflanzen und Mikroorganismen anfällig gegenüber ökologischem Stress wie Dürren sind, wurde bereits in vielen Studien für verschiedene Ökosysteme und mit verschiedenen Ansätzen untersucht, aber Analysen von Dürreauswirkungen, die ober- und unterirdische Interaktionen von Pflanzen und Mikroorganismen mit einbeziehen, sind eher selten. Deshalb wird in der vorliegenden Studie die Frage erörtert, wie Trockenheit und/oder Hitze die Interaktionen von Pflanzen und Mikroorganismen in Bezug auf ihre Kohlenstoff-Verbindung beeinflussen. Dies dient zur Bestimmung der Stärke der Pflanze-Mikroorganismen-Kohlenstoff-Verbindung, wenn das Ökosystem an seine Grenzen gebracht wird. Der Fokus liegt deshalb auf durch Trockenstress und Hitze hervorgerufenen Veränderungen in der ober-unterirdischen Kohlenstoff-Dynamik in zwei vom Klimawandel bedrohten Ökosystemen. Es wurde untersucht, wie extreme Klimaereignisse, deren Häufigkeit in Zukunft weiter ansteigen soll, die Kohlenstoff-Verbindung zwischen Pflanzen und Mikroorganismen beeinflusst und wie mikrobielle Gemeinschaften unter diesen Umständen reagieren, um die Resistenz und Reaktionsmechanismen von Ökosystemen im zukünftigen Klimawandel besser vorhersagen zu können. In Kapitel 4 wurde ein Buchenwaldunterholz-Ökosystem untersucht. Buchenwaldmonolithen wurden einem extremen Klimaereignis (Trockenheit und/oder Hitze) ausgesetzt. Die Stärke der Pflanze-Mikroorganismen-Kohlenstoff-Verbindung und Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur und -aktivität wurden mithilfe von stabilen 13C Isotopenmethoden und Ansätzen auf molekularer Basis, wie 16S rRNA- und Phospholipid-Analysen, bestimmt. In Kapitel 5 wurde ein kleines aquatisches Ökosystems untersucht. Zwei emerse aquatische Makrophyten, Phragmites australis und Typha latifolia, wurden in einem Mesokosmos-Experiment mit Sediment aus einem Soll einer einmonatigen Dürre ausgesetzt. Mithilfe einer 13CO2 Pulsmarkierung, sowie PLFA- und nicht-strukturbildenden Kohlenhydrat-Analysen wurde Kohlenstoff von den Blättern in die Wurzeln bis ins Sediment verfolgt, wo er teilweise in mikrobielle Phospholipide eingebaut wird. Diese Studie hat gezeigt, dass die zwei untersuchten Ökosysteme Trockenstress und Hitze relativ gut widerstehen können, zumindest kurzfristig, und dass das Kohlenstoff-Kontinuum, beziehungsweise die Verbindung zwischen ober- und unterirdischen Gemeinschaften, auch unter starkem Stress intakt bleibt. Zusammenfassend scheint es, dass Ökosysteme stark von einem funktionierenden Pflanze-Boden/Sediment-Mikroorganismen Kohlenstoff-Kontinuum abhängen und versuchen, es auch unter starkem Stress zu erhalten, was möglicherweise dazu beiträgt, dem Anstieg von extremen Dürreperioden aufgrund des Klimawandels besser zu widerstehen. / Climate change is threatening ecosystems around the world. Especially the increase in duration, intensity, and frequency of droughts can have a considerable impact on the global carbon cycle. The question whether plants and microbes are susceptible to environmental stress like drought has been assessed in many studies for different ecosystem types and by using numerous approaches, but research on drought effects that includes above- and belowground interactions is rather scarce. Therefore, the present study assesses the question of how drought and/or heat influence the interactions of plants and microbes, especially the carbon coupling, in order to determine the strength of plant-microbe carbon linkages when an ecosystem is pushed to its limits. The focus of this study thus lies on changes in aboveground-belowground carbon dynamics and the subsequent effects on the soil microbial community under drought and/or heat stress in two climate-threatened ecosystems. It was evaluated how extreme climate events, that are predicted to be more frequent in the near future, affect the carbon coupling between plants and microorganisms and how microbial communities respond under these circumstances, in order to be able to better predict ecosystem resistance and response mechanisms under future climate change. In chapter 4 a beech forest understory ecosystem was investigated. An extreme climate event (drought and/or heat) was imposed on beech forest monoliths and the strength of the plant-microbe carbon linkages and changes in the microbial community structure and activity were determined by using stable 13C isotope techniques and molecular-based approaches like 16S rRNA and microbial phospholipid-derived fatty acid (PLFA) analysis. In chapter 5 a small aquatic ecosystems was investigated. Two emergent aquatic macrophytes, Phragmites australis and Typha latifolia, were grown on kettle hole sediment and then exposed to a month-long summer drought in a mesocosm experiment. By conducting a 13CO2 pulse labeling as well as PLFA and non-structural carbohydrate analyses, the fate of carbon was traced from the plant leaves to the roots and into the sediment, where some of the recently assimilated carbon is incorporated into microbial PLFAs. Overall, this study showed that the two investigated ecosystems can endure environmental stress like heat and drought relatively well, at least in the short-term, and that the carbon continuum, or the linkage between above- and belowground communities, remained intact even under severe stress. In conclusion, it seems that ecosystems strongly depend on and try to maintain a functional plant-soil/sediment microorganism carbon continuum under drought, which might help to withstand the increase in extreme drought events under future climate change.

Morphological diversity of 61 Anabaena populations of 13 morphospecies was described under the field conditions of Czech fishponds and reservoirs. Polyphasic approach was then applied in classification of 45 clonal strains isolated from those populations. Detailed morphological analyses were performed and partial 16S rRNA gene sequences were obtained for 33 of the strains, and secondary metabolite production was evaluated in 20 strains. Plasticity of morphological characteristics under varied conditions of light, temperature, nitrogen and phosphorus was studied in selected strains, as well as their temperature and light growth requirements. The results were then discussed with respect to the delimitation of single Anabaena morphospecies. A new genus Sphaerospermum was defined for the morphospecies Anabaena kisseleviana, A. reniformis and Aphanizomenon aphanizomenoides, whose phenotypic and genotypic features differed considerably from all other Anabaena morphospecies. Unique information was provided on the occurrence and distribution of A. reniformis and Aph. aphanizomenoides in the Czech Republic.

We investigated the effects of substrate (cellulose or starch) and different clay contents on the production of microbial extracellular polymeric substances (EPS) and concomitant development of stable soil aggregates. Soils were incubated with different amounts of montmorillonite (+ 0.1%, + 1%, + 10%) both with and without two substrates of contrasting quality (starch and cellulose). Microbial respiration (CO2), biomass carbon (C), EPS-protein, and EPS-polysaccharide were determined over the experimental period. The diversity and compositional shifts of microbial communities (bacteria/archaea) were analysed by sequencing 16S rRNA gene fragments amplified from soil DNA. Soil aggregate size distribution was determined and geometric mean diameter calculated for aggregate formation. Aggregate stabilities were compared among 1–2-mm size fraction. Starch amendment supported a faster increase than cellulose in both respiration and microbial biomass. Microbial community structure and composition differed depending on the C substrate added. However, clay addition had a more pronounced effect on alpha diversity compared to the addition of starch or cellulose. Substrate addition resulted in an increased EPS concentration only if combined with clay addition. At high clay addition, starch resulted in higher EPS concentrations than cellulose. Where additional substrate was not provided, EPS-protein was only weakly correlated with aggregate formation and stability. The relationship became stronger with addition of substrate. Labile organic C thus clearly plays a role in aggregate formation, but increasing clay content was found to enhance aggregate stability and additionally resulted in the development of distinct microbial communities and increased EPS production.

Le microbiome intestinal humain est une importante communauté de microorganismes, spécifique aux individus et aux populations, dont la composition est influencée par de nombreux facteurs, tels que la génétique et les habitudes de vie de son hôte. La diète est cependant un élément majeur façonnant sa structure. Les influences de plusieurs diètes humaines sur le microbiome ont été largement investiguées. Toutefois, l’impact des variations saisonnières inhérentes à certaines diètes est peu connu. La diète traditionnelle inuite est un exemple de régime alimentaire riche en graisses et protéines animales qui varie temporellement en fonction de la disponibilité saisonnière des ressources. Afin d’étudier les dynamiques temporelles du microbiome intestinal inuit en réponse à la diète traditionnelle, des échantillons de papier hygiénique contenant des selles ont été récoltés auprès d’un groupe de volontaire Inuits du Nunavut (Canada) durant huit mois. Un groupe contrôle de Montréalais (Québec, Canada) de descendance européenne, consommant une diète typiquement occidentale, a également été sollicité. La diversité et la composition du microbiome ont été caractérisées par le séquençage de la région V4 de l’ARNr 16s. Les microbiomes obtenus par un échantillonnage de papier hygiénique et de selles ont été comparés. Ces deux méthodes offrent des représentations similaires mais non-identiques du microbiome intestinal. À partir du séquençage d’échantillons de papier hygiénique, nous avons trouvé que les variations inter-individuelles du microbiome sont plus importantes que les variations intra-individuelles au sein de Montréal et du Nunavut. Des différences significatives de la composition du microbiome s’expliqueraient par la consommation différentielle de certains groupes alimentaires. Bien qu’aucune différence saisonnière marquée n’ait été observée, en termes de composition, le microbiome fluctue davantage à travers le temps chez les individus inuits. Ces résultats suggèrent que le microbiome inuit pourrait être façonné par une diète plus variable. Ensemble, nos résultats suggèrent que la diète traditionnelle a encore un impact important sur la composition, la diversité et la stabilité de microbiome inuit, malgré les transitions alimentaires vécues au Nunavut. / The human gut microbiome represents a diverse microbial community specific to individuals and populations, which is heavily influenced by factors such as genetics and lifestyle. Diet is a major force shaping the gut microbiome, and the effects of dietary choices on microbiome composition have been thoroughly investigated. It has been shown that a change in diet also changes the gut microbiome, but the effects of seasonal diets are poorly known. The traditional Inuit diet is primarily based on animal products, which vary seasonally based on prey availability. To investigate the dynamics of the Inuit diet over time, we collected gut microbiome samples from Inuit volunteers living in Resolute Bay (Nunavut, Canada), and compared them to samples collected from individuals of European descent living in Montréal (Québec, Canada) and consuming a typical Western diet. We sequenced the V4 region of the 16S rRNA gene to characterize the diversity and composition of the Inuit microbiome, and surveyed differences among samples collected with toilet paper or from stool. Our results show that these sampling methods provide similar, but non-identical portraits of the microbiome. Based on sequencing from toilet paper samples alone, we found that inter-individual variations of the microbiome community composition were greater than within-individual variations, both in Nunavut and Montreal, with significant differences in microbiome explained by dietary preferences. No defined seasonal shift of microbiome composition was detected in samples collected over time. However, within-individual microbial diversity fluctuated more with time in Nunavut than in Montreal. Together, these results underline that the traditional Inuit diet still has an important impact on the composition, diversity and stability of the Inuit gut microbiome, even if the traditional seasonality of the diet is less pronounced than expected, due to an increasingly westernized diet in Nunavut.

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Les ribosomes sont responsables de la traduction des ARNm en protéines. Des modifications de la composition des ribosomes altèrent son activité de traduction et favorisent la tumorigenèse. L’identification des altérations de composition des ribosomes dans les cancers du sein pourrait être un nouveau mécanisme de tumorigenèse mammaire et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En effet, les cancers du sein restent la première cause de mortalité liés aux cancers chez la femme et leur hétérogénéité induit un problème thérapeutique important. Dans ce contexte, les altérations de composition des ribosomes dans les cancers du sein ont été abordées dans des cohortes humaines et dans des modèles cellulaires de l’EMT (Transition Epithélio-Mésenchymateuse), un processus impliqué dans la tumorigenèse mammaire. Ces travaux ont permis d’identifier : i) deux facteurs impliqués dans la biogenèse des ribosomes, FBL (fibrillarine) et NCL (nucléoline) dont les variations d’expression sont associées à un mauvais pronostic chez les patientes ; et ii) des variations de composition du ribosome et de son activité traductionnelle dans l’EMT. L’ensemble de ces résultats soutient l’existence d’altérations de composition des ribosomes dans les cancers du sein / Ribosomes are responsible of translating mRNAs to proteins. Alterations of ribosome composition modify its translation activity and favour tumourigenesis. Identification of ribosomes composition alterations in breast cancers might correspond to a new mechanism responsible of mammary tumourigenesis and might open up novel therapeutic approaches. Indeed breast cancers represent the first cause of women mortality due to cancers and their heterogeneity induces an important therapeutic problem.In this context, alterations of ribosomes composition were determined in human cohorts and in EMT (Epithelial to Mesenchymal Transition) cellular models, the EMT being a process involved in mammary tumourigenesis. This studies identify : (i) two factors involved in ribosome biogenesis, FBL (fibrillarin) and NCL (nucleolin) whose expression variations are associated with poor prognosis in patients and (ii) variations of ribosome composition and its translational activity in EMT. Altogether, this data support the presence of ribosomes composition alterations in breast cancers

With the advent of industrialization and food processing techniques the sizes of the cereal bran have been drastically reduced. In my thesis, I have tested the effect, if any, of wheat bran and maize bran particle size, in vitro, on the gut microbiota community structure by 16S rRNA sequencing and their function, by Short chain fatty acids (acetate, propionate, butyrate) production. In turn, we also linked the microbiota and SCFA differences to different chemical composition amongst variously sized fractions of wheat and maize bran.

Le snoRNA U3 contient deux motifs conservés C'/D et de B/C qui permettent de recruter les protéines constitutives de la snoRNP U3. La liaison de la protéine Snu13p/15.5 kD à chacun de ces motifs est un préalable pour le recrutement des 4 autres protéines, à savoir : Nop1p, Nop56p et Nop58p sur le motif C'/D et de Rrp9p, une protéine spécifique du snoRNA U3, sur le motif B/C. Nous avons utilisé la structure 3D connue d'une protéine humaine contenant 7 motifs WD-40 et des méthodes de modélisation moléculaire pour proposer un modèle de structure 3D de Rrp9p. En parallèle, nous avons identifié les déterminants nécessaires à l'association des protéines Snu13p, Nop1p, Nop56p et Nop58p sur le motif C'/D du snoRNA U3, ceci en produisant différents variants du snoRNA U3 et en testant leurs capacités fonctionnelles et leurs stabilités dans la levure. Sur la base d'un modèle 3D d'une snoRNP C/D construit par C. Charron, nous avons ensuite formulé des hypothèses sur les interactions possibles entre le motif C'/D et les acides aminés des protéines Snu13p et Nop58p et confirmé ces hypothèses par mutagénèse dirigée. Les données ont en plus révélé qu'une faible quantité de snoRNA U3 est suffisante pour assurer la croissance des levures. Toujours par mutagénèse dirigée et étude des conséquences in cellulo, j'ai pu montrer quelles sont les contraintes en distance entre les motifs C'/D et B/C. Ce qui nous permet de formuler des hypothèses sur leurs positionnements relatifs dans la snoRNP. Au total mon travail a permis d'apporter des informations importantes sur l'architecture et les contraintes fonctionnelles de la snoRNP U3 de levure / U3 snoRNA contains two conserved pairs of boxes C'/D and B/C needed to bind the stably associated proteins. Binding of protein Snu13p/15.5 kD to each of the conserved motifs is a prerequisite for recruitment of the 4 other U3 snoRNP proteins, namely: Nop1p, Nop56p and Nop58p on the C'/D motif and the Rrp9p U3 specific protein on the B/C motif. We used the known 3D structure of a human G protein containing 7 WD-40 motifs and 3D structure homology modeling methods to build a 3D structure model for Rrp9p. In parallel, by production of variant U3 snoRNAs, and by testing their in vivo stabilities and activities, we identified the C'/D determinants needed for association of proteins Snu13p, Nop1p, Nop56p and Nop58p to U3 snoRNA. Based on a 3D structure model of U3 C/D box RNP built by C Charron, we then formulated hypotheses on the possible interactions between the C'/D motif and amino acids from Snu13p and Nop58p and verified the hypotheses by site-directed mutagenesis of yeast cell components. The data also revealed that very low amounts of U3 snoRNA are sufficient to ensure yeast growth. By site directed mutagenesis, I also studied how the C'/D and B/C motifs should be positioned one relative to the other in order to be functional. Taken together, my work brings important information on the architecture of yeast U3 snoRNP and its functional constraints