L'élimination programmée d'ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double brin (CDB) de l'ADN et la préservation de l'intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l'introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l'excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l'élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L'implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l'excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n'y a pas de jonctions d'excision formées et les extrémités cassées s'accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L'hypothèse d'une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l'utilisation de microhomologie, a été émise. C'est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d'extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l'ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d'un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l'introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome.

Thermodynamic stabilities of eighteen cyclic C5H6 isomers were explored computationally both on singlet and triplet state potential energy surfaces (PES). All isomers have singlet ground states except for bicyclo[2.1.0]pent-5-ylidene (B5) having no stable geometry on the singlet C5H6 PES. Cyclopenta-1,3-diene (M1) is the most stable cyclic C5H6 isomer while cyclopent-1,4-diylidene is the least stable one among all. Cyclopenta-1,2-diene (M2) and cyclopentyne (M3) have biradical characters of 46.9 and 21.5%, respectively. Seven unimolecular isomerization reactions occurring among several of these molecules were investigated by DFT and ab initio methods. The conversion of bicyclo[2.1.0]pent-2-ene (B1) and tricyclo[2.1.0.02,5]-pentane (T1) into 1,3-cyclopentadiene (M1) are shown to be concerted processes whose reaction paths pass through TSs with a high degree of biradical character. The reaction enthalpies (DH0) are predicted to be -47.7 kcal/mol for B1 and -63.8 kcal/mol for T1 at UB3LYP/6-31G(d) level. The activation enthalpy (DH0&sup1 / ) for the ring opening of B1 was calculated by the CR-CCSD(T) method to be 25.2 kcal/mol, in good agreement with experiment. Furthermore, the DH0&sup1 / for the ring opening of T1 was obtained by the CR-CCSD(T) method to be 48.2 kcal/mol. The self-conversion of M1 via 1,5-hydrogen shift is a facile and concerted reaction with aromatic TS. The DH0&sup1 / estimations of B3LYP and CC methods are 25.24 and 28.78 kcal/mol, respectively. For 1,2-hydrogen shift reactions of cyclopent-3-enylidene (M4) and cyclopenten-2-ylidene (M5), the single point CC calculations predicted the DH0&sup1 / values of 3.13 and 10.12 kcal/mol, as well as, the DH0 values of -71.28 and -64.05 kcal/mol, respectively. The reason of M5 being more stable than M4 is due to the conjugation of the carbene carbon and the double bond in M5. The reaction path of cyclobutylidene methylene to cyclopentyne rearrangement is found to be rather shallow. The DH0&sup1 / and DH0 values predicted by the RCCSD(T) method to be 3.65 and -5.72 kcal/mol, respectively. Finally, triplet state isomerization of bicyclo[2.1.0]pent-5-ylidene to cyclopenta-1,2-diene, as well as, its parent reaction, cyclopropylidene to 1,2-propadiene were investigated at several levels of theory including DFT, CASSCF and CC methods. The UCCSD(T) method estimated a moderate barrier whose value is 8.12 kcal/mol for the isomerization of 3B5 with the reaction enthalpy of -44.63 kcal/mol.

Submitted by OCTAVIO MANUEL PALACIOS GIMÉNEZ null (opalacios7@gmail.com) on 2018-01-10T10:10:20Z No. of bitstreams: 1 Tesis_completa.pdf: 26112515 bytes, checksum: 3ddefcdf63a47077ccb1b62c384cae1b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-01-10T18:40:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gimenez_omp_dr_rcla.pdf: 25788766 bytes, checksum: da0e0599de64bcf81bfb8ddceda0c8e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-10T18:40:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gimenez_omp_dr_rcla.pdf: 25788766 bytes, checksum: da0e0599de64bcf81bfb8ddceda0c8e7 (MD5) Previous issue date: 2017-12-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os cromossomos sexuais se originam independentemente de um par de homólogos autossômicos e em várias linhagens apresentam características comuns, tais como acúmulo de vários tipos de DNA repetitivo, restrição da recombinação e perda ou ganho de genes devido á diferenciação morfológica e genética entre os cromossomos sexuais X e Y ou Z e W. Estas características representam um exemplo fascinante de convergência evolutiva. Em Orthoptera, o sistema cromossômico sexual comumente encontrado na maioria das espécies estudadas é do tipo X0♂/XX♀. Entretanto, sistemas cromossômicos sexuais derivados dos tipos neo-XY♂/XX♀ e neo- X1X2Y♂/X1X1X2X2♀ são também observados, surgindo repetidamente por fusões cêntricas e em tandem, inversões e dissociações envolvendo cromossomos sexuais ancestrais e autossomos. O presente trabalho teve três objetivos. Primeiro, entender o possível papel dos DNAs repetitivos na estrutura/diversificação dos cromossomos sexuais simples e derivados, a partir do isolamento e mapeamento físico de sequências, tais como, famílias multigênicas, DNA satélite (DNAsat) e microssatélites, nas espécies Gryllus assimilis, Cycloptiloides americanus e Eneoptera surinamensis. Segundo, testar e comparar transcrição diferencial de DNAsat entre diferentes tecidos, sexos e espécies a partir de transcriptomas de Gryllus assimilis, G. bimaculatus, G. firmus e G. rubens, com o objetivo de entender os possíveis papéis funcionais destas sequências na regulação gênica, modulação da cromatina e como componentes funcionais de importantes estruturas como telômeros, centrômeros e cromossomos sexuais. Terceiro, a partir de transcriptomas de espécies de grilos (Gryllus assimilis, G. bimaculatus e G. firmus) prospectar genes codificadores de proteínas relacionados com a determinação sexual, envolvidos com o fitness reprodutivo e genes enviesados do sexo, responsáveis pelas diferenças fenotípicas entre machos e fêmeas, e tentar elucidar de uma maneira comparativa os fatores evolutivos atuando nestes loci. Origem de novo de cromossomos sexuais mediante rearranjos cromossômicos, assim como acúmulo de DNA repetitivo que levaram a diferenciação entre cromossomos sexuais são relatados em C. americanus (X1X20) e E. surianmensis (neo-X1X2Y). Estas características observadas em grilos representam outro caso notável de convergência evolutiva devido os cromossomos sexuais não relacionados compartilharem muitas propriedades entre táxons distantes. Acúmulo surpreendente de loci de DNAsat foi encontrado no neo-Y altamente diferenciado de E. surinamensis, incluindo 39 DNAsat representados em excesso neste cromossomo, que é a maior diversidade de DNAsat até agora relatada para cromossomos sexuais. Foi documentado que, particularmente os DNAsat, contribuíram grandemente para o aumento de tamanho genômico entre G. assimilis e E. surinamensis. Um achado interessante foi a identificação de DNAsat conservados entre espécies de grilos (Gryllus assimilis, G. bimaculatus e G. firmus), mas transcritos diferencialmente. Os dados relativos à presença de DNAsat no genoma de G. assimilis foram discutidos em um contexto evolutivo, com dados transcricionais permitindo comparações entre os sexos e entre os tecidos quando possível. Foram discutidas hipóteses para a conservação e transcrição de DNAsat em Gryllus, que podem resultar do seu papel na diferenciação sexual no nível da cromatina, na formação da heterocromatina e na função centromérica. Outra descoberta foi a identificação de genes determinantes do sexo e outros genes relacionados ao fitness reprodutivo, como a biossíntese de hormônios de insetos e ritmo circadiano entre espécies de Gryllus. Os efetores e os alvos downstream das vias de determinação do sexo foram previamente identificados em outros insetos, mas nunca em Orthoptera. Usando G. assimilis como modelo para estudar genes enviesados do sexo foi possível identificar um conjunto de genes altamente expressos que podem explicar diferenças fenotípicas entre os sexos. Estimou-se que os genes codificadores de proteínas relacionadas com a diferenciação sexual e com o fitness reprodutivo evoluem mais rapidamente do que os genes não reprodutivos (genes housekeeping) como resultado de uma forte seleção positiva nos primeiros. Além disso, foi encontrado que as espécies estudadas apresentam níveis excepcionalmente elevados de duplicações gênicas. As descobertas sugerem que as duplicações gênicas podem desempenhar um papel na expressão de genes enviesados do sexo no grilo de campo G. assimilis, uma espécie que no futuro provavelmente irá fornecer informações sobre genômica funcional e epigenética da determinação do sexo. / Sex chromosomes have arisen independently from an ordinary autosomal pair and in several lineages they present common characteristics, such as accumulation of distinct classes of repetitive DNAs, restriction of the recombination and loss or gain of genes due to the morphological and genetic differentiation between the sexual chromosomes X and Y or Z and W. These characteristics represent a fascinating example of evolutionary convergence. In Orthoptera, the X0♂/XX♀ sex-determining system is considered modal but eventually, diverse sex chromosome systems evolved several times, such as neo-XY♂/XX♀, X1X20♂/X1X1X2X2♀ and even neo- X1X2Y♂/X1X1X2X2♀. It was found that particularly centric fusions (i.e., Robertsonian translocations) and tandem fusions with autosomes, dissociations and inversions contributed to the formation of neo-sex chromosomes in Orthoptera. The present work had three objectives. First, get insights of the role of repetitive DNAs in the structure/diversification of simple and derivative sex-chromosomes by isolation and physical mapping of repetitive DNA sequences, such as multigene families, satellite DNA (satDNA) and microsatellites using Gryllus assimilis, Cycloptiloides americanus e Eneoptera surinamensis, as models. Second, looking at differential satDNA transcription between different tissues, sexes, and species from transcriptomes of Gryllus assimilis, G. bimaculatus, G. firmus and G. rubens, I tried to understand the possible functional roles of these sequences in gene regulation, chromatin modulation and as functional components of important structures such as telomeres, centromeres and sex chromosomes. Third, using transcriptomes from cricket species (Gryllus assimilis, G. bimaculatus and G. firmus), I searched for genes encoding proteins related to sexual determination, reproductive fitness and sex-biased genes which are responsible for the phenotypic differences between males and females. I also tried to elucidate in a comparative way the evolutionary factors acting at these loci. De novo origin of sex chromosomes by chromosomal rearrangements, as well as repetitive DNA accumulation that led to the differentiation between sex chromosomes are reported for C. americanus (X1X20) e E. surianmensis (neo-X1X2Y). These features observed in crickets represent another remarkable case of evolutionary convergence because unrelated sex chromosomes share many common properties among distant taxa. Especially astonishing accumulation of satDNAs loci was found in the highly differentiated neo-Y, including 39 satDNAs over-represented in this chromosome, which is the greatest satDNAs diversity yet reported for sex chromosomes. It has been documented that, particularly the satDNA, contributed greatly to the increase in genomic size between G. assimilis and E. surinamensis. An interesting finding was the identification of satDNA conserved among species of crickets (Gryllus assimilis, G. bimaculatus and G. firmus), but differentially transcribed. The data regarding satDNA presence in G. assimilis genome was discussed in an evolutionary context, with transcriptional data enabling comparisons between sexes and across tissues when possible. I discussed hypotheses for the conservation and transcription of satDNAs in Gryllus, which might result from their role in sexual differentiation at the chromatin level, heterochromatin formation, and centromeric function. Another finding was the identification of sex-determining genes and other genes related to reproductive fitness, such as biosynthesis of insect hormones and circadian rhythm among Gryllus species. The effectors as well as downstream targets of sex-determination pathways have been previously identified in other insects but never in Orthoptera. Using G. assimilis to study sex-biased genes I identified a set of highly expressed genes that might account for phenotypic differences between sexes. Furthermore, I estimated that proteinencoding reproductive genes evolve faster than non-reproductive genes as result of strong positive selection at those loci. It was documented that the species studied harbor exceptionally high levels of gene duplications. The findings suggest that gene duplications may play a role in sex-biased genes expression in the field cricket G. assimilis, a species likely to yield insights into the functional genomics and epigenetics of sex determination. / FAPESP: 2014/02038-8

Made available in DSpace on 2016-12-08T17:00:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 michele.pdf: 1096907 bytes, checksum: b4e525381671a96621d9838a62222716 (MD5) Previous issue date: 2011-03-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the last decades of the twentieth century, Brazil emerged in the scenario of international migration. Brazilians left their country encouraged by several factors and many of these people migrated because of the crisis that ravaged the country. Most of these Brazilians chose the United States as a destination of migration. The intensity of migratory flows in some regions meant that Brazilian cities like Governador Valadares (MG), Criciúma (SC) and Maringá (PR) become poles of this migration and in these regions the transformations brought by migrants can be clearly observed. Thus, this study aimed to underline the changes performed by migrants, especially for the ones who came back to Criciúma. By understanding international migration flows as a broad phenomenon, in which many networks are created, several aspects of this migration have been explored. First of all, some elements that helped to consolidate the flow of people from Criciúma to the United States were pointed out. After a brief analysis of how these Brazilians lived abroad, we sought to highlight the difficulties with the return, because for many of them to come back to their city is more difficult than to migrate. The return promotes surprises, and people sometimes cannot deal with the new life. The return also requires investment and planning for the future. Thus, we can highlight the high demand for real estate purchase of this group and how this demand has dramatically changed the urban landscape of Criciúma. It was also attempted to investigate the rearrangements made by the family during the absence of the migrants who have migrated, and also point out some difficulties experienced by these families with plans to return. Overall, this analysis allowed us to highlight some of the consequences of migration in the place of origin, enabling us to better understand the universe of migrants and their families who were waiting for them / Nas últimas décadas do século XX o Brasil despontou no cenário das migrações internacionais. Os brasileiros partiram incentivados por diversos fatores, sendo que muitos migraram por conta das crises que assolavam o país. Grande parte destes brasileiros escolheu como destino migratório os Estados Unidos. A intensidade dos fluxos migratórios de algumas regiões fez com que cidades, como Governador Valadares (MG), Criciúma (SC) e Maringá (PR) se tornassem polos destas migrações, em tais regiões as transformações promovidas pelos migrantes podem ser claramente percebidas. Nesse sentido, este trabalho buscou dar visibilidade às mudanças desempenhadas pelos migrantes, e principalmente pelos retornados, na cidade de Criciúma. Entendendo os fluxos migratórios internacionais como fenômenos amplos, nos quais muitas redes são tecidas, diversos aspectos desta migração foram explorados. Primeiramente foram apontados alguns elementos que auxiliaram na consolidação do fluxo migratório criciumense para os Estados Unidos. Após uma breve análise da vivência destes brasileiros no exterior buscou-se evidenciar as dificuldades no retorno, pois para muitos retornar é mais difícil do que migrar. O retorno promove estranhamentos com quais, nem sempre os retornados conseguem lidar. O retorno também implica investimento e planejamento para o futuro. Assim, pode-se evidenciar a grande procura pela aquisição de bens imóveis deste grupo e o quanto esta procura alterou drasticamente a paisagem urbana criciumense. Ainda buscou-se investigar os rearranjos familiares desenvolvidos pelos familiares dos migrantes durante a ausência de seus entes, assim com apontar algumas dificuldades vivenciadas por estas famílias com os planos de retorno. De modo geral, esta análise nos possibilitou evidenciar algumas das conseqüências das migrações no local de origem dos fluxos, possibilitando-nos compreender melhor o universo do migrante e de seus familiares que ficam a sua espera

Estudos de citogenética comparativa são rotineiramente desenvolvidos a partir da comparação dos padrões de bandamentos cromossômicos. Contudo, quando se trata de espécies que apresentam genomas altamente rearranjados, como no caso das espécies de Akodon, ou que são muito divergentes, a comparação de cromossomos por padrões de bandas torna-se inadequada. Como consequência, a pintura cromossômica tem se tornado o método de escolha assertivo, já que permite comparação genômica no nível citogenético. Nessa tecnologia sondas de um cromossomo inteiro de uma determinada espécie são hibridadas in situ em cromossomos de outra espécie, detectando as regiões homólogas entre os genomas. No presente estudo comparamos os cariótipos altamente diferenciados de algumas espécies de Akodon por meio de pintura cromossômica recíproca com uso de sondas espécie-específicas, obtidas a partir de cromossomos separados por citometria de fluxo. Os resultados revelaram homologia completa entre os complementos de Akodon sp. n. (ASP), 2n=10, A. cursor (ACU), 2n=15, A. montensis (AMO), 2n=24 e A. paranaensis (APA), 2n=44 e evidenciaram com precisão muitos rearranjos cromossômicos entre os complementos das espécies. Rearranjos Robertsonianos e em tandem, inversões pericêntricas e/ou reposicionamento de centrômero, inversão paracêntrica, translocações, inserções e existência de sítios frágeis nos complementos foram observados. A pintura cromossômica empregando o conjunto de sondas de APA para 21 autossomos mais cromossomos X e Y evidenciou oito segmentos sintênicos compartilhados entre A. montensis, A. cursor e Akodon sp. n., cinco associações exclusivas para A. cursor e seis para Akodon sp. n. Foi também detectada homologia completa dos cromossomos X, com exceção da região heterocromática de ASP X, e até mesmo dos cromossomos Y que geralmente não apresenta sinal hibridação entre diferentes espécies de mamíferos. Esses dados indicam que essas espécies intimamente relacionadas passaram por um processo recente de intensa diferenciação autossômica, no qual se conservou a homologia total, por exceção de Akodon sp. n., entre os cromossomos sexuais. Pertencente a tribo Akodontini, Deltamys Thomas 1917 é um táxon pouco estudado e que é raramente capturado. Utilizando-se de caracteres morfológicos ou genéticos, alguns autores consideram Deltamys como um gênero pleno enquanto outros acreditaram que esse devesse ser referido como subgênero ou sinônimo de Akodon. A única espécie formalmente descrita é Deltamys kempi que apresenta cariótipo básico com 2n=37 nos machos e 2n=38 nas fêmeas, NF=38, com sistema de determinação de sexo do tipo X1X1X2X2: X1X2Y. Uma característica citogenética que distingue Deltamys de Akodon é a presença de um pequeno par metacêntrico marcador em Akodon. Um cariótipo com 2n=40 e NF=40; XX: XY foi relacionado ao gênero Akodon porém, como em Deltamys kempi , esse complemento não apresenta o pequeno par metacêntrico. As análises filogenéticas de máxima parcimônia e máxima verossimilhança baseadas em sequências do gene mitocondrial do citocromo b evidenciaram o monofiletismo dos espécimens de Akodon sp. 2n=40, e o monofiletismo de Deltamys kempi. Além disso, revelaram que Akodon sp. é grupo irmão de Deltamys kempi, estando mais relacionado a este último gênero do que às demais espécies de Akodon, sugerindo a inclusão dos espécimens portadores do cariótipo com 2n=40 em Deltamys. Dessa forma, o gênero Deltamys se mostrou mais diverso do que até então se tinha conhecimento, agrupando duas linhagens: Deltamys kempi , 2n=37-38 ; X1X1X2X2: X1X2Y e Deltamys sp. 2n=40, XX: XY, que apresentam entre sí uma marcante divergência genética que chega a 12, 1%. Um cariótipo com 2n=50, NF=48 foi descrito para espécimes de Thaptomys Thomas,1916, coletados em Una, estado da Bahia, Brasil, que são indistinguíveis morfologicamente dos Thaptomys nigrita que apresentam 2n=52, NF=52, encontrados em outras localidades brasileiras. Foi então proposto que esse novo cariótipo com 2n=50 pertencesse a uma espécie críptica de Thaptomys nigrita, uma vez que os rearranjos cromossômicos observados somados a distância geográfica pode representar uma barreira reprodutiva entre as duas formas. Com o intuito de se estabelecer as relações entre indivíduos de Thaptomys com os dois números diplóides, análises filogenéticas moleculares foram realizadas com o uso de dezoito sequências do gene mitocondrial do citocromo b provenientes de espécimes cariotipados coletados ao longo da distribuição geográfica do gênero. Dois clados principais, Nordeste (A) que agrupa espécimens com 2n=50 e Sudeste (B) que agrupa espécimes com 2n=52, foram recuperados por análises de máxima parcimônia e máxima verossimilhança. As relações filogenéticas intra-genéricas corroboram os distintos números diplóides, e mostram os cariótipos com 2n=50 e 2n=52 como clados irmãos entre si separados pela cladogênese basal de Thaptomys . No presente trabalho são apresentados estudos de filogenia molecular e citogenética para o gênero monotípico de roedor fossorial Blarinomys Thomas 1896. Foram realizadas análises de máxima parcimônia e máxima verossimilhança com base em sequências do gene mitocondrial citocromo b , para amostra de 11 exemplares de B. breviceps provenientes de nove localidades de quatro estados do território brasileiro. Todas as topologias recuperaram duas linhagens principais: um clado Nordeste (A) e outro Sudeste. O clado sudeste agrupou dois clados irmãos, B e C. A divergência de sequência entre os indivíduos variou de: 4,7- 8,0% entre os clados nordeste e sudeste; 4,3-5,7% entre os clados B e C; 6,1-8,0% entre os clados nordeste; e B, e 4,7-6,4% entres os clados nordeste e C. Dentro dos clados a divergência variou de 0- 4,2% no clado nordeste, foi de 0,7% no clado B, e variou de 0,1- 1,3% no clado C. Variação entre espécimes da mesma região geográfica foi de 0-1,3%. Os estudos de citogenética de cinco exemplares revelaram alta diversidade cariotípica com cinco números diplóides distintos: 2n=52 (48A+2Bs, XY), 2n=43 (37A+4Bs, XX), 2n=37 (34A+1B, XY), 2n=34 (32A, XX) e 2n=31 (27A+2Bs, XX) e mesmo número de braços autossômicos (NF=50), excluindo-se os cromossomos sexuais e os supernumerários. Foram observados polimorfismos decorrentes de rearranjos Robertsonianos, além de variação de 0 a 4 cromossomos Bs, que são heterogêneos quanto a morfologia, constituição de heterocromatina e presença de sinais teloméricos intersticiais (ITS). ITS também foram observados na região pericentromérica de alguns pares autossômicos com dois braços em três dos exemplares. Foi realizada pintura cromossômica com sonda do cromossomo X de Akodon cursor (ACU X). Nossos dados revelaram uma diversidade até então desconhecida para Blarinomys , mostrando duas linhagens distintas correspondentes a regiões na Mata Atlântica e um extraordinário polimorfismo cromossômico. / Traditionally comparative cytogenetic studies are based mainly on banding patterns. Nevertheless, when dealing with species with highly rearranged genomes, as in Akodon species, or with other highly divergent species, cytogenetic comparisons of banding patterns prove to be inadequate. Hence, comparative chromosome painting has become the method of choice for genome comparisons at the cytogenetic level, since it allows complete chromosome probes of a species to be hybridized in situ onto chromosomes of other species, detecting homologous genomic regions between them. In the present study, we have explored the highly rearranged complements of the Akodon species using reciprocal chromosome painting through species-specific chromosome probes obtained by chromosome sorting. The results revealed complete homology among the complements of Akodon sp. n. (ASP), 2n=10, A. cursor (ACU), 2n=15, A. montensis (AMO), 2n=24 and A. paranaensis (APA), 2n=44 and extensive chromosome rearrangements have been detected within the species with high precision. Robertsonian and tandem rearrangements, pericentric inversions and/or centromere repositioning, paracentric inversion, translocations, insertions and fragile sites were observed. The chromosome painting using the APA set of 21 autosomes plus X and Y exhibited eight syntenic segments that are shared with A. montensis, A. cursor and Akodon sp. n. plus five exclusive associations for A. cursor and six for Akodon sp. n. Chromosomes X, except for the heterochromatin region of ASP X, and even chromosome Y that often present no hybridization signal when hybridized between species of mammals, shared complete homology among the species. These data indicate that all those closely related species have experienced a recent intensive process of autosomic differentiation, in wich, there is still complete maintenance, except for chromosome X of Akodon sp. n., of the sex chromosomes homologies. Member of the tribe Akodontini, Deltamys Thomas 1917 is a poorly studied and rarely collected taxon. Based on morphological or genetic characters, some authors considered Deltamys as a full genus while others regarded it as subgenus or synonym of Akodon. The single described species, Deltamys kempi presents a basic karyotype with 2n=37 in males and 2n=38 in females, FN=38, and with sex determination system of the type X1X1X2X2: X1X2Y. A cytogenetic character that distinguishes Deltamys from Akodon is the presence of a small metacentric pair marker in Akodon. A karyotype with 2n=40 and FN=40; XX: XY was related to the genus Akodon, but as in Deltamys kempi, this complement does not present the small metacentric pair. Phylogenetic analyses of maximum parsimony and maximum likelihood based on sequences of the mitochondrial gene cytochrome b evidenced the monophyly of a clade grouping specimens of Akodon sp. 2n=40 and monophyly of a clade containing specimens of Deltamys kempi. Besides that, the analyses showed that Akodon sp. is the sistergroup of Deltamys kempi, thus more related to this genus than to other species of Akodon and suggesting the placement of specimens with 2n=40 Deltamys. The genus Deltamys is, thus, more diverse than previously thought, grouping two lineages: Deltamys kempi, 2n=37-38 ; X1X1X2X2: X1X2Y and Deltamys sp. 2n=40, XX: XY, with a marked genetic divergence of 12,1% between them. A karyotype with 2n=50, FN=48 has been described for specimens of Thaptomys Thomas, 1916 collected at Una, State of Bahia, Brazil, which are morphologically indistinguishable from Thaptomys nigrita with 2n=52, FN=52 found in other Brazilian localities. It has been hence proposed that this new karyotype with 2n=50 could belong to a distinct species, cryptic of Thaptomys nigrita, once chromosome rearrangements observed along with the geographic distance could represent a reproductive barrier between both forms. Molecular phylogenetic analyses using the cytochrome b sequences of eighteen karyotyped specimens of Thaptomys were performed attempting to establish the relationships among the individuals along the geographic distribution of the genus. Two major clades, Northeastern (A) with specimens with 2n=50 and Southeastern (B) with specimens with 2n=52, were reconstructed by maximum parsimony (MP) and maximum likelihood (ML). The intra-generic relationships recovered by phylogenetic analyses corroborated the distinct diploid numbers. The 2n=50 and 2n=52 karyotypes appeared as monophyletic separated by the basal cladogenesis of the genus, sister-group to each other. We present molecular phylogenetic and cytogenetic data on the monotypic fossorial rodent genus Blarinomys . Maximum parsimony and maximum likelihood based on cytochrome b gene sequences were performed for a sample of 11 individuals from nine localities of four states of Eastern Brazil. All topologies recovered two main lineages: a Northeastern (A) and a Southeastern clade. The Southeastern grouped two sister-clades B and C. Sequence divergence between individuals ranged from 4.7-8.0% between northeastern and southeastern clades, from 4.3-5.7% between clades B and C, from 6.1-8.0% between clades northeastern and B, and from 4.7-6.4% between clades northeastern and C. Within the clades, divergence varied from 0- 4.2% in the northeastern clade, was 0.7% in the clade B, and varied from 0.1- 1.3% in clade C. Variation among specimens from the same geographic regions ranged from 0-1.3%. Cytogenetic studies of five individuals revealed high karyotypic diversity with five distinct diploid numbers: 2n=52 (48A+2Bs,XY) from state of Bahia, and 2n=43 (37A+4Bs,XX), 2n=37 (34A+1B,XY), 2n=34 (32A,XX), and 2n=31 (27A+2Bs,XX) from state of São Paulo; and same number of autosomic arms (FN=50) excluding sex chromosomes and supernumeraries. Polymorphisms are due to Robertsonian rearrangements, in addition to the variation from none to four B chromosomes, which are heterogeneous regarding morphology, heterochromatin constitution and presence of interstitial telomeric signals (ITS). ITSs were also observed in the pericentromeric regions of some biarmed autosomic pairs of three specimens. Our results revealed a high unknown diversity for Blarinomys , showing two distinct lineages corresponding to regions of the Atlantic Rainforest, besides an extraordinary chromosomal polymorphism.

Este estudo teve como objetivo identificar mecanismos pelos quais rearranjos cromossômicos aparentemente equilibrados possam estar associados de maneira causal a determinados quadros clínicos. Para isso estudamos seis translocações cromossômicas aparentemente equilibradas, detectadas em pacientes com malformações congênitas, comprometimento neuropsicomotor ou déficit intelectual. Os pontos de quebra desses rearranjos foram mapeados por hibridação in situ fluorescente (FISH). A busca por microdeleções e duplicações genômicas foi realizada por a-CGH. Estudamos duas translocações esporádicas, t(7;17)(p.13;q24) e t(17;20)(q24.3;q11.2), nas quais os pontos de quebra no cromossomo 17 foram localizados, respectivamente, a 917-855 kb e 624-585 kb upstream ao gene SOX9, em segmentos sem genes mapeados. Ambos os portadores apresentavam alterações esqueléticas que indicaram o diagnóstico de displasia campomélica acampomélica. Não foram detectados desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos por a-CGH. Essas translocações podem levar à expressão alterada do gene SOX9, ao afetar a região reguladora desse gene. Sequências dos outros cromossomos participantes da translocação, que foram aproximadas ao gene pelo rearranjo, também podem ter afetado sua expressão. O estudo dos rearranjos t(7;17) e t(17;20) forneceu informação para o entendimento da região reguladora do gene. As manifestações clínicas associadas à t(17;20) permitiram redefinir o limite distal do cluster distal de rearranjos do cromossomo 17 associados ao espectro de manifestações clínicas do SOX9. A presença de testículo no portador dessa translocação indicou um elemento conservado candidato a atuar como enhancer do SOX9, para o desenvolvimento do testículo. Duas outras translocações equilibradas estavam associadas a desequilíbrios submicroscópicos em cis aos pontos de quebra. Caracterizamos uma t(10;21)(p13;q22) esporádica associada a atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, microcefalia e espasticidade generaliza. Os pontos de quebra dos cromossomos 10 e 21, foram mapeados, respectivamente, em segmentos de 440 kb e 172 kb. Três genes estão mapeados no segmento que contém o ponto de quebra do cromossomo 10 e três outros, no intervalo delimitado para o ponto de quebra no cromossomo 21. O gene CDNF, que pode ter sido interrompido pelo ponto de quebra do cromossomo 10, é altamente expresso no sistema nervoso. A análise por meio de a-CGH detectou quatro deleções no cromossomo 10 todas de novo, indicando a complexidade do rearranjo. Duas deleções estavam próximas ao ponto de quebra: uma deleção de 973 kb em 10p14 e uma outra de 1,15 Mb em 10p13, mapeadas a 3,27 Mb e 210 kb do ponto de quebra da translocação, respectivamente. Outras duas deleções no cromossomo 10 ocorreram no braço longo: uma deleção de 700 kb em 10q26.13 estaria a 110,10 Mb do ponto de quebra da translocação, mas não conseguimos mapeá-la por FISH; uma outra deleção de 1,66 Mb em 10q26.2-q26.3 foi mapeada a 114,68 Mb do ponto de quebra da translocação. Quatorze genes estão localizados nas regiões das microdeleções. Os genes GPR26, OPTN, CUGBP2 são altamente expressos no sistema nervoso e, assim como o CNDF, podem ser considerados candidatos ao efeito fenotípico. O modelo de chromothripsis, em que o rearranjo resulta de uma série de quebras na dupla fita do DNA, seguida de ligação aleatória dos fragmentos resultantes, pode explicar a formação da translocação t(10;21). Aplicando a-CGH no estudo de uma translocação t(X;22)(q22;q13) esporádica, detectamos duplicações de 490 kb e 570 kb, respectivamente, em 22q13 e Xq22. A análise por FISH revelou que as cópias adicionais desses segmentos estavam localizadas nos pontos de quebra dos cromossomos derivativos X (segmento duplicado de 22q13) e 22 (segmento duplicado de Xq22). Não há genes mapeados no segmento duplicado do cromossomo 22. Um dos 14 genes duplicados no cromossomo X é o PLP1 (proteolipid protein 1), cujas mutações de ponto e duplicações causam a doença de Pelizaeus- Merzbacher, caracterizada pela hipomielinização do sistema nervoso central e afetando quase que exclusivamente indivíduos do sexo masculino. O exame neurológico, incluindo ressonância magnética, mostrou que o quadro clínico da paciente é compatível com o da doença de Pelizaeus-Merzbacher. A análise do padrão de inativação do cromossomo X em linfócitos de sangue periférico da paciente, com base na metilação do gene AR e também citologicamente em metáfases, após incorporação de 5-BrdU, revelou que, na maioria das células, o cromossomo X normal está inativo. Esse padrão de inativação torna as células funcionalmente equilibradas quanto aos segmentos translocados. O PLP1, entretanto, tem uma cópia adicional no cromossomo 22, além das cópias localizadas nos cromossomos X e der(X). Portanto, duas cópias ativas do gene estão presentes nas células da portadora da t(X;22). O mecanismo de formação de rearranjos cromossômicos baseado em bolhas de replicação explicaria a formação de translocações com duplicação em ambos os pontos de quebra, como ocorreu nessa t(X;22). Estudamos também uma aparente t(2;22)(p14;q12) familial que cossegregava com quadro de atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dificuldade de aprendizado associados a dismorfismos craniofaciais e alterações de mãos. A identificação de duplicações e deleções submicroscópicas, por meio de a-CGH e sua validação por FISH revelaram que se tratava, na verdade, de rearranjo, complexo entre três cromossomos 2, 5 e 22: um segmento de 1,2 Mb de 2p14 inseriu-se no braço curto do cromossomo 5, um evento que pode ter causado a deleção de um segmento de 1,4 Mb em 5p15.1; no cromossomo derivativo der(22) um segmento adicional de 5q23.2- 23.3 inseriu-se no ponto de quebra. Todos os afetados da família eram portadores do der(2) e do der(22). No entanto, o der(5) não segregava com o quadro clínico e foi detectado em um individuo fenotipicamente normal da família. Todos os afetados eram portadores da duplicação de 6,6 Mb do braço longo do cromossomo 5 (5q23.2-23.3). Os 17 genes duplicados são candidatos para o quadro clínico, por aumento da dosagem de seus produtos. Outra alteração comum a todos os afetados foi a haploinsuficiência do gene SLC1A4 mapeado em 2p14 e altamente expresso no sistema nervoso. É interessante que a deleção em 2p14, consequente à ausência do der(5), está restrita aos dois afetados que aparentam tem maior déficit cognitivo. Além do SLC1A4 , quatro genes mapeados nesse segmento CEP68, RAB1A, ACTR2 e SPRED2 podem contribuir para a variabilidade clínica dos afetados. A translocação t(2;5;22) pode ter-se originado a partir de duas quebras no braço curto do cromossomo 2, duas no braço curto e duas outras no braço longo do cromossomo 5 e uma quebra no braço longo do cromossomo 22. As quebras teriam ocorrido simultaneamente em um único evento. Após reunião de extremidades quebradas, formaram-se os cromossomos derivativos. Investigamos por a-CGH uma t(2;16)(q35;q24.1) esporádica cujos pontos de quebra foram mapeados anteriormente por FISH; nenhum gene estava mapeado nos segmentos que continham esses pontos de quebra. Não detectamos desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos. A paciente portadora da translocação t(2;16) tinha quatro dígitos nas duas mãos e hexadactilia nos pés. A cerca de 1 Mb do ponto de quebra do cromossomo 2 está mapeado o gene IHH, que atua no desenvolvimento dos membros. A translocação pode ter interrompido elemento regulador do IHH ou separado o gene de elemento(s) regulador(es), levando à alteração de sua expressão e ao fenótipo. Este estudo fornece evidência adicional da importância da busca de desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos em associação com rearranjos aparentemente equilibrados. Em três das seis translocações estudadas - t(10;21), t(2;22), t(X;22) - foram detectados desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos em cis aos pontos de quebra, que podem ser responsáveis pelas manifestações clínicas dos portadores. Este estudo ressalta ainda a importância da técnica de FISH na análise dos desequilíbrios cromossômicos detectados por array, permitindo determinar a relação entre as perdas ou ganhos de segmentos submicroscópicos e os rearranjos equilibrados. A caracterização de rearranjos equilibrados neste estudo também contribuiu para sugerir mecanismos para sua formação / This study aimed at identifying mechanisms that lead to phenotypic abnormalities in carriers of balanced chromosomal rearrangements. We studied six apparently balanced chromosomal translocations detected in patients with congenital malformations, intellectual impairment or neuropsychomotor delay. Breakpoint mapping of apparently balanced chromosomal rearrangements was performed by fluorescence in situ hybridization (FISH), and cryptic genomic imbalances were investigated by array comparative genomic hybridization (a-CGH). We studied two sporadic translocations, t(7;17) (p13;q24) and t(17;20) (q24.3,q11.2). The breakpoints were located on chromosome 17, respectively, 917-855 kb and 624-585 kb upstream the SOX9 gene. There are no genes mapped to these segments. Patients had skeletal abnormalities that led to the diagnosis of acampomelic campomelic dysplasia. No submicroscopic chromosomal imbalances were detected by a-CGH. These translocations can alter gene expression by directly disrupting regulatory elements or by a position effect. The translocation t(7;17) and (17;20) provided additional information regarding the regulatory region of SOX9. The clinical manifestations associated with the translocation t(17;20) allowed the redefining of the limits of the distal breakpoint cluster of rearrangements on chromosome 17, which are associated with SOX9-related disorders. A conserved element was identified as a candidate SOX9 enhancer for testis development. Two additional sporadic translocations were associated with submicroscopic imbalances in cis to the breakpoints: t(10;21) and t(X;22). The translocation t(10;21)(p13;q22) was present in a girl with delayed motor development, microcephaly and generalized spasticity. The breakpoints on chromosomes 10 and 21 were mapped to 440 kb and 172 kb segments, respectively. Among the genes mapped to these breakpoint regions, only CDNF on chromossome 10, is highly expressed in the nervous system. Four de novo deletions on chromosome 10 were identified by a-CGH, revealing the complexity of the rearrangement. Two deletions were located at the vicinity of the translocation breakpoint: a 973 kb deletion on 10p14 and a 1.15 Mb deletion on 10p13 located, respectively, 3.27 Mb and 210 kb distal to the translocation breakpoint. Two other deletions were detected on the long arm of chromosome 10: a 700 kb deletion on 10q26.13, located 110.10 Mb distal to the translocation breakpoint, which we could not mapped by FISH; and a 1.66 Mb deletion on 10q26.2-q26.3, located 114.68 Mb distal to the translocation breakpoint. Fourteen genes are mapped to the microdeletion regions. Among these genes, GPR26, OPTN, CUGBP2 are highly expressed in the nervous system and, together with CNDF, are candidates for having clinical effects. The chromothripsis model, in which rearrangements result from a series of simultaneous double-stranded breaks followed by random joining of chromosomal fragments, might explain the formation of this t(10,21) translocation. Applying a-CGH to the apparently balanced translocation t(X;22)(q22;q13) carried by a girl, we detected duplicated segments on 22q13 and Xq22, encompassing 490 kb and 570 kb, respectively. FISH analysis revealed that the additional copies were located to the breakpoints of the derivative X chromosome (22q13 duplicated segment) and of the derivative 22 chromosome (Xq22 duplicated segment). No genes are mapped to the duplicated segment of chromosome 22. One of the 14 duplicated genes on the X chromosome is PLP1 (proteolipid protein 1). PLP1 point mutations and duplications cause Pelizaeus-Merzbacher disease, characterized by hypomyelination of the central nervous system, and affecting almost exclusively males. Neurological examination of the patient, including MRI showed that her clinical manifestations were compatible with Pelizaeus-Merzbacher disease. The pattern of X chromosome inactivation was determined in peripheral blood lymphocytes, based on the AR gene methylation, and cytologically, in metaphases spreads, after 5-BrdU incorporation, and showed that the normal X chromosome was the inactive one in the majority of cells. This pattern of X inactivation makes cells functionally balanced for the translocated segments. A copy of the PLP1 gene, however, is present on chromosome 22, in addition to the copies located on the chromosomes X and der(X). Thus, two active copies of the gene are present in the cells, irrespective of the X-inactivation pattern. A mechanism based on replication bubbles can explain the formation of translocations with duplication at the breakpoints, such as this t(X;22). An apparently balanced familial translocation t(2;22)(p13;q12.2) was detected in association with learning disability and craniofacial and hand dysmorphisms. The combination of a-CGH and FISH revealed that the rearrangement, identified by Gbanding as a two-break balanced translocation, was a more complex three-chromosome rearrangement: a segment from chromosome 2 was inserted into chromosome 5 short arm, an event that probably caused a 5p15.1 deletion; on chromosome 22 a segment from 5q23.2-23.3 was inserted into the breakpoint. Chromosomes der(2) and der(22) were present in all affected individuals. However, the der(5) did not segregate with the clinical phenotype, and was detected in a phenotypically normal individual. The 6.6 Mb duplication of the long arm of chromosome 5 was the imbalance common to all affected individuals. The 17 genes in this region are candidates for the clinical phenotypes through dosage effect. In addition, common to all affected individuals is the haploinsufficiency of SLC1A4, a gene highly expressed in the nervous system, which is encompassed by the deletion on chromosome 2. Interestingly, learning disabilities were more pronounced in those patients who also carried chromosome 2 deletion. CEP68, RAB1A, ACTR2 and SPRED2, mapped to this deleted segment, might contribute to the variability of the clinical phenotype in the family. The translocation t(2;5;22) might have originated from a series of simultaneously occurring brakes, two on the short arm of chromosome 2, four breaks on the short arm and two on the long arm of chromosome 5, and one break on the long arm of chromosome 22. We also investigated by a-CGH a sporadic translocation t(2;16)(q35;q24.1) whose carrier had hand and feet defects. Submicroscopic imbalances were not detected. Previously performed FISH delimited the breakpoints segments on chromosomes 2 and 16, which encompassed no genes. The IHH gene, which is involved in limb development, is located approximately 1 Mb upstream chromosome 2 breakpoint. Therefore, the translocation might have disrupted a regulatory element of IHH or, alternatively, separated the gene from a regulatory region, thus altering IHH expression. This study provides further evidence for the occurrence of submicroscopic chromosomal imbalances in association with apparently balanced rearrangements. In three out of six translocations - t(10,21), t(2;5;22), t(X;22) - cryptic duplications/deletions in cis to the breakpoints were detected, which might account for the clinical manifestations of the patients. This study also highlights the importance of FISH in the analysis of genomic imbalances detected by array in determining how losses and gains of submicroscopic segments relate to the rearranged chromosomes. The characterization of the balanced translocations in this study also contributed to suggest mechanisms for their formation

Rearranjos subteloméricos submicroscópicos são uma causa importante de malformações congênitas múltiplas e retardo mental. Recentemente, os mecanismos de origem de rearranjos subteloméricos começaram a ser investigados. O seqüenciamento dos pontos de quebra de rearranjos cromossômicos em 1p36 revelou predomínio por mecanismos de reparo não exclusivos. Rearranjos constitucionais em 1p36 são as alterações subteloméricas mais comuns e incluem deleções terminais simples, cromossomos derivados, deleções intersticiais e rearranjos complexos. Estes rearranjos resultam em um padrão específico de malformações e distúrbios do desenvolvimento neuropsicomotor que caracterizam a síndrome de monossomia 1p36. Os genes causativos ainda não foram identificados e a expressão fenotípica pode ser em função da haploinsuficiência de genes contíguos ou pelo mecanismo de efeito de posição. Obesidade e hiperfagia são características descritas em ~15% dos casos. Investigamos por MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) a presença de rearranjos no segmento cromossômico 1p36 em um grupo de 154 pacientes com obesidade e hiperfagia e testes genéticos negativos para a síndrome de Prader-Willi (PWS), e outro grupo de 83 pacientes encaminhados para estudos cromossômicos por diversos motivos. A estratégia de MLPA utilizada permitiu identificar em nove pacientes diferentes tipos de rearranjos na região subtelomérica 1p36. Para investigar os mecanismos de quebra, reparo e estabilização cromossômica envolvidos em rearranjos subteloméricos, linhagens celulares de seis pacientes contendo rearranjos constitucionais em 1p36 foram desenvolvidas. A clonagem e seqüenciamento das junções dos pontos de quebra de um rearranjo complexo e três translocações não recíprocas identificaram similaridades nas junções que sugerem o reparo por NHEJ (Nonhomologous end-joining) como o mais provável mecanismo de origem destes rearranjos. Duas deleções terminais aparentemente simples também foram investigadas e o refinamento dos pontos de quebra identificou dois intervalos genômicos distintos contendo duplicações segmentares específicas de 1p36 com 90-98% de homologia. Estas duplicações segmentares podem ter estimulado ou sido usadas como substratos no mecanismo de reparo do DNA. Nossos achados reforçam a associação da monossomia 1p36 com obesidade e hiperfagia e sugerem que estas características estejam freqüentemente associadas com fenótipos atípicos/leves e deleções submicroscópicas com 2-3 Mb de extensão. Sugerimos o uso de MLPA como um método alternativo rápido de diagnóstico para detectar e caracterizar rearranjos em 1p36. / Subtelomeric abnormalities are an important cause of mental retardation and birth defects. The mechanisms involved in the formation of subtelomeric rearrangements are now beginning to be elucidated. Breakpoint sequencing analysis of 1p36 rearrangements has revealed prevalence of different nonexclusive recombination-repair mechanisms. Rearrangements of 1p36 are the most frequently detected subtelomeric abnormalities and include different-sized simple terminal deletions, derivative chromosomes, interstitial deletions and complex rearrangements. These rearrangements have been reported to result in the specific pattern of malformation and neurodevelopmental disabilities that characterizes monosomy 1p36 syndrome. Thus far, no genes have been conclusively determined to be causative. Besides, it is still not known if a mechanism of haploinsufficiency or position effect that influences phenotype expression in this commonest terminal deletion syndrome. Obesity and hyperphagia have been reported to occur in ~15% of cases. We have used multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) to screen for monosomy 1p36 in a group of 154 hyperphagic and obese, PWS negative patients and in a separate group of 83 patients sent to investigate a variety of other conditions. The MLPA strategy used allowed the identification of a diversity of rearrangements in nine subjects. In order to gain further insights into the mechanisms of chromosome breakage, repair, and stabilization mediating subtelomeric rearrangements in humans, we have used cell lines containing constitutional rearrangements of 1p36 of six patients. Cloning of the breakpoint junctions in a complex rearrangement and three non-reciprocal translocations revealed similarities at the junctions that suggest NHEJ as the most likely mechanism of DNA repair that generated these rearrangements. Additionally, two apparently pure terminal deletions were also investigated and the refinement of the breakpoint regions identified two distinct genomic intervals ~25-kb apart, each containing a series of 1p36 specific segmental duplications with 90-98% identity. These segmental duplications might have been stimulated or used as substrate for a recombination-repair mechanism. Our work reinforces the association between monosomy 1p36 and obesity and hyperphagia, and further suggests that these features might be usually associated with an atypical/mild phenotype in addition to a submicroscopic deletion of ~2 to 3 Mb in size. We suggest the use of MLPA as an alternative method for high-throughput detection and delineation of rearrangements at 1p36.

Le nombre de génomes bactériens et archées complètement séquencés augmentant sans cesse plus, une telle augmentation rend possible le développement de nouveaux types d’approches large échelle, afin de comprendre l’évolution de la structure des génomes au cours du temps. La prédiction du contenu en gènes et la comparaison des génomes ont évolué de telle sorte qu’il est dorénavant possible d’extraire un certain nombre de nouvelles information permettant de comprendre l’évolution des procaryotes. Des séquences importantes dans la compréhension des opérations de réarrangements au sein des génomes de au cours du temps sont les éléments transposables, qui sont des fragments d’ADN ayant la possibilité de se mouvoir d’un lieu à l’autre, et peuvent se dupliquer au cours de ces transpositions. Les éléments transposables chez les procaryotes sont les séquences d’insertion, qui suivent un processus de couper-coller à l’intérieur des séquences ADN. Cependant, les outils ayant pour but de découvrir de telles séquences d’insertions d’une manière efficace et de développer une manière algorithmique originale pour découvrir les séquences d’insertions dans des génomes bactériens, et de constituer une base de données pour découvrir les séquences d’insertion dans des génomes bactériens, et de constituer une base de données les insérant. A l’aide de ces données, nous devons déduire un modèle d’évolution de ces éléments transposables, qui doit être relié à l’évolution de la séquence hôte (le génome procaryote). En particulier, nous devons déterminer si les séquences d’insertion et les génomes hôtes ont évolué de la même manière, et si ces séquences sont responsables, au moins jusqu’à une certaine mesure, de recombinaisons génomiques telles que les inversions. / The number of completely sequenced bacterial and archaeal genomes are rising steadily, such an increasingmakes it possible to develop novel kind of large scale approaches to understand genomes structureand evolution over time. Gene content prediction and genome comparison have both provided newmajor information and deciphering keys to understand evolution of prokaryotes. Important sequencesin understanding rearrangement operations inside genome sequences during evolution are the so-calledtransposable elements (TEs), which are DNA fragments or segments that have the ability to insert themselvesinto new chromosomal locations, and often make duplicate copies of themselves during transposition process.The transposable elements involved in such a move are the insertion sequences (ISs) in prokaryotes, theyfollow a cut-and-paste process inside the host DNA sequence. But the tools that deal with discovering ISs inan efficient way and that relate them to genome rearrangements are still too few and not totally accurate.The aim of this thesis is to develop an accurate algorithmic way to discover insertion sequences (ISs) inbacterial genomes and to constitute a database with these discoveries. Using these data, we must deduce amodel of evolution of these transposable elements, which must be related to the evolution of the host sequence(the prokaryotic genome). In particular, wemust ask whether insertion sequences and host genomes haveevolved in a similar way, and if ISs are responsible, at least to some extent, for genomic recombinationlike inversions.

Nous avons développé deux méthodes originales de synthèse de cyclopenténones fonctionnalisées et découvert de nouveaux réarrangements d’alcools 1-styryl propargyliques catalysés par des acides.Ce travail de thèse a aussi permis de mettre en évidence les limitations d’une méthode de synthèse des flavaglines développée par des chercheurs de la compagnie Bayer. De plus, la resynthèse de certaines flavaglines et la synthèse d’une sonde de fluorescence originale ont permis de mieux caractériser le mode d’action et le potentiel thérapeutique des flavaglines pour leurs effets anticancéreux (notamment dans la résistance aux inhibiteurs de B-RAF), la régulation du canal TRPM6 et l’infection par le virus du Chikungunya. / We have developed two novel methods to prepare functionalized cyclopentenones and also discovered new acid-catalyzed rearrangements of 1-styryl propargylic alcohols. This work also explored the limitations of a method for the synthesis of flavaglines reported by Bayer researchers. Moreover, the re-synthesis of some flavaglines and the synthesis of an original fluorescence probe allowed some advances in the characterization of the mechanism of action and therapeutic potential of flavaglines for their anti-cancer effects (especially in the resistance to B6RAF inhibitors), the regulation of TRPM6 channel and the infection by Chikungunya virus.

La déficience intellectuelle (DI) est définie par un QI < 70. La DI, répartie en formes non syndromiques et en formes syndromiques, est observée dans 3 % de la population. Des anomalies chromosomiques sont identifiées dans 15 % des DI syndromiques. Les translocations chromosomiques réciproques (TR) apparemment équilibrées sont observées chez 1 individu sur 1000 et seul 6 % des patients avec une TR de novo apparemment équilibrée ont une DI. Plusieurs mécanismes chromosomiques peuvent expliquer la DI syndromique associée à une TR : (i) un microremaniement déséquilibré identifié par l'utilisation de techniques plus résolutives, (ii) la formation d'un gène de fusion, (iii) un effetde position, (iv) la modification d’une région soumise à une empreinte parentale, (v) une interruption d'un gène au niveau d'un ou des deux points de cassure, (vi) une mutation génique sans rapport avec la TR, (vii) ou encore une cause acquise ou multifactorielle. Nous rapportons l'étude de 12 patients avec DI et porteurs d'une TR de novo apparemment équilibrée. L'analyse systématique par puces à ADN de ces individus a été réalisée avec une résolution de 25 kb. Un déséquilibre infracytogénétique au niveau des points de cassure ou ailleurs dans le génome a été observé chez 3/12 patients. Chez les 9 patients sans anomalies sur puces à ADN, nous avons étudié les points de cassure des remaniements de novo apparemment équilibrés. En dehors de la technique de marche sur le chromosome par FISH, deux autres approches ont été mises en oeuvre : (i) l'Array-Painting qui correspond à l'hybridation sur puces à ADN de chacun des dérivés chromosomiques préalablement séparés par Cytométrie en Flux, (ii) et le séquençage haut débit (WGS - Whole Genome Sequencing). Grâce à l'Array-Painting, nous avons identifié (i) chez 2 patients, des interruptions de gènes pouvant expliquer leur phénotype, à savoir les gènes : KIF1A, AUTS2 et EPHA6 ; (ii) et chez 1 patiente, un point de cassure entraînant une dérégulation de la transcription du gène MEF2C. L'étude par WGS a permis (i) chez 1 patiente, de diagnostiquer un déséquilibre plus complexe que celui observé par puce à ADN ; (ii) chez 2 patients, de mettre en évidence unchromothripsis, qui pourrait avoir un impact dans les pathologies constitutionnelles par interruption de gènes et/ou par effet de position ; (iii) et chez 2 autres patients, de caractériser précisément les points de cassure. Ainsi, grâce aux résultats obtenus par ces différentes techniques, plusieurs mécanismes physiopathologiques responsables de DI sont mis en évidence permettant un conseil génétique adéquat. Cependant, aucun mécanisme chromosomique commun ne peut être identifié hormis le chromothripsis observé chez patients. Finalement, ce travail nous permet principalement de comparer les techniques mises en oeuvre qui se sont avérées complémentaires. En conclusion, nous proposons une démarche diagnostique pour explorer un remaniement chromosomique apparemment équilibré chez des patients à phénotype anormal / Intellectual disability (ID) is defined by an IQ <70. ID, observed in 3% of the population, and displays heterogeneous origins, including acquired etiology (toxicologic, pathologic, traumatic) or genetic disorders with non-syndromic and syndromic forms. Numerical or structural chromosomal abnormalities are observed in 15% of patients with ID. Reciprocal balanced chromosomal translocations (RT) are observed in one individual in 1000. However, only 6% of patients carrying a de novo apparently balanced RT present ID. The relation between these balanced rearrangements and ID could be explained by different mechanisms namely (i) subtle rearrangement, (ii) gene fusion, (iii) position effect, (iv) disturbance of parental imprinting, (v) gene disruption at the breakpoints, (vi) mutation in gene unrelated to the translocation, (vii) or acquired or multifactorial cause. We report a chromosomal study of 12 patients with DI and carrying a de novo apparently balanced reciprocal translocation. A systematic analysis by microarrays was performed in all individuals (using a resolution of 25 kb). For three patients, a microdeletion was observed at the breakpoints or elsewhere in the genome. For the 9 remaining cases, we hypothesize that the phenotype is due to a disruption of gene(s) located at the breakpoint(s). In this context, we studied the breakpoints of the apparently balanced de novo rearrangements in these patients. Outside FISH walking, two approaches have been implemented namely Array-Painting, which combines flow chromosome sorting in an attempt to isolate derivative chromosomes from each other and DNA microarrays as well as Whole Genome Sequencing (WGS). Using Array-Painting, we identified (i) in 2 patients, a gene disruptions: in the KIF1A, AUTS2 and EphA6 genes; (ii) and in 1 patient, a breakpoint resulting in deregulation of transcription of the gene MEF2C. The WGS technology has permitted (i) in 1 patient, to diagnose more complex imbalance than that observed by micro-array; (ii) in 2 patients, to show a chromothripsis, (iii) and 2 other patients, to characterize precisely breakpoints. In conclusion, taking together, these results highlight different physiopathological mechanisms responsible for DI allowing adequate genetic counseling. However, no common chromosomal mechanism can be identified except for chromothripsis observed in 2 patients. In addition, this work allows us especially to compare the used techniques which seem to be complementary. Finally, we propose a pipeline to elucidate the etiology of the abnormal phenotype in patients carrying an apparently balanced rearrangement