Chez la brebis, les BMPs inhibent la synthèse et la libération de FSH. La détection des ARNm de certaines BMPs dans l’hypophyse et de leurs récepteurs sur les cellules gonadotropes suggère une action paracrine/autocrine des BMPs sur la production de FSH. L’objectif de cette thèse a visé à déterminer l’importance des BMPs hypophysaires, en particulier BMP-4, dans la régulation de la sécrétion de FSH chez la brebis. Nous montrons que l’expression des ARNm du système BMP-4,analysée par RT-PCR en temps réel, ne varie pas au cours du cycle oestrien ou in vitro quelque soit le temps d’incubation (6h-48h) et le traitement (GnRH, oestradiol, activine) des cellules hypophysaires.Afin de déterminer si les cellules hypophysaires ovines sécrètent des BMPs, des milieux conditionnés(MC) hypophysaires ont été soumis à un test d’activité biologique reposant sur des cellules embryonnaires transfectées avec un élément de réponse BMPs couplé au gène rapporteur luciférase.Aucun effet des MC n’a été observé sur l’activité luciférase comparé au milieu non conditionnésuggérant l’absence ou la très faible activité BMP des MC, et cela quelque soit le temps d’incubation(6h-48h) et le traitement (GnRH, oestradiol, activine) des cellules hypophysaires. Toutefois, nous détectons une activité inhibitrice de BMPs qui est augmentée par la GnRH et l’oestradiol suggérant l’implication d’inhibiteurs de BMPs dans la régulation de la production de FSH. En conclusion,l’ensemble de nos résultats n’est pas en faveur d’un rôle de BMP-4 hypophysaire dans la synthèse de FSH chez l’adulte. Un rôle des BMPs au niveau hypophysaire via la voie endocrine peut s’envisager puisque nous avons mis en évidence une bioactivité de type BMP dans le sérum ovin. Les inhibiteurs BMPs produits par l’hypophyse, qui restent à identifier, pourraient moduler la biodisponibilité des BMPs atteignant l’hypophyse par la voie sanguine. / BMPs inhibit FSH synthesis and release in ewe. The detection of BMP mRNAs in the pituitary as well as the colocalisation of the two types of BMP receptors on gonadotrope cells suggest that these BMPs can exert paracrine/autocrine actions on FSH production. The aim of this thesis work was to determine the importance of pituitary BMPs in the regulation of FSH production in the ewe. We showed that the level of mRNAs for BMP-4 system, analyzed by real-time RT-PCR, did not vary across the oestrous cycle or in vitro whatever the incubation period (6h-48h) and the treatment (GnRH, oestradiol, activin) of pituitary cells. By using a bioactivity test based on embryonic mesenchymal cells transfected with an expression construct containing a BMP-responsive element fused to firefly luciferase reporter gene,we detected no BMP activity within conditioned media from pituitary cells whatever the incubation period (6h-48h) and the treatment (GnRH, oestradiol, activin) of the pituitary cells. However, we detected a BMP inhibitory activity which is increased by GnRH and oestradiol suggesting the implication of BMP inhibitor(s) in FSH regulation. In conclusion, the results are not in favor of a role for pituitary BMP-4 in the regulation of FSH synthesis in adult ewe. An endocrine action of BMPs at pituitary level can be evoked since BMP bioactivity was detected within ovine serum. BMP inhibitors that remain to be identified can modulate the bioavailability of BMPs reaching the pituitary by the blood way.

In Brazil there is still no variety of commercial transgenic sugarcane used in large scale, although biotechnological research in the area of gene expression has been performed in order to obtain varieties that can be cultivated in low rainfall, high temperatures and in low fertil soils. In the present work it was analised the diferencial gene expression in leaves of the variety of sugarcane RB72910 in field capacity and under severe water stress in a greenhouse. The evaluation was done using the technique real-time RT-PCR a powerful tool used to identify and quantify significant changes in the levels of transcripts, facilitating the selection of candidate genes for use in transgenic plants. For this we analized the expression of 11 genes in leaf samples in two conditions of water regime. The genes analyzed were: DNAJ, PGR5, H1, PSI, LTP, WIP, ZmPIP2-1, ZmTIP4-2, SAMDC and two genes with unknown functions. It was observed that the variety studied showed diferential gene expression under water stress mainly for genes encoding proteins of the protective fotosynthetic system and for maintenance of the homeostasis. Thus, it was concluded that the genotype RB72910 has important agronomical traits of fotoprotection and adaptation to drought. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / No Brasil ainda não há uma variedade de cana-de-açúcar transgênica comercial usada em larga escala, porém pesquisas biotecnológicas na área de expressão gênica estão sendo feitas visando a obtenção de variedades que possam ser cultivadas em condições de baixa pluviosidade, altas temperaturas e solos com pouca fertilidade. No presente trabalho foi analisada a expressão gênica diferencial em folhas na variedade de cana-deaçúcar RB72910 nas condições de capacidade de campo e sob estresse hídrico severo em casa de vegetação. A avaliação foi feita por meio da técnica real-time RT-PCR, uma potente ferramenta usada para identificar e quantificar mudanças significativas nos níveis de transcritos, facilitando a seleção de genes candidatos à utilização em transgenia. Para isso foi analisada a expressão de 11 genes em amostras foliares em duas condições de regime hídrico. Os genes analisados foram: DNAJ, PGR5, H1, PSI, LTP, WIP, ZmPIP2-1, ZmTIP4-2, SAMDC e dois genes com funções indeterminadas. Observou-se que a variedade estudada demonstrou expressão diferencial sob estresse hídrico principalmente para genes que codificam proteínas de proteção do sistema fotossintético e de manutenção da homeostase. Com isso, concluímos que o genótipo RB72910 apresenta importantes características agronômicas de fotoproteção e de adaptação à seca.

Por representar a mais importante arbovirose em nível mundial, as infecções causadas pelos vírus da dengue são de grande importância em nosso país, apresentando uma ampla variedade de sintomas clínicos que vão desde infecção assintomática até formas mais graves da doença. O título de anticorpos neutralizantes produzidos frente à infecção por dengue parece ser determinante na forma de apresentação da doença no paciente. Atualmente, a forma com que o teste de neutralização é realizado demanda tempo para sua realização. O objetivo deste trabalho foi padronizar um ensaio de neutralização viral por RT-PCR em tempo real em cepas virais dos quatro sorotipos dengue para, posteriormente, ser empregada na detecção rápida e em grande escala de anticorpos em soro de pacientes e de candidatos vacinais. Para isso, foram construídas curvas padrão, para cada sorotipo viral, por meio da transcrição in vitro do RNA viral. O ensaio de neutralização padronizado nesse estudo reduziu o número de dias de detecção da neutralização em 48 horas quando comparada com a técnica de neutralização tradicional (PRNT), além de utilizar técnicas moleculares sensíveis e específicas para detecção como a RT-PCR em tempo real que garantem maior aplicabilidade do teste. / Because Dengue virus is the most important arboviral disease worldwide, infections caused by this pathogen are of great importance in Brazil, producing a wide variety of clinical symptoms ranging from asymptomatic infection to more serious forms of the disease. The title of neutralizing antibodies produced against the dengue infection appears to be determinant in the outcome of the disease. Currently, neutralization tests that have been performed take time for its execution. The aim of this study was to standardize a viral neutralization assay by real-time RT-PCR of viral strains of the four Dengue serotypes to subsequently be used for rapid detection and large-scale using antibodies of patients and for vaccine candidates. For this matter, standard curves were constructed for each Dengue serotype, by in vitro transcription of viral RNA. The neutralization assay in this study reduced the period of neutralization to 48 hours, compared to traditional neutralization test (PRNT), and it uses a more sensitive and specific molecular technique for detection of neutralizing antibodies, such as real time RT-PCR, to ensure greater applicability of the test

[EN] Tomato spotted wilt virus is one of the most widespread and economically important viruses worldwide. It infects a large number of plant species, being the tomato and pepper the most affected. TSWV is transmitted from one plant to another by various species of thrips in a circulative and propagative manner, being Flankliniella occidentalis the main vector. The best strategy for disease control in tomato and pepper has been breeding resistant cultivars, but only tomato with the gene Sw-5 and pepper with gene Tsw have been effective against a wide spectrum of TSWV isolates, but resistance-breaking isolates often arise. To obtain a more effective and durable control is necessary: A) the genetic and biological characterization of conventional and resistance-breaking isolates of TSWV; B) the understanding the evolutionary and epidemiological factors involved in the emergence and dispersion of resistance-breaking isolates; C) the development of tools for viral detection and quantification; and D) evaluation of new sources of resistance (total or partial, estimated as the difficulty to viral infection or/and accumulation) or tolerance (total or partial, estimated as the difficulty to symptoms development and damage without affecting viral infection). In this work, TSWV isolates from Spanish tomato and pepper crops have been biologically and molecularly characterized. The complete genome of three TSWV isolates with different biotypes were sequenced: N (unable to infect Sw-5 resistant tomato and Tsw resistant pepper), T (tomato Sw-5 resistance-breaking), and P (pepper Tsw resistance-breaking). No correlation between genetic variation and the ability of overcoming resistance was found. These nucleotide sequences and others retrieved from the GenBank database were used to develop RT-qPCR, with high sensitivity and dynamic range. Primers and one TaqMan MGB were designed from conserved sequence stretches with the aim of detecting and quantifying any TSWV isolate. It was not possible to develop a molecular method to differentiate between conventional and resistance-breaking isolates since there is no correlation between genotype and biotype. Instead, two TaqMan MGB probes were designed to quantify the two main genotypes (according to the M segment) in mixed infections. RT-qPCR was used to evaluate TSWV accumulation in non-resistant tomato, non-resistant pepper and Datura stramonium (an important reservoir), as well as in the main vector F. occidentalis, which was considered to evaluate transmission efficiency. The results showed that resistance breakdown was not associated to a fitness cost (tradeoff) in the infectivity of susceptible hosts or transmissibility by thrips and that the resistance-breaking isolates have the same potential for dispersion in field as the conventional isolates. Finally, the information obtained from the previous studies and the RT-qPCR technique were used to evaluate the resistance and tolerance to TSWV of a new accession of Capsicum baccatum. In addition to considering the genetic and biological variation of TSWV, a new approach was used based on analysis of longitudinal data (those measured in the same individuals over time). The resistance level was estimated with two variables: A) absolute fitness, calculated from the variation in time of the viral titer, quantified by RT-qPCR; and B) infectition survival, the median time in which the virus was detected in a plant by ELISA. The tolerance level was estimated as symptom survival, the median time in which a plant developed severe symptoms. This analysis showed that this new accession is partially resistant and totally tolerant to TSWV conventional and resistance-breaking isolates and therefore is a good candidate for a pepper breeding program / [ES] Tomato spotted wilt virus (TSWV) es uno de los virus más extendidos y de mayor importancia económica del mundo. Infecta a un gran número de especies vegetales, siendo los cultivos de tomate y pimiento los más afectados. Este virus se transmite de una planta a otra por trips en una manera propagativa y circulativa, siendo Flankliniella occidentalis el más eficaz. El cultivo de variedades resistentes de tomate y pimiento permitió el control de la enfermedad, ya que estos genes inducen una respuesta hipersensible impidiendo la infección sistémica del virus. Sin embargo, con frecuencia aparecen aislados del virus capaces de superar estas resistencias. Para obtener un control de la enfermedad más eficaz y duradero es necesario: A) la caracterización genética y biológica de los aislados del TSWV que superan y no superan las resistencias; B) el estudio de los factores evolutivos y epidemiológicos implicados en la aparición y establecimiento de los aislados que superan las resistencias; C) el desarrollo de herramientas que permitan la detección y cuantificación de estos aislados virales; y D) la evaluación de nuevas fuentes de resistencia o tolerancia. En este trabajo se han caracterizado biológicamente y molecularmente diferentes aislados del TSWV procedentes de cultivos de tomate y pimiento de España. Se determinó la secuencia nucleotídica del genoma completo de tres aislados españoles correspondientes a tres biotipos: N (incapaz de infectar variedades resistentes de tomate o pimiento); T (supera la resistencia Sw-5 de tomate); y P (supera la resistencia Tsw de pimiento). No se encontró correlación entre la variación genética y la capacidad de superar la resistencia. Estas secuencias nucleotídicas y otras obtenidas de la base de datos Genbank se utilizaron para desarrollar una técnica basada en la RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR) que permite detectar el virus con un alto grado de sensibilidad y cuantificar en un amplio rango dinámico. Se diseñaron los iniciadores y una sonda TaqMan MGB a partir de segmentos de secuencia conservados para que fueran válidos para todos los aislados del TSWV. También se desarrollaron dos sondas Taqman que permitían cuantificar diferencialmente variantes genéticas del virus en infecciones mixtas. La RT-qPCR se utilizó para evaluar la acumulación de varios aislados del TSWV en tomate sin Sw-5, pimiento sin Tsw y Datura stramonium, así como, en su principal vector F. occidentalis que se usó para evaluar la eficiencia de la transmisión. Se observó que la superación de la resistencia no suponía un coste en la eficacia biológica (fitness) tanto en la multiplicación del virus en estas plantas como en la transmisión por trips. Por tanto, los aislados que superan las resistencias tienen la misma capacidad de dispersión en campo que los aislados convencionales. Por último, se utilizó la RT-qPCR y la información obtenida para evaluar la capacidad de resistencia y tolerancia al TSWV de una accesión de Capsicum baccatum. El nivel de resistencia se estimó a partir de dos variables: A) la eficacia absoluta, calculada a partir de la variación en el tiempo del título viral, cuantificado por RT-qPCR; y B) la infectividad, como la mediana del tiempo que tarda el virus en ser detectado en una planta por ELISA. El nivel de tolerancia se estimó como la mediana del tiempo que tarda una planta en mostrar síntomas graves. Esta nueva accesión es parcialmente resistente y totalmente tolerante tanto para aislados del TSWV convencionales como para aquellos capaces de infectar e inducir síntomas severos en variedades de pimiento con el gen Tsw. Por tanto, esta nueva variedad de C. baccatum es un buen candidato para usarlo en programas de mejora genética de pimiento. / [CAT] Tomato spotted wilt virus (TSWV) és un dels virus més estesos i de major importància econòmica del món. Infecta a un gran nombre d'espècies vegetals i els cultius de tomaca i pebrot són alguns dels més afectats. Aquest virus es transmet d'una planta a una altra, per trips de manera propagativa i circulativa, i Flankliniella occidentalis és el més eficaç. El cultiu de varietats resistents de tomaca i pebrot (en els quals s'han introduït per millora genètica els gens Sw-5 i Tsw, respectivament) va permetre el control de la malaltia, ja que aquests gens indueixen una resposta hipersensible i impedeixen la infecció sistèmica del virus (resistència total). No obstant açò, amb freqüència apareixen aïllats del virus que són capaços de superar aquestes resistències. Per a obtenir un control de la malaltia més eficaç i durador és necessari: A) la caracterització genètica i biològica dels aïllats del TSWV que superen i no superen les resistències; B) l'estudi dels factors evolutius i epidemiològics implicats en l'aparició i establiment dels aïllats que superen les resistències; C) el desenvolupament d'eines que permeten la detecció i quantificació d'aquests aïllats virals; i D) l'avaluació de noves fonts de resistència (total o parcial, que dificulten la infecció i multiplicació viral) o tolerància (total o parcial, que dificulten l'aparició de símptomes i danys encara que no tinguen un efecte en la infecció viral). En aquest treball s'han caracteritzat biològicament i molecularment diferents aïllats del TSWV procedents de cultius de tomaca i pebrot d'Espanya. Es va determinar la seqüència nucleotídica del genoma complet de tres aïllats espanyols corresponents a tres biotips: N (incapaç d'infectar varietats resistents de tomaca o pebrot); T (supera la resistència Sw-5 de tomaca); i P (supera la resistència Tsw de pebrot). Els resultats van mostrar que no hi havia una correlació entre la variació genètica i la capacitat de superar la resistència. Aquestes seqüències nucleotídiques i altres obtingudes de la base de dades Genbank es van utilitzar per a desenvolupar una tècnica basada en la RT-qPCR que permet detectar el virus amb un alt grau de sensibilitat i quantificar en un ampli rang dinàmic. Es van dissenyar els iniciadors i una sonda TaqMan MGB a partir de segments de seqüència conservats perquè foren vàlids per a tots els aïllats del TSWV. Tambe es van desenvolupar dos sondes Taqman que permetien quantificar diferencialment variants genètiques del virus en infeccions mixtes. La RT-qPCR es va utilitzar per a avaluar l'acumulació de diversos aïllats del TSWV en tomaca sense Sw-5, pebrot sense Tsw i Datura stramonium així com, en el seu principal vector F. occidentalis que es va usar per a avaluar l'eficiència de la transmissió. Es va observar que la superació de la resistència no suposava un cost en l'eficàcia biològica (fitness) tant en la multiplicació del virus en aquestes plantes com en la transmissió per trips. Per tant, els aïllats que superen les resistències tenen la mateixa capacitat de dispersió en camp que els aïllats convencionals. Finalment, es va utilitzar la RT-qPCR i la informació obtinguda per a avaluar la capacitat de resistència i tolerància d'una accessió de Capsicum baccatum al TSWV. El nivell de resistència es va estimar a partir de dues variables: A) l'eficàcia absoluta, calculada a partir de la variació en el temps del títol viral, quantificat per RT-qPCR; i B) la infectivitat, com la mitjana del temps que es tarda a detectar el virus en una planta per mitjèr d'ELISA. El nivell de tolerància es va estimar com la mitjana del temps que tarda una planta a mostrar símptomes greus. Aquesta nova accessió és parcialment resistent i totalment tolerant tant per a aïllats del TSWV convencionals com per a aquells capaços d'infectar i induir símptomes severs en varietats amb el gen Tsw. Per tant, aquesta nova varietat d / Debreczeni, DE. (2015). Caracterización de aislados del virus del bronceado del tomate (TSWV) que superan las resistencias de los genes Sw-5 en tomate y Tsw en pimiento. Identificación de una fuente de tolerancia en pimiento [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/51460 / TESIS

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-24Bitstream added on 2014-06-13T20:43:03Z : No. of bitstreams: 1 colombo_j_dr_sjrp.pdf: 949474 bytes, checksum: 856a4b47ea1a9aa6adebae3e2e97b6a0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os tumores de cabeça e pescoço ocupam, mundialmente, a quinta posição na lista das neoplasias mais freqüentes. O tipo histológico predominante é o carcinoma de células escamosas, que acomete a cavidade oral, a orofaringe, a hipofaringe e a laringe. O tumor de laringe é um dos tipos mais comuns, correspondendo a 25% dos casos, com alto índice de mortalidade e prognóstico reservado. O principal fator etiológico para o seu desenvolvimento é o consumo combinado de álcool e fumo. O desenvolvimento do câncer de cabeça e pescoço é um processo multipasso acompanhado por mudanças genéticas e epigenéticas. Recentemente, estudos envolvendo a tecnologia microarray têm identificado genes específicos, cuja expressão está alterada em câncer de cabeça e pescoço quando comparado ao tecido normal. No entanto, a maioria dos estudos são realizados usando tumores de diferentes sítios. Neste estudo, foi analisado somente amostras de carcinoma de laringe para minimizar as diferenças genéticas. Dessa forma, os objetivos do presente projeto foram identificar e validar possíveis biomarcadores moleculares envolvidos na carcinogênese de laringe. Para tanto, foi construído um cDNA microarray com 340 genes previamente identificados pelo Head and Neck Annotation Consortium. A expressão desses genes foi analisada em 8 amostras de tecido tumoral e em 4 amostras de tecido histologicamente normal de laringe pela técnica de microarray. Foram identificados 35 genes diferencialmente expressos (SNR ½1.0½, p-value 0.001), os quais estão envolvidos em diversos processos celulares como adesão celular, apoptose, ciclo celular, inibição de proteases, metabolismo, proteólise, reparo de DNA, regulação da transcrição e transdução de sinal. A robustez da assinatura dos 35 genes diferencialmente expressos foi confirmada em um conjunto adicional de 5 amostras tumorais e 6 amostras... / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the fifth most common cancer world-wide. More than 90% of this cancer type has a squamous origin and common sites include oral cavity, oropharynx, hypopharynx and larynx Laryngeal squamous cell carcinoma is very common in head and neck cancer, corresponding to 25% of cases, with high mortality rates and poor prognosis. Tobacco use and/or alcohol consumption are the two principal risk factors involved in development of HNSCC. The development of head and neck cancer is a multistep process accompanied by genetic and epigenetic changes. In recent years, studies involving microarrays have identified specific genes whose expression has changed in head and neck cancer compared with normal tissue. However, most microarray studies are performed using tumors from different sites in head and neck. In our study, we analyzed only larynx carcinoma samples to minimize the genetic differences. Thus, the purpose of this work was to identify and to validater molecular biomarkers involved in larynx carcinogenesis. Therefore, we constructed a cDNA microarray containing 340 genes previously identified by Head and Neck Annotation Consortium. Expression analysis was applied to 8 larynx tumor samples and 4 larynx normal samples. We identified 35 differentially expressed genes between tumor and non-tumor adjacent tissue of larynx (SNR ½1.0½, p-value 0.001). Genes detected were involved in processes as apoptosis, cell adhesion, cell cycle, DNA repair, metabolism, protease inhibition, proteolysis, signal transduction and transcription regulation. The robustness of the 35-gene signature was confirmed using data from an additional set of 5 larynx tumor samples and 6 adjacent non-tumor larynx tissues. For real time RT-PCR validation we selected fourteen genes, of which 10 (ADCY6, AES, AL2SCR3, CRR9, CSTB, DUSP1, MAP3K5, PLAT, UBL1 and ZNF706) were validated... (Complete abstract click electronic access below)

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Para obter resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, seja pela indústria ou pelos órgãos de fiscalização, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para a detecção e quantificação de Salmonella. Os propósitos do estudo foram avaliar a viabilidade de emprego do QIAamp® DNA Stool Mini Kit para extração e purificação de DNA de Salmonella; validar ensaios baseados em PCR-tempo real (PCR-RT) para quantificar o DNA de Salmonella empregando ttr ou tuf e desenvolver um ensaio para quantificar Salmonella baseado na transcriptase reversa-PCR-tempo real (RT-PCR-RT). Para avaliação do QIAamp® DNA Stool Mini Kit empregaram-se fezes coletadas diretamente do reto de animais infectados ou não, sendo estas últimas artificialmente contaminadas e submetidas à extração segundo protocolo do fabricante. As amostras de DNA isoladas foram quantificadas empregando um ensaio Salmonella-específico PCR-RT utilizando como alvo o lócus ttr. O mesmo ensaio foi utilizado para células de Salmonella provenientes de meio de cultura. O ensaio PCR-RT baseado no alvo tuf foi validado empregando-se primeiramente cepas de diferentes sorotipos de Salmonella e de outras Enterobacteriaceae. A seguir sua eficiência foi avaliada para alimentos-modelo (ave e suíno) artificialmente contaminadas com elevada (≈ 6 log UFC/mL) e baixa (≈ 2 log UFC/mL) população de Salmonella Typhimurium DT 104. A validação do método quantitativo de Salmonella por RT-PCR-RT foi realizada primeiramente com células em meio de cultura e posteriormente nos mesmos alimentos-modelo utilizados para PCR-RT. Em ambos os métodos, alíquotas dos alimentos-modelo foram mantidas a 20 ºC e a 8 ºC, sendo examinadas em diferentes tempos pós-inoculação. Como controle empregou-se a enumeração de microrganismos mesófilos totais e de Salmonella por técnicas convencionais. A taxa de recuperação de Salmonella em fezes suínas artificialmente inoculadas, após tratamento com QIAamp® DNA Stool Kit, variou entre 25% a 50%, dependendo da quantidade inicial de células. Empregando o DNA extraído e submetendo-o à PCR-RT para o ttr obteve-se limite de detecção de 2,8 log UFC eq/g de fezes; método que foi menos sensível que o convencional. A quantificação de Salmonella por PCR-RT empregando tuf apresentou limite de detecção menor que 1 log UFC eq. Os resultados obtidos com este método, empregando-se células em meio de cultura ou alimentos-modelo, foram, de maneira geral, ligeiramente inferiores aos do método convencional. A eficiência de amplificação para PCR-RT e tuf foi de 94%. O método RT-PCR-RT apresentou limite de detecção semelhante ao obtido com o ttr (2 log UFC eq) e sua eficiência de amplificação foi de 100%. Observou-se que tuf é expresso na fase logarítmica de multiplicação bacteriana, o que o torna um bom indicador da viabilidade de Salmonella. / In order to get fast and trustworthy results that allow monitoring the microbiological food safety either by industries or governmental agencies, diverse alternative methods have been developed for Salmonella detection and quantification. The purposes of this study were to evaluate the viability of the use of QIAamp® DNA Stool Mini Kit for Salmonella DNA extraction and purification; to validate assays based on real time-PCR (PCR-RT) to quantify Salmonella DNA by using ttr or tuf, and to develop an assay to quantify Salmonella based on reverse transcriptase- PCR-real time (RT-PCR-RT). For QIAamp® DNA Stool Mini Kit evaluation feces taken directly from the rectum of infected or health animals were used, with the former being artificially contaminated. Samples were submitted to DNA extraction, according to manufacturers protocol. The isolated DNA were quantified using a Salmonella-specific PCR-RT targeting the ttr locus. The same assay was used for Salmonella cells originated from culture medium. The PCR-RT assay with tuf as target was first validated employing different Salmonella serovars and other Enterobacteriaceae strains. After, its efficiency was evaluated on food-models (chicken and swine) spiked with high (≈ 6 log CFU/mL) and low (≈ 2 log CFU/mL) Salmonella Typhimurium DT 104 populations. The validation of the quantitative RT-PCR-RT method was first conducted with cells grown in culture medium, and then in the same food-model used for PCR-RT. For both methods aliquots of foodmodels were maintained at 20 ºC and 8 ºC being evaluated at different incubation times. Enumeration of total mesophilic microorganisms and Salmonella based on conventional methods were used as controls. The DNA recovery rate in swine feces artificially inoculated, after QIAamp® DNA Stool Mini Kit treatment, was between 25% to 50% depending the initial amount of cells. Using the extracted DNA and submitting it to PCR-RT for ttr a detection level of 2,8 CFU eq/g of feces was obtained. This method showed lower sensitivity than the conventional. Salmonella quantification by PCR-RT employing tuf showed a detection level lower than 1 log CFU eq. The results obtained with this method and cells suspended in culture medium or in food-model systems were, in general slightly lower that those obtained with the conventional method. The efficiency of amplification for PCR-RT tuf was 94%. Detection limit of RT-PCR-RT was similar to that of ttr (2 log CFU eq) and efficiency of amplification was 100%. tuf was expressed in logarithmic phase of bacteria growth curve showing that it is a good viability indicator for Salmonella.

Para obter resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, seja pela indústria ou pelos órgãos de fiscalização, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para a detecção e quantificação de Salmonella. Os propósitos do estudo foram avaliar a viabilidade de emprego do QIAamp® DNA Stool Mini Kit para extração e purificação de DNA de Salmonella; validar ensaios baseados em PCR-tempo real (PCR-RT) para quantificar o DNA de Salmonella empregando ttr ou tuf e desenvolver um ensaio para quantificar Salmonella baseado na transcriptase reversa-PCR-tempo real (RT-PCR-RT). Para avaliação do QIAamp® DNA Stool Mini Kit empregaram-se fezes coletadas diretamente do reto de animais infectados ou não, sendo estas últimas artificialmente contaminadas e submetidas à extração segundo protocolo do fabricante. As amostras de DNA isoladas foram quantificadas empregando um ensaio Salmonella-específico PCR-RT utilizando como alvo o lócus ttr. O mesmo ensaio foi utilizado para células de Salmonella provenientes de meio de cultura. O ensaio PCR-RT baseado no alvo tuf foi validado empregando-se primeiramente cepas de diferentes sorotipos de Salmonella e de outras Enterobacteriaceae. A seguir sua eficiência foi avaliada para alimentos-modelo (ave e suíno) artificialmente contaminadas com elevada (≈ 6 log UFC/mL) e baixa (≈ 2 log UFC/mL) população de Salmonella Typhimurium DT 104. A validação do método quantitativo de Salmonella por RT-PCR-RT foi realizada primeiramente com células em meio de cultura e posteriormente nos mesmos alimentos-modelo utilizados para PCR-RT. Em ambos os métodos, alíquotas dos alimentos-modelo foram mantidas a 20 ºC e a 8 ºC, sendo examinadas em diferentes tempos pós-inoculação. Como controle empregou-se a enumeração de microrganismos mesófilos totais e de Salmonella por técnicas convencionais. A taxa de recuperação de Salmonella em fezes suínas artificialmente inoculadas, após tratamento com QIAamp® DNA Stool Kit, variou entre 25% a 50%, dependendo da quantidade inicial de células. Empregando o DNA extraído e submetendo-o à PCR-RT para o ttr obteve-se limite de detecção de 2,8 log UFC eq/g de fezes; método que foi menos sensível que o convencional. A quantificação de Salmonella por PCR-RT empregando tuf apresentou limite de detecção menor que 1 log UFC eq. Os resultados obtidos com este método, empregando-se células em meio de cultura ou alimentos-modelo, foram, de maneira geral, ligeiramente inferiores aos do método convencional. A eficiência de amplificação para PCR-RT e tuf foi de 94%. O método RT-PCR-RT apresentou limite de detecção semelhante ao obtido com o ttr (2 log UFC eq) e sua eficiência de amplificação foi de 100%. Observou-se que tuf é expresso na fase logarítmica de multiplicação bacteriana, o que o torna um bom indicador da viabilidade de Salmonella. / In order to get fast and trustworthy results that allow monitoring the microbiological food safety either by industries or governmental agencies, diverse alternative methods have been developed for Salmonella detection and quantification. The purposes of this study were to evaluate the viability of the use of QIAamp® DNA Stool Mini Kit for Salmonella DNA extraction and purification; to validate assays based on real time-PCR (PCR-RT) to quantify Salmonella DNA by using ttr or tuf, and to develop an assay to quantify Salmonella based on reverse transcriptase- PCR-real time (RT-PCR-RT). For QIAamp® DNA Stool Mini Kit evaluation feces taken directly from the rectum of infected or health animals were used, with the former being artificially contaminated. Samples were submitted to DNA extraction, according to manufacturers protocol. The isolated DNA were quantified using a Salmonella-specific PCR-RT targeting the ttr locus. The same assay was used for Salmonella cells originated from culture medium. The PCR-RT assay with tuf as target was first validated employing different Salmonella serovars and other Enterobacteriaceae strains. After, its efficiency was evaluated on food-models (chicken and swine) spiked with high (≈ 6 log CFU/mL) and low (≈ 2 log CFU/mL) Salmonella Typhimurium DT 104 populations. The validation of the quantitative RT-PCR-RT method was first conducted with cells grown in culture medium, and then in the same food-model used for PCR-RT. For both methods aliquots of foodmodels were maintained at 20 ºC and 8 ºC being evaluated at different incubation times. Enumeration of total mesophilic microorganisms and Salmonella based on conventional methods were used as controls. The DNA recovery rate in swine feces artificially inoculated, after QIAamp® DNA Stool Mini Kit treatment, was between 25% to 50% depending the initial amount of cells. Using the extracted DNA and submitting it to PCR-RT for ttr a detection level of 2,8 CFU eq/g of feces was obtained. This method showed lower sensitivity than the conventional. Salmonella quantification by PCR-RT employing tuf showed a detection level lower than 1 log CFU eq. The results obtained with this method and cells suspended in culture medium or in food-model systems were, in general slightly lower that those obtained with the conventional method. The efficiency of amplification for PCR-RT tuf was 94%. Detection limit of RT-PCR-RT was similar to that of ttr (2 log CFU eq) and efficiency of amplification was 100%. tuf was expressed in logarithmic phase of bacteria growth curve showing that it is a good viability indicator for Salmonella.