Magíster en fisiología / La Hipertensión Pulmonar (HP) es una patología vascular compleja que conduce a falla cardíaca, menor expectativa de vida y tiene un impacto significativo en la sociedad, ya que produce la muerte de pacientes en edad productiva e implica altos costos de financiamiento en su tratamiento. Existe evidencia sobre la contribución de venas intrapulmonares a la Resistencia Vascular Pulmonar (RVP). La Hipertensión Venosa Pulmonar (HVP) puede producir un incremento en la RVP y aumentar la Presión Arterial Pulmonar (PAP), debido a transmisión pasiva de la presión venosa al territorio arterial. La familia de receptores purinérgicos se encuentra ampliamente expresada en diversos vasos sanguíneos y se ha descrito respuesta contráctil de arterias intrapulmonares a nucleótidos, en particular a Uridín Trifosfato (UTP). La investigación del rol de la señalización purinérgica en la circulación pulmonar venosa podría aportar información relevante para abordar otra vía involucrada en la fisiopatología de la HAP. Se realizaron rebanadas de pulmón de ratas Sprague Dawley controles y con HAP inducida por Monocrotalina (HAP-MCT), en un vibrátomo a 150 μm de espesor. La respuesta contráctil de Venas Intrapulmonares Pequeñas (VIP) inducida por UTP se registró mediante videomicroscopía de contraste de fases (VMCF), demostrando actividad del nucleótido como agente vasoconstrictor en VIP, con mayor respuesta en la VIP provenientes de ratas con HAP-MCT (EC50= 8,8±1,4 μM) que en las control (EC50= 16 μM) (p<0,05). Las imágenes de inmunofluorescencia muestran expresión de los receptores P2Y2 y P2Y4 en la capa media de VIP de ratas control y con HAP-MCT. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo involucrado en la HAP, orientando el estudio de nuevas terapias para combatir el curso de la enfermedad, mejorar la sobrevida y la calidad de vida de pacientes que padecen HAP. / Pulmonary Hypertension (HP) is a complex vascular condition that leads to heart failure, lower life expectancy and has a significant impact on society, because it involves the death of patients of working age and involves high costs of financing treatment. Pulmonary Venous Hypertension (HVP) may cause an increase in Pulmonary Vascular Resistance (RVP), Pulmonary Artery Pressure (PAP) is increased by the HVP, due to passive transmission of venous pressure to arterial territory. There is also evidence on the contribution of intrapulmonary veins to the RVP. Purinergic receptor family is widely expressed in various blood vessels and described intrapulmonary artery contractile responses to nucleotides, especially Uridine Triphosphate (UTP). The investigation of the role of purinergic signaling in the pulmonary venous circulation could provide relevant information to address another pathway involved in the pathophysiology of Pulmonary Arterial Hypertension (HAP). Lung slices from Sprague Dawley rats controls and rats with Pulmonary Hypertension monocrotaline induced (HAP-MCT), were made from vibratome to 150 μm thick . The contractile response of small intrapulmonary veins (VIP) was recorded by videomicroscopy phase contrast (VMCF), showing nucleotide activity as a vasoconstrictor agent in VIP, with greater response in the VIP from rats HAP-MCT (EC50 = 8.8 ± 1,4 μM) than in control (EC50 = 16 ± 1,1 μM (p<0,05). Immunofluorescence images show expression of P2Y2 and P2Y4 receptors in the middle layer of VIP of control and HAP-MCT rats. These findings suggest a new mechanism involved in PAH, directing the study of new therapies to combat disease course, improve survival and life quality of these patients.

Los receptores de neurotransmisores son elementos clave en la comunicación neuronal. Conforman proteínas integrales de membrana especializadas que median respuestas de tipo excitatoria y/o inhibitoria. Estos receptores, junto a enzimas y proteínas que modulan el metabolismo del neurotransmisor, constituyen verdaderos sistemas organizados para una transmisión de la información correcta y eficaz. Los recep-tores de neurotransmisores pertenecientes a la familia Cys-loop, son canales iónicos activados por ligando. A esta familia pertenecen los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRn), los receptores ionotrópicos de GABA, los receptores de sero-tonina tipo 3 (5HT3), los receptores de glicina (Gly-R) y los receptores de zinc. Estos receptores también han sido identi-ficados en otros tejidos, por ejemplo epitelio respiratorio, pán-creas, endotelio y células inmunes. Existen trabajos que pos-tulan que estos sistemas no-neuronales ejercen una actividad moduladora de procesos celulares tales como diferenciación, migración y proliferación. Sin embargo la función de estos sistemas aún no está completamente esclarecida. El objetivo de esta tesis es identificar y caracterizar dos sistemas de neurotransmisores en linfocitos humanos: el sistema colinér-gico y el sistema GABAérgico. En primer lugar determinamos la participación del AChRn α7 durante la activación de linfocitos T estimulados con un mitógeno (PHA). Establecimos que durante este proceso aumenta la producción del neurotrans-misor ACh, así como también los niveles de ARN mensajero (ARNm) y de proteína del receptor α7. Además, demostramos que la modulación de dicho receptor por agonistas y anta-gonistas específicos, inhibe y potencia la proliferación de estas células, respectivamente. En segundo lugar caracteri-zamos la presencia de un sistema GABAérgico completo en linfocitos humanos, similar al descripto en neuronas. Deter-minamos la presencia de enzimas y proteínas que llevan a cabo la síntesis, transporte y catabolismo del neurotransmisor GABA, así como también la presencia y actividad de transpor-tadores de membrana y de receptores ionótropicos de GABA. Al evaluar este sistema durante el proceso de activación, observamos que existe un aumento tanto de los componentes GABAérgicos como de la actividad de los transportadores y receptores, respecto a las células no estimuladas. También observamos que la activación de los receptores por el propio neurotransmisor o por agonistas específicos como muscimol, provoca una disminución de la proliferación inducida por el mitógeno. Por último, evaluamos la propiedad de plasticidad de estos receptores no neuronales, utilizando como estímulo la exposición a GABA. Se observaron cambios en la expresión del ARNm y en las proteínas de las subunidades de los recep-tores. Se determinó que durante la exposición al neurotrans-misor se activa la vía de Akt. Esta proteína fosforila las subunidades de los receptores de GABA ocasionando una mayor expresión de los mismos en membrana. Estos cambios se corroboraron al detectar un mayor porcentaje de células que responden electrofisiológicamente a la aplicación de GABA. El trabajo desarrollado en esta tesis aporta nuevos datos acerca de las propiedades y funciones de los sistemas neuro-nales presentes en linfocitos. Nuestros resultados podrían ser de gran utilidad para el diseño de nuevos tratamientos farma-cológicos que actúen sobre estos sistemas, presentando nuevas alternativas en la modulación de la respuesta inmune. / Neurotransmitter receptors are key elements in neuronal communication. They are transmembrane proteins specialized in mediating both excitatory and/or inhibitory responses. These receptors, as well as the enzymes and proteins that are responsible for neurotransmitter metabolism, form orga-nized systems for an efficient and appropriate neuronal transmission. Neurotransmitter receptors that belong to the Cys-loop family are ligand-gated ion channels. Nicotinic acetylcholine receptors (nAChR), ionotropic GABA receptors, serotonin type 3 receptors (5HT3), glycine receptors (Gly-R) and zinc receptors are members of this family. The presence of these receptors has been reported in non-neuronal tissues, such as respiratory epithelium, pancreas, endothelium and immune cells. Previous studies have proposed that these non-neuronal systems are involved in different cellular processes like migration, differentiation and proliferation. However, little is known about their functional role. The aim of this thesis is to identify and characterize two neurotransmitter systems in human lymphocytes: the cholinergic system and the GABAer-gic system. Firstly, we have determined the participation of the α7 nAChR in mitogen (PHA)-induced T cell activation. We have established that ACh synthesis as well as a7 messenger RNA (mRNA) and receptor levels increase during lymphocyte activation. We have also demonstrated that α7 nAChR modu-lation by specific agonist and antagonist drugs, inhibits and stimulates lymphocyte proliferation, respectively. Secondly, we have characterized the presence of a complete, neuronal-like GABAergic system in human lymphocytes. We have determined the presence of enzymes and proteins responsible for the synthesis, transport and degradation of the neuro-transmitter GABA, and the presence of membrane transporters and ionotropic GABA receptors. We have also observed an increase in these GABAergic elements and in their activity during lymphocyte activation. In addition, we have detected a decrease in mitogen-induced proliferation produced by the activation of ionotropic GABA receptors with GABA and the specific agonist, muscimol. Finally, we have studied the plas-ticity of these non-neuronal receptors during GABA exposure. We have detected changes in the mRNA and protein levels of GABA receptor subunits. We have also observed an increase in the activation of the Akt pathway during GABA incubation, which leads to GABA receptor subunit phosphorylation, resul-ting in a higher receptor expression in the cell membrane. These changes correlate with the detection of a higher number of cells showing electrophy-siological activity during GABA exposure. Findings from these Ph. D. thesis provide new data about the properties and functions of the neurotrans-mitter systems present in immune cells. Our results could be useful tools for the design of new pharmacological treatments targeting on these systems, to finally introduce alternatives for the modulation of the immune response.

Existe una gran cantidad de patologías que afectan al esqueleto, en las que se ve comprometido el balance entre la formación y la resorción ósea. Generalmente, las alternativas terapéuticas apuntan a la modulación de la resorción ósea actuando a nivel del osteoclasto. Sin embargo, estos abordajes terapéuticos no resultan suficientes, generando la necesidad de implementar nuevas estrategias farmacológicas con blanco de acción en la fisiología de la célula formadora de hueso, el osteoblasto. Para ello, un extensivo y detallado conocimiento tanto de la función como de los procesos de proliferación, migración y diferenciación, de la citada célula, son necesarios. El sistema de señalización purinérgico, donde los nucleótidos son liberados por las células, de manera controlada, y actúan como mensajeros extracelulares activando receptores purinérgicos en la membrana plasmática de la célula blanco es conocido desde hace unos 45 años. Desde entonces, se ha reportado un número creciente de células capaces de liberar nucleótidos, de manera controlada, al medio extracelular, lo que sumado al hecho de que, virtualmente, todas las células del cuerpo poseen algún tipo de receptor purinérgico (purinoceptor), hace de este sistema de señalización uno de los más importantes respecto de la regulación de la homeostasis del cuerpo. El papel de los nucleótidos y sus receptores en los procesos de proliferación y diferenciación de los osteoblastos ha sido estudiado desde hace unos 25 años. Sin embargo, aún no se ha alcanzado la dilucidación completa de los mecanismos regulatorios de estos procesos. El objetivo de esta tesis fue determinar los efectos de la activación de receptores purinérgicos, por nucleótidos extracelulares, en los procesos de migración, proliferación y diferenciación celular de cultivos primarios de calvaria de rata neonata. Se investigó también, el efecto de una concentración elevada de calcio extracelular en la proliferación y diferenciación celular y su influencia en la regulación de dichos procesos por la estimulación purinérgica. Además, se evaluó el rol de la enzima GSK3 (por inhibición con Litio), en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. Por último, se examinó el efecto de los agonistas mencionados sobre la expresión y localización de β-catenina. La migración celular fue evaluada mediante “ensayo de la herida”. El tratamiento con los nucleótidos mostró estimular la migración de las células calvariales. Para estudiar el proceso de proliferación se recurrió a citometría de flujo, recuento en cámara de Neubauer y tinción con Cristal Violeta. Los resultados obtenidos le atribuyen efectos positivos a los nucleótidos extracelulares. Por otro lado, el tratamiento con Litio provocó disminuciones en la capacidad proliferativa de las células. Mientras que no se observaron cambios en la proliferación por incubación de las células en un medio con elevada concentración de Calcio extracelular. El análisis de la diferenciación de las células a un fenotipo osteoblástico se llevó a cabo mediante mediciones de actividad enzimática de Fosfatasa Alcalina, cuantificación de ARNm de marcadores de maduración/diferenciación osteoblástica por QRT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa) y detección de mineralización por tinción con rojo de Alizarina. Al respecto, el tratamiento con ATPγS exhibió un rol pro-osteogénico, al elevar la actividad enzimática de FAL, la expresión génica de marcadores de diferenciación y la capacidad mineralizante. En cambio, el agonista UTP no indujo cambios en la actividad de la enzima y, en la mayoría de los casos, reprimió la transcripción de genes osteogénicos. Por su parte, la exposición a Litio incrementó la actividad de FAL pero reprimió la expresión de genes osteogénicos y disminuyó la mineralización de los cultivos. Una elevada concentración de Calcio extracelular mostró efectos positivos a nivel de diferenciación, al incrementar la actividad FAL y la mineralización de los osteoblastos. Finalmente, el tratamiento de los cultivos con nucleótidos extracelulares, en un medio conteniendo elevada concentración de Calcio, mostró leves efectos aditivos/sinergísticos en la estimulación de la diferenciación a células formadoras de hueso. La expresión de β-catenina resultó aumentada bajo tratamiento con nucleótidos extracelulares, Litio o Calcio. Asimismo, la translocación a núcleo se vio incrementada por dichos tratamientos. De acuerdo a los resultados obtenidos en esta tesis, puede atribuirse un rol regulatorio sobre la fisiología osteoblástica al sistema de señalización purinérgico y GSK3/ β-catenina. / There are a great number of pathologies that affect the skeleton, in which the balance between formation and bone resorption is compromised. Generally, the therapeutic alternatives point to the modulation of the bone resorption acting at the level of the osteoclast. However, these therapeutic approaches are not enough, generating the need to implement new pharmacological strategies targeting the physiology of the bone-forming cell, the osteoblast. To this end, an extensive and detailed knowledge of both the function and processes of proliferation, migration and differentiation of the aforementioned cell are necessary. Purinergic signaling system, wherein nucleotides are released by cells in a controlled manner, and act as extracellular messengers activating purinergic receptors in the plasma membrane of the target cell is known for about 45 years. Since then, it has been reported an increasing number of cells capable of releasing nucleotides, in a controlled manner, to the extracellular medium, which together with the fact that virtually all cells in the body have some type of purinergic receptor (purinoceptor), makes of this signaling system one of the most important regarding the regulation of body homeostasis. The role of nucleotides and their receptors in the proliferation and differentiation processes of osteoblasts has been studied for about 25 years. However, the complete elucidation of the regulatory mechanisms of these processes has not yet been reached. The aim of this work was to determine the effects of the activation of purinergic receptors by extracellular nucleotides in the processes of cell migration, proliferation and differentiation in neonatal rat calvaria primary cultures. We also investigated the effect of a high concentration of extracellular calcium on cell proliferation and differentiation and its influence on the regulation of these processes by purinergic stimulation. In addition, the role of the GSK3 enzyme (by inhibition with lithium) was evaluated in the regulation of cell proliferation and differentiation. Finally, the effect of the mentioned agonists on the expression and localization of β-catenin was examined. Cell migration was assessed by "wound assay". Treatment with nucleotides showed to stimulate the migration of the calvaria cells. The proliferation process was studied by using flow cytometry, Neubauer chamber count and Crystal Violet staining. The results obtained attribute positive effects to the extracellular nucleotides. On the other hand, treatment with Lithium caused decreases in the proliferative capacity of the cells. While no changes in proliferation were observed by incubation of the cells in medium with high concentration of extracellular calcium. The analysis of cell differentiation to an osteoblastic phenotype was carried out by measurements of Alkaline Phosphatase (FAL) enzyme activity, quantification of mRNA of osteoblastic maturation / differentiation markers by QRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction) and detection of mineralization by Alizarin red staining. In this regard, treatment with ATPγS exhibited a pro-osteogenic role, by raising the enzymatic activity of FAL, the gene expression of differentiation markers and the mineralizing capacity. In contrast, the UTP agonist did not induce changes in enzyme activity and, in most cases, repressed the transcription of osteogenic genes. On the other hand, exposure to lithium increased FAL activity but repressed the expression of osteogenic genes and decreased the mineralization of the cultures. A high concentration of extracellular calcium showed positive effects at the level of differentiation, increasing the FAL activity and mineralization of osteoblasts. Finally, the treatment of cultures with extracellular nucleotides in medium containing high calcium concentration showed slight additive / synergistic effects in the stimulation of differentiation into bone-forming cells. Expression of β-catenin was increased under treatment with extracellular nucleotides, Lithium or Calcium. Also nucleus translocation was increased by these treatments. According to the results obtained in this work, a regulatory role on osteoblastic physiology can be attributed to the purinergic signaling system and GSK3 / β-catenin.

Caenorhabditis elegans es un nematodo de vida libre utilizado como organismo modelo en diferentes disciplinas de la ciencia. Su tamaño reducido, plan corporal anatómicamente simple, ciclo de vida corto y amplio repertorio de comportamientos, lo han transformado en un organismo muy útil en investigación. Además, emerge como un modelo de interés en la industria farmacéutica para realizar ensayos in vivo rápidos y económicos, y para la detección de compuestos con actividad biológica. C. elegans comparte características fisiológicas y farmacológicas con nematodos parásitos y además es sensible a la mayoría de las drogas antiparasitarias que se utilizan en el hombre y en los animales. Dado que es difícil trabajar con nematodos parásitos en el laboratorio, C. elegans ha emergido como un excelente modelo de nematodo parásito y ha contribuido al conocimiento de los mecanismos de acción de diversos fármacos. C. elegans cuenta con la mayor familia de receptores Cys-loop. En sus músculos, posee tres receptores Cys-loop principales: dos receptores nicotínicos (nAChRs), el L-AChR y el N-AChR, y el receptor de GABA, UNC-49. Los nAChRs median la contracción de los músculos de la pared del cuerpo mientras que los receptores de GABA median la relajación muscular, permitiendo el movimiento sinusoidal típico del nematodo. Estos receptores son los blancos moleculares de drogas antihelmínticas. El levamisol, actuando como agonista del L-AChR, genera contracción sostenida de los músculos y finalmente la parálisis espástica del nematodo. La piperazina, actuando como agonista de los receptores de GABA, genera relajación muscular y parálisis flácida. Otros receptores Cys-loop presentes en el nematodo también son blancos de fármacos antihelmínticos. El receptor de glutamato permeable a cloruro (GluCl) presente en neuronas y células musculares es el blanco molecular de la ivermectina (IVM), uno de los antiparasitarios más utilizados a nivel mundial. En cuanto a los receptores Cys-loop, C. elegans no es más diferente a los nematodos parásitos de lo que cada especie individual de parásito lo es de otra. Esto se evidencia en la amplia diversidad de subunidades que generan receptores Cys-loop con diferente composición y propiedades farmacológicas en los nematodos y cuyas bases moleculares no se comprenden completamente. En esta Tesis se utilizó a C. elegans como modelo de nematodo parásito. Se estudiaron las propiedades antihelmínticas y los blancos de acción de diferentes compuestos químicos a través de ensayos de comportamiento. Para determinar sus mecanismos de acción se realizaron registros electrofisiológicos de corrientes unitarias y macroscópicas sobre receptores presentes en células musculares de C. elegans o expresados heterologamente en células de mamífero. En el Capítulo 1 se estudió el befenio, un antihelmíntico colinérgico cuyo modo de acción no se conocía completamente. Mediante ensayos de comportamiento se determinó que befenio genera parálisis espástica en nematodos salvajes adultos jóvenes. Utilizando cepas mutantes se determinó que el L-AChR es el blanco molecular involucrado en la actividad paralizante de befenio. Estos resultados sugieren que no existiría un receptor específico para befenio en los músculos de C. elegans. Cuando befenio fue combinado con levamisol el efecto paralizante fue aditivo. Esto es de importancia ya que la combinación de drogas es una buena estrategia para reducir la resistencia en nematodos parásitos. A nivel molecular, mediante registros de canal único, se determinó que befenio activa el L-AChR de C. elegans tanto en larvas L1 como L2, y a mayores concentraciones, actúa como un bloqueador de canal abierto de dicho receptor. Los estudios de docking molecular mostraron que befenio se une al sitio de unión ortostérico del agonista y forma las interacciones cation-π requeridas para la activación del receptor. Estos resultados podrían explicar la alta eficacia para activar el L-AChR. La selectividad de befenio por el nAChR muscular de mamífero fue estudiada mediante registros de canal único y de corrientes macroscópicas. Se determinó que befenio activa el nAChR pero actúa como un agonista muy débil y un bloqueador de canal potente. Según estudios de docking molecular, befenio generaría las interacciones necesarias para la activación solamente en uno de los dos sitios ortostéricos del receptor. Esto explicaría su baja eficacia en receptores de mamífero con respecto a los receptores de nematodos. Cepas mutantes de C. elegans que carecen de la subunidad LEV-8 podrían contener LAChRs formados por la subunidad ACR-8 en su reemplazo. Estos L-AChRs imitan un receptor de nematodo parásito, como el receptor de H. contortus, cuya subunidad ACR-8 podría mediar la actividad de befenio. Mediante ensayos de comportamiento con la cepa mutante se determinó que la subunidad ACR-8 no es requerida para el efecto paralizante de befenio en C. elegans. A nivel de canal único, los receptores que carecen de la subunidad LEV-8 también fueron activados por befenio y dicha droga, al igual que ACh, indujo una rápida desensibilización del receptor. En el Capítulo 2 se estudiaron tres terpenoides, carvacrol, timol y eugenol, presentes en plantas. Mediante ensayos de comportamiento utilizando nematodos salvajes, se determinó que los terpenoides paralizan rápidamente a C. elegans. El orden de potencia de parálisis fue: carvacrol>timol>eugenol. Las larvas fueron más sensibles que los nematodos adultos jóvenes. Además, los compuestos inhibieron irreversiblemente la eclosión de los huevos con el mismo orden de potencia. Estos hallazgos indican que los terpenoides producen efectos antihelmínticos a corto y largo plazo. Se evaluaron tres combinaciones de drogas: timol/levamisol, timol/piperazina y timol/ivermectina. El efecto paralizante de la combinación timol/levamisol fue sinérgico y dicha combinación también fue efectiva en la inhibición de la eclosión de huevos. Mediante ensayos de comportamiento con nematodos mutantes se determinó que los L-AChRs y los receptores de GABA son los blancos moleculares de los terpenoides. Los registros de corrientes macroscópicas revelaron que los compuestos no son capaces de activar los receptores, pero inhiben las corrientes evocadas por los agonistas. En registros de canal único, los terpenoides disminuyeron la actividad de L-AChRs generada por ACh y levamisol, redujeron la frecuencia de aperturas del L-AChR e indujeron un componente de estado cerrado más prolongado. Sin embargo, no afectaron las propiedades del canal como la conductancia y la duración de apertura. El análisis global indicó que los terpenoides ejercen su efecto antihelmíntico actuando como antagonistas no competitivos del L-AChR. En el Capítulo 3 se estudió la doxepinona, considerada una estructura química privilegiada. Mediante ensayos de comportamiento se demostró que la doxepinona ejerce su acción paralizante sobre nematodos salvajes adultos jóvenes actuando a través el GluCl, el blanco molecular de la IVM. Este compuesto sintético generó parálisis estacionaria en nematodos salvajes. La IVM actúa sobre GluCls presentes en la faringe del nematodo e inhibe el bombeo faríngeo. Doxepinona también redujo la velocidad de bombeo faríngeo en nematodos salvajes y el efecto fue mediado por los GluCls. Mediante registros de corrientes macroscópicas se caracterizaron las corrientes del receptor heteromérico GluCl α 1/GluClß de C. elegans evocadas por el agonista glutamato. Se determinó que la doxepinona no es un agonista de dicho receptor ya que no es capaz de activarlo. Mediante diferentes protocolos de aplicación de drogas, se determinó que la doxepinona actúa como un inhibidor alostérico de los GluCls. Se propuso a la inhibición del GluCl como un nuevo mecanismo antihelmíntico. En resumen, en esta Tesis Doctoral, utilizando a C. elegans como modelo de nematodo parásito, se identificaron los sitios y se descifraron los mecanismos de acción molecular de diferentes compuestos químicos, con actividad antihelmíntica. / Caenorhabditis elegans is a free-living nematode used as a model organism in different science disciplines. Its reduced size, anatomically simple body plan, short life cycle and broad repertoire of behaviours have turned it in a useful organism for research. It also emerges as an interesting model in the pharmaceutical industry for fast and cheap in vivo assays and for the detection of compounds with biological activity. C. elegans shares pharmacological and physiological characteristics with parasitic nematodes and is sensitive to most antiparasitic drugs used in humans and animals. Given that parasitic nematodes are difficult to work with in the laboratory, C. elegans has emerged as an excellent parasitic model and has contributed to the understanding of mechanisms of action of anthelmintic drugs. C. elegans has the largest Cys-loop receptor family. In its muscle, it has three main Cysloop receptors: two nicotinic receptors (nAChRs), L-AChR and N-AChR, and the UNC-49 GABA receptor. nAChRs mediate body wall muscle contraction while GABA receptors mediate muscle relaxation, thus allowing the typical sinusoidal movement of the nematode. These receptors are the molecular targets of anthelmintic drugs. Levamisole, acting as an L-AChR agonist, generates sustained muscle contraction which ends in spastic paralysis of the nematode. Piperazine, by acting as an agonist of GABA receptors, generates muscle relaxation and flaccid paralysis. Other Cys-loop receptors in the nematode are also targets of anthelmintic drugs. The glutamate-activated chloride channel (GluCl) present in neurons and muscle cells is the molecular target of ivermectin (IVM), which is one of the most used antiparasitic drug worldwide. Considering Cys-loop receptors, C. elegans is no more dissimilar to parasitic nematodes than each individual species of parasite is to another. This results from the wide subunit diversity that generates Cys-loop receptors with different compositions and pharmacological properties among nematodes; the molecular basis of this diversity remains not fully understood. In this Thesis, C. elegans was used as parasitic nematode model. The anthelmintic properties and molecular targets of different chemical compounds were studied through behavioural assays. To determine their mechanisms of action, electrophysiological recordings, single-channel and macroscopic current recordings, were carried out in C. elegans muscle cells or in mammalian cells heterologously expressing the receptor under study. In Chapter 1 bephenium was studied. It is a cholinergic anthelmintic drug whose mechanism of action was not fully understood. Through behavioural assays it was determined that bephenium generates spastic paralysis in young adult wild-type worms. By using different mutant strains, it was determined that L-AChR is the molecular target involved in the paralyzing activity of bephenium. The results suggested that there may not be a specific receptor for bephenium in C. elegans muscle. When bephenium was combined with levamisole, the paralyzing effects were additive; which is of significance since drug combination is a good strategy to reduce resistance in parasitic nematodes. At the molecular level, through single channel recordings, it was determined that bephenium activates L-AChR in larvae L1 and L2 C. elegans. At higher concentrations, it acted as an L-AChR open channel blocker. Molecular docking studies showed that bephenium binds to the orthostetic agonist binding site and forms the cation-π interactions required for receptor activation. This result may explain the high efficacy for L-AChR activation. Bephenium selectivity for the mammalian muscle nAChR was studied through singlechannel and macroscopic current recordings. Bephenium activated nAChRs, but it acted as a very weak agonist and a potent channel blocker. According to the molecular docking studies, bephenium would generate the necessary interactions for activation only in one of the two orthosteric sites of the receptor. This may explain the low efficacy in the mammalian receptor with respect to nematode receptors. C. elegans mutant strains that lack LEV-8 subunit may have L-AChRs containing the spare ACR-8 subunit in its replacement. These L-AChRs may mimic those in certain nematode parasites, like the H. contortus receptor, for which it was suggested that its ACR-8 subunit may mediate bephenium activity. Through behavioural assays in the mutant strain, it was determined that the ACR-8 subunit is not required for the paralyzing effects of bephenium on C. elegans. At the single channel level, the receptors that lack LEV-8 subunit were similarly activated by bephenium. Bephenium, like ACh, induced fast receptor desensitization. In the Chapter 2 terpenoids present in plants (carvacrol, thymol and eugenol) were studied. Through behavioural assays in wild-type nematodes, it was determined that terpenoids produced fast paralysis of the worms. The paralyzing potency order was: carvacrol > thymol > eugenol. The larvae were more sensitive than young adults. Also, the compounds irreversibly inhibited egg hatching with the same potency order. These findings indicate that terpenoids generate short- and long-term anthelmintic effects. Three drug combinations were evaluated: thymol/levamisole, thymol/piperazine and thymol/ivermectin. The paralyzing effect of thymol/levamisole combination was synergic, and this combination was effective in the inhibition of egg hatching too. Through behavioural assays in mutant nematodes, it was determined that L-AChRs and GABA receptors are the molecular targets of the terpenoids. The macroscopic current recordings revealed that the compounds could not activate the receptors but inhibited the currents evoked by the agonists. In single channel recordings, terpenoids reduced L-AChR activity generated by ACh and levamisole, reduced the frequency of L-AChR openings and induced a longer closed state component. However, terpenoids did not affect channel properties, such as conductance and open duration. The global analysis indicated that, terpenoids exert their anthelmintic effect, acting as L-AChR non-competitive antagonists. In the Chapter 3, doxepinone was studied. Doxepinone is considered a privileged chemical structure. Through behavioural assays, it was demonstrated that doxepinone exert the paralyzing action in wild-type young adult worms acting through GluCls, which are the molecular targets of IVM. The synthetic compound generated stationary paralysis on wild-type worms. IVM acts on nematode pharyngeal GluCls and inhibits pharyngeal pumping. Doxepinone also reduced the pharyngeal pumping rate in wild-type worms and the effect was mediated by GluCls. Through macroscopic current recordings, the responses of GluCl α1/GluClß receptors of C. elegans evoked by the agonist glutamate were characterized. It was determined that doxepinone is not a GluCl agonist because it is not capable of activating the receptor. Through different drug application protocols, it was determined that doxepinone acts as an allosteric inhibitor of GluCls. The inhibition of GluCls was proposed as a new anthelmintic mechanism. In summary, in this Doctoral Thesis, using C. elegans as a model of parasitic nematode, the target sites and mechanisms of action of different chemical compounds with anthelmintic activity were deciphered.

O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da endotoxina durante a sensibilização com extrato de Blomia tropicalis (Bt) Para induzir a alergia pulmonar experimental, camundongos foram sensibilizados s.c. com Bt adsorvido ao alum em presença ou não de LPS e desafiados i.n. com Bt. Os animais sensibilizados e desafiados com de Bt apresentaram intensa inflamação pulmonar eosinofílica, AHR, grande produção de muco, aumento na produção de citocinas do tipo 2 no lavado broncoalveolar (BAL) e aumento de IgE. Quando o LPS foi adicionado, observou-se inibição no influxo de eosinófilos e aumento no influxo de neutrófilos no BAL. O LPS também inibiu IL-4 e IL5 e aumentou IFN<font face=\"Symbol\">g e IL-17. Surpeendentemente, o LPS não afetou a AHR, nem a produção de IgE. Utilizando animais nocautes, verificou-se que a inibição eosinofílica induzida pelo LPS é dependente de IFN<font face=\"Symbol\">g e MyD88 enquanto que o aumento de neutrófilos é independente de IFN<font face=\"Symbol\">g e dependente da sinalização dos TLR2, TLR4 e CD14. Além disso, na ausência de TLR2, TLR4 ou CD14, o LPS suprimiu a alergia pulmonar experimental. Em conclusão, os resultados indicam que camundongos sensibilizados com Bt e LPS co-adsorvidos ao alum desenvolvem um fenótipo de asma não clássico, dependente da sinalização pelos TLR. / The aim of this work was to study the effects of endotoxin during sensitization with Blomia tropicalis extract (Bt). To induce experimental allergic airways, mice were sensitized s.c. with Bt with or without LPS co-adsorbed onto alum, and challenged i.n. with Bt. Wild type mice sensitized and challenged with HDM showed eosinophilic lung inflammation, Arway hyperactivity (AHR), mucus hyperproduction, increased levels of type 2 cytokines in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and augmented total IgE. When LPS was added at the sensitization, we observed an inhibition of eosinophil influx and an increase in neutrophil counts in the BAL. Moreover, LPS inhibited IL-4 and IL-5 production and increased IFN-<font face=\"Symbol\">g and IL-17 production. Surprisingly, LPS did not affect AHR or IgE production. Using knockout mice, we found that the eosinophilic inhibition induced by LPS was dependent on IFN<font face=\"Symbol\">g and MyD88, while the neutrophilic increase was independent of IFN<font face=\"Symbol\">g and dependent on TLR2, TLR4 and CD14 signaling. Moreover, in the absence of TLR2, TLR4 or CD14, LPS suppressed AAD. In conclusion, our results indicate that mice sensitized with Bt and LPS co-adsorbed to alum develop a non-classical asthma-like phenotype that is dependent on TLR signaling.

O sistema histaminérgico no sistema nervoso central (SNC) apresenta funções que modulam o aprendizado e consolidam a memória. O objetivo foi estudar o efeito da histamina através dos receptores histaminérgico (H1 e H2) na reconsolidação da memória discriminativa na região CA1 do hipocampo de ratos. Foram utilizados 153 ratos Wistar submetidos à cirurgia exterotáxica para implantação de cânulas guia na região CA1 do hipocampo. Os animais foram habituados por quatro dias consecutivos no campo aberto durante 20 minutos. Na sessão de treino os ratos foram expostos a dois diferentes objetos (A e B) por 5 min. Após 24h (reativação), um dos objetos foi trocado para um novo (objeto C), e os ratos foram reexpostos no campo aberto por 5 min. Imediatamente após, os animais receberam infusões bilaterais intra-CA1 dos agonistas/antagonistas histaminérgicos. O teste da reconsolidação da memória discriminativa foi realizado na tarefa de reconhecimento de objetos (RO). Os dados foram expressos pela média ± erro padrão da média para o teste de t-student para p<0,05 de significância. Foi realizado 3 dias, 7 dias ou 10 dias após a sessão de reativação. Resultados:Nossos dados mostraram que 3 dias após a infusão tanto os grupos salina (56.69 ± 4,651) quanto o grupo histamina (61.10 ± 4,712) exploraram mais o objeto novo (D) em relação ao objeto familiar. Em 7 dias após a reativação os animais tratados com histamina (55.96 ±7,022) exploraram mais o objeto (D) em relação ao objeto familiar, comparados aos salina (39.40 ± 4,845) p< 0,01. No teste do dia 10 não houve mais diferença estatística entre os grupos p>0.05. O SKF 91488 mostrou que o aumento da histamina endógena induz a melhora a memória discriminativa quando testados 7 dias (57.60 ± 5.210) comparado ao salina (48.09 ± 7.582) para p<0,001. O agonista H2 Dimaprit (56.14 ± 7.425) também melhorou a memória discriminativa comparado à salina (49.04 ± 9, 309) p < 0,05. O mesmo não ocorreu com o agonista H1 Piridiletiletanolamina (52.93 ± 8.946) e o grupo salina (49.04 ± 9,309). Nas coinfusões os antagonistas e histamina, os animais que receberam Pirilamina + histamina (56.41 ± 6.694) e histamina (60.04 ± 10.16) obtiveram uma taxa exploratória maior do objeto novo comparado a os animais que receberam Ranitidina + histamina (51.06 ±7.238) e o salina (47.04 ± 4.718) que tiveram a memória bloqueada com significância de p<0.05. As doses utilizadas nas infusões intra- CA1 bilaterais foram de (1μl) de salina, Histamina 10mM/μl, SKF 91488 50mM/μl, os agonistas Piridiletiletanolamina (PEA) e Dimaprit nas doses de 10mM/μl e os antagonistas Pirilamina e Ranitidina nas doses de 50mM/μl. De acordo com os dados obtidos neste estudo pode-se concluir que a histamina infundida na região CA1 do hipocampo dorsal de ratos imediatamente após a reativação melhora a memória discriminativa na tarefa de RO via receptor do tipo H2. / The histaminergic system in the central nervous system is involved in the regulation of learning and memory. Therefore, the aim of this study was to investigate the effects of histamine through histaminergic receptors activation (H1,H2) in discriminative memory reconsolidation in rat hippocampal region CA1. Wistar male rats (n= 154) were used to investigate whether histamine itself or receptor-selective histamine agonist and antagonist given into the CA1 region of this hippocampus immediately post-reactivation can affect the object recognition test (RO) performance. Our results showed an improve in RO test performance seven days after memory reactivation caused by histamine and SKF-98144 infusion. The same test ten days after memory reactivation not show difference between saline and histamine group. H1 agonist did not improve discriminative memory in RO. The enhancing effect of histamine was blocked by the H2 receptor antagonist, ranitidine, but not by the H1 receptor antagonist, pyrilamine. The present results suggest that histamine infusion in rat hippocampal region CA1 post-activation improves discriminative memory in RO trough H2 receptor.

O Peptídeo Liberador de Gastrina é um peptídeo neuroendócrino que tem importante atividade como fator de crescimento em diferentes tipos de cânceres. A expressão aumentada do GRP tem sido documentada em várias neoplasias, e estudos sobre uso terapêutico do bloqueio dos receptores do GRP (GRPR) têm apresentado resultados promissores. Nosso objetivo foi determinar a expressão do GRPR no carcinoma epidermóide de canal anal e discutir suas potenciais aplicações clínicas. Foi realizada análise imunoistoquímica em blocos de parafina com amostras tumorais de 35 pacientes com câncer anal. Como grupo controle não maligno, analisamos 24 amostras de tecidos anais (anatomopatológicos de hemorroidectomias). A expressão do GRPR foi avaliada utilizando uma abordagem semi-quantitativa de acordo com a intensidade e distribuição da coloração. Todos os tecidos analisados, com exceção de uma amostra controle, apresentaram imunoexpressão positiva do GRPR. O GRPR teve forte expressão em 54% das amostras tumorais e em somente 12% das amostras do grupo controle (P < 0.003). Nos tumores, o receptor demonstrou um padrão de distribuição difuso e homogêneo Em contraste, as amostras do grupo controle apresentaram um padrão de coloração focal restrito à metade mais profunda da camada basal do epitélio. Em conclusão, demonstramos que o GRPR é altamente expresso no carcinoma epidermóide do canal anal, o que sugere que este receptor possa desempenhar um papel na carcinogênese anal. Nossos resultados fornecem uma base para a exploração do receptor de gastrina como um alvo diagnóstico e terapêutico no carcinoma anal.

Resumo não disponível.

Introdução: Poucos estudos sobre a farmacogenética do Transtorno de Déficit de Atenção/Hiperatividade (TDAH) foram conduzidos até o momento, apesar da extensa literatura sobre a participação de genes na etiologia do TDAH. Os estudos farmacogenéticos podem auxiliar na identificação a priori dos indivíduos que se beneficiarão de determinados tratamentos e dos que possivelmente apresentarão intolerância aos agentes farmacológicos. A maior parte dos estudos, até o momento, avaliou genes do sistema dopaminérgico e resultou em achados tanto positivos quanto negativos. Métodos: em um estudo naturalístico avaliamos os efeitos dos polimorfismos dos genes candidatos dopaminérgicos (DRD4, DAT1) e serotoninérgicos (HTR1B, HTR2A e 5-HTT) na resposta ao tratamento em 111 pacientes para os quais foi prescrito metilfenidato. As medidas de desfecho (Swanson, Nolan, and Pelham scale - versão IV – anexo I, Children Global Assessment Scale – anexo II, Barkley’s Stimulants Side Effects Rating Scale – anexo III) foram aplicadas no momento de avaliação e um mês após a intervenção. Resultados: Participaram do estudo 111 famílias de crianças e adolescentes eurobrasileiros de ambos os sexos que apresentavam TDAH segundo o DSM-IV. Estes pacientes foram consecutivamente triados no Programa de Déficit de Atenção/Hiperatividade do Hospital de Clínicas de Porto Alegre entre janeiro de 2003 e maio de 2004. Não foi detectada associação significativa entre os polimorfismos dos genes dopaminérgicos e serotoninérgicos avaliados e a resposta ao metilfenidato ou presença de eventos adversos. Conclusão: Os achados deste estudo quanto aos genes dopaminérgicos são negativos, concordando com três outros estudos disponíveis na literatura. Este foi o primeiro estudo a avaliar o efeito dos genes serotoninérgicos isolados na resposta ao metilfenidato e na presença de eventos adversos. Não foi encontrada nenhuma associação significativa. Os resultados dos estudos existentes são de difícil comparação devido à grande variabilidade metodológica existente entre os estudos. Assim, ensaios controlados multicêntricos prospectivos com maiores tamanhos amostrais são necessários para desvendar o papel dos genes candidatos na resposta ao tratamento para o TDAH.

Introdução: Estudos epidemiológicos demonstram que cerca de 99,0% dos carcinomas cervicais estão associados à infecção persistente por alguns tipos de Papilomavírus Humano (HPV). O longo período de latência a partir da infecção primária e o aparecimento de lesões sugerem que fatores adicionais, como início precoce das relações sexuais, número de parceiros, tabagismo, uso de hormônios, presença de co-infecções, estejam envolvidos no processo de carcinogênese. A co-infecção por Chlamydia trachomatis (CT) tem sido sugerida, como um fator contribuinte na patologia cervical. A detecção precoce das lesões e o grau histológico são fundamentais, mas às vezes, difícil. O emprego de marcadores prognósticos, através da técnica de imuno-histoquímica possibilita esclarecer e complementar resultados controversos de citologia e de biópsias. Objetivos: Verificar a presença de infecção pelo Papilomavírus humano, tipos de alto risco, a presença de co-infecção por CT, associação com as características epidemiológicas, bem como, identificar a expressão imuno-histoquímica de p16INK4a, Ki67, receptores de estrogênio e progesterona em lesões pré-neoplásicas e neoplásicas de cérvice uterina. Métodos: Um estudo transversal envolvendo mulheres assintomáticas foi desenvolvido entre fevereiro de 2003 e janeiro de 2006 em uma Unidade de Atenção Primária à Saúde em Porto Alegre – RS, Brasil para verificar a prevalência de infecção pelo HPV, tipos -16, -18, -31 e de CT. Um total de 89 participantes respondeu a um questionário epidemiológico padronizado sobre as características demográficas, hábitos pregressos, história reprodutiva e de comportamento sexual. A pesquisa de DNA-HPV, tipos de alto risco, bem como a presença de DNA-CT foi identificada através da técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR). Após examecolposcópico, foi coletada biópsia para avaliação imuno-histoquímica empregando os marcadores p16INK4a, Ki67, receptores hormonais de estrogênio e progesterona. RESULTADOS: A presença de DNA-HPV foi identificada em 83,0% (74/89) das biópsias, sendo que 46,0% (34/74) eram portadoras de HPV de alto risco. O DNA-CT foi presente em 16/86 pacientes testadas (19,0%). Quanto ao exame anatomopatológico (AP), 7,0% eram lesões de alto grau, 59,0% de baixo grau e em 34,0% não foram observadas alterações. A expressão de p16INK4a foi observada em 85,3% (29/34) das mulheres positivas para DNA-HPV-AR e esta associação foi estatisticamente significativa (p=0,02), sendo que, todas as biópsias, positivas para HPV-16 (16/34), expressaram a proteína (p=0,01). Houve uma associação estatisticamente significativa entre a intensidade de expressão, o padrão de expressão de p16INK4a e o grau da lesão (p= 0,001). A associação entre a expressão de p16INK4a e DNA-HPV se mostrou estatisticamente significativa entre fumantes (p=0,03; OR: 11,25 IC95%:1,11-114,4), entre mulheres com história prévia de DST (p=0,01; OR: 6,82 IC95% 1,53-30,3), com sexarca entre17-19 anos (p=0,048; OR: 8,500 IC95% 0,971-74,424) e em mulheres com três ou mais parceiros sexuais ao longo da vida (p=0,02; OR: 8,12 IC95%: 1,31-50,2). Todas as mulheres positivas para DNA-CT foram positivas para DNA-HPV. Entre as portadoras de co-infecção, 56,0% expressaram a p16INK4a (OR=0,51, IC95%: 0,17-1,57. Para Ki67, todas as lesões de alto grau, 50,0% das lesões de baixo grau e 31,0% das biópsias negativas expressaram o mesmo (p=0,004). Para as pacientes portadoras de DNA-HPV, o Ki67 foi expresso em 100,0%, 31,0% e 32,0% das lesões de alto grau, baixo grau e fragmentos normais, respectivamente, apresentando uma associação estatisticamente significativa (p<0,003). Não foi observada associação entre a expressão do receptor de estrogênio e os desfechos estudados. Já, o receptor de progesterona foi expresso em 42,0% (37/89) dos casos estudados e, 26,5% (9/37) eram positivas para os tiposvirais de alto risco (p=0,023). A expressão do receptor de progesterona foi maior em nãofumantes (p=0,02), entre as mulheres que utilizavam anticoncepcional oral (p=0,03) e que tinham um menor grau de escolaridade (p=0,04). Discussão e conclusões: A presença da infecção persistente pelo HPV em lesões cervicais nos diferentes graus histológicos é fato já demonstrado. A atividade transformadora do vírus, especialmente com a expressão de oncoproteínas virais, facilita a de replicação e a diferenciação do epitélio após a sua integração no genoma hospedeiro. Desta forma, a identificação dos tipos virais de alto risco é essencial para se estabelecer e avaliar o prognóstico das lesões e a expressão imuno-histoquímica de p16INK4a e Ki67 podem confirmar resultados citológicos suspeitos. A co-infecção por CT, descrita em diversos estudos epidemiológicos, tem sido relatada como um fator de risco para a infecção por HPV, bem como o desenvolvimento de lesões mais agressivas. Entretanto, em nosso estudo, não foi encontrada associação entre os desfechos e a infecção por CT, exceto para pacientes com menor grau de escolaridade, provavelmente, em virtude do pequeno tamanho da amostra. Observa-se, através desta análise, a contribuição da técnica de imuno-histoquímica e de marcadores de oncogenicidade, como a p16INK4a e do Ki67 no diagnóstico das lesões ativas. A associação das variáveis epidemiológicas com estes marcadores se mostrou efetiva, já que existem evidências de que alguns destes podem facilitar e contribuir para o desenvolvimento destas lesões. / Introdution: Epidemiological studies have shown that about 99.0% of cervical carcinomas are related to persistent infection caused by some human papillomavirus (HPV) types. The large latency period since primary infection and the appearance of lesion suggests that adicional factors such as age at first intercourse, number of sexual partners, smoking, oral contraceptive use and other factors are involved in the carcinogenesis process. Among this, the co-infection by Chlamydia trachomatis (CT) have been sugested by some authors as a contributor factor in the cervical patology. The precoce detection of lesions and the histological grade are important, but sometimes difficult. The use of prognostic markers through immunohistochemical technic clarify and complement controversial results in citology. Objetives: Verifing the presence of Human papillomavirus infection, high – risk subtypes, the presence of CT co-infection, and the association with the epidemiological factors as well as identifying the immunoistochemical expression of p16INK4a, Ki67, and estrogen and progesterone receptors in pre-neoplastic and neoplastic lesions of uterine cervix. . Materials and methods: A cross-sectinal study with assintomatic women was conducted between february 2003 and december 2006 in a primary care unit in Porto Alegre- RS, Brazil to verify the prevalence of Papillomavirus infection, sub-types -16,18,31 and CT infecttion. The participants answered a questionaire about sociodemographic characteristics, former habits, reproductive history and sexual behaviour.The high-risk DNA-HPV subtypes reserach (HPV - 16,-18,-31) and the presence of DNA-Chlamydia trachomatis (CT) was identified through Polimerase Chain Reation Technique (PCR). After colposcopi examination, was collected biopsy for immunohistochemical analysis of p16INK4a, Ki67, estrogen and progesterone receptors. RESULTS: The DNA-HPV was observed in 83% (74/89) biopsies and 46% (34/74) were highrisk types (16,18,31). DNA-CT was detected in 16/86 patients (19%). In relation to anatomopathological exam, 7% were high-squamous intraepithelial lesion (HSIL), 59% low squamous intraepithelial lesion (LSIL) and in 34% no was observed alterations. The expression of p16INK4a was observed in 85,3% (29/34) positive women to DNA-HPV HR and this association was statistically significant (p=0,02). All biopsies HPV-16 positive (16/34) expressed p16INK4a (p=0,01). There was a significant association between intensity, pattern of expression and grade of lesion (p=0,001). The association between p16INK4a expression and DNA-HPV was statistically significant in smokers (p=0,03; OR: 11,25 IC95%:1,11-114,4), in women with previous history of sexual transmitted disease (SDT) (p=0,01; OR: 6,82 IC95% 1,53-30,3), women withbthe first intercourse between 17-19 years (p=0,048; OR: 8,500 IC95% 0,971- 74,424) and in women with three or more lifetime sexual partners (p=0,02;OR 8,12 IC95%:1,31- 50,2). Women positive to DNA-CT were positive to DNA-HPV. Between women DNA-HPV positive, the antibody Ki67 was expressed in 100%, 31% and 32% of HSIL, LSIL and normal fragments respectively and this association was statisticaly significative (p<0,003). No association was observed between the estrogen receptor expression and the outcomes studied. The progesterone receptor was expressed in 42% of cases studied (37/89), and 26,5% (9/37) was positive for high-risk types (p=0,023). The progesterone receptor expression was greater in nosmokers (p=0,02), between women who use oral contraceptives (p=0,03) and that have lower school-grade (p=0,04). Discussion and conclusion: The presence of HPV persistent infection in cervical lesions in different histological grades is fact already demonstrated. The virus transforming activity is in accordance with its capacity of replication and the diferentiation through epiteliaafter its integration. The identification of high types of virus is essential to establish and evaluate the prognosis of lesions. The co-infection with CT described in several epidemiological studies has been related as a risk factor to acquire the HPV infection and to develop more agressive lesions. Howevwer in our study except in relation to lower school grade no association was observed between the outcomes and the co-infection by CT, probably due to the small sample. It observed trough this study, the contribution of the immunohistochemical analysis of concogenic markers suh as p16INK4a and Ki67 expression in the diagnostic and follow-up of active lesions. The associaton of epidemiological variables with these markers showed efficient, and evidence existe that some variables can contribute to lesions transformation.