O tecido muscular tem uma alta capacidade de regeneração após lesão, que está diretamente ligada à presença de células satélites (SCs). Essas células são as principais células-tronco do músculo e também têm um papel fundamental no desenvolvimento muscular na embriogênese. Embora quiescente nos músculos adultos normais, as SCs podem ser ativadas por sinais específicos após lesão muscular. Em doenças caracterizadas por processo de degeneração crônica, como distrofias musculares, as SCs são constantemente ativadas, e esta condição pode levar à depleção do pool de SCs e consequente falha no processo regenerativo. Nós estudamos as SCs musculares nas linhagens distróficas murinas DMDmdx, Largemyd, DMDmdx/Largemyd, em comparação a camundongos normais, com o principal objetivo de avaliar o comportamento das SCs em músculos distróficos com diferentes graus de degeneração histopatológica. A expressão de genes e proteínas de fatores de transcrição relacionados a SCs foram estudadas no músculo, e os resultados foram comparados com as características histopatológicas de regeneração e degeneração e estado de proliferação de células musculares. Nossos resultados mostraram que o músculo distrófico mantém seu pool de células satélites, expressando PAX7, um importante fator muscular para autorrenovação do pool de SCs, em níveis semelhantes em todas as linhagens distróficas e controle normal. As células isoladas de músculo distrófico apresentaram uma maior proporção de células em proliferação, como observado pela análise dos marcadores de ciclo celular no músculo gastrocnêmio dissociado, com maior número de células na fase G2/M. A cascata de genes de regeneração é ativada no músculo distrófico, com altos níveis de expressão de fatores de regeneração muscular, como MYOD e Myogenin. O músculo distrófico mantém a capacidade de formar novas fibras, observada por um número significativo de fibras recém formadas, que expressam dMHC, em todas as linhagens analisadas. No entanto, essas novas fibras mostram características de maturação incompleta, como tamanho pequeno e pouca variação em seu calibre, que pode ser determinante para sua disfunção. A degeneração muscular é intensa apesar da regeneração, com infiltração significativa de tecido conjuntivo em camundongos distróficos. Em conclusão, nossos achados sugerem que os músculos distróficos, independentemente do grau de degeneração, mantêm o pool de células satélites com capacidade proliferativa e estão prontos para responder aos estímulos regenerativos. Por outro lado, a maturação dessas novas fibras é incompleta e não previne a degeneração do músculo / Muscle tissue has a high regeneration capacity after injury, which is directly linked to satellite cells (SCs). These cells are the main stem cells of the muscle and also have a key role in muscle development in embryogenesis. Although quiescent in normal adult muscles, SCs can be activated by specific signals upon muscle injury. In diseases characterized by chronic degeneration process, such as muscular dystrophies, the SCs are constantly activated, leading to depletion of the SC pool and consequent failure of the regenerative process. We studied muscle SCs in the mouse dystrophic strains DMDmdx, Largemyd, DMDmdx/Largemyd, comparing to wild-type mice, with the main objective to evaluate SCs behavior in dystrophic muscles with different degrees of histopathological degeneration. Gene and protein expression of transcription factors related to SCs were studied in the muscle, and the results were compared to regenerating and degenerating histopathologic pattern and proliferative state of muscle cells. Our results showed that the dystrophic muscle retains its satellite cells pool, expressing PAX7, an important muscle factor for self-renewal of the SCs pool, at similar levels in all dystrophic strains and wild-type. Dystrophic muscle single cells presented a higher proportion of proliferating cells, as observed by the analysis of cell cycle markers in dissociated gastrocnemius muscle, with a greater number of cells in the G2/M phase. The cascade of regeneration genes is activated in the dystrophic muscle, with high levels of expression of muscle regenerating factors, such as MYOD and Myogenin. Dystrophic muscle retains the ability to form new fibers, as observed by a significant number of new fibers expressing dMHC in all dystrophic strains. However, these new fibers show incomplete maturation characteristics, such as small size and no variation in fiber caliber, which could be determinant for its dysfunction. Muscle degeneration is intense in spite of regeneration, with significant more connective tissue infiltration in dystrophic mice than wild-typemice. In conclusion, our findings suggest that dystrophic muscles, independently of the degree of degeneration, retain the pool of satellite cells with proliferating capacity and ready to respond to regenerating stimuli. On the other hand, the maturation of these new fibers is incomplete and do not prevent the degeneration of the muscle

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2012-09-21T20:01:08Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_BloqueioAtividadeNitrergica.pdf: 2617475 bytes, checksum: 1e94bbc47037e73511cc9924c4f6d175 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2012-09-28T17:38:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_BloqueioAtividadeNitrergica.pdf: 2617475 bytes, checksum: 1e94bbc47037e73511cc9924c4f6d175 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-28T17:38:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_BloqueioAtividadeNitrergica.pdf: 2617475 bytes, checksum: 1e94bbc47037e73511cc9924c4f6d175 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A atrofia é uma resposta imediata do músculo em situações de tensão e carga reduzida e caracteriza-se por mudanças morfológicas, aumento da proteólise muscular, perda de massa e redução da área da fibra que estão implicadas em déficits funcionais, afetando assim a qualidade de vida dos indivíduos. Rupturas tendíneas ocasionam atrofia muscular devido à intrínseca relação funcional existente entre ambas as estruturas, músculos-tendões. Considerando a injúria tendínea, trabalho prévio do nosso grupo identificou que a inibição da síntese de óxido nítrico localmente a injúria acelerou a recuperação histológica no tendão e a melhora funcional em animais tenotomizados. Desta forma, a proposta do trabalho é avaliar os efeitos da inibição nitrérgica local no tendão em relação ao padrão de regeneração muscular. Portanto, para gerar atrofia muscular esquelética, o trabalho utiliza o modelo experimental de ruptura do tendão calcâneo com posterior sutura. Os grupos foram divididos em controle, ruptura, ruptura+veículo (Salina 0,9%) e ruptura+L-nitro-arginina-metil-éster (L-NAME, 5mM). As amostras foram coletadas 14 e 21 dias seguintes ao procedimento cirúrgico experimental. Objetivando avaliar a dosagem de proteínas, o método de Bradford foi utilizado. As amostras também foram reservadas para processamento histológico qualitativo e quantitativo da área da fibra muscular e presença de lesões de núcleo central. Assim como no trabalho prévio de nosso grupo, acreditamos que a ação da droga restringiu-se ao local, pois não ocasionou fortes influências em relação ao peso corporal dos animais, que foi medido nos dias 0, 7, 14 e 21. O grupo tratado com L-NAME apresentou diminuição significativa no número de lesões de núcleo central no 14º dia pós-operatório e aumento nos níveis de proteína e área da fibra no 21º dia. Em conjunto, nossos resultados sugerem que houve efeito benéfico da inibição local da NOS após a ruptura com relação à atenuação da atrofia, contribuindo para acelerar a regeneração muscular. / Muscle atrophy is an immediate response of muscle under both situations of reduced tension and unloading. It is characterized by morphological changes, increase in muscular proteolysis, loss of mass and decrease in fiber area which are implicated in functional deficits, affecting the life quality of individuals. Tendon ruptures induce muscle atrophy due to intrinsic functional connection between both structures. Our previous work has shown that local inhibition of nitric oxide synthesis accelerated histological recovery in tendon and functional improvement in tenotomized animals. The present study was undertaken in order to evaluate the effects of local nitrergic inhibition on pattern of skeletal muscle regeneration after tenotomy. Skeletal muscle atrophy was induced by experimental rupture of the calcaneal tendon followed by suture. Animals were divided in the following groups, control, rupture, rupture + vehicle (0.9 % Saline) and rupture + L-nitroarginine methyl ester (5 mM L-NAME). Muscle samples were obtained 14 and 21 days after experimental surgical procedure. Total protein was measured by Bradford method. Samples were also used to qualitative and quantitative histological processing to determination of muscle fiber area and central core lesion. Animals were weighed at 0, 7, 14 and 21 days after surgery. Animals showed no significant differences in body weights, suggesting that drug had a local action. Group treated with L-NAME showed significant decrease in number of central core lesions at 14th postoperative day and increase in protein levels and fiber area at 21th day. Taken together our results suggest that local NOS inhibition had a beneficial effect after tendon rupture with regard to attenuation of atrophy, contributing for acceleration of muscle regeneration.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:19:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1843.pdf: 1192914 bytes, checksum: 124690357d5fd2c475721de4dd0a5c76 (MD5) Previous issue date: 2008-02-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / As lesões musculares são bastante comuns na prática esportiva e na reabilitação ortopédica. A terapia laser de baixa intensidade (TBLI) apresenta bons resultados no tratamento de diferentes afecções que acometem o tecido muscular esquelético, entretanto a fluência utilizada neste tratamento ainda é controversa. Este estudo tem como objetivo verificar os efeitos de diferentes fluências do laser de λ= 830nm no processo de regeneração muscular. Foram utilizados ratos machos Wistar, distribuídos em 8 grupos de 7 animais cada: grupo controle (C); grupos em que os músculos tibial anterior direito (TAD) foram apenas irradiados com laser diodo (λ= 830nm) com fluência de 4J/cm 2 (4J), 8J/cm 2 (8J) e 16J/cm2 (16J); grupo lesão (CL), no qual o músculo foi submetidos à criolesão; grupos em que os músculos TAD foram submetidos à criolesão e tratados com laser diodo (λ= 830nm) com fluência de 4J/cm 2 (L6J), 8J/cm 2 (L8J), 16J/cm2 (L16J). A irradiação teve início 24horas após a lesão por 5 dias consecutivos de forma pontual, sobre a área de lesão. No sexto dia após a lesão, os animais foram eutanaziados. O sangue foi coletado para avaliação dos níveis plasmáticos de NOx-, através da técnica de Griess. A avaliação muscular contou com análises histológicas da área de lesão (Hematolina e Eosina e Fosfatase Ácida). Além disso, a atividadade da COX-2 foi analisada pelas técnicas de Biotin Switch e a atividade e expressão protéica de MMP-2 por técnica de Zimografia e Western Blotting, respectivamente. Os resultados mostraram que houve uma diminuição da área de lesão conforme aumento da fluência do laser (8J/cm2 e 16J/cm2); um aumento nos níveis plasmáticos de NOx- em todos grupos lesados e uma diminuição apenas no grupo L16J em relação aos grupos lesados; a COX-2 foi ativada apenas nos grupos CL e L4J; a atividade da MMP-2 aumentou em todos grupos lesados e a expressão protéica aumentou nos grupos L8J e L16J. Conjuntamente os resultados permitem concluir que as fluências de 8J/cm2 e 16J/cm2 foram as que apresentaram um melhor desempenho na TLBI nos processos que envolvem regeneração do músculo esquelético de ratos. Este estudo trouxe dados importantes para o uso clínico, pois confrontou variáveis importantes como o comportamento de diferentes fluências no processo de regeneração muscular, proporcionando verificar um protocolo de aplicação mais seguro e eficaz.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseACA.pdf: 1948849 bytes, checksum: 00677b36766e019e8a7e13bd7b288172 (MD5) Previous issue date: 2004-03-11 / The Low Intensity Laser Therapy (LILT) constitutes one of the resources most used by physical therapists, with the goal of stimulating the process of repairing the skeleton muscle tissue. On the other hand, the intense utilization, its respective action mechanisms and therapeutic effectiveness are not scientifically proved. Based on this, we elaborated the present study aiming to investigate the influence of the LILT, at wavelengths (λ) usually used at clinical practices (670, 685 and 830 nm), on the function of the Myogenic Precursor Cells (MPCs), directly responsible for the tissue regeneration process. The beginning phase was carried out throughout in vitro experiments, determining the alterations started by radiations over the proliferation ability and the cellular differentiation. The MPCs used were in the second passage, after had been extracted from four days old Wistar rats. To analyze the proliferation, it was elaborated, for each λ, a dose-response data curve including the control group constituted of non-radiated cells, and the irradiated groups with doses of 0.3; 0.6; 0.9; 1.2; and 1.5 J/cm2. This procedure was carried out with the cells under the influence of 5 or 10% of fetal bovine serum (FBS). The dose demonstrating the highest effectiveness on the cellular proliferation in each radiation, was used to establish the influence on the process of cellular differentiation, and investigated throughout the analysis of the expression of the genes related to the isoforms IIa and IIx of the myosin heavy chain (MHC). The final phase of the study was pointed towards the radiation action evaluation, at the same dose parameters used before, on the muscle regeneration process in vivo, after induced cryoscopy lesion at the Tibialis anterior muscles of adults Wistar rats. There were evaluations of the histological, histochemical aspects for the Succinic Dehydrogenase enzyme (SDH) and the activity of the Lactate Dehydrogenase enzymes (LDH) and Citrate Sintase (CS). The outcomes demonstrated that the radiation at λ of 670, 685 and 830 nm promoted an increase of 56.8, 70.6 and 84.8 % on the proliferate ability of the PMCs. These values were achieved with the 1.2, 0.6 and 0.3 J/cm2 doses respectively, and with the cells under the influence of 5% of FBS. The highest concentration of serum (10% of FBS) determined a less pronounced bio-stimulating effect, rising only 13.6, 17.5 and 10.9 %, respectively. In relation to the MHC isoforms expression rate, it showed that there was a significant fall of the IIa isoform, due to the action of the 685 nm, and an increase of the IIx isoform, due to the action of the 685 and 830 nm radiations, in relation to the non-radiated cells rate. By means of in vivo analysis, it was possible to demonstrate the ability of radiation at λ of 685 and 830 nm on increasing DHL enzymes and CS during the muscle regeneration process. Therefore, according to the outcomes it is allowed to attribute to the LILT an ability λ and dose-dependent of influencing the proliferation function and the metabolism of the MPCs. It was not possible to infer its effect on the cellular differentiation process, because of the inverted effect on the MHC isoforms expression, though. / A terapia LASER de baixa intensidade (TLBI) constitui um dos recursos mais utilizados pelos fisioterapeutas com o intuito de estimular o processo de reparo do tecido muscular esquelético. Em contrapartida à intensa utilização, seus respectivos mecanismos de ação e sua efetividade terapêutica não se encontram cientificamente comprovados. Com base nesse contexto, elaboramos a presente pesquisa com o objetivo de investigar a influência exercida pela TLBI, nos comprimentos de onda (λ) freqüentemente utilizados na prática clínica (670, 685 e 830 nm), sob a função das células precursoras miogênicas (CPMs), responsáveis diretas pelo processo de regeneração tecidual. A fase inicial foi realizada por meio de experimentos in vitro, determinando as alterações desencadeadas pelas radiações sobre a capacidade de proliferação e diferenciação celular. As CPMs utilizadas encontravam-se na 2a passagem, após terem sido extraídas dos músculos de ratos Wistar com 4 dias após o nascimento. Para analisar a proliferação foi elaborada, para cada λ, uma curva doseresposta compreendendo o grupo controle, constituído por células não irradiadas, e os grupos irradiados com as doses de 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 e 1.5 J/cm2. Esse procedimento foi realizado com as células sob influência de 5 ou 10 % de soro fetal bovino (SFB). A dose demonstrando a maior efetividade sobre a proliferação celular em cada radiação foi utilizada para estabelecer a influência sobre o processo de diferenciação celular, investigada por meio da análise da expressão dos genes relacionados as isoformas IIa e IIx da cadeia pesada de miosina (MHC). A fase final da pesquisa foi direcionada a avaliar a ação das radiações, nos mesmos parâmetros dosimétricos previamente utilizados, sobre o processo de regeneração muscular in vivo após criolesão induzida no músculo tibial anterior de ratos Wistar adultos. Foram avaliados os aspectos histológicos, histoquímicos para a enzima Succinato Desidrogenase (SDH) e a atividade das enzimas Lactato Desidrogenase (LDH) e Citrato Sintase (CS). Os resultados demonstraram que as radiações nos λ de 670, 685 e 830 nm proporcionaram um aumento de 56.8, 70.6 e 84.8 % na taxa de proliferação das CPMs. Esses valores foram alcançados com as respectivas doses 1.2, 0,6 e 0,3 J/cm2 e com as células sobre a influência de 5% de SFB. A maior concentração de soro determinou um efeito bioestimulante menos pronunciado, com elevação de 13.6, 17.5 e 10.9 % respectivamente. Em relação à taxa de expressão das isoformas de MHC foi demonstrado que houve uma significativa diminuição da isoforma IIa, pela ação da radiação de 685 nm, e uma elevação da isoforma IIx, pela ação das radiações de 685 e 830 nm, em relação às células não irradiadas. A análise in vivo demonstrou a capacidade das radiações nos λ de 685 e 830 nm em elevar a atividade das enzimas LDH e CS durante o processo de regeneração muscular. Conjuntamente os resultados permitem atribuir à TLBI uma capacidade λ e dose-dependente de influenciar a função proliferativa e o metabolismo das CPMs. Porém, não foi possível inferir seu efeito sobre o processo de diferenciação celular em virtude do efeito inverso sobre a expressão das isoformas de MHC.

No intuito de avaliar o papel do receptor b2-adrenérgico no processo de regeneração muscular, os músculos tibialis anterior de camundongos knockout para o adrenoceptor b2 (b2KO) foram criolesados e analisados após 1, 3, 10 e 21 dias. Análises de aspectos morfológicos e contráteis, atuação de macrófagos M1 e M2, conteúdo de AMPc e ativação de elementos da via de sinalização TGF-b/smad foram realizadas. Os músculos em regeneração dos animais b2KO apresentaram redução do calibre das fibras musculares, redução na função contrátil em 10 dias após criolesão, atenuado aumento do conteúdo de AMPc nos músculos em 10 dias após criolesão, aumento da inflamação e do número de macrófagos nos músculos em regeneração em 3 e 10 dias após lesão, predominância de macrófagos M1, diminuição da ativação de TbR-I e smad2/3 e da expressão de smad4 em 3 dias após lesão, e aumento na expressão de akirina1 em 10 dias após lesão. Nossos resultados sugerem que o adrenoceptor b2 contribui para a regulação das fases iniciais da regeneração muscular. / In this study, we investigated the role of the b2-adrenoceptor in skeletal muscle regeneration. Tibialis anterior muscles from b2-adrenoceptor knockout (b2KO) mice were cryolesioned and analysed after 1, 3, 10, and 21 days. Analysis of structural and contractile aspects, M1 and M2 macrophage profile, cAMP content, and activation of TGF-b/smad signalling elements. Regenerating muscles from b2KO mice showed diminished calibre of regenerating myofibres, decreased muscle contractile function at 10 days when compared with those from wild-type, attenuated augment in cAMP content in muscles at 10 days post-injury, increase in inflammatory process and in the number of macrophages at 3 and 10 days, prevalence of M1 macrophage phenotype, reduction in TbR-I and smad2/3 activation, and in the smad4 expression at 3 days, and an increase in akirin1 expression at 10 days in muscles from b2KO mice when compared to those from wild-type. Our data suggest that the b2-adrenoceptor contributes to the control of the initial stages of muscle regeneration.

O tecido muscular tem uma alta capacidade de regeneração após lesão, que está diretamente ligada à presença de células satélites (SCs). Essas células são as principais células-tronco do músculo e também têm um papel fundamental no desenvolvimento muscular na embriogênese. Embora quiescente nos músculos adultos normais, as SCs podem ser ativadas por sinais específicos após lesão muscular. Em doenças caracterizadas por processo de degeneração crônica, como distrofias musculares, as SCs são constantemente ativadas, e esta condição pode levar à depleção do pool de SCs e consequente falha no processo regenerativo. Nós estudamos as SCs musculares nas linhagens distróficas murinas DMDmdx, Largemyd, DMDmdx/Largemyd, em comparação a camundongos normais, com o principal objetivo de avaliar o comportamento das SCs em músculos distróficos com diferentes graus de degeneração histopatológica. A expressão de genes e proteínas de fatores de transcrição relacionados a SCs foram estudadas no músculo, e os resultados foram comparados com as características histopatológicas de regeneração e degeneração e estado de proliferação de células musculares. Nossos resultados mostraram que o músculo distrófico mantém seu pool de células satélites, expressando PAX7, um importante fator muscular para autorrenovação do pool de SCs, em níveis semelhantes em todas as linhagens distróficas e controle normal. As células isoladas de músculo distrófico apresentaram uma maior proporção de células em proliferação, como observado pela análise dos marcadores de ciclo celular no músculo gastrocnêmio dissociado, com maior número de células na fase G2/M. A cascata de genes de regeneração é ativada no músculo distrófico, com altos níveis de expressão de fatores de regeneração muscular, como MYOD e Myogenin. O músculo distrófico mantém a capacidade de formar novas fibras, observada por um número significativo de fibras recém formadas, que expressam dMHC, em todas as linhagens analisadas. No entanto, essas novas fibras mostram características de maturação incompleta, como tamanho pequeno e pouca variação em seu calibre, que pode ser determinante para sua disfunção. A degeneração muscular é intensa apesar da regeneração, com infiltração significativa de tecido conjuntivo em camundongos distróficos. Em conclusão, nossos achados sugerem que os músculos distróficos, independentemente do grau de degeneração, mantêm o pool de células satélites com capacidade proliferativa e estão prontos para responder aos estímulos regenerativos. Por outro lado, a maturação dessas novas fibras é incompleta e não previne a degeneração do músculo / Muscle tissue has a high regeneration capacity after injury, which is directly linked to satellite cells (SCs). These cells are the main stem cells of the muscle and also have a key role in muscle development in embryogenesis. Although quiescent in normal adult muscles, SCs can be activated by specific signals upon muscle injury. In diseases characterized by chronic degeneration process, such as muscular dystrophies, the SCs are constantly activated, leading to depletion of the SC pool and consequent failure of the regenerative process. We studied muscle SCs in the mouse dystrophic strains DMDmdx, Largemyd, DMDmdx/Largemyd, comparing to wild-type mice, with the main objective to evaluate SCs behavior in dystrophic muscles with different degrees of histopathological degeneration. Gene and protein expression of transcription factors related to SCs were studied in the muscle, and the results were compared to regenerating and degenerating histopathologic pattern and proliferative state of muscle cells. Our results showed that the dystrophic muscle retains its satellite cells pool, expressing PAX7, an important muscle factor for self-renewal of the SCs pool, at similar levels in all dystrophic strains and wild-type. Dystrophic muscle single cells presented a higher proportion of proliferating cells, as observed by the analysis of cell cycle markers in dissociated gastrocnemius muscle, with a greater number of cells in the G2/M phase. The cascade of regeneration genes is activated in the dystrophic muscle, with high levels of expression of muscle regenerating factors, such as MYOD and Myogenin. Dystrophic muscle retains the ability to form new fibers, as observed by a significant number of new fibers expressing dMHC in all dystrophic strains. However, these new fibers show incomplete maturation characteristics, such as small size and no variation in fiber caliber, which could be determinant for its dysfunction. Muscle degeneration is intense in spite of regeneration, with significant more connective tissue infiltration in dystrophic mice than wild-typemice. In conclusion, our findings suggest that dystrophic muscles, independently of the degree of degeneration, retain the pool of satellite cells with proliferating capacity and ready to respond to regenerating stimuli. On the other hand, the maturation of these new fibers is incomplete and do not prevent the degeneration of the muscle

O músculo esquelético é um tecido que tem a capacidade de se regenerar após lesão, seja ela patológica ou induzida. Para tanto, células musculares progenitoras, presentes no músculo adulto, atuam fundindo-se entre si, ou com as fibras musculares danificadas, para formar novas fibras. A via da macroautofagia, implicada na degradação e reciclagem de proteínas e organelas danificadas via lisossomo, é essencial para a manutenção da massa muscular, mas já foi também implicada na diferenciação e funcionamento de células progenitoras do músculo. Além disso, essa via está desregulada em diversas doenças neuromusculares, o que destaca seu papel nesse tecido. Nesse estudo, a regulação da autofagia foi investigada em diferentes situações de formação e degradação do músculo. Para estudar o processo de diferenciação muscular in vitro utilizamos um modelo de células musculares imortalizadas normais, e de paciente com miopatia ligada ao X com autofagia excessiva (XMEA). A análise dos genes e proteínas p62, BNIP3, BECLIN1, VPS34, ATG12 e LC3, além de alvos de mTOR, mostrou um padrão similar de expressão em mioblastos indiferenciados e miotubos diferenciados a partir de células controle e nas derivadas de paciente XMEA. Estes resultados sugerem que a desregulação da via autofágica relacionada à doença provavelmente surge em estágios mais avançados, como se observa em doenças de acúmulo lisossomal. A investigação da diferenciação muscular nessas células mostrou um aumento na capacidade de fusão de mioblastos XMEA, que não foi relacionado a mudanças na expressão de genes envolvidos na miogênese. Isso indica que o defeito primário relacionado a XMEA, como a deficiência da ATPase vacuolar, pode interferir no processo de diferenciação muscular. Para estudar o músculo em condições patológicas, utilizamos modelos animais para distrofias musculares que possuem distintos graus de afecção do músculo, como o DMDmdx, modelo para distrofia muscular de Duchenne, o SJL/J, modelo para distrofia muscular de cinturas tipo 2B e o Largemyd, modelo para distrofia muscular congênita 1D. Observamos que não há alterações globais na expressão de genes e proteínas da autofagia. Adicionalmente, cada modelo murino teve alterações pontuais, destacando a ausência de correlação entre o grau de degeneração do músculo e as alterações observadas na via autofágica. Por outro lado, quando uma lesão muscular é induzida em músculo normal, houve uma diminuição da expressão de todos os genes estudados, Bnip3, Beclin1, Vps34, Atg12, Lc3 e Gabarapl1, com possível acúmulo das proteínas autofágicas p62 e Beclin1. Com a recuperação do músculo, após cinco dias da lesão, a maior parte dos genes estudados teve sua expressão normalizada. Tais resultados indicam que a lesão aguda se relaciona a uma resposta drástica e recuperação rápida na via da autofagia. Em conjunto, nossos resultados mostram que a via da autofagia é diferencialmente afetada a depender do estímulo dado ao músculo, seja ele de regeneração e formação de novas células musculares ou de degeneração. Dessa forma, este estudo pode ter implicações para o desenvolvimento de terapias que tenham como alvo a via autofágica, já que indica que o momento da intervenção terapêutica pode ser importante, assim como o estímulo que levou a alterações no tecido muscular / The skeletal muscle is a tissue that has the ability to regenerate upon lesion, whether it occurs pathologically or induced. Therefore, progenitor muscle cells, present in the adult muscle, act by fusing with each other or with damaged fibers in order to recover the tissue. The macroautophagy pathway, related to degradation and recycling of proteins and damaged organelles via lysosome, is essential for the maintenance of muscle mass, and it was also implicated in the differentiation and functioning of muscle progenitor cells. Besides that, this pathway is deregulated in several neuromuscular disorders, highlighting its important role in this tissue. In this study, the autophagic regulation was investigated in distinct contexts of muscle formation and degradation. To study the muscle differentiation process in vitro, we used a model of immortalized muscle cells from both a normal control and a patient with X-linked myopathy with excessive autophagy (XMEA). The genes and proteins p62, BNIP3, BECLIN1, VPS34, ATG12, LC3 and mTOR targets showed a similar pattern of expression in both undifferentiated myoblasts and differentiated myotubes, from both control cells and XMEA patient-derived cells. This fact suggests that autophagic deregulation might arise in later stages of the disease, in a pattern observed in disorders with protein accumulation. The investigation of muscle differentiation in the studied cells showed an enhancement of the myoblast fusion capacity in XMEA cells, which was not related to changes in the expression of myogenic genes. This observation indicates that the primary defect related to the XMEA pathology, as the deficiency of the vacuolar ATPase, might interfere in the process of muscle differentiation. In order to evaluate muscle in pathological conditions, we studied animal models for muscular dystrophies that have distinct patterns of muscle affection, such as the DMDmdx, model for the Duchenne muscular dystrophy, the SJL/J, model for the limb-girdle muscle dystrophy type 2B and the Largemyd, model for the congenital muscular dystrophy type 1D. We did not find any global alterations in the expression of autophagic genes and proteins. Additionally, each animal model had discrete changes, highlighting the absence of correlation between the pattern of muscle degeneration and alterations in the autophagy pathway. On the other hand, when a lesion is induced in normal muscle, there is a decrease in the expression of all studied genes, such as Bnip3, Beclin1, Vps34, Atg12, Lc3 and Gabarapl1, with a possible accumulation of the autophagic proteins p62 and Beclin1. With muscle recovery, five days after lesion, most of the studied genes had their expression returning to normal levels. These results indicate that the acute lesion is related to a drastic response and rapid recovery of the autophagic pathway. Together, our results show that autophagy is differentially affected depending on the stimulus given to the muscle, either of regeneration and formation of new muscle cells or degeneration. In that sense, this study may have implications for the development of therapies that target autophagy, since it indicates that the time point of therapeutic interventions may be important, as well as the stimulus that led to alterations in the skeletal muscle tissue

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-27T13:42:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoTratamentoEuterpe.pdf: 1788654 bytes, checksum: e0867245790bc25fdec23f03b4ff05e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-04-03T15:23:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoTratamentoEuterpe.pdf: 1788654 bytes, checksum: e0867245790bc25fdec23f03b4ff05e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-03T15:23:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoTratamentoEuterpe.pdf: 1788654 bytes, checksum: e0867245790bc25fdec23f03b4ff05e9 (MD5) Previous issue date: 2016-09-09 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O tendão de Aquiles é o maior e mais forte tendão do corpo humano, seu uso em excesso induz o surgimento de microtraumas e ativação de vias de sinalização que levam a uma resposta inflamatória. O extrato etanólico de Euterpe Oleracea(açaí)é um produto natural extraído do fruto dessa palmeira. Apesar de evidências apontarem um efeito anti-inflamatório e antioxidante desse produto, não há dados na literatura sobre tais efeitos na lesão tendínea. Assim, o objetivo do trabalho foi investigar o efeito anti-inflamatório e pró-regenerativo do extrato etanólico de Euterpe oleracea em modelo de ruptura total do tendão de Aquiles em ratos. Esse trabalho foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa animal da instituição (CEPAE-UFPA/206-14). Os animais foram distribuídos em quatro grupos (n=24): controle; veículo (salina 0,9%); extrato de E. oleracea (extrato etanólico de Euterpe oleracea,125μg/ml) e metilprednisolona (30 mg/ml). Após os respectivos tratamentos, o tecido foi analisado em 7, 14 ou 21 dias pós-injúria (dpi) por histoquímica com hematoxilina eosina e autofluorescência do colágeno. Imunofluorescência para COX2 e mensuração dos níveis de nitrito pelo método de Griess foi realizado em 7dpi. O tratamento com o extrato de E. Oleracea acelerou a organização tecidual e melhorou a orientação das células, um efeito semelhante ao anti-inflamatório esteroidal metilprednisolona. O tratamento com o produto natural levou a um alinhamento precoce das fibras de colágeno, bem como na matriz, de modo geral, se comparado aos demais grupos, o que foi observado no 7dpi e mantido em 14 e 21 dpi. O tratamento com o extrato de E. oleracea ou metilprednisolona reduziram a marcação para COX2 se comparado ao veículo em 7 dpi. Redução nos níveis teciduais de nitrito foi observado em 7dpi nos grupos tratados com extrato de E. oleracea(20.80 ± 2.54 μm/ml) e metilprednisolona (19.40 ± 2.31 μm/ml) se comparado ao grupo veículo (29.33 ± 3.98μm/ml). O tratamento com extrato de E. oleracea melhorou o padrão de organização tecidual, reduziu a marcação para COX2 e os níveis de nitrito, sugerindo efeito anti-inflamatório e antioxidante. Nossos achados destacam que o extrato de E. oleracea representa um produto natural com potencial aplicação no reparo do tendão de Aquiles. / Achilles tendon is the largest and strongest tendon in the human body, its excessive use induces microtrauma and activation of signaling pathways that lead to an inflammatory response. The ethanolic extract of Euterpe oleracea(açaí) is a natural product extracted from the fruit of the palm tree.Although evidence suggests an anti-inflammatory and antioxidant effect of this product, there is no data in the literature about such effects on tendon lesion. The aim of this study was to investigate the anti-inflammatory and pro-regenerative effects of ethanolic extract of Euterpe oleracea in a rat model of total Achilles tendon rupture. This study was approved by the Animal Research Ethics Committee (CEPAE-UFPA/206-14). The animals were divided into four groups (n = 24): control; vehicle (0.9% saline); E. oleracea extract (125 μg/mL ethanolic extract of Euterpe oleracea) and methylprednisolone (30 mg/ml). After the respective treatments, the tissue was analyzed at 7, 14 or 21 days post-injury (dpi) by immunohistochemistry with hematoxylin/eosin and collagen autofluorescence. Immunofluorescence for COX2 and measurement of nitrite levels by Griess method were performed at 7 dpi. Treatment with E. oleracea extract accelerated tissue organization and orientation of the cells, similarly to the anti-inflammatory steroid methylprednisolone. This natural product led to an early alignment in collagen fibers as well as in the overall matrix structure when compared to the other groups, which was observed at 7 dpi and maintained at both 14 and 21 dpi. Treatment with E. oleracea extract or methylprednisolone reduced COX2 labeling in comparison to the vehicle at 7 dpi. Reduction in nitrite tissue levels was observed at 7 dpi in groups treated with E. oleracea extract (20.80 ± 2.54 μm/ml) and methylprednisolone (19.40 ± 2.31 μm/ml) compared to vehicle group (29.33 ± 3.98 μm/ml). Treatment with E. oleracea extract improved tissue organization and reduced both COX2 labeling and nitrite levels, suggesting anti-inflammatory and antioxidant effects. Our findings highlight E. oleracea extract as a natural product with potential application in Achilles tendon repair.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5282.pdf: 2759184 bytes, checksum: ddd5666e5ff979383a7a5f6cdf80a469 (MD5) Previous issue date: 2013-03-01 / Financiadora de Estudos e Projetos / Skeletal muscle injuries from sport activities are usual, but despite the inherent healing capacity of muscle tissue, this process can be impaired depending on the injury extension, what can lead to atrophy, fibroses, pain and functional recovery incomplete, increasing the risks of recurrent lesions. In addition, biophysical and biochemical resources have been studied in an attempt to enhance the muscle regeneration process, as the low level laser therapy (LLLT). Many studies have showed that this therapeutic modality stimulates positives responses during muscle healing process. Thus, two studies were performed with the aim of evaluating the effects of LLLT (InGaAlP 660 nm), with the fluences of 10 J/cm2 and 50 J/cm2, during Tibiales anterior muscle regeneration after cryolesion. Sixty three Wistar rats (3 month of age, ±300 g) were randomly divided into 3 groups: injured control group (CG) injured animals without any treatment; treated group, at 10 J/cm2 (G10) and treated group, at 50 J/cm2 (G50). Each group was divided into 3 different subgroups (n=7) and on days 7, 14 and 21 post-injury, were sacrificed. The laser irradiation was performed at a single point and started 48 hours after injury, 5 times per week (each 24 hours), followed by an interval of 48 hours. At the first study, the effects of LLLT were analyzed on the muscle regeneration related on molecular mechanisms involved at repair process. The results showed a downregulation of mRNA Cox-2 expression in all treated groups after 14 and 21 days. On day 7, both treated groups had a downregulation of mRNA Vegf expression, but had a increase after 14 and 21 days of treatment, meanly at 50 J/cm2. The mRNA MyoD expression was upregulated with the higher fluence, in all periods evaluated, and with the lower fluence the MyoD levels increased only after 21 days. The Myogenin expression was downregulated in both treated groups on day 7, and was upregulated with dose of 10 J/cm2 after 21 days. These responses suggest that LLLT can improve the skeletal muscle regeneration through the gene expression stimulation. At the second study, the effects of LLLT were evaluated during muscle regeneration, through histological and immunohistochemical aspects. The treated groups had an inflammatory process modulation after 7 days. On day 14, the treated animals, with both fluences, showed organized new muscle fibers and less granulation tissue. After 21 days of lesion, all groups had complete tissue repair. Moreover, the irradiated groups had less necrosis area at the first experimental period evaluated, and, also had more blood vases quantity after 14 and 21 days, at 50 J/cm2. The immunohistochemistry analysis showed Myogenin expression in all experimental groups after 7 and 14 days, and at day 21st; the immunoexpression was detectable in the control group and in the treated group with lower fluence. Superior MyoD expression appeared in both treated groups during all evaluated periods. Concluding, both fluencies of LLLT played positive effects on muscle repair. Such findings are fundamentals to elucidate the biological and molecular mechanisms involved in the skeletal muscle regeneration. / Lesões do sistema músculo esquelético decorrentes de atividades esportivas são comuns, porém apesar da capacidade regenerativa intrínseca do tecido muscular, este processo pode ser prejudicado de acordo com a extensão da lesão, causando atrofia, fibrose, dor e incompleta recuperação funcional, aumentando o risco de lesões recorrentes. Dentro desse contexto, recursos biofísicos e bioquímicos tem sido estudados na tentativa de acelerar o processo de regeneração muscular, como a terapia laser de baixa intensidade (LLLT). Vários estudo demonstram que esta modalidade terapêutica estimula respostas positivas durante o reparo do tecido muscular. Diante disso, foram desenvolvidos dois estudos com o objetivo de verificar os efeitos da LLLT (InGaAlP 660 nm), com as fluências de 10 J/cm2 e 50 J/cm2, durante a regeneração do músculo tibial anterior criolesionado. Sessenta e três ratos da linhagem Wistar (3 meses de idade, ±300 g) foram distribuídos randomicamente em 3 grupos: grupo controle lesado sem nenhum tratamento (GC), grupo lesado e tratado com 10 J/cm2 (G10) e grupo lesado e tratado com 50 J/cm2 (G50). Ainda, todos os grupos foram subdivididos em 3 subgrupos (n=7), onde os animais foram eutanasiados depois de 7, 14 e 21 dias da indução da lesão. A irradiação laser foi realizada em um único ponto e se iniciou 48 horas após a criolesão, 5 vezes por semana (a cada 24 horas), seguidos de um intervalo de 48 horas. No primeiro estudo, foram analisados os efeitos da LLLT na regeneração muscular em relação aos mecanismos moleculares envolvidos no processo de reparo. Os resultados demonstraram que ocorreu uma redução da expressão do RNAm do Cox-2 em todos os grupos irradiados após 14 e 21 dias. No sétimo dia, a expressão do RNAm do VEGF não aumentou nos dois grupos tratados, entretanto sua expressão aumentou depois de 14 e 21 dias de tratamento, principalmente com a fluência de 50 J/cm2. A expressão do RNAm da MyoD foi aumentada com a fluência maior, em todos os períodos analisados, e com a fluência menor apenas depois de 21 dias. A expressão da Miogenina foi reduzida em ambos os grupos tratados em 7 dias, e foram aumentadas com a fluência de 10 J/cm2 depois de 21 dias. Estes resultados sugerem que a LLLT pode melhorar a regeneração muscular através da estimulação da expressão gênica. No segundo estudo, foram avaliados os efeitos da LLLT durante a regeneração muscular, nos seus aspectos histológicos e imunohistoquímicos. Uma modulação do processo inflamatório em 7 dias foi visualizada nos grupos tratados. No 14o dia, os animais irradiados, com as duas fluências, apresentaram fibras musculares jovens organizadas e pouco tecido de granulação. Depois de 21 dias de lesão, todos os grupos apresentaram tecido muscular organizado similar ao músculo esquelético sem lesão. Além disso, uma menor área de necrose no primeiro período experimental foi observada nos grupo tratados e uma maior quantidade de vasos sanguíneos depois de 14 e 21 dias foi visualizada no grupo tratado com a fluência de 50 J/cm2. A imunohistoquímica demonstrou expressão da Miogenina em todos os grupos experimentais depois de 7 e 14 dias, e no 21o dia, no grupo controle e no grupo tratado com a menor fluência. Maior expressão da MyoD esteve presente nos grupos tratados em todos os períodos avaliados. Concluindo, as duas fluências da LLLT desempenharam efeitos positivos durante o reparo muscular. Tais resultados são fundamentais na elucidação dos mecanismos biológicos e moleculares envolvidos na regeneração muscular.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2518.pdf: 1232652 bytes, checksum: e57f0134a52e7bb7bc66a121273dc146 (MD5) Previous issue date: 2009-03-13 / Financiadora de Estudos e Projetos / The elderly still go through physical changes, especially musculoskeletal disorders such as sarcopenia, changes in central and peripheral nervous system, blood hypoperfusion, regenerative changes contributing to atrophy and muscle weakness, undermining the activities of daily living (AVL). The regenerative process happens about the determination, proliferation and differentiation of satellite cells through activation of muscle-specific genetic program, which is regulated by specific transcription factors, known as myogenic regulatory factors (MRFs). But in the elderly because of changes in skeletal muscle-activation of MRFs are inefficient, hindering the process of regeneration. However, recent findings showed very promising results of low laser therapy (LLT) in muscle regeneration, but the effects of this therapy when associated with aging are still unknown. This project aims to evaluate the effects of (LLT), &#955; = 830nm, the tibial muscle of aged rats after cryolesioning. We used 56 male Wistar rats randomly divided into 4 groups (n = 7) of young rats from 3 months to 4 groups (n = 7) of aged rats, 10 months, divided into control groups (C), groups in which the right Tibialis anterior muscle (TA) was only irradiated (I), groups in which the AT was submitted to cryolesioning (CL) and groups where the TA muscle cryolesioning and was subjected to irradiation (LI). Treatment with the laser model of the DMC, Class 3B, energy of 0.87 J, was performed every 24 h for five consecutive days, with the first application 24 hours after induction of injury. On the sixth day after injury, with the animals anesthetized and the TA muscle was carefully dissected and removed, and then the animals were euthanaziated. We carried out histological analysis of the area of the lesion with toluidine blue, and counting of blood capillaries with hematoxylin-eosin. Through analysis by RT-PCR, it was possible to analyze the expression of MyoD and VEGF genes. The results showed that there was significant increase (p <0.05) of the expression of MyoD gene, VEGF gene and capillary blood count of more prominent in elderly victims and irradiated groups than in the young. Probably the LLT increased the maturation of satellite cells into myoblasts and miotubos, enhancing the regenerative process of aged rats irradiated. / Os idosos passam por continuas mudanças físicas, principalmente músculo-esqueléticas, como sarcopenia, alterações no sistema nervoso central e periférico, hipoperfusão sanguínea, alterações regenerativas contribuindo para atrofia e fraqueza muscular, prejudicando as atividades de vida diárias (AVDs). O processo regenerativo ocorre pela determinação, proliferação, diferenciação das células satélites através da ativação do programa genético músculo-específico, que é regulado por fatores de transcrição específicos, conhecidos como fatores regulatórios miogênicos (FRMs). Porém no idoso por causa das alterações músculo-esqueléticas a ativação dos FRMs são ineficientes, prejudicando o processo de regeneração. Entretanto, recentes achados mostraram resultados muito promissores da laser terapia de baixa intensidade (LTBI) na regeneração muscular, mas os efeitos desta terapia quando associado ao envelhecimento continuam desconhecidos. Este projeto tem por objetivo avaliar os efeitos da (LTBI), &#955;=830nm, no músculo tibial de ratos idosos após criolesão. Foram utilizados 56 ratos machos Wistar, divididos aleatoriamente em 4 grupos (n=7) de ratos jovens de 3 meses e 4 grupos (n=7) de ratos idosos de 10 meses; subdivididos em: grupos controle (C), grupos em que o músculo tibial anterior direito (TAD) foi apenas irradiado (I), grupos em que o TAD foi submetido à criolesão (CL) e grupos onde o TAD foi submetido à criolesão e a irradiação (LI). O tratamento com o laser modelo da DMC, classe 3B, energia de 0,87 J, foi realizado a cada 24 h, durante cinco dias consecutivos, com a primeira aplicação 24 horas após a indução da lesão. No sexto dia pós lesão, com os animais vivos e anestesiados, o músculo TAD foi cuidadosamente dissecado e retirado, e logo depois os animais foram eutanaziados. Realizou-se analises histológicas da área da lesão com Azul de Toluidina e contagem dos capilares sanguíneos com Hematoxilina-eosina. Por meio da análise por RT-PCR, foi possível analisar a expressão dos genes MyoD e VEGF. Os resultados mostraram que houve aumento significativo (p<0,05) da expressão gênica da MyoD, do VEGF e da contagem de capilares sanguíneos mais proeminentes nos grupos idosos lesados e irradiados do que no grupo jovem. Provavelmente a LTBI aumentou a maturação das células satélites em mioblastos e miotubos, melhorando o processo regenerativo dos ratos idosos irradiados.