Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La recombinaison méiotique joue un double rôle de moteur évolutif en participant à la création d'une diversité génétique soumise à la sélection naturelle et de contrôle dans la fabrication des gamètes lors de la méiose. De plus, en association avec certains mécanismes de réparation, la recombinaison, au travers de la conversion génique biaisée manipule les fréquences alléliques au sein des populations. Les connaissances sur le fonctionnement même de ce processus ont considérablement augmenté ces dernières années faisant découvrir un processus complexe, autant dans son fonctionnement que dans son évolution. Le thème général de la thèse est l'analyse, dans un contexte évolutif, des relations entre les différents rôles et caractéristiques fonctionnelles de la recombinaison. Un modèle de la recombinaison prenant en compte des contraintes liées au contrôle de la méiose et le phénomène d'interférence a permis une comparaison entre espèces au sein des vertébrés et des non-vertébrés de même qu'une comparaison entre sexes. Par ailleurs, nous avons montré l'impact de la localisation spécifique aux sexes des points chauds de recombinaison sur l'évolution du contenu en GC des génomes de plusieurs vertébrés. Finalement, nous proposons un modèle à l'échelle de la génétique des populations, permettant d'analyser l'impact de la recombinaison sur la fréquence de mutations délétères dans les populations humaines. Cette thèse, nous l'espérons, apportera sa pierre à l'étude interdisciplinaire de la recombinaison, à la fois au sein de la biologie et par ses relations au travers de la modélisation avec l'informatique et les mathématiques. / Meiotic recombination plays several critical roles in molecular evolution. First, recombination represents a key step in the production and transmission of gametes during meiosis. Second, recombination facilitates the impact of natural selection by shuffling genomic sequences. Furthermore, the action of certain repair mechanisms during recombination affects the frequencies of alleles in populations via biased gene conversion. Lately, the numerous advancements in the study of recombination have unraveled the complexity of this process regarding both its mechanisms and evolution. The main aim of this thesis is to analyze the relationships between the different causes, characteristics, and effects of recombination from an evolutionary perspective. First, we developed a model based on the control mechanisms of meiosis and inter-crossover interference. We further used this model to compare the recombination strategies in multiple vertebrates and invertebrates, as well as between sexes. Second, we studied the impact of the sex-specific localization of recombination hotspots on the evolution of the GC content for several vertebrates. Last, we built a population genetics model to analyze the impact of recombination on the frequency of deleterious mutation in the human population.

Cette thèse traite de la solution numérique de deux types de problèmes stochastiques. Premièrement, nous nous intéressons aux EDS fortement oscillantes, c'est-à-dire, les systèmes composés de variables ergodiques évoluant rapidement par rapport aux autres. Nous proposons un algorithme basé sur des résultats d'homogénéisation. Il est défini par un schéma d'Euler appliqué aux variables lentes couplé avec un estimateur à pas décroissant pour approcher la limite ergodique des variables rapides. Nous prouvons la convergence forte de l'algorithme et montrons que son erreur normalisée satisfait un résultat du type théorème limite centrale généralisé. Nous proposons également une version extrapolée de l'algorithme ayant une meilleure complexité asymptotique en satisfaisant les mêmes propriétés que la version originale. Ensuite, nous étudions la solution des EDS de type McKean-Vlasov (EDSPR-MKV) associées à la solution de certains problèmes de contrôle sous un environnement formé d'un grand nombre de particules ayant des interactions du type champ-moyen. D'abord, nous présentons un nouvel algorithme, basé sur la méthode de cubature sur l'espace de Wiener, pour approcher faiblement la solution d'une EDS du type McKean-Vlasov. Il est déterministe et peut être paramétré pour atteindre tout ordre de convergence souhaité. Puis, en utilisant ce nouvel algorithme, nous construisons deux schémas pour résoudre les EDSPR-MKV découplées et nous montrons que ces schémas ont des convergences d'ordres un et deux. Enfin, nous considérons le problème de réduction de la complexité de la méthode présentée tout en respectant la vitesse de convergence énoncée. / This Ph.D. thesis deals with the numerical solution of two types of stochastic problems. First, we investigate the numeric solution to strongly oscillating SDEs, i.e. systems in which some ergodic state variables evolve quickly with respect to the remaining ones. We propose an algorithm that uses homogenization results and consists of an Euler scheme for the slow scale variables coupled with a decreasing step estimator for the ergodic averages of the fast variables. We prove the strong convergence of the algorithm as well as a generalized central limit theorem result for the normalized error distribution. In addition, we propose an extrapolated version applicable under stronger regularity assumptions and which satisfies the same properties of the original algorithm with lower asymptotic complexity. Then, we treat the problem of solving decoupled Forward Backward Stochastic Differential equations of McKean-Vlasov type (MKV-FBSDE) which appear in some stochastic control problems in an environment of a large number of particles with mean field interactions. As a first step, we propose a new algorithm, based on the cubature method on Wiener spaces, to weakly approach the solution of a McKean-Vlasov SDE. It is deterministic and can be parametrized to obtain any given order of convergence. Using this first forward approximation algorithm, we construct two procedures to solve the decoupled MKV-FBSDE and show that they converge with orders one and two under appropriate regularity conditions. Finally, we consider the problem of reducing the complexity of the presented method while preserving the presented convergence rates.

La recombinaison méiotique initiée en prophase I de méiose génère soit des crossing-over (COs), qui sont des échanges réciproques entre segments chromosomiques, ou des conversions géniques non associées aux COs (NCOs). Les deux types d'événements se produisent dans de petites régions (moins de 10 kilobases) appelées points chauds, qui sont distribuées de manière non homogène le long des chromosomes. L'objectif de ma thèse était la caractérisation d'un point chaud de recombinaison méiotique (nommée 14a) chez Arabidopsis thaliana (i) dans différentes accessions (ii) dans le mutant msh4, un gène impliqué dans la formation des COs. Dans les deux hybrides ColxLer et ColxWs (i) 14a a un taux très élevé de COs 0,85% et 0,49%, respectivement (ii) Les COs sont regroupés dans deux petites régions de quelques kilobases, 14a1 et 14a2 avec une distribution de type gaussienne observée aux points chauds décrits dans d'autres espèces (iii) 14a1 est aussi un point chaud de NCO avec un taux aussi élevé que celui des COs (0,5%) dans ColxLer (iv) un biais de l'initiation de recombinaison a été trouvé dans 14a1 aussi bien pour les COs que les NCOs dans le fond génétique ColxLer.Une réduction de la fréquence de CO a été observée dans le mutant msh4 dans le fond génétique ColxLer à 14a1 et 14a2 (6,4% et 18,7% par rapport au sauvage). Cela confirme le rôle précédemment connu de la protéine MSH4 impliqué dans la formation de CO. La fréquence de NCO à 14a1 est similaire à celle observéedans le fond sauvage. Le rôle des H3K4 histones trimethyltransferase d’Arabidopsis dans la recombinaison méiotique (comme précédemment observé comme Set1 chez S. cerevisiae ou PRDM9 chez les mammifères) a également été étudiée. Aucun des dix gènes d’histones méthyltransférase étudié n'a montré de rôle dans la méiose. Cela pourrait être dû à (i) une forte redondance de la fonction entre les protéines (ii) une autre histone méthyltransférase en charge de l'étiquetage des points chauds de recombinaison méiotique (plus de 29 putatif histone méthyltransférase ont été identifiés dans le génome d'Arabidopsis!) (iii) contrairement à S. cerevisiae, les souris et l'homme, un autre mécanisme de contrôle épigénétique de la recombinaison méiotique. / Meiotic recombination initiated in prophase I of meiosis generates either crossovers (COs), which are reciprocal exchanges between chromosome segments, or gene conversion not associated to crossovers (NCOs). Both kinds of events occur in narrow regions (less than 10 kilobases) called hotspots, which are distributed non-homogenously along chromosomes. The aim of my PhD was the characterization of a hotspot of meiotic recombination (named 14a) in Arabidopsis thaliana (i) across different accessions (ii) in msh4 mutant, a gene involved in CO formation. In both ColxLer and ColxWs hybrids (i) 14a had a very high rate of COs 0.85% and 0.49%, respectively (ii) COs clustered in two small regions of a few kilobases, 14a1 and 14a2 with typical Gaussian curve distribution observed in other organisms (iii) 14a1 was also a hotspot of NCO with high rate (0.5%) in ColxLer (iv) a bias of recombination initiation at 14a1 CO and NCO hotspot was found in ColxLer. A reduction of CO frequency was observed in msh4 mutant in ColxLer background at 14a1 (6.4%) and 14a2 (18.7%) compared to wild type. This confirmed previously known role of MSH4 protein in CO formation. Frequency of NCO at 14a1 was similar to wild type. The role of putative Arabidopsis histone H3K4 trimethyltransferase in meiotic recombination as previously observed like Set1 in S.cerevisiae or PRDM9 in mammals (mice and human) was also studied. None of ten putative histone methyltransferase genes was involved in meiosis. This could be due to (i) a strong redundancy of function between gene products (ii) another histone methyltransferase in charge of labeling meiotic recombination hotspots (more than 29 putative histone methyltransferase have been identified in the Arabidopsis genome!) (iii) contrary to S. cerevisiae, mice and humans, another mechanism for epigenetic control of meiotic recombination

En génomique comparative, on considère classiquement trois forces déterminant l'évolution des séquences : la mutation, la sélection et la dérive génétique. Récemment, lors de l'étude de l'origine évolutive des variations de la composition en base des génomes, un quatrième agent a été identifié : la conversion génique biaisée (BGC). Le BGC est intimement lié à la recombinaison méiotique et semble présent chez la plupart des eucaryotes. Ce phénomène introduit une surreprésentation de certains allèles dans les produits méiotiques aboutissant à une augmentation de la fréquence de ces variants dans la population. Ce processus est capable de mimer et d'interférer avec la sélection naturelle. Il est donc important de le caractériser afin de pouvoir le distinguer efficacement de la sélection dans l'étude de l'adaptation à l'échelle moléculaire. C'est ce que nous nous attachons à faire dans le cadre de ce travail. Pour cela nous utilisons deux espèces modèles. Premièrement la levure Saccharomyces cerevisiae pour laquelle une carte de recombinaison haute résolution permettant l'analyse du processus de conversion, est disponible. L'étude approfondie de cette carte nous a permis de lever le voile sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le BGC. Deuxièmement, grâce à des découvertes récentes sur la détermination des patrons de recombinaison via la protéine PRDM9 chez les mammifères, nous avons quantifié la dynamique et l'intensité de ce processus dans l'histoire évolutive récente de l'homme. Ces résultats nous ont permis de confirmer la place du BGC comme quatrième force d'évolution moléculaire, mais aussi de discuter de l'origine évolutive de ce phénomène / Usually, three main forces are considered when studying sequences evolution in comparative genomics : mutation, selection and genetic drift. Recently, a fourth process has been identified during the study of base composition landscapes in genomes : biased gene conversion (BGC). This phenomenon introduces an overrepresentation of certain alleles in meiosis products (gametes or spores) leading to an increase of the frequency of those variants in the population. Thus, it is able to mimic and interfere with natural selection. Hence, it is important to describe this phenomenon in order to be able to trustfully distinguish BGC and selection in the study of adaptation at the molecular scale. So, the main goal of this work is to analyze the molecular origin, the intensity and the dynamics of BGC. To do so, we use two model species. First, we use the yeast Saccharomyces cerevisiae because, for this specie, a high-resolution recombination map is available which allows a fine study of the conversion process. Analyzing this map led us to shed the light on the molecular mechanisms of BGC. Secondly, recent discoveries on the role of the PRDM9 protein in the determination of recombination landscapes in mammals allowed us to quantify the dynamics and intensity of BGC in the recent human history. Thanks to those two studies, we first confirmed that BGC is the fourth force of molecular evolution and we also provided hypotheses about the evolutionary origin of this process

La maturation des cellules lymphoïdes T est un processus thymique hautement régulé au cours duquel les réarrangements ordonnés des loci du TCRδ, y, β et enfin α déterminent le développement des lignées yδ et αβ. Les remaniements somatiques des segments géniques V, (D) et J du TCR font intervenir les protéines RAG1/2, les séquences RSS jouxtant ces segments et des éléments régulateurs (enhancers) assurant une cis-régulation de ce processus. Le contrôle de la recombinaison V(D)J se fait grâce à divers mécanismes incluant des mécanismes épigénétiques, l’intervention de facteurs de transcription et la conformation/séquence des RSS. Dans ce travail, nous montrons que les réarrangements du locus TCRδ sont strictement ordonnés chez l’Homme. Le premier réarrangement Dδ2-Dδ3 se produit à un stade ETP (Early T-cell Precursor) CD34+/CD1a-/CD7+dim, et précède systématiquement le réarrangement Dδ2-Jδ1. L’analyse in silico du locus a permis d’identifier un site de fixation clé pour le facteur de transcription RUNX1 à proximité immédiate de l’heptamètre Dδ2-23RSS chez l’Homme mais absent chez la souris. Le recrutement de RUNX1 sur ce site dans les thymocytes très immatures CD34+/CD3- permet d’augmenter l’affinité de fixation des protéines RAG1/2 sur le Dδ2-23RSS de manière spécifique. Ce travail identifie un rôle original de cofacteur de RUNX1 au cours de la recombinaison V(D)J dans la thymopoïèse humaine. Une série d’analyses épigénétiques exhaustives, menées dans le cadre du projet Européen Blueprint, sur les sous-populations thymiques humaines, nous a permis d’établir que l’enhanceosome du TCRα est constitué, comme chez la souris, dès les étapes les plus précoces de la thymopoïèse sans pour autant pouvoir s’activer avant la fin de la β-sélection. Nos résultats préliminaires suggèrent que les protéines homéotiques HOXA (notamment HOXA9) répriment l’activité de l’enhancer alpha (et donc les réarrangements du TCRα en interagissant avec le facteur de transcription ETS1 via leurs homéodomaines. Leur répression, induite par le passage de la β-sélection, aboutit à l’ouverture chromatinienne des segments Vα/Jα via l’activation du TCRα. Ces résultats apportent un éclairage nouveau sur le découplage jusqu’ici inexpliqué entre la formation de l’enhanceosome du TCRα à un stade très immature et son activation, permettant les réarrangements du locus, à un stade thymique bien plus tardif. / Maturation of T lymphoid cells is a highly regulated process where ordered thymic rearrangements at the TCRδ, TCRy, TCRβ and finally TCRα loci determine the development into either yδ or αβ T-cell lineages. Somatic rearrangements of V, (D), and J gene segments of TCR loci involve RAG1/2 proteins, RSS sequences juxtaposing V, D, and J genes segments and regulatory elements (enhancers) providing a cis-regulation of this process. The control of the V(D)J recombination is achieved through various mechanisms including epigenetic modifications, involvement of transcription factors and RSS conformation/sequence. In this work, we show that TCRδ rearrangements are strictly ordered in Humans. The first Dδ2-Dδ3 rearrangement occurs at ETP (Early T-Cell Precursor) stage CD34+/CD1a-/CD7+dim, and always precedes Dδ2-Jδ1 rearrangement. In-silico analysis of the locus identified a key binding site for a transcription factor RUNX1 in close proximity to the Dδ2-23RSS heptamer in human, but not in mice. The RUNX1 recruitment at this site in immature CD34+/CD3- thymocytes increases binding affinity of RAG1/2 proteins. This work identifies an original cofactor of human VDJ recombination. A set of comprehensive epigenetic analysis conducted within the Europeen Blueprint project on human thymic subpopulations allowed as to establish that the TCRα enhanceosome (Eα), as in mice, is already formed from the earliest stages of thymopoiesis without being able to be activated before the end of β-selection. Our preliminary results suggest that HOXA homeobox proteins (including HOXA9) suppress the activity of the Eα (thus TCRα rearrangements) by interacting with the transcription factor ETS1 via their homeodomains. Induced by β-selection HOXA repression results in the chromatin opening of the Vα/Jα gene segments through TCRα activation. These finding shed new light on the so far unexplained shift observed between the formation of Eα enhanceosome at a very immature stages and its activation at a much later developmental stages.

La bactérie Deinococcus radiodurans est connue pour sa capacité à résister à un grand nombre de traitements génotoxiques parmi lesquels on peut citer l’exposition aux rayons ionisants, aux ultra-violets, à la mitomycine C, à la dessication et au stress oxydant. Elle est capable lors d’une exposition à des doses extrêmes de rayons γ générant des centaines de cassures de l’ADN de reconstituer un génome intact en seulement 2 à 3 heures via un mécanisme original, l’ESDSA, impliquant une synthèse massive d’ADN pendant la phase de réparation des cassures de l’ADN. En plus de mécanismes efficaces de réparation de l’ADN, elle possède un kit de survie comprenant une compaction importante du nucléoïde, des mécanismes de protection des protéines contre l’oxydation, une réponse originale aux lésions de l’ADN et des protéines spécifiques induites après irradiation. Tous ces facteurs contribuent au maintien de l’intégrité du génome et à la survie de la cellule lors de l’exposition à différents agents génotoxiques. Souvent considéré comme un organisme ayant une stabilité génomique exceptionnelle, cette bactérie possède dans son génome un grand nombre de séquences répétées et des éléments mobiles et est par ailleurs naturellement compétente. Ce sont autant de facteurs pouvant participer à la variabilité génétique de cette espèce. Je me suis donc intéressée lors de ma thèse à deux processus pouvant participer à l’instabilité génétique chez D. radiodurans : la recombinaison entre séquences répétées et la transformation naturelle.L’introduction dans le génome de D. radiodurans de séquences répétées directes de 438 pb séparées par des régions d’ADN d’une longueur allant de 1479 pb à 10 500 pb m’a permis de mettre en évidence le rôle majeur joué par l’appariement simple brin (Single Strand Annealing ou SSA) impliquant la protéine DdrB, spécifique des Deinococcaceae, joue un rôle majeur dans la recombinaison « spontanée » entre les séquences répétées en absence de la recombinase RecA. L’absence de DdrB dans des souches déficientes pour la recombinaison augmente davantage la perte de viabilité observée dans ces souches ce qui suggère que le SSA participe à la prise en charge de fourches de réplication bloquées, source majeure d’instabilité génétique en absence de stress extérieur, si ces fourches ne peuvent être prise en charge par des voies impliquant des protéines de recombinaison. Je me suis également intéressée à la transformation naturelle et aux protéines impliquées dans ce processus chez D. radiodurans. J’ai pu démontrer que la protéine DprA impliquée dans la protection de l’ADN simple brin et le chargement de RecA sur l’ADN simple brin internalisé lors de la transformation de nombreuses espèces comme Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis ou Helicobacter pylori, est également impliquée dans la transformation chez D. radiodurans. J’ai pu montrer également qu’en plus de jouer un rôle majeur dans la transformation par de l’ADN plasmidique, DdrB est impliquée dans la transformation par de l’ADN génomique si la protéine DprA est absente. / The bacterium Deinococcus radiodurans is known for its ability to withstand a large number of genotoxic treatments, including exposure to ionizing or ultraviolet radiation, mitomycin C, desiccation, and oxidative stress. It is able, upon exposure to extreme doses of γ-radiation generating hundreds of DNA breaks, to reconstitute an intact genome in only 2 to 3 hours via an ESDSA mechanism, involving massive DNA synthesis during DNA double strand break repair. Together with efficient DNA repair mechanisms, D. radiodurans possesses a survival kit comprising significant compaction of its nucleoid, protection mechanisms against protein oxidation, an original response to DNA damage and specific proteins induced after irradiation. All of these contribute to the maintenance of genomic integrity and cell survival upon exposure to various genotoxic agents. In spite of the idea that D. radiodurans is an organism with outstanding genomic stability, this bacterium has in its genome a large number of repeat sequences and mobile elements and is also naturally competent. All these factors contribute to the genetic variability of species. I was interested in two processes that can play a role in genetic variability in D. radiodurans: recombination between repeated sequences and natural transformation.The introduction, into the genome of D. radiodurans, of 438 bp direct repeated sequences separated by DNA regions ranging from 1,479 bp to 10,500 bp in length allowed me to demonstrate the major role of Single Strand Annealing (SSA) involving the DdrB protein specific for Deinococcaceae, in the "spontaneous" recombination between the repeated sequences in the absence of the RecA recombinase. The absence of DdrB in strains deficient for recombination further increased the loss of viability observed in these strains, suggesting that SSA is required for the management of blocked replication forks, a major source of genetic instability in the absence of external stress when these forks cannot be rescued by pathways involving recombination proteins.I was also interested in the natural transformation and proteins involved in this process in D. radiodurans. I demonstrated that DprA protein involved in DNA single strand protection and loading of RecA on single-stranded DNA internalized during transformation of many species such as Streptococcus pneumoniae, Helicobacter pylori, or Bacillus subtilis, is also involved in this process in D. radiodurans. I also showed that, in addition to playing a major role in transformation by plasmid DNA, DdrB is also involved in transformation by genomic DNA of cells devoid of the DprA protein.

Les archées hyperthermophiles ont une température optimale de croissance supérieure à 80°C.Les cellules exposées à un stress thermique subissent une augmentation de la sensibilité aux agents induisant des cassures double brin de l’ADN. Les études sur les eucaryotes et bactéries ont démontré que la recombinaison homologue joue un rôle essentiel non seulement dans la réparation de l’ADN, mais aussi dans le redémarrage des arrêts de la fourche de réplication. Les enzymes associées aux étapes initiales de la recombinaison homologue chez les archées sont homologues à celles des eucaryotes, et différentes des analogues bactériens. De plus, plusieurs études ont démontré que les protéines impliquées dans la recombinaison homologue sont essentielles chez les archées hyperthermophiles, soulignant l’importance biologique de cette voie de réparation chez ces organismes particuliers. Le rôle de la recombinaison homologue pour la stabilité génomique a été bien étudié chez les eucaryotes et les bactéries, cependant, peu de ses propriétés fonctionnelles ont été étudiées chez les archées hyperthermophiles. Pour mieux comprendre le mécanisme de recombinaison homologue impliquée au niveau de la maintenance génomique chez les archées, un réseau d’interactions protéine-protéines a été révélé précédemment au laboratoire à partir des protéines de Pyrococcus abyssi. Ces travaux ont démontré de nouvelles interactions où interviennent les protéines de la réplication et les protéines de la recombinaison de l’ADN. L’objet de cette étude de thèse est de présenter deux interactions : PCNA/Mre11-rad50 (MR) complexe et Primase/RadA. Pour la première fois chez P. furiosus, une interaction physique et fonctionnelle a été démontrée entre le PCNA et le complexe MR (l’initiateur de HR). Un motif, situé en position Cterminale de Mre11, permet l’interaction avec PCNA.PCNA stimule l’activité endonucléase du complexe MR à distance proche de l’extrémité 5’ d’une cassure double brin. Cette propriété est en accord avec l’intervention ultérieure des enzymes assurant la suite du mécanisme de réparation par recombinaison homologue. Par ailleurs, les protéines RadA, Primase et P41 ont été produites et purifiées. Leurs fonctions enzymatiques ont été confirmées. Cependant, nous n’avons pas pu caractériser la fonction de l’association de RadA/Primase. / Hyperthermophilic archaea (HA) are found in high-temperature environments and grow optimally above 80°C. Usually, cells exposed to heat stress display an increased sensitivity to agents inducing double-stranded DNA breaks (DSBs). Studies in Eukaryotes and Bacteria have revealed that homologous recombination (HR) plays a crucial role not only in DNA DSBs repair, but also in the collapsed/stalled DNA replication fork restart.Recombinase and various HR-associated enzymes in archaea specifically resemble the eukaryotic homologues, rather than bacterial homologues.Furthermore, several studies have demonstrated the necessity of HR proteins in HA, suggesting that, HR is an important mechanism in HA. HR influencing genome stability has been well studied in Eukaryotes andBacteria, however, few of its functional properties have been studied in HA.To better understand how HR mechanism is involved in the archaeal genome maintenance process, a previous work proposed a protein-protein interaction network based on Pyrococcus abyssi proteins. Through the network, new interactions involving proteins from DNA replication and DNA recombination were highlighted. The targets of the study presented here for two protein interaction are: PCNA/Mre11-rad50 complex (MR complex) and Primase/RadA. For the first time in P. furiosus, we showed both physical and functional interactions between PCNA (Maestro in DNA replication) and MR complex (initiator of HR). We have identified a PCNA-interaction motif (PIP) located in the C-terminal of Mre11, and shown that PCNA stimulated MR complex endonuclease cleavage proximal to the s’ strand of DNA DSBs at physiological ionic strength. For the second interaction, we have purified the proteins PabRadA/PfuRadA, PabPrimase and PabP41, and confirmed its enzymatic functions. However, we were not able to characterize the function of Primase/RadA association.

Les cellules déficientes pour la recombinaison homologue (RH) présentent un ralentissement des fourches de réplication, un nombre aberrant de centrosomes et une aneuploïdie même en absence de stress exogène (Bertrand P 2003, Daboussi F 2005, 2008, Deng 1999, 2002, Griffin 2000, Kraakman-van der Zwet 2002). De plus, la fréquence des mitoses présentant des chromosomes surnuméraires est plus élevée dans ces cellules.L’ensemble des ces résultats suggéraient que le ralentissement des fourches de réplication dans les cellules déficientes pour la RH pourrait avoir un impact direct sur la formation de centrosomes surnuméraires. De plus, nous voulions savoir si cela pouvait également influencer la ségrégation des chromosomes au cours de la mitose. Les résultats que nous avons obtenus sont rassemblés dans l’article intitulé : “Homologous Recombination protects against mitotic defects and unbalanced chromosome segregation caused by spontaneous replication stress”.Le traitement des cellules compétentes pour la RH avec 5µM d’hydroxyurée (HU), un inhibiteur de l’enzyme de synthèse des dNTPs, induit un ralentissement des fourches de réplication parfaitement comparable à celui observé dans les cellules déficientes pour la RH. Après traitement à l’HU des cellules compétentes pour la RH, la fréquence de mitoses présentant des chromosomes surnuméraires augmente et devient similaire à la fréquence de mitoses avec des chromosomes surnuméraires pour les cellules déficientes pour la HR non traitées à l’HU. Nous avons mesuré l’impact de l’HU sur l’apparition des ponts anaphasiques et sur des défauts de ségrégation des chromosomes lors de la mitose. En l’absence de traitement, nous observons une fréquence plus élevée de ponts anaphasiques et de défauts de ségrégation dans des cellules déficientes pour la RH. Des traitements avec 5µM d’HU augmentent la fréquence des ponts anaphasiques et des erreurs de ségrégation dans les cellules compétentes pour la RH, pour atteindre un niveau comparable aux cellules déficientes pour la RH. Ainsi, une altération de la dynamique de réplication consécutive à une déficience de RH ou à un traitment avec de faibles doses d’HU induit des défauts au cours de la mitose. Un lien direct entre une dynamique de réplication anormale et l’apparition d’un nombre aberrant de centrosomes pourrait être la persistance en mitose d’ADN non répliqué ou endommagé.  Comme l’ADN non répliqué ou les fourches bloquées induisent la formation d’ADN simple brin couvert par RPA, nous avons compté le nombre de cellules en G2/M présentant des foyers de RPA, et observé que la fraction de cellules ayant plus de 5 foyers de RPA augmente dans des cellules déficientes pour Brca2. En conclusion, nous proposons un lien direct entre des altérations de la cinétique de réplication, l’apparition de centrosomes surnuméraires et des défauts de ségrégation des chromosomes en mitose dans les cellules déficientes pour la RH même non soumises à un stress exogène. L’utilisation de faibles doses d’HU dans des cellules compétentes pour la RH mime les phénotypes observés dans les cellules déficientes pour la RH et confirme notre modèle.Nous avons également cherché à comprendre les causes du ralentissement des fourches de réplication observé dans les cellules déficientes pour la RH. Il est ainsi possible que les arrêts de fourches spontanés soient une conséquence d’un stress oxydatif endogène. Dans les cellules compétentes pour la RH, le redémarrage des fourches bloquées est possible et assure une progression normale de la réplication de l’ADN. Ceci favorise une ségrégation équilibrée des chromosomes, le maintien de la diploïdie et la stabilité du génome. Dans des cellules déficientes pour la RH, les blocages de fourches devraient être délétères puisque les principaux mécanismes de redémarrage des fourches ne sont pas fonctionnels. De plus, l’arrêt prolongé des fourches ainsi que les cassures double brin générées par l’effondrement des fourches devraient activer des voies de signalisation. Nous avons néanmoins observé que les cellules ne sont pas bloquées dans le cycle cellulaire, ce qui suggère qu’un seuil supérieur de dommages doive être atteint pour induire l’arrêt du cycle. Les stress endogènes ne semblent donc pas suffisamment élevés pour atteindre ce seuil : même si l’ensemble des fourches parcourant le génome sont ralenties, l’activation d’origines cryptiques permet de compenser et ainsi de maintenir la progression dans le cycle. Mais puisque les cellules ne sont pas arrêtées dans le cycle, des fourches bloquées, de l’ADN endommagé ou non répliqué pourraient persister jusqu’à la transition G2/M et in fine perturber le déroulement de la mitose. Des centrosomes multipolaires provoquent la formation de fuseaux multipolaires et favorisent la ségrégation déséquilibrée des chromosomes, entraînant l’aneuploïdie, la déstabilisation du génome et le développement de cancers. / HR deficient cells show slow replication kinetics, aberrant centrosome number and aneuploidy even in the absence of any exogenous stress (Bertrand P 2003, Daboussi F 2005, 2008, Deng 1999, 2002, Griffin 2000, Kraakman-van der Zwet 2002). Frequency of mitosis with extra centrosomes is elevated and replication kinetics decreased in HR deficient compared to HR proficient cells, in the absence of exogenous stress. Thus the question arose, if replication slowing down in HR deficient cells has direct impact on the appearance of supernumerary centrosomes. Furthermore we wanted to know if this might directly impact chromosome segregation. The results we gained are brought together in the paper “Homologous recombination suppression causes spontaneous mitotic alterations through endogenous replication stress”. By treating our HR proficient cells with 5µM HU we found the perfect concentration to mimic replication dynamics of HR deficient cells in an HR proficient background. This concentration was applied to HR proficient cells. After HU treatment the frequency of mitosis with extra centrosomes was elevated in HR proficient cells. Now they showed the same frequency of mitosis with extra centrosomes, than unchallenged HR deficient cells. We measured the impact of HU treatment on occurrence of anaphase bridges or aberrant mitotic segregation. In the absence of treatment higher frequency of anaphase bridges and aberrant mitotic segregation was detected for HR deficient cells. With 5µM HU the frequency of anaphase bridges and aberrant mitosis could be elevated in HR proficient cells. Now they showed aberrant mitotic features with the same frequency than unchallenged HR deficient cells. A direct link between abnormal replication kinetics and aberrant centrosomes might be unreplicated or damaged DNA, that enter mitosis. Unreplicated or blocked DNA might harbour ss DNA bound RPA. Thus we counted G2/M cells with RPA foci. Indeed the fraction of cells that harbour more than 5 RPA foci was elevated in Brca2 deficient in comparison to Brca2 proficient cells. In conclusion we propose a direct link between delayed replication, supernumerary centrosomes and aberrant chromosome segregation in unchallenged HR deficient cells. If we mimicked replication kinetics of HR deficient cells in an HR proficient background, we also mimicked frequency of mitosis with extra centrosome number and aberrant chromosome segregation. Furthermore we investigated the causes of replication slowing down in HR deficient cells. It can be hypothesized that endogenous oxidative stress is implicated in spontaneous fork arrest. In HR proficient cells, reactivation of stalled replication forks and therefore normal replication progression is assured. This favours balanced chromosome segregation, diploidy and genetic stability.In HR deficient cells, replication fork blockage might be detrimental as the main restart mechanism for blocked forks is absent. Prolonged fork blockage or DSB’s arising by fork collapse or resolution of blocked replication forks might activate signalling pathways. However cells are not arrested in cell cycle progression, suggesting that a threshold should be reached to activate cell cycle arrest. Endogenous stress is not sufficient high to reach this threshold. Replication is genome wide slowed down. In this context, the activation of cryptic origins compensates at least partly the slow replication velocity. However, because cells were not arrested in cell cycle progression, some blocked replication forks and damaged or unreplicated DNA regions might persist until G2/M phase and affect centrosome duplication and chromosome segregation. Multipolar centrosomes cause multipolar spindles and favour unbalanced chromosome segregation leading to aneuploidy, genetic instability and cancer development.

Chez les bactéries, la ségrégation du chromosome est initiée durant la phase de réplication. Des expériences de time lapse, utilisées pour observer que la dynamique des loci frères durant le cycle cellulaire, montrent que, chez Escherichia coli, les régions sœurs restent colocalisées pour une période significative dans les régions des macrodomaines du chromosome et pour une courte période dans les régions non-structurées. Nous nous sommes posés la question suivante: est ce que l’étape de colocalisation révèle une réelle cohésion entre les chromatides sœurs ? Pour y répondre, nous avons développé un outil génétique, alternatif aux outils de biologie cellulaire, permettant de mesurer la distance entre les chromatides sœurs de manière directe. La fréquence de recombinaison intermoléculaire médiée par la recombinase Cre entre les sites loxP positionnés sur les chromatides sœurs est mesurée pour différentes positions. De cette fréquence, nous avons pu déduire la proximité entre les chromatides sœurs. Nous révélons que les loci frères restent proche l’un de l’autre pour une courte période après la réplication. Nous appelons cette étape la cohésion moléculaire, celle-ci est dépendante du locus considéré. Nous montrons que les facteurs qui favorisent la colocalisation des foci frères n’augmentent pas nécessairement l’habilité des loci frères à recombiner. En effet, la protéine MatP, un acteur de la colocalisation des macrodomaines Ter, n’affecte pas la cohésion entre les deux copies de cette région. La Topoisomérase IV est un facteur essentiel à la ségrégation des chromosomes. En son absence, les chromosomes ne peuvent se ségréger et restent colocalisés dans la cellule. Nous révélons par le test de recombinaison que l’absence de Topoisométase IV dans les cellules provoque une augmentation des interactions entre chromatides sœurs. Au final, nous avons montré que l’étape de cohésion est différente de la colocalisation, que les mécanismes moléculaires diffèrent d’une étape à l’autre et que les liens de précaténation moduleraient la cohésion post-réplicative entre chromatides sœurs. / In bacteria, the segregation of the chromosome is initiated during the replication phase. Time lapse experiments, used to watch the dynamic of loci during cell cycle, showed, in Escherichia coli, that the sister loci remain colocalized for a significant amount of time in the macrodomain regions of the chromosome and for shorter period in the Non Structured regions. We asked the following question: does this colocalization step reveal a real cohesion between the sister chromatids? To answer, we have developed a genetic tool, alternative to cell biology tools, to measure the distance between sister chromatids directly. The frequency of intermolecular recombination mediated by Cre recombinase loxP sites located on sister chromatids was measured for various loci. From this frequency we were able to deduce the proximity of sister chromatids. We revealed that sister loci remained in close proximity for a short period following replication. We called this step molecular cohesion, it is dependent on the considered locus. We showed that factors that promote colocalisation of sister foci do not necessarily increase the ability of sister loci to recombine. Indeed, the MatP protein, an actor of macrodomain Ter colocalisation, does not affect the cohesion between the two copies of this region. The TopoIV is essential for the segregation of chromosomes. In its absence, the chromosomes can not segregate and remain colocalized in the cell. We reveal by recombinaison assy that the absence of Topoisomerase IV revealed an increase of interactions between sister chromatids. To conclude, we have shown that the cohesion step is different from the colocalisation step, the molecular mechanisms differ from one stage to another and précaténation links take part in the post-replicative cohesion between sister chromatids