Linhagens celulares humanas tem despertado interesse como plataformas de produção de proteínas terapêuticas recombinantes por sua capacidade de realizar modificações pós-traducionais complexas e de modo similar à humana, sem gerar epítopos imunogênicos como ocorre com proteínas produzidas em células de mamíferos. Para a produção de uma proteína com correta qualidade terapêutica, as agências regulatórias recomendam processos livres de componentes animais de modo a evitar contaminação com vírus e príons. Deste modo, esse trabalho visa a produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante (FVIIr) utilizada no tratamento de hemofílicos com inibidores em células humanas adaptadas para meios de cultura livres de soro fetal bovino. As linhagens humanas SK-Hep-1, HKB-11 e Huh-7 foram adaptadas para suspensão e meios livres de soro fetal bovino (SFB). Essas células adaptadas foram transfectadas de forma transiente com o vetor lentiviral p1054-GFP e o reagente polietilenimina. No entanto, a baixa eficiência de transfecção nas células SK-Hep-1 e Huh-7 mostraram que essas linhagens são difíceis de transfectar por esse método, e mesmo a transfecção da célula HKB-11 só foi possível após a variação de alguns parâmetros, resultando em uma transfecção de 49,5% de células HKB-11 GFP-positivas. Desta forma, a expressão estável foi avaliada e as células adaptadas foram transduzidas com um ciclo de lentivírus (MOI = 1) contendo o vetor p1054-FVII. Foram observadas porcentagens de células GFP-positivas acima de 35% nas três linhagens celulares humanas modificadas. As células transduzidas foram submetidas a dois processos de sorting por citometria de fluxo, no qual a população obtida apresentava mais de 90% de células GFP-positivas. As três células foram avaliadas com relação à expressão de FVIIr após a adição de vitamina K no cultivo, no entanto, não foi possível detectar níveis de FVIIr no sobrenadante de 48 horas do cultivo dessas células pelo teste ELISA. As células foram transduzidas com um segundo ciclo de lentivírus (MOI = 2). A quantificação por ELISA do sobrenadante de 48 horas de cultivo das três células detectou 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL e 78,46 ng/mL de FVII total, respectivamente, nos cultivos das células HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C e Huh-7-F7-2C. A expressão relativa de RNA mensageiro por RT-PCR também foi observada nos três cultivos. Paralelamente, foi analisado o proteoma das três células adaptadas e não-adaptadas em triplicata sendo identificadas de forma abundante proteínas do citoesqueleto, do metabolismo celular, da síntese, enovelamento e degradação de proteínas, relacionadas à apoptose, ao ciclo celular e ao crescimento, proteínas contra estresse oxidativo e osmótico, com ação antioxidante, entre outras. / Human cell lines have attracted great interest as a plarform for recombinant therapeutic proteins production, due their ability to perform complex posttranslational modification in a similar manner to human proteins. These proteins do not carry immunogenic epitopes as occurs with proteins produced in mammalian cells. These therapeutic proteins should be produced in a animal-free process avoiding virus and prion contamination, as recommended by regulatory agencies for quality control. Thus, this work aims the production of recombinant blood coagulation factor VII (rFVII) used in the treatment of hemophiliacs with inhibitors in human cell lines adapted to serum-free suspension cultures. Human cell lines SK-Hep-1, HKB-11 and Huh-7 were adapted to suspension and serum-free media. These adapted cells were transiently transfected with p1054-GFP lentiviral vector and the polyethyleneimine reagent. However, low transfection efficiency in SK-Hep-1 and Huh-7 cells showed that these cells are difficult to transfect by this method, and even transfection of HKB-11 cell was only possible after varying some parameters, resulting in a 49,5% HKB-11 GFP-positive cells. Stable transfection was assessed and adapted cells were transduced with lentivirus particles containing p1054-FVII vector in one cycle (MOI=1). Percentages of GFP-positive cells above 35% were observed in three modified human cell lines. Transduced cells were sorted by FACS and more than 90% of GFP-positive cells were obtained. The expression of rFVII were evaluated by ELISA test after vitamin K supplementation, however, it was not possible to detect FVII levels in the 48 hour culture supernatant. Cells were transduced again with a second lentivirus cycle (MOI = 2). ELISA quantification of the 48 hour culture supernatant detected 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL and 78,46 ng/mL total FVII, respectively, in the cultures of HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C and Huh-7-F7-2C cells. Relative expression of mRNA by RT-PCR was also observed in the three cultures assessed. In parallel, a proteomic analysis of adapted and non-adapted cells was performed in triplicate. Proteins related to cellular metabolism, cytoskeletal structure, apoptosis, cell cycle and cell growth, against oxidative and osmotic stress, antioxidant action were found.

Linhagem de células de inseto S2 foram cultivadas em meio TC100 suplementado em reator bubble free de 1.5 L e para estudar o seu crescimento e expressão da glicoproteína G do vírus da raiva (RVGP). Os dados permitiram propor um modelo matemático que reproduz o crescimento e produção da glicoproteína e que considera oito variáveis de estado e vinte parâmetros cinéticos. O modelo considera a velocidade específica de crescimento limitada por glicose, glutamina e glutamato e inibida por NH4+; consumo e formação de glutamina; velocidade específica de morte limitada por NH4+ e inibida por glicose; velocidade específica de produção de NH4+ e de GPV associada ao crescimento e a degradação de GPV. As concentrações de oxigênio dissolvido (pO2), glicose e glutamina foram modificadas para se avaliar a sua influência na velocidade específica de crescimento máxima e nos fatores de conversão. Os parâmetros do modelo foram ajustados usando a técnica de otimização dos poliedros flexíveis e as equações diferenciais do modelo foram integradas pelo método de Gear. / S2 cell strain from Drosophila melanogaster were cultivated in supplemented TC100 media in reactor \"bubble free\" to study their growth and expression of glycoprotein G of rabies virus (RVGP). The data allowed proposing a mathematical model that reproduces the growth and production of glycoprotein and that consider eight state variables and twenty kinetic parameters. The model considers the specific growth rate limited by glucose glutamine and glutamate and inhibited by NH4+ consumption and formation of glutamine, specific death rate limited by NH4+ and inhibited by glucose; production specific rate of NH4+ and RGPV associated with growth and degradation of RGPV. The concentrations of dissolved oxygen (pO2), glucose and glutamine were varied to evaluate their influence on maximum specific growth rate and conversion factors. The model parameters were adjusted using the flexible polyhedron optimization method and the differential equations of the model were integrated by the method of Gear.

A esquistossomose é a mais importante das doenças helmínticas humanas em termos de morbidez e mortalidade. A proteína Sm14 de Schistosoma mansoni, que pertence à família de proteínas ligadoras de ácidos graxos (fatty acid-binding proteins, FABPs) (Moser et al., 1991), mostrou um bom nível de proteção (65%) contra a esquistossomose em animais experimentais (Tendler et al., 1996). No presente trabalho foram desenvolvidos sistemas de expressão que possibilitará a produção da proteína Sm14 em larga escala em E.coli. Com o intuito de conhecer a estrutura do gene da proteína Sm14, foi clonado um fragmento de DNA genômico de S. mansoni que contém a seqüência codificante da proteína Sm14. Como os outros membros da família gênica das FABP, o gene para a proteína Sm14 contém quatro \"exons\" separados por três \"introns\" de 674, 585 e 42 bp. Esta é a primeira descrição da estrutura gênica de um membro das FABP correspondente a um helminto. A Sm14 é uma proteína que pode ser potencialmente usada como vacina. Estudamos a existência de polimorfismo em duas linhagens de S. mansoni endêmicas do Brasil: LE e BH. Para a análise de polimorfismo, a ORF correspondente à proteína Sm14 foi amplificada por RT-PCR do RNA total de vermes adultos de S. mansoni. Os produtos de amplificação independentes foram clonados no vetor pGEM-T e seqüenciados. As análises de seqüências mostraram duas isoformas principais para a proteína Sm14: Sm14-M20, com seqüência idêntica a proteína Sm14 previamente reportada para a linhagem de Puerto Rico de S. mansoni (Moser et AL., 1991), e Sm14-T20, onde o códon da Met20 (ATG) mudou para o códon de Thr (ACG) (polimorfismo M20T). Dois clones mostraram uma deleção de seqüência de aminoácidos correspondente ao \"exon\" 3 inteiro (clones ΔExon3), gerada por \"splicing\" alternativo. As outras trocas observadas acontecem em posições onde os aminoácidos são menos conservados e estão representados apenas por um único clone que podem ter sido obtidas por mutagênese na PCR. A metionina correspondente à posição 20 na Sm14 é altamente conservada nas FABP dos mais diversos organismos,e não se tem nenhuma outra proteína com treonina nesta posição. Para o estudo da estrutura e função destas isoformas, os cDNAs correspondentes foram subclonados no vetor pAE (desenvolvido no nosso laboratório), assim como o mutante M20A (Sm14-A20) construído para efeitos de comparação. A estabilidade e estrutura das proteínas recombinantes purificadas foram caracterizadas por dicroísmo circular (CD). A comparação da estrutura e termoestabilidade mostrou que as formas Sm14-T20 e Sm14-A20 são menos termoestáveis do que a Sm14-M20 (um ΔTm de aproximadamente 10°C). Porém, todas as formas de Sm14 foram capazes de ligar o DAUDA [ácido 11-(dansylamino) undecanoico] com a mesma afinidade. Para poder diferenciar as propriedades de ligação de ácidos graxos pelas isoformas, experiências de competição do deslocamento do DAUDA por ácidos graxos naturais, foram realizadas. A partir destes dados podemos assumir que a forma Sm14-M20 liga melhor todos os ácidos graxos naturais testados do que a forma Sm14-T20. Porém esta forma mantém a capacidade de ligar ácidos graxos, ao contrario do mutante Sm14-A20. Pode-se deduzir como resultado destas experiências que a proteína Sm14-M20 é mais estável e liga com maior afinidade os ácidos graxos naturais do que a forma Sm14-T20. Pelo visto, a proteína Sm14-T20 tem menos estrutura-β, porém, mantém a capacidade de ligar moléculas hidrofóbicas. Ainda é desconhecido o papel funcional do polimorfismo da proteína Sm14 no metabolismo dos vermes de S. mansoni. Problemas de estabilidade da proteína Sm14 recombinante, durante seu transporte e armazenamento, comprometem sua viabilidade como vacina. Com o intuito de melhorar a estabilidade desta proteína, foi feita uma mutagênese no único resíduo de cisteína presente na Sm14 na posição 62. Este resíduo é responsável pela formação de dímeros, o que é relacionado a estabilização da perda de estrutura-β e precipitação da proteína. Esta cisteína foi trocada por serina (C62S) e por valina (C62V) por mutagênese sítio dirigida, resultando nas proteínas Sm14-M20S62 e Sm14-M20V62. As formas mutantes não apresentaram maior termoestabilidade, mas a renaturação após o aquecimento a 80°C atingiu quase 100%, diferentemente das proteínas com Cys62. As proteínas com o resíduo de cisteina trocado foram as únicas formas que conservaram a estrutura de β-barril após 3 meses de armazenamento a 4°C, como mostram as análises de dicroísmo circular, sendo a forma mais estável a proteína Sm14-M20V62. Após estes estudos, a isoforma Sm14-M20 com a mutação C62V (Sm14-M20V62) mostrou-se como a melhor alternativa ao antígeno Sm14-T20 usado até agora como modelo de vacina experimental para S. mansoni. Esta indicação deve ser confirmada em ensaios de imunização e posterior desafio com cercárias de S. mansoni. / The schistosomiasis is the most important human helmintic disease in terms of morbidity and mortality. The Sm14 protein of Schistosoma mansoni belongs to the family of fatty acid-binding proteins (FABPs) (Moser et aI. , 1991) and showed a good protection level as vaccine antigen against the schistosomiasis in experimental animals (Tendler et al., 1996). In the present work were developed systems for the expression of Sm14 protein that will facilitate its large scale production in E.coli.. In order to know the gene structure of the Sm14 protein, we amplified by PCR a genomic DNA fragment of S. mansoni that contains the coding sequence for the Sm14 protein. As the other members of the FABP family, the Sm14 gene contains four exons separated by three introns of 674,585 and 42 bp, respectively. This is the first detailed description of the genomic structure for a member of FABPs corresponding to a helmint. We also studied the existence of polymorphisms within two Brazilian endemic strains of S.mansoni: LE and BH. For the polymorphism analysis, the ORF corresponding to the Sm14 protein was amplified by RT-PCR from total RNA of S. mansoni adult worms. The independent amplified products were cloned into pGEM-T vector and sequenced. The sequence analyses showed two main isoforms: Sm14-M20, with identical sequence to that previously reported Sm14 protein from the Puerto Rican strain of S. mansoni (Moser et al., 1991), and Sm14-T20, where the codon for Met20 (ATG) was changed for the Thr codon (ACG) (M20T polymorphism). Two clones showed the same amino acid sequence deletion corresponding to the whole third exon (ΔExon3 clones), generated by alternative splicing. The other observed changes occurred in positions where the amino acids were less conserved and were just represented by only one clone that could be obtained by PCR mutagenesis. The methionine corresponding to the position 20 in Sm14 is highly conserved among FABPs and no other related protein has threonin in this position. To study the structure and function of these amino acid in the isoforms, the corresponding cDNAs were subcloned in to the pAE vector (developed in our laboratory), as well as the mutant M20A (Sm14-A20). The stability and structure of the purified recombinant proteins were characterized by circular dicroism (CD). The comparison of their structure and thermo stability showed that the forms Sm14-T20 and Sm14-A20 are less thermostable than Sm14-M20 (ΔTm around 10ºC). However, all of the Sm14 forms were capable to bind the DAUDA [11- (dansylamine) undecanoic acid] with similar affinities. To differentiate the fatty acid binding properties of Sm14 isoforms, displacement experiments of DAUDA with natural fatty acid were performed. From these data we can assume that the Sm14-M20 form binds better than the Sm14-T20 and Sm14-A20 forms of all natural fatty acid assayed. This suggests that the Sm14-20 protein is most stable and binds better the natural fatty acids than the Sm14-T20 form. Although the Sm14-T20 protein has less structure, it maintains the capacity to bind fatty acids. It is still unknown the functional role of this Sm14 protein polymorphism in the metabolism of S. mansoni worms. Stability problems of the recombinant Sm14 protein during its transport and storage, could hamper its use as vaccine. With the aim to improve the stability of this protein, it was made a mutagenese at the unique cysteine residue present in Sm14 at the position 62. This residue is responsible for the dimer formation and is related the loss of the terciary structure and precipitation of the protein. This cysteine was changed by serine (C62S) and for valine (C62V) by site directed mutagenesis, resulting in the proteins Sm14-M20S62 and Sm14-M20V62. The mutant forms did not present a higher thermal stability but the renaturation after heating at 80°C almost reached 100%, in contrast to Sm14 proteins with Cys62. These mutants conserved the β-barrel structure after 3 months of storage at 4°C, in contrast to proteins with Cys62, as shown by circular dicroism analyses. After these studies, the Sm14-M20 isoform with the C62V mutation (Sm14-M20V62) was considered the best alternative to the antigen Sm14-T20 used up to now as the model for an experimental vaccine for S. mansoni. This indication should be confirmed by immunization and posterior challenge with S. mansoni cercaria.

Les anticoagulants antivitamines K (AVKs) sont des molécules qui par inhibition de l’activation des PVKDs, empêchent ou retardent la coagulation sanguine. Aujourd’hui, le traitement par AVKs est la première cause d’accidents iatrogènes médicamenteux chez l’homme. Cependant le bénéfice par rapport au risque étant largement supérieur. Elles sont également utilisées dans le contrôle des populations de rongeurs nuisibles. Les AVKs agissent en inhibant l’enzyme VKORC1. Des phénomènes d’hypersensibilité et de résistance aux AVKs sont apparus et plusieurs mutations spontanées ont été découvertes dans le gène vkorc1. Ces mutations ont alors été associées à la résistance sans que ce lien n’ait jamais été démontré. Le travail, présenté dans ce mémoire, a pour objectif de confirmer ou d’infirmer ces liens de causalité. Cette étude a permis de démontrer la responsabilité des mutations Leu120Gln, Leu128Gln et Tyr139Phe, Ser et Cys dans l’apparition du phénotype résistant aux AVKs de 1ère génération chez le rat sauvage. Les propriétés catalytiques expliquent de plus le coût biologique associé à l’apparition de cette résistance chez certaines lignées de rats sauvages. Ainsi, les mutations en position 139 sont responsables d’un détournement de la catalyse avec production majoritaire d’hydroxyvitamine K directement éliminable par l’organisme. Chez l’homme, 29 mutations sur 30 ont été caractérisées. Alors que ces mutations ont été observées chez des patients résistants aux AVKs, la causalité de ces mutations n’a été démontrée que pour 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His). Les autres mutations ne seraient pas responsables du phénotype observé / The antivitamines K (AVKs) are molecules which can be inhibiting the activation of PVKDs, preventing or delaying the blood clotting. Today, the treatment by AVKs is the first cause of iatrogenic accidents medicated in humans. In addition, the benefits are significantly higher than the risk so they are used to control the populations of rodent pests. The AVKs are acting as inhibitor for the enzyme VKORC1. The phenomena of hypersensitivity and the resistance to AVKs have been emerged and several spontaneous mutations have been discovered in the gene vkorc1. These mutations were associated with resistance despite the fact that this link has been never been demonstrated. The objective of this work is to confirm or deny these causal links. This study helps to demonstrate the responsibility of the mutations Leu120Gln, Leu128Gln and Tyr139Phe, Ser or Cys in the emergence of the phenotype resistant to AVKs 1ST generation among the wild rat. The catalytic property explains the biological cost associated with the emergence of this resistance in some strains of wild rats. Thus, the mutations at position 139 are responsible for the misappropriation of the catalysis with majority production of hydroxyvitamine K which is directly consumable by the body. In humans, 29 mutations out of 30 have been characterized. While these mutations have been observed in patients resistant to AVKs, the causality of these mutations has been demonstrated only for 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His) and the other mutations would not be responsible for the phenotype observed

LOPAP, proteína isolada da toxina de lagartas Lonomia obliqua, possui ação ativadora de protrombina, efeito pró-coagulante e ação citoprotetora em células do endotélio humano, em cultura. Tem cadeia única com 181 resíduos de aminoácidos e 21 kDa. Sua estrutura terciária é formada por oito folhas-b fechadas em uma extremidade, mantidas juntas por pontes de hidrogênio, em formato de barril. Está classificada como pertencente ao grupo das Lipocalinas (proteínas de transporte). Neste trabalho estudou-se o LOPAP, que foi produzido recombinante em cultivo de Pichia pastoris em biorreator e purificado. Avaliou-se sua estabilidade quanto às atividades enzimática e citoprotetora, e sua estrutura secundária. Não foi detectada ativação de protrombina para o r-LOPAP obtido, mas foi observada ação citoprotetora. Considerando estes resultados e a análise de sua estrutura secundária por dicroísmo circular, concluiu-se que a proteína foi expressa com tamanho e sequência corretos, mas sem uma estrutura terciária correta, o que é determinante para a atividade enzimática. / LOPAP, a protein isolated from the toxin of Lonomia obliqua caterpillars, has prothrombin activation action, procoagulant effect and cytoprotection action in human endothelium cells culture. It has only chain with 181 amino acid residues and 21 kDa of size. Its tertiary structure is made by eight b-sheets closed at one end, hold together by hydrogen bonds, barrel-shaped. It is classified as belonging to the Lipocalin group (proteins of transport). This work studied the LOPAP, which was produced recombinant in Pichia pastoris culture in bioreactor, was purified, and it was evaluated its stability related to enzymatic and cytoprotection activities, and its secondary structure. It was not detected prothrombin activation for the r-LOPAP obtained, but it was observed a cytoprotective effect. Regarding these results and the analysis of its secondary structure, by circular dichroism, it was concluded that the protein was expressed with correct size and sequence, but without a correct tertiary structure, which is determinant for the enzymatic activity.

Plant secondary products such as flavonoids have a variety of roles in plants including UV protection, antifeedant activity, pollinator attraction, stress response, flavor, and many more. These compounds also have effects on human physiology. Glucosylation is an important modification of many flavonoids and other plant secondary products. In grapefruit, glucosylation is important in the synthesis of the bitter compound naringin and several flavonoid glucosyltransferase (GT) enzymes have been characterized from young grapefruit leaf tissue. To study structure and function of flavonoid GTs, it is necessary to isolate cDNA’s that can be cloned and manipulated. In prior work, the plant secondary product glucosyltransferase (PSPG) box was used to identify putative GT clones. We report on results from experiments to test the hypothesis that PGT clones 4 and 11 are plant secondary product GTs, specifically flavonoid GTs. Previously, PGT 4 was cloned into a bacterial expression system, however all protein was localized into inclusion bodies and GT activity could not be tested. For this work, recombinant PGT 4 and PGT 11 were transformed into yeast and the proteins expressed and screened for glucosyltransferase activity with a variety of flavonoid substrates including flavanones, flavones, and flavonols.

<p>Истраживање има фокус на хуманим ензимима из суперфамилије алдо-кето редуктаза, које имају велики метаболички значај за хомеостатско функционисање организма. Неки од чланова подфамилије 1С алдо-кето редуктаза (AKR1C) имају улогу у развоју одређених патолошких стања, као што су леукемија, тумори простате,<br />дојке и ендометријума, као и у смањивању ефекта хемотерапија. До сада није регистрован лек који директно утиче на протеине ове групе и самим тим је акценат на изналажењу специфичних лиганада (супстрата, инхибитора), који би могли да имају фармаколошку примену, али и на утврђивању везе између структуре и функције испитиваних лиганада према ензиму. Теза је имала фокус на протеину<br />AKR1C3. У овој дисертацији је представљена оптимизација ензимског есеја и испитивање потенцијалних лиганада и њиховог ефекта на ензимску активност одређених хуманих изоформи протеина из подфамилије AKR1C. Тестирана су синтетисанa стероиднa jeдињења, комерцијална једињења и биљни екстракти. Стероидни лиганди (<strong>AKR-1, -2, -3, -7, -9, -19</strong> и <strong>-22</strong>) који су показали добре инхибиторне карактеристике су детаљније описани одређеним добијеним<br />кинетичким параметрима и затим су кокристализовани са протеином и<br />кофакторм. Од 7 различитих комплекса протеина са најбољиминхибитором, за два комплекса су добијене дифракције са инхибитором и решене кристалне структуре са лигандом у везном месту и врло добром резолуцијом, <strong>AKR-7: 1.7 &Aring;, AKR -19: 1.6 &Aring;.</strong> Ови резултати представљају прве протеинске кристале чију су структуру решили истраживачи из Србије, а у научном смислу и одличну основу за даљи дизајн и тестирање једињења и кокристализације.</p> / <p>Istraživanje ima fokus na humanim enzimima iz superfamilije aldo-keto reduktaza, koje imaju veliki metabolički značaj za homeostatsko funkcionisanje organizma. Neki od članova podfamilije 1S aldo-keto reduktaza (AKR1C) imaju ulogu u razvoju određenih patoloških stanja, kao što su leukemija, tumori prostate,<br />dojke i endometrijuma, kao i u smanjivanju efekta hemoterapija. Do sada nije registrovan lek koji direktno utiče na proteine ove grupe i samim tim je akcenat na iznalaženju specifičnih liganada (supstrata, inhibitora), koji bi mogli da imaju farmakološku primenu, ali i na utvrđivanju veze između strukture i funkcije ispitivanih liganada prema enzimu. Teza je imala fokus na proteinu<br />AKR1C3. U ovoj disertaciji je predstavljena optimizacija enzimskog eseja i ispitivanje potencijalnih liganada i njihovog efekta na enzimsku aktivnost određenih humanih izoformi proteina iz podfamilije AKR1C. Testirana su sintetisana steroidna jedinjenja, komercijalna jedinjenja i biljni ekstrakti. Steroidni ligandi (<strong>AKR-1, -2, -3, -7, -9, -19</strong> i <strong>-22</strong>) koji su pokazali dobre inhibitorne karakteristike su detaljnije opisani određenim dobijenim<br />kinetičkim parametrima i zatim su kokristalizovani sa proteinom i<br />kofaktorm. Od 7 različitih kompleksa proteina sa najboljiminhibitorom, za dva kompleksa su dobijene difrakcije sa inhibitorom i rešene kristalne strukture sa ligandom u veznom mestu i vrlo dobrom rezolucijom, <strong>AKR-7: 1.7 &Aring;, AKR -19: 1.6 &Aring;.</strong> Ovi rezultati predstavljaju prve proteinske kristale čiju su strukturu rešili istraživači iz Srbije, a u naučnom smislu i odličnu osnovu za dalji dizajn i testiranje jedinjenja i kokristalizacije.</p> / <p>This research focuses on human enzymes of the aldo-keto reductase superfamily, whose functions have a significant metabolic impact on organism homeostasis. Some members of the 1C aldo-keto reductase (AKR1C) subfamily play role in the development of specific pathological conditions, such as leukaemia, prostate cancer, breast cancer and endometrial cancer, as well as reducing the effectivness of chemotherapy. However, currently there are no approved and registered drugs that directly affect proteins from this subfamily. Therefore our main aim was to screen for specific ligands (substrates, inhibitors) with potential pharmacological applications, and to establish structure-activity relationships for these ligands and enzymes. This thesis mainly focuses on isoform AKR1C3. In this dissertation, optimization of an enzymatic assay and testing of potential&nbsp; ligands and their effects on the enzymatic<br />activity of specific human isoforms of proteins from subfamily AKR1C are presented. Tested ligands include synthetic steroidal compounds, commercial compounds and plant extracts. Steroid compounds, <strong>AKR-1, -2, -3, -7, -9, -19</strong> and -<strong>22</strong>, were found to be&nbsp;&nbsp; good inhibitors of AKR1C3, and further kinetic studies were conducted. Finally, cocrystalization of protein AKR1C3 with cofactor and these inhibitors was accomplished. From 7 different complexes of protein with inhibitors, two structures were solved to very high resolution, <strong>AKR-7: 1.7 &Aring;, AKR -19: 1.6 &Aring;</strong>. These results represent the first protein crystal structures solved by researchers from Serbia, and&nbsp; results provide an excellent basis for further design and testing of new inhibitors.</p>

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LOPAP, proteína isolada da toxina de lagartas Lonomia obliqua, possui ação ativadora de protrombina, efeito pró-coagulante e ação citoprotetora em células do endotélio humano, em cultura. Tem cadeia única com 181 resíduos de aminoácidos e 21 kDa. Sua estrutura terciária é formada por oito folhas-b fechadas em uma extremidade, mantidas juntas por pontes de hidrogênio, em formato de barril. Está classificada como pertencente ao grupo das Lipocalinas (proteínas de transporte). Neste trabalho estudou-se o LOPAP, que foi produzido recombinante em cultivo de Pichia pastoris em biorreator e purificado. Avaliou-se sua estabilidade quanto às atividades enzimática e citoprotetora, e sua estrutura secundária. Não foi detectada ativação de protrombina para o r-LOPAP obtido, mas foi observada ação citoprotetora. Considerando estes resultados e a análise de sua estrutura secundária por dicroísmo circular, concluiu-se que a proteína foi expressa com tamanho e sequência corretos, mas sem uma estrutura terciária correta, o que é determinante para a atividade enzimática. / LOPAP, a protein isolated from the toxin of Lonomia obliqua caterpillars, has prothrombin activation action, procoagulant effect and cytoprotection action in human endothelium cells culture. It has only chain with 181 amino acid residues and 21 kDa of size. Its tertiary structure is made by eight b-sheets closed at one end, hold together by hydrogen bonds, barrel-shaped. It is classified as belonging to the Lipocalin group (proteins of transport). This work studied the LOPAP, which was produced recombinant in Pichia pastoris culture in bioreactor, was purified, and it was evaluated its stability related to enzymatic and cytoprotection activities, and its secondary structure. It was not detected prothrombin activation for the r-LOPAP obtained, but it was observed a cytoprotective effect. Regarding these results and the analysis of its secondary structure, by circular dichroism, it was concluded that the protein was expressed with correct size and sequence, but without a correct tertiary structure, which is determinant for the enzymatic activity.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_paula_finger.pdf: 729110 bytes, checksum: fe15bb22f0abb92bf1b2938fd6dcdfc9 (MD5) Previous issue date: 2011-12-19 / The chickens infectious bronchitis (IB) is a highly contagious viral disease which causes predominantly respiratory lesions manifested clinically and invariably by sneezing and tracheo-bronchial rales, which may lead to more severe signs, with a decrease in fertility and reduction of eggs production. The infectious bronchitis virus (IBV) encodes four major structural proteins: N (nucleocapsid protein), S (spike protein), E (envelope protein) and M (membrane protein) being the S protein is cleaved into S1 and S2. The 1 subunit (S1) is found exposed in the viral envelope, which makes it an important or main inducer of neutralizing antibodies against the IBV, the main target for the host s immune system. The variations in two regions of the envelope s S1 subunit, called hypervariables regions, may originate to new serotypes. The IBV s mutation and recombination capacity and the selection pressure exerted by the prolonged use of live vaccines contribute to the appearance of a wide variety of serotypes and subtypes of IBV. The objective of this study was to express, in Pichia pastoris, the gene that encodes the surface protein S1 of IBV strain M41 and, in Escherichia coli, to express the S1 of the synthetic gene designed from consensus sequences of national and international field samples, as an interesting alternative for the production of antigen that can be used for monitoring vaccination of birds and also an antigen that is suitable for the use in serological diagnostic. The cloning and expression of glycoprotein S1 in both heterologous expression systems was successfully performed. The process of expression using E. coli was simple and quick when compared to the use of P. pastoris. The P. pastoris was able to express the entire S1; however, it showed difficulty in secreting the glycoprotein. The results will be evaluated for use in immunodiagnostic kit for monitoring the disease in poultry, being more affordable than the ones existing currently. / A bronquite infecciosa das galinhas (IB) é uma enfermidade viral altamente contagiosa que causa predominantemente lesões respiratórias que se manifestam clinicamente e invariavelmente por espirros e estertores tráqueo-bronquiolares, podendo levar a sinais mais severos, com diminuição na fertilidade e redução da produção de ovos. O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) codifica quatro proteínas estruturais importantes: N (proteína do nucleocapsídeo), S (proteína de superfície), E (proteína do envelope) e M (proteína da membrana), sendo a proteína S subdividida em S1 e S2. A subunidade 1 (S1) encontra-se exposta no envelope viral, o que torna-a um importante, ou principal, indutor da produção de anticorpos neutralizantes frente ao IBV, sendo o principal alvo para o sistema imune do hospedeiro. As variações em duas regiões da subunidade S1 do envelope, chamadas regiões hipervariáveis, podem dar origem a novos sorotipos. A capacidade de mutação e recombinação de IBV e a pressão de seleção exercida pelo uso prolongado de vacinas vivas contribuem para o aparecimento de uma grande variedade de sorotipos e subtipos de IBV. O objetivo deste trabalho foi expressar em Pichia pastoris o gene que codifica a proteína de superfície S1 da estirpe M41 do IBV e, em Escherichia coli, expressar a S1 de um gene sintético elaborado a partir de sequências consenso de amostras de campo nacionais e internacionais, como uma alternativa interessante para a produção de antígeno que possa ser utilizado para monitoramento vacinal das aves e também um antígeno que seja adequado para utilização em diagnóstico sorológico. A clonagem e a expressão da glicoproteína S1 em ambos os sistemas heterólogos de expressão foi realizada com sucesso. O processo de expressão usando E. coli foi rápido e simples quando comparado ao uso da P. pastoris. A P. pastoris foi capaz de expressar a S1 inteira, porém, apresentou dificuldade em secretar a glicoproteína. Os resultados obtidos deverão ser avaliados para uso em Kit de imunodiagnóstico para monitoramento da enfermidade na avicultura, sendo de custo mais acessível do que os existentes no mercado.