Durant l’ontogénie B, le locus des chaînes lourdes d’immunoglobulines (IgH) subit trois processus majeurs de réarrangements géniques. Lors de la phase précoce du développement B, indépendamment de la rencontre avec un antigène (Ag), les recombinaisons VHDJH donnent le répertoire diversifié des Ig fonctionnelles. Durant la phase tardive, suite à une activation par l’Ag, l’hypermutation somatique (SHM) permet l’augmentation de l’affinité de l’Ig à son Ag et la recombinaison isotypique (CSR) va modifier ses fonctions effectrices. Tous ces processus sont strictement régulés par différents éléments cis-régulateurs repartis tout au long du locus IgH. La région régulatrice en 3’ (3’RR) en est un. Elle s’étend sur environ 30 Kb et est constituée de quatre activateurs transcriptionnels, dont les trois premiers forment une structure palindromique. La 3’RR contrôle, chez le lymphocyte B-2 (LB-2), la transcription du locus IgH, le devenir de la cellule B, la SHM et la CSR mais elle n’a aucun effet sur les recombinaisons VHDJH et la diversité du répertoire antigénique. Les LB-1 représentent un petit pourcentage des LB totaux. Ils diffèrent des LB-2 par leur origine, développement, fonctions, marqueurs de surface et distribution tissulaire. Les LB-1 maintiennent l'homéostasie dans l'organisme et sont la source principale des Ig naturelles (NIgM et NIgA) au cours des premières phases d'une réponse immunitaire. Lors de ma thèse, nous avons étudié le rôle de la 3’RR sur le développement des LB-1. D’une façon identique aux LB-2, la 3’RR contrôle la transcription du locus IgH, le devenir des cellules B et la SHM dans les LB-1. A l’inverse des LB-2, la 3’RR joue un rôle indirect sur la diversité du répertoire antigénique dans les LB-1 et n’a aucun effet sur la CSR vers IgA. Ces résultats mettent en évidence, pour la première fois, la contribution de la 3'RR dans le développement d’une population cellulaire B à l’interface entre l’immunité innée et acquise. Ils renforcent nos connaissances sur le rôle des éléments cis-régulateurs du locus IgH dans le développement de ces deux immunités. / During B-cell development, the immunoglobulin heavy chain locus (IgH) undergoes three major genic rearrangements. During the early stages, before encountering the antigen (Ag), VHDJH rearrangements allow the generation of the Ig repertoire. During the late stages, after encountering the Ag, somatic hypermutation (SHM) increases the affinity of the Ig for its Ag, while class switch recombination (CSR) modifies its effector functions. All these genetic events are strictly regulated by cis-regulatory elements spread along the IgH locus, including the 3’ regulatory region (3’RR). The 3’RR extends over more than 30kb and contains four transcriptional enhancers, the first three displaying a palindromic conformation. The 3'RR controls B2 B-cell IgH transcription, cell fate, SHM and CSR but not repertoire diversity. B1 B-cells represent a small percentage of total B-cells differing from B2 B-cells by several points such as precursors, development, functions, surface markers and tissue distribution. B1 B-cells act at the steady state to maintain homeostasis and during the earliest phases of an immune response by secreting natural Ig (NIgM and NIgA). During my PhD, we investigated the role of the 3'RR on B1 B-cells. Similarly to B2 B-cells, the 3'RR controls IgH transcription, cell fate and SHM in B1 B-cells. In contrast to B2 B-cells, 3'RR deletion indirectly affects B1 B-cell repertoire diversity and has no effect on their CSR towards IgA. These results highlight, for the first time, the contribution of the 3'RR in the development of a B-cell population at the interface between innate and acquired immunity. Moreover, these results strengthen our knowledge of the role of the cis-regulatory elements of the IgH locus in the development of these two immune responses.

Les réarrangements permettent une évolution rapide du génome par l’acquisition de séquences codantes exogènes, la perte de fonctions non-essentielles ou la création de nouvelles organisations génomiques. Différents mécanismes de réarrangements impliquant des éléments génétiques mobiles (EGM) ont été identifiés chez les archées, les bactéries et les eucaryotes. En revanche, on ignore l’origine des nombreuses inversions génomiques détectées pour les espèces du genre archéen Thermococcus. Mes travaux de thèse visent à améliorer la compréhension de l’évolution génomique chez les Thermococcales à travers l’étude de deux familles d’EGM : les familles de plasmides pTN3 et pT26-2. Plus précisément, je me suis intéressée aux recombinases à tyrosine (ou intégrases) que ces plasmides encodent et qui permettent leur intégration dans le chromosome de l’hôte. J’ai montré que l’intégrase plasmidique Intᵖᵀᴺ³ est responsable d’inversions dans le chromosome de son hôte Thermococcus nautili grâce à une activité catalytique inédite de recombinaison homologue. J’ai par la suite caractérisé deux autres intégrases de Thermococcales reliés phylogénétiquement à Intᵖᵀᴺ³ dont seulement une présente une activité de recombinaison homologue. La comparaison de leurs séquences primaires et la résolution de la structure de Intᵖᵀᴺ³ vont maintenant éclairer les déterminants génétiques responsables de la spécificité de site et de l’activité de recombinaison homologue. Les trois intégrases appartiennent à une classe de recombinases spécifique des archées qui catalyse une intégration suicidaire. Lors de l’intégration, le gène de l’intégrase est fragmenté et probablement désactivé. L’EGM intégré se retrouve piégé dans le chromosome. Les avantages évolutifs d’une telle activité suicidaire restent pour l’instant mystérieux. J’ai identifié 62 intégrases hyperthermophiles suicidaires et reconstruit leur histoire évolutive. Ces intégrases sont très prévalentes et recrutées par différents EGM. De plus, j’ai montré que l’une de ces intégrases présente in vitro une activité de recombinaison site-spécifique à des températures proches de l’ébullition de l’eau, représentant un avantage dans les environnements hyperthermophiles. / Genomes rapidly evolve through rearrangements that can generate new genome organizations or lead to the acquisition of foreign coding sequences or the loss of non-essential functions. Several mechanisms of rearrangement were uncovered for Archaea, Bacteria and Eukaryotes that involve mobile genetic elements (MGE). Species from the archaeal genera Thermococcus present numerous genomic inversions but none of the previously known inversion drivers. To better understand the genomic evolution of Thermococcales, I investigated two of their MGE families: the pTN3 and pT26-2 plasmid families. Specifically, I focused on the tyrosine recombinases (or integrase) that these plasmids encode and that catalyze their site-specific integration in the host chromosome. I demonstrated that the plasmidic integrase Intᵖᵀᴺ³ is responsible for chromosomal inversions in the host Thermococcus nautili through an unprecedented homologous recombination catalytic activity. I also characterized two other related Thermococcus integrases and only one catalyzes homologous recombination. The structure resolution of Intᵖᵀᴺ³ and primary sequence comparisons will now provide clues about the genetic determinants of site specificity and of the homologous recombination activity. The three integrases all belong to an archaeal-specific class of integrases that catalyzes a suicidal integration. The integrase gene is partitioned and presumably inactivated upon integration. The integrated MGE is then trapped into the chromosome. The evolutionary benefits of this suicide activity are puzzling. I identified 62 related suicidal hyperthermophilic integrases and reconstructed their evolutionary history. They are highly prevalent and recruited by diverse MGE. I also showed that one of these integrases can catalyze in vitro site-specific recombination at near boiling water temperature, representing an advantage in hyperthermophilic environments.

Au cours de la méiose, les points chauds de recombinaison sont le siège de la formation de cassures double-brin de l’ADN. Ces dernières sont ensuite réparées par un processus qui, chez de nombreuses espèces, favorise la transmission des allèles G et C : la conversion génique biaisée vers GC (gBGC). L’intensité de cet important distorteur de la ségrégation méiotique varie fortement entre espèces mais les facteurs déterminant son évolution sont toujours inconnus. Nous avons donc voulu quantifier directement le biais de transmission chez la souris et comparer les paramètres dont il dépend avec d’autres mammifères. Dans cette étude, en couplant des développements bioinformatiques à une technique de capture ciblée d’ADN suivie de séquençage haut-débit (capture-seq), nous avons réussi à mettre au point une approche qui s’est révélée 100 fois plus performante pour détecter les événements de recombinaison que les méthodes existant actuellement. Ainsi, nous avons pu identifier 18 821 crossing-overs (COs) et non-crossovers (NCOs) à très grande résolution chez des individus uniques, ce qui nous a permis de caractériser minutieusement la recombinaison chez la souris. Chez cette espèce, les points chauds de recombinaison sont ciblés par la protéine PRDM9 et sont donc soumis à une deuxième forme de conversion génique biaisée (BGC) : le biais d’initiation (dBGC). La quantification du dBGC et du gBGC à partir de nos données nous a permis de mettre en lumière le fait que, au moment où des populations structurées s’hybrident, le gBGC des lignées parentales est propagé par un phénomène d’auto-stop génétique (genetic hitchhiking) provenant du dBGC. Nous avons ensuite pu observer que, chez les souris mâles, seuls les NCOs — et plus particulièrement les NCOs contenant un seul marqueur génétique— contribuent à l’intensité du gBGC. En comparaison, chez l’Homme, à la fois les NCOs et au moins une part des COs (ceux qui présentent des tracts de conversion complexes) distordent les fréquences alléliques. Ceci suggère que la machinerie de réparation des cassures double-brin qui induit le biais de conversion génique (BGC) présente des variations au sein des mammifères. Nos résultats sont aussi en accord avec l’hypothèse selon laquelle une pression de sélection limiterait l’intensité de ce processus délétère à l’échelle de la population. Cela se traduirait par une compensation de la taille efficace de population à de multiples niveaux : par le taux de recombinaison, par la longueur des tracts de conversion et par le biais de transmission. Somme toute, notre travail a permis de mieux comprendre la façon dont la recombinaison et la conversion génique biaisée opèrent chez les mammifères. / During meiosis, recombination hotspots host the formation of DNA double-strand breaks (DSBs). DSBs are subsequently repaired through a process which, in a wide range of species, is biased towards the favoured transmission of G and C alleles: GC-biased gene conversion (gBGC). The intensity of this fundamental distorter of meiotic segregation strongly varies between species but the factors dictating its evolution are not known. We thus aimed at directly quantifying the transmission bias in mice and comparing the parameters on which it depends with other mammals. Here, we coupled capture-seq and bioinformatic techniques to implement an approach that proved 100 times more powerful than current methods to detect recombination. With it, we identified 18,821 crossing-over (CO) and non-crossover (NCO) events at very high resolution in single individuals and could thus precisely characterise patterns of recombination in mice. In this species, recombination hotspots are targeted by PRDM9 and are therefore subject to a second type of biased gene conversion (BGC): DSB-induced BGC (dBGC). Quantifying both dBGC and gBGC with our data brought to light the fact that, in cases of structured populations, past gBGC from the parental lineages is hitchhiked by dBGC when the populations cross. We next observed that, in male mice, only NCOs — and more particularly single-marker NCOs — contribute to the intensity of gBGC. In contrast, in humans, both NCOs and at least a portion of COs (those with complex conversion tracts) distort allelic frequencies. This suggests that the DSB repair machinery leading to gBGC varies across mammals. Our findings are also consistent with the hypothesis of a selective pressure restraining the intensity of the deleterious gBGC process at the population-scale: this would materialise through a multi-level compensation of the effective population size by the recombination rate, the length of conversion tracts and the transmission bias. Altogether, our work has allowed to better comprehend how recombination and biased gene conversion proceed in the mammalian clade

La recombinaison méiotique joue un rôle essentiel dans la ségrégation des chromosomes pendant la méiose et dans la création de nouvelles combinaisons du matériel génétique des espèces. Ses effets cause une déviation du principe de l'assortiment indépendant de Mendel; cependant, les mécanismes moléculaires impliqués restent partiellement incompris jusqu'à aujourd'hui. Il s'agit d'un processus hautement régulé et de nombreuses protéines sont impliquées dans son contrôle, dirigeant la recombinaison méiotique dans des régions génomiques de 1 à 2 kilobases appelées « hotspots ». Au cours des dernières années, l'apprentissage profond a été appliqué avec succès à la classification des séquences génomiques. Dans ce travail, nous appliquons l'apprentissage profond aux séquences d'ADN humain afin de prédire si une région spécifique d'ADN est un hotspot de recombinaison méiotique ou non. Nous avons appliqué des réseaux de neurones convolutifs sur un ensemble de données décrivant les hotspots de quatre individus non-apparentés, atteignant une exactitude de plus de 88 % avec une précision et un rappel supérieur à 90 % pour les meilleurs modèles. Nous explorons l'impact de différentes tailles de séquences d'entrée, les stratégies de séparation des jeux d'entraînement/validation et l’utilité de montrer au modèle les coordonnées génomiques de la séquence d'entrée. Nous avons exploré différentes manières de construire les motifs appris par le réseau et comment ils peuvent être liés aux méthodes classiques de construction de matrices position-poids, et nous avons pu déduire des connaissances biologiques pertinentes découvertes par le réseau. Nous avons également développé un outil pour visualiser les différents modèles afin d'aider à interpréter les différents aspects du modèle. Dans l'ensemble, nos travaux montrent la capacité des méthodes d'apprentissage profond à étudier la recombinaison méiotique à partir de données génomiques. / Meiotic recombination plays a critical role in the proper segregation of chromosomes during meiosis and in forming new combinations of genetic material within sexually-reproducing species. For a long time, its side effects were observed as a deviation from the Mendel’s principle of independent assortment; however, its molecular mechanisms remain only partially understood until today. We know that it is a highly regulated process and that many molecules are involved in this tight control, resulting in directing meiotic recombination into 1-2 kilobase genomic pairs regions called hotspots. During the past few years, deep learning was successfully applied to the classification of genomic sequences. In this work, we apply deep learning to DNA sequences in order to predict if a specific stretch of DNA is a meiotic recombination hotspot or not. We applied convolution neural networks on a dataset describing the hotspots of four unrelated male individuals, achieving an accuracy of over 88% with precision and recall above 90% for the best models. We explored the impact of different input sequence lengths, train/validation split strategies and showing the model the genomic coordinates of the input sequence. We explored different ways to construct the learnt motifs by the network and how they can relate to the classical methods of constructing position-weight-matrices, and we were able to infer relevant biological knowledge uncovered by the network. We also developed a tool for visualizing the different models output in order to help digest the different aspects of the model. Overall, our work shows the ability for deep learning methods to study meiotic recombination from genomic data.

Cette thèse se concentre sur certains sujets en génétique des populations. Dans la première partie, nous donnons des formules y compris l'espérance et la variance de la hauteur et celles de la longueur du graphe de recombinaison ancestral (ARG) et l'espérance et la variance du nombre de recombinaison et nous montrons que l'espérance de la longueur de l'ARG est une combinaison linéaire de l'espérance de la longueur de la coalescence de Kingman et l'espérance de la hauteur de l'ARG. En outre, nous avons obtenu une relation entre l'espérance la longueur de l'ARG et l'espérance du nombre de recombinaisons. À la fin de cette partie, nous montrons que l'ARG descend de l'infini de telle sorte que X_0 =∞, alors que X_t < ∞ ; pour tout t et on trouve la vitesse à laquelle l'ARG descend de l'infini. Dans la deuxième partie on généralise la formule d'échantillonnage d'Ewens (GESF) en présence de la recombinaison pour les échantillons de taille n = 2 et n = 3. Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions l'ARG le long du génome et nous avons trouvé la distribution du nombre de mutations dans le cas avec une seule recombinaison dans la généalogie de l'échantillon. / This thesis is concentrated on some sub jects on population genetics. In the first part we give formulae including the expectation and variance of the height and the length of the ancestral recombination graph (ARG) and the expectation and variance of the number of recombination events and we show that the expectation of the length of the ARG is a linear combination of the expectation of the length of Kingman's coalescent and the expectation of the height of the ARG. Also we show give a relation between the expectation of the ARG and the expectation of the number of recombination events. At the end of this part we show that the ARG comes down from infinity in the sense that we can dfine it with X_0 = ∞, while X_t <∞ ; for all t and we find the speed that the ARG comes down from infinity. In the second part wfind a generalization of the the Ewens sampling formula (GESF) in the presence of recombination for sample of sizes n = 2 and n = 3. In the third part of the thesis we study the ARG along the genome and we we find the distribution of the number of mutations when we have one recombination event in the genealogy of the sample.

Ce travail de thèse est une contribution à l'étude des propriétés de spin dans les semiconducteurs par spectroscopie de photoluminescence et par photoconductivité en vue d’applications possibles dans le domaine de l’électronique du spin.Nous avons analysé les propriétés de spin des électrons de conduction dans les matériaux semiconducteurs nitrures dilués, massif et puits quantiques (GaAsN, GaAsN/GaAs). Nous avons étudié le mécanisme de recombinaison dépendante du spin des électrons de conduction sur les centres paramagnétiques induits par l’introduction d’azote dans GaAs. Nous avons mis en évidence l’effet de « filtrage » de spin des électrons de conduction que ce mécanisme peut induire ; en particulier, nous avons mené des études détaillées en fonction de la concentration d’azote, de la puissance excitatrice, d’un champ magnétique externe et, pour les hétérostructures, de l’épaisseur des puits quantiques. L’origine chimique des centres paramagnétiques a été, de plus, identifiée par des études de résonance paramagnétique détectée optiquement (ODMR).Nous avons également complété ces études purement optiques sur la recombinaison dépendante du spin, par des expériences de photoconductivité en vue d’applications possibles liées à l’électronique du spin. Nous avons montré que la photoconductivité des matériaux nitrures dilués peut être contrôlée par la polarisation de la lumière incidente. Un détecteur électrique de la polarisation de la lumière à base de GaAsN a été ainsi fabriqué et testé.Ces résultats ont été également interprétés et simulés grâce à un système d’équations dynamiques pouvant rendre compte à la fois des résultats de photoluminescence et de transport / This thesis work is a contribution to the investigation of the spin properties of semiconductors by photoluminescence and photoconductivity spectroscopy with the aim of future applications in the spintronic field. We have studied the conduction band electron spin properties of dilute nitride semiconductors in epilayers and quantum wells (GaAsN, GaAsN/GaAs). In particular, we have investigated the spin dependent recombination of conduction band electrons on deep paramagnetic centers induced by the introduction of nitrogen into GaAs. We have also evidenced the “spin filtering” effect made possible by this spin dependent recombination mechanism. More precisely, we have carried out a systematic study of the spin filtering effect as a function of the nitrogen concentration, excitation power, external magnetic field and, for the hetero-structures, as well as a function of the quantum well thickness. The chemical origin of the deep paramagnetic centers has been also determined by optically detected magnetic resonance (ODMR). We have completed these all-optical studies on the spin dependent recombination by photoconductivity experiments in order to demonstrate a “proof of concept” system for spintronic applications. We have shown that the photoconductivity in dilute nitride semiconductors can be controlled by the polarization of the incident light: an electrical detector of the light polarization has therefore been built. These results have been as well modeled thanks to a rate equation system able to reproduced both the photoluminescence and photoconductivity experimental results

Mon projet de recherche avait pour but de caractériser le rôle de deux protéines, ArgR et PepA, qui agissent en tant que facteurs accessoires de la recombinaison au niveau de deux sites cer du plasmide ColE1 présent dans la bactérie Escherichia coli. Ces deux protéines, couplées aux deux recombinases à tyrosine XerC et XerD, permettent la catalyse de la recombinaison site spécifique au niveau de la séquence cer, convertissant les multimères instables de ColE1 en monomères stables. Cette étude a principalement porté sur la région C-terminale de la protéine ArgR. Cette région de la protéine ArgR possède une séquence en acides-aminés et une structure similaire à celle de la protéine AhrC de Bacillus subtilis. De plus, AhrC, le répresseur de l’arginine de cette bactérie, est capable de complémenter des Escherichia coli mutantes déficientes en ArgR. Les régions C-terminales de ces protéines, montrent une forte similarité. De précédents travaux dans notre laboratoire ont démontré que des mutants d’ArgR comprenant des mutations dans cette région, en particulier les mutants ArgR149, une version tronquée d’ArgR de 149 acides-aminés, et ArgR5aa, une version comprenant une insertion de cinq acides-aminés dans la partie C-terminale, perdaient la capacité de permettre la recombinaison au niveau de deux sites cer présents dans le plasmide pCS210. Malgré cette incapacité à promouvoir la réaction de recombinaison en cer, ces deux mutants étaient toujours capables de se lier spécifiquement à l’ADN et de réprimer une fusion argA :: lacZ. Dans ce travail, les versions mutantes et sauvages d’ArgR furent surexprimées en tant que protéines de fusion 6-histidine. Des analyses crosslinking ont montré que la version sauvage et ArgR5aa pouvaient former des hexamères in-vitro de manière efficace, alors qu’ArgR149 formait des multimères de plus faible poids moléculaire. Des formes tronquées d’ArgR qui comportaient 150 acides-aminés ou plus, étaient encore capables de permettre la recombinaison en cer. Les mutants par substitution ArgRL149A et ArgRL151A ont tous montré que les substitutions d’un seul acide-aminé au sein de cette région avaient peu d’effets sur la recombinaison en cer. Les expériences de crosslinking protéine-à-protéine ont montré que le type sauvage et les formes mutantes d’ArgR étaient capables d’interagir avec la protéine accessoire PepA, également impliquée dans la recombinaison en cer. Les expériences de recombinaison in-vitro utilisant la forme sauvage et les formes mutantes d’ArgR combinées avec les protéines PepA, XerC et XerD purifiées, ont montré que le mutant ArgR149 ne soutenait pas la recombinaison, mais que le mutant ArgR5aa permettait la formation d’une jonction d’Holliday. Des expériences de topologie ont montré que PepA était capable de protéger l’ADN de la topoisomérase 1, et d’empêcher ArgRWt de se lier à l’ADN. Les deux mutants ArgR149 et ArgR5aa protègent aussi l’ADN avec plus de surenroulements. Quand on ajoute PepA, les profils de migration montrent un problème de liaison des deux mutants avec PepA. D’autres expériences impliquant le triplet LEL (leucine-acide glutamique-leucine) et les acides-aminés alentour devraient être réalisés dans le but de connaitre l’existence d’un site de liaison potentiel pour PepA. / My research project involved the role of two proteins, ArgR and PepA, which act as accessory factors in the ColE1 cer recombination system from the gram negative bacteria Escherichia coli. These two proteins, in addition to the tyrosine recombinases XerC and XerD, catalyze a site-specific recombination event at the cer sequence which converts unstable multimeric forms of ColE1 into more stable monomers. Our study mainly focused on the C-terminal end of the ArgR. This region of the ArgR protein possesses a structural and amino acid sequence similarity with the AhrC protein from Bacillus subtilis. Moreover, AhrC, the Arginine repressor of this bacterium, is able to complement Escherichia coli mutants deficient in ArgR. The C-terminal regions of these proteins, display a very high region of similarity. Previous work from our laboratory has shown that ArgR mutants with mutations in this region, especially the mutants ArgR149, a truncated 149 amino acids form of ArgR, and ArgR5aa, a form containing a five amino acid insertion in the C-terminal part, lost the ability to perform a recombination reaction at two cer sites in the plasmid pCS210. Despite this defect in promoting cer recombination, the mutants were still able to bind specifically to DNA, and to repress an argA :: lacZ genetic fusion. In this work, both wild type and mutant ArgR proteins were overexpressed as 6-histidine fusion proteins. Crosslinking analysis showed that both wild type and ArgR5aa efficiently formed hexamers in vitro, while ArgR149 formed lower molecular weight multimers. Truncated forms of ArgR that were 150 amino acids or longer, were able to support cer recombination. The substitution mutants between positions 149 to 151 all showed that single amino acid substitutions at this region had little effect on cer recombination. Protein-protein crosslinking experiments showed that wild type and mutant forms of ArgR, were able to interact with and the other accessory protein involved in cer recombination, PepA. In vitro recombination experiments using wild type and mutant forms of ArgR, combined with purified PepA, XerC and XerD showed that the ArgR149 mutant did not support recombination, but the ArgR5aa mutant did promote Holliday junction formation, raising the possibility that these two mutants interact differently with the Xer recombination machinery. Topology experiments showed that after adding topoisomerase 1, PepA is able to protect DNA from topoisomerase 1, and prevent ArgRWt binding to DNA. The two mutants ArgR149 and ArgR5aa are protecting DNA with more supercoiling. When PepA is added, migration profiles with the two mutants showed a binding problem with PepA. Other experiments involving the LEL triplet (leucine-glutamic acid-leucine) and amino-acids around it should be done in order to know the existence of a possible binding site for PepA.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36. / BRCA1 is a tumour suppressor involved in transcription, DNA repair and maintenance of genomic stability. Indeed, BRCA1 mutation carriers have an exceptionally higher risk of breast and ovarian cancers. BRCA1 is mainly known for its role in homologous recombination repair (HR) by recruiting HR proteins to chromatin upon double strand break (DSBs) formation, e.g., following treatment with ionizing irradiation (IR). However, the function of BRCA1 in other DNA repair pathways such as nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) is still obscure. It is thus of fundamental and clinical importance to investigate BRCA1 function following exposure to diverse genotoxic agents. Using human cultured cell, we observed that BRCA1 is downregulated by the proteasome upon treatment with MMS or UV, but not with IR. Moreover, this downregulation prevents Rad51 recruitment to chromatin following exposure to MMS. Given that DNA damage induced by UV and MMS trigger NER and BER pathways respectively, this implies that HR could be inhibited in order to prevent competition between independent DNA repair pathways. We also found that BRCA1 downregulation is reversible and the recovery of BRCA1 levels correlates with the reappearance of BRCA1 and Rad51 on chromatin. This implies that the HR has been reactivated at the late stage of DNA damage for the repair of double strand breaks generated by replication fork collapse. Since BRCA1 stability is highly regulated by ubiquitination and is downregulated following MMS treatment, one would expect that a deubiquitinase is responsible for relieving this downregulation to promote the reactivation of the HR pathway. To characterize this aspect further, we conducted DUB RNAi screens in which a particular DUB is depleted and the localization of BRCA1 and other related proteins were observed. According to a preliminary screen, a few DUBs (BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1, and USP36) were identified as potential regulators of the stability and localization of BRCA1 and proteins involved in homologous recombination.

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie. / The deubiquitinase BAP1 (BRCA1-Associated Protein1) is a nuclear member of the ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH) family, previously isolated for promoting the function of the tumor suppressor BRCA1. Importantly, homozygous inactivating mutations of BAP1 have been found in mesothelioma, renal, melanoma and breast cancers strongly suggesting that this deubiquitinase is a tumor suppressor. Indeed BAP1 overexpression reduces cell proliferation and tumor growth in xenograft models. Nonetheless, the biological function and the mechanism of action of this deubiquitinase remain poorly defined. The goals of this thesis are to characterize the biological function of BAP1 and to reveal the molecular basis of its tumor suppressive function. To provide insights into BAP1 biological function, we conducted a tandem affinity immunopurification of BAP1-associated proteins and found that most interacting partners are transcription factors and cofactors. Next, we demonstrated that BAP1 is indeed a transcription regulator. Concomitantly, another group showed that the drosophila BAP1, Calypso, is a Polycomb Group protein that regulates the ubiquitination levels of H2A and gene expression. Indeed, our global gene expression analysis suggests that BAP1 plays important role in DNA damage response. Consistently, loss- and gain- of function experiments (RNAi approach, DT40 chicken B cells KO model and re-introduction of BAP1 in BAP1 null-cells) revealed that BAP1 promotes homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Our data suggest that BAP1 exerts its tumor suppressor function by controlling error-free DNA repair by homologous recombination. Thus, in a situation of BAP1 inactivation, cells might become more reliant on non-homologous end joining, an error-prone DNA repair mechanism, which would result in the accumulation of mutations and chromosomal aberrations, causing genomic instability. Further studies are required to delineate the exact role of BAP1 in transcription and to define how deregulation of H2A ubiquitination pathway contributes to cancer. Defining the mechanisms of tumor suppression is of great interest, not only for understanding cancer development, but also for designing rational cancer therapies.