Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-13Bitstream added on 2014-06-13T20:16:39Z : No. of bitstreams: 1 dipillo_f_me_jabo.pdf: 266438 bytes, checksum: 248a318a5e5422d95006058e8dd1370a (MD5) / A técnica de imunocaptura associada com a reação de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (IC-RT-PCR) executadas tanto pelos procedimentos convencional como em tempo real foram testadas para a detecção rápida do gene da glicoproteína de Matriz (M) do vírus de influenza aviária (AIV) em amostras de líquido cório-alantóide (LCA) e em suabes traqueais e cloacais. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e otimizar a técnica de IC-RT-PCR para o diagnóstico do vírus da Influenza aviária. Os resultados obtidos foram comparados com um sistema empregando “beads” magnéticas em microplacas (AMBION), que é o método padrão de extração de RNA usado no laboratório de referência para diagnóstico de influenza aviária, o National Veterinary Services Laboratory – Ames, EUA (USDA), acrescido ainda de outros métodos de extração tradicionalmente usados nos laboratórios de referência para AIV, como os procedimentos com o uso do solvente orgânico Trizol® (Invitrogen) e com um sistema robotizado e que utiliza “beads” magnéticas (MagNA Pure - ROCHE). A técnica de IC-RT-PCR em tempo real neste estudo detectou a estirpe H2N2 do AIV, sem que nenhum outro dos RNA-vírus heterólogos testados fossem detectados (vírus das doença de Gumboro, de Newcastle e da bronquite infecciosa aviária). Os limites de detecção do IC-RTPCR foram iguais aos obtidos na técnica de extração com o kit da AMBION e menores do que aqueles que foram observados para os métodos de extração com Trizol® (Invitrogen) e com o MagNA Pure. O IC-RT-PCR demonstrou ser um sistema de diagnóstico capaz de conciliar simplicidade operacional e um menor custo com sensibilidade e especificidade analíticas iguais às do procedimento padrão atualmente adotado, podendo ser inclusive por laboratórios dotados de uma infra-estrutura mais simples / The polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription-PCR (RT-PCR), including real-time RT-PCR have been used for the rapid detection of Matrix glycoprotein gene (M gene) Avian influenza virus (AIV). Despite the availability of various RNA extraction methods for using in RT-PCR, isolation and detection of viral RNA are still difficult due to the unstable nature of viral RNA molecules and the presence of PCR inhibitory substances. In this study, a simple method using immune-capture (IC) to recover viral RNA from H2 AIV samples was developed and compared to one standard and two others reference methods used for viral RNA extraction, such as Ambion MagMAXTM kit and Trizol® (Invitrogen) and Magnapure kit (Roche), respectively, with subsequent analysis by real-time RT-PCR. The real-time IC-RT-PCR developed in was able to detect specifically H2N2 AIV strain, without detecting non-related avian RNA-virus pathogens, such as Newcastle disease virus, avian infectious bronchitis virus and Gumboro disease virus. Comparable detection limits were found for IC and the standard RNA extraction method using Ambion MagMAXTM kit, either for the detection of AIV in allantoic fluid suspension or in seeded tracheal and cloacal swab samples by conventional or real time RT-PCR techniques. These methods were less sensitive than Trizol® (Invitrogen) and Magnapure kit (Roche) procedures. Thus, IC was rapid and as sensitive and specific as current standard AIV RNA extraction method for real time or conventional RT-PCR, besides it conciliated simplicity and lower cost and can be applied simultaneously for direct detection of AIV in a large number of samples, including less-equipped laboratories

Orientador: Ciro Moraes Barros / Resumo: Em células da teca e da granulosa, de folículos bovinos, foram detectados quatro transcritos alternativos do receptor do hormônio luteinizante (LHR). Apenas dois deles são traduzidos em proteínas funcionais com afinidades distintas em relação aos ligantes. Em humanos e símios, a isoforma completa ("full-length") tem afinidade pelo LH e hCG, enquanto que a isoforma que apresenta deleção do exon 10 tem afinidade somente pelo hCG. Além disso, isoformas com deleção do exon 3 foram observadas em ratos, embora nenhum outro estudo tenha investigado essa região do gene bovino. Objetivouse com este trabalho caracterizar o padrão da expressão do gene do LHR nas células da teca e da granulosa de folículos antrais bovinos. Ovários foram coletados em matadouro, os folículos (5-14 mm) foram dissecados e as células da teca e da granulosa separadas para extração de RNA total com Trizol. As concentrações de esteróides no fluido folicular foram determinadas por radioimunoensaio (RIE). A expressão gênica do LHR foi mensurada por RTPCR semiquantitativo com oligonucleotídeos iniciadores ("primers") específicos para amplificar o fragmento entre o final da região extracelular e o final da intracelular (LHRBC; "primers" posicionados nos exons 9 e 11). A ocorrência de transcritos alternativos oriundos do início da região extracelular (LHRA; "primers" posicionados nos exons 2 e 9) foi investigada mediante amplificação por RT-PCR. Como controle interno no PCR, utilizou-se a expressão da GAPDH. Paralelamente, células da granulosa cultivadas in vitro foram tratadas com 1 ou 10 ng de FSH no meio de cultura. Mediante RT-PCR, foi investigada a expressão das isoformas do LHRBC nas células da granulosa cultivadas e tratadas com FSH... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Growth of dominant follicle in the absence of circulating FSH and the events following the LH surge that culminate in ovulation, are dependent on the interaction between LH and its receptor (LHR). Four LHR alternative transcripts were described in theca and granulosa cells from bovine follicles. Only two of them can be translated to functional proteins (receptors coupled with G protein) with different affinities to their ligands. In humans and marmosets, the full-length isoform has affinity to both LH and hCG molecules, whereas the isoform with deletion of only exon 10 has affinity to hCG exclusively. Additionally, isoforms with deletion of exon 3 were observed in rats, although no previous report have investigated this region of the bovine gene. The objective of this study was to characterize the pattern of gene expression of the LHR in theca and granulosa cells from bovine antral follicles. Additionally, LHR expression was determined in cultured granulosa cells under FSH treatment. From ovaries collected in abattoir, antral follicles were dissected (5 to 14mm of diameter), and samples of theca and granulosa cells were obtained to total RNA extraction (Trizol protocol). Steroids concentrations in the follicular fluid were determined by RIA. Gene expression of LHR was measured by semiquantitative RT-PCR with specific primers to amplify part of extracellular region (LHRA; primers annealing on exons 2 and 9) and the fragment from the end of extracellular region, including the transmembrane domain and finishing near the end of intracellular region (LHRBC; primers annealing on exons 9 and 11). As internal control of the PCR, it was used GAPDH expression. Cultured granulosa cells were treated with 0, 1 or 10 ng of FSH (3 replicates each dose). As in vivo and positive control, theca cell sample was utilized to comparison... (Complete abstract, access undermentioned electronic address) / Doutor

Os cofatores de ferro-enxofre [Fe-S] estão entre os mais versáteis e antigos cofatores enzimáticos encontrados na natureza. As células têm explorado as propriedades eletrônicas e estruturais destes cofatores inorgânicos para uma ampla variedade de atividades incluindo a transferência de elétrons, a catálise e a ativação de substratos. Um grande número de proteínas está envolvido na biogênese dos cofatores [Fe-S], e este processo pode ser dividido em três etapas principais: (i) formação do enxofre elementar, (ii) montagem do cofator [Fe-S], e (iii) inserção do cofator em apoproteínas. As plantas realizam fotossíntese e respiração, dois processos que requerem proteínas Fe-S, sendo os únicos organismos em que a biossíntese destas proteínas é compartimentalizada. Diversos fatores afetam o desenvolvimento das plantas, entre eles, a temperatura baixa, fator limitante à produtividade e à distribuição geográfica das plantas, incluindo Eucalyptus grandis, uma espécie com grande importância econômica. Devido a esse fato, foi realizada uma análise transcricional dos genes codificados pelo sistema ISC de biossíntese de cofatores [Fe-S] NFS1, ISA1 e ISU1 de E. grandis por meio de PCR quantitativa (RT-qPCR), após plântulas desta espécie serem submetidas ao tratamento de frio. O gene NFS1 teve sua expressão reprimida nas primeiras 48 horas de tratamento, porém, após esse período observa-se um aumento da expressão gênica em relação à condição controle. O genes ISU1 e ISA1 apresentaram maior expressão gênica nas primeiras duas horas de tratamento, diminuindo drasticamente logo após este período. Foi verificado um aumento na quantidade relativa de Fe e S nos nas plântulas submetidas ao tratamento de frio, indicando um possível aumento na quantidade de cofatores [Fe-S] requeridos para o reestabelecimento da homeostase celular. As bactérias, por sua vez, desenvolveram pelo menos três sistemas de biossíntese, altamente conservados, que estão envolvidos na formação dos cofatores [Fe-S], sendo estes NIF, ISC e SUF. Em muitas proteobactérias, a regulação da produção de cofatores [Fe-S] pelos sistemas ISC e SUF é controlada por uma única proteína, IscR, pertencente à família de reguladores Rrf2. A proteína IscR possui um domínio de ligação ao DNA na região N-terminal e um segundo domínio de ligação de cofatores com três resíduos de cisteínas (Cys) altamente conservados. A ligação de um cofator do tipo [2Fe-2S] reprime a transcrição do seu próprio promotor in vitro. O genoma de Azotobacter vinelandii não inclui um sistema SUF completo e, portanto, permite o estudo dos efeitos da regulação de IscR não relacionada a SUF. No presente trabalho, objetivamos analisar a expressão do operon isc em linhagens selvagens e mutantes para IscR de A. vinelandii por meio das técnicas de sequenciamento do transcritoma e RT-qPCR. As substituições das Cys92, Cys104, His107 e a deleção de 120 pb da região codificadora do segundo domínio de IscR levaram à indução de um aumento da expressão de todo o operon isc. Notou-se também uma diferença fenotípica clara no tamanho das colônias portadoras das substituições de Cys e His, sendo estas menores em relação à linhagem selvagem. As substituições das Cys98 e Cys111, ou ainda a dupla substituição Cys98/111 não levaram a alteração da expressão do operon. A ligação ou não do cofator [Fe-S] é, portanto, responsável pela regulação do operon isc em A. vinelandii, bem como, de outros operons codificadores de proteínas envolvidas em cadeias tranportadoras de elétrons. / The iron-sulfur clusters [Fe-S] are among the oldest and most versatile enzyme cofactors found in nature. The cells have explored the structural and electronic properties of these inorganic clusters for a wide variety of activities including electron transfer, catalysis and activation of substrates. A large number of proteins is involved in the biogenesis of the [Fe-S] clusters, and this process can be divided into three main steps: (i) formation of elemental sulfur, (ii) assembly of the [Fe-S] cluster and (iii) insertion into apoproteins. Plants perform photosynthesis and respiration, two processes that require Fe-S protein, and in these organisms the synthesis of these proteins is compartmentalized. Several factors affect the development of plants, among them, the low temperature is a limiting factor to productivity and geographical distribution of plants, including Eucalyptus grandis, a specie with great economic importance. Due to this fact, we performed a transcriptional analysis by quantitative PCR (RT-qPCR) of the genes encoded by the E. grandis [Fe-S] cluster ISC system NFS1, ISA1 and ISU1 after seedlings were submitted to the chilling treatment. The NFS1 gene expression is repressed in the first 48 hours of treatment, but after this period there was an increase in gene expression relating to the control condition. The genes ISU1 and ISA1 showed higher gene expression in the first two hours of treatment, followed by a sharp decrease. There was an increase in the relative amount of Fe and S in the seedlings subjected to cold treatment, indicating a possible increase in the amount of [Fe-S] clusters, required for the reestablishment of cellular homeostasis. Bacteria have developed at least three synthesis systems, highly conserved, which are involved in the formation of Fe-S proteins, NIF, ISC and SUF. In many proteobacteria, the regulation of clusters production by ISC and SUF is controlled by a single protein, IscR, belonging to the Rrf2 regulators family. The protein IscR has a DNA binding site at the N-terminal domain and second cofactors binding domain with three cysteine residues (Cys) highly conserved. The binding of a [2Fe-2S] cluster represses the transcription of its own promoter in vitro. The genome of Azotobacter vinelandii does not include a full SUF system and thus permits the study of the effects of IscR regulation unrelated to SUF. In this study, the aim was to analyze the expression of isc operon in wild type and mutant strains of A. vinelandii IscR by the techniques of the transcriptome sequencing and qRT-PCR. The replacement of Cys92, Cys104, His107 and a deletion of 120 bp region encoding the second IscR domain led to an increased expression of the whole isc operon. It also showed a clear phenotypic difference in colonies size in the strains carrying the substitutions of His and Cys, it was smaller compared to the wild type strain. The replacement of Cys98 and Cys111, or the double substitution Cys98/111 not led to an altered operon expression. The [Fe-S] cluster binding or not, is therefore responsible for the regulation of the isc operon in A. vinelandii as well as of other operons encoding proteins involved in electron tranport chains.

Os cofatores de ferro-enxofre [Fe-S] estão entre os mais versáteis e antigos cofatores enzimáticos encontrados na natureza. As células têm explorado as propriedades eletrônicas e estruturais destes cofatores inorgânicos para uma ampla variedade de atividades incluindo a transferência de elétrons, a catálise e a ativação de substratos. Um grande número de proteínas está envolvido na biogênese dos cofatores [Fe-S], e este processo pode ser dividido em três etapas principais: (i) formação do enxofre elementar, (ii) montagem do cofator [Fe-S], e (iii) inserção do cofator em apoproteínas. As plantas realizam fotossíntese e respiração, dois processos que requerem proteínas Fe-S, sendo os únicos organismos em que a biossíntese destas proteínas é compartimentalizada. Diversos fatores afetam o desenvolvimento das plantas, entre eles, a temperatura baixa, fator limitante à produtividade e à distribuição geográfica das plantas, incluindo Eucalyptus grandis, uma espécie com grande importância econômica. Devido a esse fato, foi realizada uma análise transcricional dos genes codificados pelo sistema ISC de biossíntese de cofatores [Fe-S] NFS1, ISA1 e ISU1 de E. grandis por meio de PCR quantitativa (RT-qPCR), após plântulas desta espécie serem submetidas ao tratamento de frio. O gene NFS1 teve sua expressão reprimida nas primeiras 48 horas de tratamento, porém, após esse período observa-se um aumento da expressão gênica em relação à condição controle. O genes ISU1 e ISA1 apresentaram maior expressão gênica nas primeiras duas horas de tratamento, diminuindo drasticamente logo após este período. Foi verificado um aumento na quantidade relativa de Fe e S nos nas plântulas submetidas ao tratamento de frio, indicando um possível aumento na quantidade de cofatores [Fe-S] requeridos para o reestabelecimento da homeostase celular. As bactérias, por sua vez, desenvolveram pelo menos três sistemas de biossíntese, altamente conservados, que estão envolvidos na formação dos cofatores [Fe-S], sendo estes NIF, ISC e SUF. Em muitas proteobactérias, a regulação da produção de cofatores [Fe-S] pelos sistemas ISC e SUF é controlada por uma única proteína, IscR, pertencente à família de reguladores Rrf2. A proteína IscR possui um domínio de ligação ao DNA na região N-terminal e um segundo domínio de ligação de cofatores com três resíduos de cisteínas (Cys) altamente conservados. A ligação de um cofator do tipo [2Fe-2S] reprime a transcrição do seu próprio promotor in vitro. O genoma de Azotobacter vinelandii não inclui um sistema SUF completo e, portanto, permite o estudo dos efeitos da regulação de IscR não relacionada a SUF. No presente trabalho, objetivamos analisar a expressão do operon isc em linhagens selvagens e mutantes para IscR de A. vinelandii por meio das técnicas de sequenciamento do transcritoma e RT-qPCR. As substituições das Cys92, Cys104, His107 e a deleção de 120 pb da região codificadora do segundo domínio de IscR levaram à indução de um aumento da expressão de todo o operon isc. Notou-se também uma diferença fenotípica clara no tamanho das colônias portadoras das substituições de Cys e His, sendo estas menores em relação à linhagem selvagem. As substituições das Cys98 e Cys111, ou ainda a dupla substituição Cys98/111 não levaram a alteração da expressão do operon. A ligação ou não do cofator [Fe-S] é, portanto, responsável pela regulação do operon isc em A. vinelandii, bem como, de outros operons codificadores de proteínas envolvidas em cadeias tranportadoras de elétrons. / The iron-sulfur clusters [Fe-S] are among the oldest and most versatile enzyme cofactors found in nature. The cells have explored the structural and electronic properties of these inorganic clusters for a wide variety of activities including electron transfer, catalysis and activation of substrates. A large number of proteins is involved in the biogenesis of the [Fe-S] clusters, and this process can be divided into three main steps: (i) formation of elemental sulfur, (ii) assembly of the [Fe-S] cluster and (iii) insertion into apoproteins. Plants perform photosynthesis and respiration, two processes that require Fe-S protein, and in these organisms the synthesis of these proteins is compartmentalized. Several factors affect the development of plants, among them, the low temperature is a limiting factor to productivity and geographical distribution of plants, including Eucalyptus grandis, a specie with great economic importance. Due to this fact, we performed a transcriptional analysis by quantitative PCR (RT-qPCR) of the genes encoded by the E. grandis [Fe-S] cluster ISC system NFS1, ISA1 and ISU1 after seedlings were submitted to the chilling treatment. The NFS1 gene expression is repressed in the first 48 hours of treatment, but after this period there was an increase in gene expression relating to the control condition. The genes ISU1 and ISA1 showed higher gene expression in the first two hours of treatment, followed by a sharp decrease. There was an increase in the relative amount of Fe and S in the seedlings subjected to cold treatment, indicating a possible increase in the amount of [Fe-S] clusters, required for the reestablishment of cellular homeostasis. Bacteria have developed at least three synthesis systems, highly conserved, which are involved in the formation of Fe-S proteins, NIF, ISC and SUF. In many proteobacteria, the regulation of clusters production by ISC and SUF is controlled by a single protein, IscR, belonging to the Rrf2 regulators family. The protein IscR has a DNA binding site at the N-terminal domain and second cofactors binding domain with three cysteine residues (Cys) highly conserved. The binding of a [2Fe-2S] cluster represses the transcription of its own promoter in vitro. The genome of Azotobacter vinelandii does not include a full SUF system and thus permits the study of the effects of IscR regulation unrelated to SUF. In this study, the aim was to analyze the expression of isc operon in wild type and mutant strains of A. vinelandii IscR by the techniques of the transcriptome sequencing and qRT-PCR. The replacement of Cys92, Cys104, His107 and a deletion of 120 bp region encoding the second IscR domain led to an increased expression of the whole isc operon. It also showed a clear phenotypic difference in colonies size in the strains carrying the substitutions of His and Cys, it was smaller compared to the wild type strain. The replacement of Cys98 and Cys111, or the double substitution Cys98/111 not led to an altered operon expression. The [Fe-S] cluster binding or not, is therefore responsible for the regulation of the isc operon in A. vinelandii as well as of other operons encoding proteins involved in electron tranport chains.

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:21:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Degaki_KarinaYumi_M.pdf: 2877669 bytes, checksum: b1e725db393d6287fab125efb8b00e16 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As células natural killer uterinas (uNK) atuam na modulação da interface materno-fetal e homeostasia do útero gestante, sem desencadear a atividade citolítica típica de uma resposta imune inata. Contudo, ao provocar uma lesão cirúrgica no embrião (LCE) ocorrem alterações no comportamento das células uNK de camundongos e possível indução da atividade citolítica. O presente trabalho avaliou a expressão gênica de mediadores relacionados tanto com a ativação, quanto efetores da atividade citotóxica das células uNK no útero gestante de camundongos frente à anomalia provocada pela LCE. Foram avaliadas as expressões dos genes perforina, granzima-A, IFN-y, IL-15, IL-18, TNF-a, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L através do RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) semi-quantitativo, a partir do RNAtotal obtido de homogenados teciduais da região mesometrial (RM) dos sítios uterinos de camundongos no 9º dia de gestação normal e grupos de animais submetidos à LCE nos períodos de 0,5, 1, 2, 6, 12 e 24 horas pós-LCM e, de RNA obtido de células uNK isoladas de animais gestantes normais. Foram investigadas também as diferenças nas expressões dos genes DAP12, IFN-??e TNF-a ?em RNA extraídos de células uNK imaturas e maduras microdissecadas de criocortes da RM pela microscopia de captura a laser (LCM) e avaliadas pelo qRT-PCR (quantitative Real Time-PCR). Os resultados do RT-PCR confirmam a expressão de todos os genes avaliados nos homogenados da RM e nas células uNK isoladas não foram detectadas apenas os genes da IL-15 e IL-2. Pela análise semi-quantitativa dos amplicons do RT-PCR os genes das proteínas citolíticas, granzima-A e perforina, juntamente com citocinas pró-inflamatórias IFN- y ?e TNF-a ?apresentaram aumentos significativas em 1h após a LCE e redução para níveis próximos do animal normal nos períodos após 6h da LCE. O aumento na expressão destes genes relacionado com a resposta imune inata das células NK, sugere uma rápida mudança do comportamento das células uNK em resposta à LCE, cujas ativações podem envolver a expressão do gene DAP12 que também mostra tendências de aumento nos mesmos períodos pós-LCE. Por outro lado, a expressão dos genes IL-15, IL-2, IL-18 e IL-6 relacionada com a migração, proliferação e diferenciação das células uNK não teve uma variação significativa entre as amostras de gestação normal e pós-LCE. Do sistema Fas/FasL, a redução significante do FasL resulta na regulação negativa da indução de morte celular por apoptose das células uNK, podendo prolongar a viabilidade destas células no ambiente uterino alterado pela LCE. Estes resultados comprovam que a LCE induz uma rápida regulação positiva da expressão dos genes relacionados com mecanismos de citotoxicidade da resposta imune inata das células uNK. Pelas análises dos genes DAP12, TNF-??e IFN-y ?através do qRT-PCR do RNA extraído de células uNK isoladas pela LCM identificaram-se diferenças nas expressões destes genes entre as células uNK imaturas e maduras classificadas atualmente por critérios morfológicos. As diferenças de expressões comprovam a ocorrência de subpopulações com heterogenidade funcional não atribuível apenas a subtipos de estágios de diferenciação celular e com possíveis domínios de distribuição específica no ambiente uterino / Abstract: The uterine natural killer cells (uNK) actively modulate the maternal-fetal interface and homeostasis of pregnant uterus, without triggering the typical cytolytic activity of innate immune response. However, experimentally induced embryo lesion in the pregnant mouse uterus, changes the uterine homeostasis with commitment of uNK cell and possible induction of its cytolytic activity. The present work evaluated the gene expression of mediators related either to the activation and effectors molecules of uNK cells cytotoxic activity. It was evaluated the genes of perforin, granzyme-A, IFN-y, IL-15, IL-18, TNF-a, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), using RNA isolated from normal pregnant mice uterus on gestational day (gd) 9 and after 0.5, 1, 2, 6, 12 and 24h of abnormal pregnancy provoked by surgical lesion of the embryo (SLE) and also from RNA obtained from uNK cells isolated from normal pregnant mice. Differences in the DAP12, IFN-??and TNF-a ?genes expressions were also investigated with RNA isolated from immature and mature subtypes of uNK cells dissected from cryosections of mesometrial regions in the laser capture microscope (LCM) and evaluated by quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR). The results of RT-PCR confirmed the expression of all genes evaluated in the uterine tissue homogenates and in the uNK cells were not detected the only expression of IL-15 and IL-2 genes. By semi-quantitative analysis of RT-PCR amplicons, the genes of cytolytic proteins, granzymes-A and perforin all together with pro-inflammatory cytokines IFN-y ?and TNF-a ?showed significant increasing at 1h after SLE and decreasing to the level near of normal pregnancy after 6h of SLE. The increasing expression of these genes related to innate immune response of NK cells suggest the quick changes of uNK cells behavior in response to the SLE, which activation could involve the expression of DAP12 gene that also showed increasing at the same period after SLE. On the other hand, the expression of IL-15, IL-2, IL-18 and IL-6 genes related to the migration, proliferation and differentiation of uNK cells did not showed significant differences among the SLE samples and normal pregnancy. The significant decreasing of FasL after SLE could down regulate the triggering of apoptotic cell death pathway in the uNK cells and therefore, increasing the viability of these cells in the uterine microenvironment affected by SLE. These results prove that SLE induces fast up-regulation genes expression related to the cytotoxic pathway of uNK cells innate immune response ability. Based on analysis of qRT-PCR of DAP12, TNF-a ?and IFN-y ?genes performed with RNA obtained from uNK cells dissected in the LCM, it was identified differences in the expression of these genes between now a days classified as immature and mature forms of uNK cells. These expressions differences attest the occurrence of functionally heterogeneous subpopulations of uNK cells not restricted to the differentiation stages and possible specific distribution domains in the uterine environment / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Estudos anteriores mostraram que indivÃduos expostos à Leishmania amazonensis apresentam resposta diferenciada em relaÃÃo à produÃÃo de IFNγ. Aqueles com baixa produÃÃo geram uma resposta Th2 e os que apresentam alta produÃÃo desta citocina, desde as primeiras horas de infecÃÃo, uma resposta Th1. Com o objetivo de avaliar o mecanismo de supressÃo induzido por L. amazonensis, foi determinado o perfil e a cinÃtica da expressÃo de quimiocinas e receptores de quimiocinas, como tambÃm de citocinas em culturas de cÃlulas mononucleadas do sangue perifÃrico de indivÃduos sadios, estimuladas com promastigotas vivas de L. amazonensis. A anÃlise semiquantitativa da expressÃo de RNAm das quimiocinas e seus receptores, atravÃs de RT-PCR, e a quantificaÃÃo das citocinas foi determinada por ELISA, apÃs 12 horas, 48 horas e 120 horas de infecÃÃo. Verificaram-se dois padrÃes de resposta em relaÃÃo à secreÃÃo de IFNγ. IndivÃduos com produÃÃo superior a 145,8 pg/mL foram classificados como alto respondedor (AR) e aqueles com produÃÃo inferior, como baixo respondedor (BR). Observou-se no grupo AR o desenvolvimento de uma resposta mista, com predomÃnio de Th1. Esta resposta està associada à expressÃo de quantidades relevantes de MIP-1α (CCL3), RANTES (CCL5), MCP-1(CCL2), IP-10 (CXCL10), IL-8 (CXCL8), CCR1, CCR2 e CXCR3 em 12 e 48 horas de infecÃÃo. IL-12, IL-13 e IL-10 foram observadas em altas concentraÃÃes. Em relaÃÃo ao grupo BR, observou-se diminuiÃÃo da expressÃo de MIP-1α (CCL3), RANTES (CCL5), MCP-1(CCL2), I-309 (CCL1), CCR2, CXCR3 e CCR5 durante todo o perÃodo avaliado e de IP-10 (CXCL10) nas primeiras 48h de infecÃÃo. IL-10 e IL-13 encontravam-se em elevadas concentraÃÃes desde 12h, tendo um pico de produÃÃo com 48h de infecÃÃo. Os resultados sugerem que apÃs 48 horas de exposiÃÃo à o momento em que hà diferenciaÃÃo na expressÃo das molÃculas. IL-10 e IL-13 parecem ter papel relevante na modulaÃÃo da supressÃo de INFγ induzida nos BR por L. amazonensis. / Previous studies have shown that individuals exposed to Leishmania amazonensis respond differentially with regard to interferon gamma (IFN)_ production. Individuals who have a low production of IFN_ develop a Th2 response, while those who produce high amounts of this cytokine during the early stages of infection show the Th1 response. In order to evaluate the mechanism of suppression induced by L. amazonensis, the profile and kinetics of chemokines and theirs receptors were determined, as also the cytokines in the cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy individuals, stimulated with live promastigotes of L. amazonensis. A semiquantitative analysis of mRNA expression for the chemokines and their receptor was performed by RT-PCR, and the cytokines were quantified by ELISA, at 12, 48 and 120 hours after infection. The two patterns of IFN_ response were studied. Individuals with a production higher than 145,8 pg/mL were classified as high responders (HR), and those with lower levels of production were considered as low responders (LR). Individuals in the HR group developed a mixed response, with a predominance of Th1, which was associated with the expression of relevant quantities of MIP-1_, RANTES, MCP-1, IP-10, IL-8, CCR1, CCR2 and CXCR3, within 12 and 48 hours after infection. IL-12, IL-13 and IL-10 were observed in significant quantities. In the LR group, the suppression of expression of MIP-1_, RANTES, MCP-1, I-309, CCR2, CXCR3 and CCR5 during the entire period of study, and that of IP-10 during the first 48 hours of infection, was observed. IL-10 and IL-13 were found in elevated concentrations from 12 hours of infection onwards, with a peak production at 48 hours. These results suggest that the pattern of response apparently is defined around 48 hours of infection. IL-10 and IL-13 appear to exercise a relevant role in the modulation of suppression of IFN_, induced in the LR group by L. amazonensis.

A cultura do maracujazeiro tem sido afetada por um grande número de pragas e doenças, que exigem dedicação e esforços urgentes, no sentido de minimizar as perdas e evitar sua disseminação. O vírus da pinta verde do maracujazeiro (PVM) (Passion fruit green spot virus PFGSV) caracteriza-se por induzir a formação de pequenas manchas verdes em frutos e em folhas, e lesões necróticas em ramos. Exames de secções ultrafinas de tecidos infectados ao microscópio eletrônico de transmissão consistentemente revelam a presença de partículas baciliformes em cisternas do retículo endoplasmático e viroplasma denso no citoplasma. Os efeitos citopáticos encontrados, a relação com o ácaro vetor, Brevipalpus phoenicis, e a comparação com outros vírus transmitidos por Brevipalpus (VTB), como o da leprose dos citros, classifica o vírus como sendo do tipo citoplasmático. Seu relato inicial deu-se há cerca de 10 anos em Vera Cruz-SP, mas em 1994 foi relatada uma doença no Estado da Bahia chamada de definhamento precoce do maracujazeiro (DPM), que apresenta sintomas, efeitos citopáticos e vetor semelhantes ao da pinta verde, tendo sido sugerida a possibilidade de serem duas denominações para uma mesma doença. Atualmente a PVM/DPM encontra-se em vários outros Estados como Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba e Pará, além do Distrito Federal. Sua diagnose ainda depende dos sintomas observados, infestação por ácaros Brevipalpus e microscopia eletrônica. Para se desenvolver um método de diagnose molecular, que permita detectar o vírus causador da PVM/DPM de maneira rápida e confiável, em grande número de amostras, foi feita uma Biblioteca de cDNA a partir do RNA dupla fita do vírus, extraído de tecidos sintomáticos de maracujazeiros infectados com um isolado do PFGSV encontrado em Limeira-SP. Com o sequenciamento parcial do genoma viral, foram desenhados primers específicos que amplificam partes dos genes putativos da p24 e aqueles que codificam a proteína de movimento (MP) e a Replicase (Rep) de diferentes isolados do PFGSV. Primers do PFGSV e de dois outros VTBs do tipo citoplasmático (VTB-C) para os quais se dispõe de primers para sua detecção por RT-PCR (vírus da leprose dos citros C - CiLV-C; mancha anelar de Solanum violaefolium - SvRSV) foram testados em reações homólogas e heterólogas. Ocorreram amplificações por RT-PCR gerando fragmentos de tamanho esperados apenas para os vírus homológos, mas não nas reações heterólogas, indicando que PFGSV deve diferir do CiLV-C e SvRSV. Assim, tem-se agora uma ferramenta molecular que detecta especificamente o PFGSV. Um estudo inicial sobre a variabilidade genética do PFGSV foi feito a partir da extração do RNA total, seguido de RT-PCR utilizando os primers específicos, purificação dos fragmentos obtidos e uso da técnica de Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP). Foram analisados isolados procedentes de diferentes regiões brasileiras e em geral a variabilidade foi maior para as amostras do Estado de São Paulo. Logrou-se transmitir experimentalmente o PFGSV com ácaros para uma espécie silvestre de maracujá (Passiflora morifolia). / In Brazil, passion fruits are affected by several diseases and pests which affect their yield. Among them, a recently recognized viral disease, caused by Passion fruit green spot virus (PFGSV), is characterized by the presence of green spots on fruits and senescent leaves, and necrotic lesions on branches. When the infection is early, stem lesions may coalesce, girdling the branch resulting in the subsequent death of the plant. Electron microscopic examination of the thin sections of infected tissues revealed the presence of short, bacilliform particles in the cistern of the endoplasmic reticulum and dense, vacuolated viroplasma in the cytoplasm. The disease was shown to be transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). The localized symptoms, transmission by Brevipalpus mite and the observed cytopathic effect are considered evidences to demonstrate the viral nature of the disease and place it among the socalled cytoplasmic type of Brevipalpus-transmitted viruses (C-BTV), whose prototype is the Citrus leprosis virus C (CiLV-C). Though the first report of the disease occurred more than 10 years ago at Vera Cruz-SP, little is known about PFGSV, though it has been found in several passion flower growing areas in Brazil. In 1994 was report a disease named of DPM (definhamento precoce do maracujazeiro) was reported state of Bahia, with characteristics similar to that of the PVM and it has been suggested that DPM and PVM are the same disease. Subsequently the PVM/DPM has been found in several others Brazilian States as Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pará and Distrito Federal. Diagnosis has been made by symptoms, association with Brevipalpus mites and the time consuming transmission electron microscopy. This work reports the results of efforts to generate a quick and precise method to detect the virus for the diagnosis of the disease, evaluate the variability of the PFGSV isolates from different regions of the country and determine the taxonomic position of this virus. From the dsRNA present in extracts of the PFGSV-infected passion flower plant tissues, a cDNA library was obtained and its sequencing permitted to identify part of the viral genome. Based on these sequences, particularly of p24 and the putative genes that code for the movement protein (MP) and replicase (Rep), specific primers were designed which specifically detected PFGSV by RT-PCR in extracts of PFGSV-infected tissues. Evaluation of the variability of different isolates of PFGSV was made by single strand conformational polymorphism (SSCP) of the amplified fragments of the viral genome. In general, it a larger variation was found in isolates from São Paulo state. PFGSV seems to differ from two other C-BTV with available primers, CiLV-C and the Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV), since RT-PCR assays do not cross amplify their genomes. Experimental transmission of PFGSV by mites to woodland passion flower (Passiflora morifolia) was achieved.

O Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) é uma espécie do gênero Tospovirus, transmitido por tripes, que infecta diversas espécies da família Cucurbitaceae. Já foi constatado em diversos estados brasileiros e sua incidência tem aumentado significativamente nos últimos anos em algumas regiões. Por se tratar de uma virose em potencial para as cucurbitáceas, pouco se conhece sobre os danos causados e a reação das diferentes espécies de cucurbitáceas à infecção em campo. Esse trabalho teve por objetivos: estudar a eficiência da RT-PCR para a detecção rápida e especifica do ZLCV em cucurbitáceas; avaliar os danos causados pelo ZLCV em abobrinha de moita em campo e a reação de sete espécies/variedades de cucurbitáceas à infecção natural A detecção do ZLCV por RT-PCR foi estudada utilizando um par de oligonucleotídeos iniciadores, desenhados com base na seqüência do S-RNA do ZLCV (AF067069). Quatro espécies de tospovírus (TSWV, TCSV, GRSV e CSNV) e outros vírus que infectam cucurbitáceas (PRSV-W-1, PRSV-W-C, ZYMV-M, ZYMV-Atibaia e CMV) foram incluídos no teste. Na reação de RT-PCR foi obtido um fragmento de aproximadamente 350 pb, amplificado somente a partir de RNA total extraído de planta infectada com o ZLCV. A seqüência obtida desse fragmento apresentou 98,2 % de identidade com a seqüência de nucleotídeos do S-RNA do ZLCV depositada no GenBank. Os danos causados pelo ZLCV em abobrinha de moita 'Caserta' foram avaliados em campo na ESALQ/USP, Piracicaba-SP, onde esse vírus é freqüente. As plantas foram monitoradas semanalmente quanto à infecção pelo ZLCV por meio dos sintomas e por PTA-ELISA. As plantas foram agrupadas em função da época de aparecimento dos sintomas do ZLCV, avaliando a produção de frutos comerciais (FC) e não comerciais (FNC) de cada grupo e comparando com a de plantas que permaneceram sem sintomas até o final do experimento. As plantas que apresentaram sintomas até os 23 dias após a emergência (DAE) não produziram qualquer tipo de frutos. FC foram colhidos de plantas que apresentaram sintomas a partir dos 42 DAE. Mesmo assim, houve redução de 78,5 % na produção de FC. Plantas que mostraram sintomas por ocasião da última colheita (55 DAE) apresentaram redução na produção de FC de 9,6 %. A infecção com o ZLCV até o início da frutificação inviabiliza a produção de FC de abobrinha de moita 'Caserta'. A reação de sete espécies/variedades de cucurbitáceas à infecção com o ZLCV foi avaliada em campo, por meio da infecção natural e em casa de vegetação, onde as plantas foram duplamente inoculadas mecanicamente com o ZLCV no estádio cotiledonar. A avaliação foi feita com base no monitoramento dos sintomas e por PTA-ELISA. A abobrinha de moita 'Caserta' e a abóbora híbrida 'Takaiama' apresentaram alta suscetibilidade ao ZLCV. O pepino 'Safira' apresentou baixa infecção em campo e intermediária em casa de vegetação. Enquanto que a melancia 'Crimson Sweet', o maxixe do Norte, a abóbora rasteira 'Menina Brasileira' e a moranga 'Alice' apresentaram valores menores de infecção. A moranga 'Exposição' foi altamente resistente, pois não foi infectada nos ensaios em campo e em casa de vegetação. / Zucchini lethal chlorosis virus is a specie of the Genus Tospovirus, transmitted by thrips (Frankliniella zucchini), which infects some species of the family Cucurbitaceae. The occurrence of this Tospovirus has already been reported for several Brazilian states and its incidence in cucurbit crops has increased in the last years in some regions. Considering the importance of this Tospovirus for cucurbit crops, very little is known about the damage caused by this virus and the reaction of the different species of cucurbits to infection. This work aimed: to study the efficiency of the RT-PCR for the fast and specific detection of ZLCV, to evaluate the damage caused by this virus on zucchini squash under field condition and the reaction of seven species/varieties of cucurbits to infection with this Tospovirus. The detection of ZLCV by RT-PCR was studied using a pair of primers designed based on the nucleotide sequence of the SRNA of ZLCV (AF067069). Four other Tospovirus species (TSWV, TCSV, GRSV and CSNV) and other virus that infect cucurbits (mild strain PRSV-W-1, wild strain PRSV-WC, mild strain ZYMV-M, wild strain ZYMV-Atibaia and CMV) were included in this test. The RT-PCR reaction generated a fragment of approximately 350 bp, only amplified from total RNA extracted from plant infected with ZLCV. The sequence of this fragment presented 98.2 % identity with the corresponding nucleotide sequence of the S-RNA of ZLCV deposited in the GenBank. The damage caused by ZLCV on zucchini squash (Cucurbita pepo cv. Caserta) was evaluated under field condition. Zucchini squash plants were weekly monitored for the presence of characteristic symptoms induced by ZLCV and PTA-ELISA for virus indexing. Plants were grouped based on the time the symptoms were first seen. Fruits harvested from each plant within each group were classified on marketable (M) and non-marketable (NM) based on the phenotype. Plants that did not show symptoms by the end of the crop were considered still healthy and their yield was used as control. Zucchini squash plants that showed symptoms of ZLCV infection up to 23 days after emergency (DAE) did not yield any fruit. Marketable fruits were first harvested only from plants that showed symptoms 42 DAE. However, the yield of marketable fruits was reduced by 78.5 %, as compared to that from asymptomatic plants. Plants that showed symptoms 55 DAE showed a reduction on the yield of marketable fruit of 9.6%. The reaction of seven species/varieties of cucurbits to infection with ZLCV was evaluated under field and greenhouse conditions. In the field experiment, ZLCV infection occurred naturally. In the greenhouse, plants were twice mechanically inoculated with ZLCV at the cotyledonal stage. Evaluations were based on symptoms expression and PTA-ELISA. Zucchini squash 'Caserta' and hybrid squash 'Takaiama' were highly susceptible. The cucumber 'Safira' presented low percentage of infected plants in the field and intermediate in the greenhouse. Watermelon 'Crimson Sweet', northern gherkin, long neck squash 'Menina Brasileira' and winter squash 'Alice' presented lower values of infected plants. Winter squash 'Exposição' was highly resistant to infection under field and greenhouse conditions.

A alimentação diferencial durante o desenvolvimento das abelhas Apis mellifera desencadeia respostas endógenas em vias de sinalização e sistema endócrino, que promovem o desenvolvimento de fenótipos alternativos nas castas femininas. Rainhas e operárias diferem em sua fisiologia, morfologia, longevidade, função na colônia, comportamento, e principalmente, na ativação do sistema reprodutivo. Em relação aos ovários, resultados prévios baseados em ensaios de microarranjos revelaram um conjunto de genes como diferencialmente expressos (DEGs) em larvas de rainhas e operárias. Esse trabalho teve como objetivo analisar os padrões de expressão desses DEGs em mais detalhe em ovários larvais de rainhas e operárias. Com esse objetivo, foram selecionados 18 DEGs para validação por RTqPCR. Estas análises foram realizadas em ovários dissecados de rainhas e operárias em quatro estágios larvais que representam fases críticas no desenvolvimento ovariano (L4, L5F1, L5F2 e L5F3). Dentre os 18 DEGs candidatos, 11 foram confirmados como de fato diferencialmente expressos. Entre esses, quatro genes que codificam enzimas: short chain dehydrogenase reductase (GB54419), 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), SCPEP1-like gene (GB11273) e glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902), exibiram um pico de expressão em L5F1 em ovários de operárias. Dentre os dois genes relacionados à estocagem ou transporte de proteínas, o gene apolipoprotein III (GB20117) encontrou-se mais expresso em operárias enquanto que hexamerin 70b (GB10869) se mostrou superexpresso em ovários de rainhas. Os genes relacionados à tradução de mRNA e vias de sinalização: elongation factor 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) e mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) estavam significativamente superexpressos em ovários de rainhas. O gene OCLP-1 (GB19297), que possui uma função hipotética como inibidor de cistina foi encontrado como superexpresso em ovários de operárias. A fim de avaliar a modulação desses genes por hormônio juvenil, foi realizado o tratamento in vivo de larvas de operárias com aplicação tópica do hormônio. Após seis horas de tratamento, os ovários foram dissecados e as amostras analisadas por RT-qPCR. Dos onze DEGs testados para resposta a HJ, seis se mostraram significativamente modulados pelo hormônio Dois genes, short chain dehydrogenase reductase e heat shock protein 90, que também respondem a ecdisona, são up-regulados por HJ, enquanto os genes OCLP-1, hexamerin 70b, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase e apolipoprotein III eram downregulados. A expressão diferencial desses genes que codificam enzimas, proteínas de transporte/estocagem e fatores de vias de sinalização, indica que estes genes são importantes no desenvolvimento casta-especifíco dos ovários, uma vez que sua expressão está fortemente modulada durante os estágios em que ocorre a morte celular programada em ovários de operárias. / Differential feeding during larval development of the honey bee (Apis mellifera) triggers endogenous responses in signaling pathways and the endocrine system which promote the development of alternative phenotypes in the female castes. Queens and workers differ in physiology, morphology, longevity, function in the colony, behavior, and, especially so, the activation of the reproductive system. Concerning the ovaries, previous results based on microarray assays revealed a set of differentially expressed genes (DEGs) in queen and worker larvae.This project now aimed to further analyze the expression patterns of DEGs in the ovaries of larval workers and queens. From the microarray assays we selected a set of 18 DEGs for validation by qPCR. These analyses were performed on ovaries dissected from queens and workers of four larval stages representing critical phases of ovary development (L4, L5F1, L5F2, L5F3). Among the 18 DEG candidates, 11 were confirmed as differentially expressed. Four genes that code for enzymes: a short chain dehydrogenase reductase (GB54419), a 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), an SCPEP1-like gene (GB11273) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902) exhibited an expression peak at L5F1 in worker ovaries. Among the two genes encoding storage or transport proteins, apolipoprotein III (GB20117) was more expressed in workers and hexamerin 70b (GB10869) was overexpressed in queen ovaries. Among the genes related to mRNA translation and signaling pathways: elongation fator 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) and a mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) were found significantly overexpressed in queen ovaries. The gene OCLP-1 (GB19297), which has a hypothetical function as an inhibitor cystine knot peptide, was found higher expressed in worker ovaries. So as to evaluate the modulation of these genes by juvenile hormone, an in vivo treatment of workers larvae was performed with cuticular application of the hormone. After six hours of treatment, the ovaries were dissected and the samples analyzed by RTqPCR. Of the eleven DEGs tested for response to JH, six were significantly modulated by the hormone. Two genes, short chain dehydrogenase reductase and heat shock protein 90, which also respond to ecdysone, were up-regulated by JH, while OCLP-1 hexamerin 70b, 15- hydroxyprostaglandin dehydrogenase and apolipoprotein III were down-regulated.The differential expression of these genes encoding enzymes, storage/transport and signaling pathway proteins indicates that they are important in caste-specific ovary development, as their expression is strongly modulated during stages when programmed cell death takes place.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Marcus_Cristian_Muniz_Conde.pdf: 970527 bytes, checksum: a12676103871857eca97235b488f90c1 (MD5) Previous issue date: 2010-04-30 / Isolate high quality RNA form dental tissues is a most critical step to perform gene expression analysis. In some situations it is impossible to achieve the RNA isolation after tooth extraction, which leads to tooth discarding. Since, the aim of this experiment was to verify the effect of different teeth storage methods in the quality of RNA obtained from freshly extracted third molars. The teeth were randomly divided in five groups according to the temperature and storage time conditions. In control group RNA was isolated immediately after tooth extraction in room temperature. Experimental storage conditions evaluated were: liquid nitrogen, -80°C, -20°C (24h) and 4°C (6h). To RNA isolation, teeth were longitudinally sectioned and then pulp and pre-dentin were submerged in TRIzol®. Semi-quantitative RT-PCR was used to analyze the expression of odontoblast makers (DSPP, DMP1, and MEPE), which were normalized against the GAPDH gene. DSPP, DMP1 and MEPE were amplified in all storage conditions evaluated, regardless of storage method or tissue analyzed. Was possible to obtaining high quality RNA from pulp and dentin in all storage conditions appraised, increasing the RNA available to be used as positive control in cell differentiation studies / Extrair RNA de qualidade dos tecidos dentais é um passo crítico para a realização da análise de expressão gênica. Em algumas situações não é possível realizar o isolamento do material genético dos tecidos dentários logo após a exodontia, o que conduz ao descarte do dente. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de diferentes formas de armazenamento dos dentes na qualidade do RNA odontoblástico isolado de terceiros molares recém extraídos. Os dentes foram separados de forma aleatória em cinco grupos de acordo com o tempo e a temperatura de armazenamento. No grupo controle o RNA foi isolado imediatamente após o procedimento cirúrgico em temperatura ambiente.As condições experimentais avaliadas foram: armazenamento dos dentes em nitrogênio líquido, -80°C e -20°C durante 24h e armazenamento 4°C durante 6h. Para a extração do RNA os dentes foram seccionados e então o tecido pulpar e a pré-dentina foram imersos, separadamente, em TRIzol. RT-PCR foi utilizado para analisar a efetividade dos métodos de armazenamento através da amplificação dos marcadores da diferenciação odontoblástica (DSPP, DMP1, e MEPE), que foram normalizados contra o gene constitutivo GAPDH. DSPP, DMP1, e MEPE foram amplificados de forma clara em todas as condições avaliadas, independentente do método de armazenamento, ou do tecido avaliado. Foi possível obter RNA de qualidade em polpa e dentina, em todas as condições de armazenamento avaliadas, aumentando assim a disponibilidade de RNA para ser utilizado como controle positivo em estudos de diferenciação celular