O uso de células-tronco mesenquimais (CTMs) na medicina regenerativa, principalmente quando associado ao sistema nervoso, requer alternativas em relação à via de aplicação. A associação da terapia celular com a nanotecnologia para uso em neurociências, desenvolvida nesse trabalho, é uma abordagem inovadora no Brasil. Dessa forma, as matrizes de nanofibras, produzidas pela técnica de electrospinning (ES), funcionam como suportes para a proliferação e diferenciação celular proporcionando uma alternativa para a reconstituição do tecido lesado. O processo de regeneração do tecido neural pode ser aperfeiçoado com a liberação controlada de fatores neurotróficos, através do uso dessas matrizes. Entre esses fatores, encontra-se o NGF (Nerve Growth Factor – fator de crescimento neural), o qual exerce um papel central no desenvolvimento, manutenção e sobrevivência dos neurônios. Além disso, características de superfície das matrizes, como o alinhamento de nanofibras, podem estimular a diferencição neural. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver matrizes de nanofibras alinhadas e não alinhadas com e sem o NGF incorporado, através da técnica ES de emulsão. Além disso, objetivou-se avaliar o comportamento celular, bem como a capacidade de diferenciação neural das CTMs, sobre as estruturas tridimensionais desenvolvidas. As CTMs foram extraídas da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Quatro grupos de scaffolds foram desenvolvidos, caracterizados e avaliados: scaffolds com fibras randomizadas e com fibras alinhadas, sendo cada tipo com e sem o NGF incorporado. As análises físico-químicas realizadas foram morfologia, diâmetro das fibras e degradabilidade do biomaterial. Os parâmetros biológicos avaliados foram morfologia, adesão, viabilidade e proliferação celular, bem como a citotoxicidade frente ao biomaterial. A diferenciação neural foi quantificada através da expressão dos genes neurais nestina, β- III tubulina e NSE (enolase específica para neurônios). As matrizes de nanofibras produzidas mostraram-se satisfatórias para o cultivo de CTMs, mimetizando a estrutura física da matriz extracelular (MEC). Além disso, a técnica utilizada permitiu a obtenção de estruturas com nanofibras alinhadas e randomizadas. As CTMs cultivadas nas matrizes foram capazes de aderir e proliferar com vantagens para adesão nas matrizes alinhadas contendo o NGF, em relação às matrizes alinhadas controle. As estruturas produzidas não apresentaram características tóxicas permitindo que as CTMs mantivessem a viabilidade ao longo do tempo. A avaliação da diferenciação neural das CTMs indicou que todos os grupos de matrizes foram capazes de promover o aumento da expressão de genes neurais. Tal capacidade foi observada tanto para CTMs cultivadas sobre as matrizes com o meio controle quanto com o meio de indução neural. Esses achados mostram a possível influência das características químicas e topográficas providas pelos substratos produzidos. As características da matriz artificial permitem que as CTMs respondam adequadamente ao microambiente e expressem genes neurais, podendo auxiliar na regeneração tecidual quando aplicada em lesões do sistema nervoso. / The use of mesenchymal stem cells (MSCs) in regenerative medicine, particularly when associated with the nervous system, requires alternatives with respect to cell application methods. The association of cellular therapy with nanotechnology for use in neuroscience, developed with this work, is an innovative approach in Brazil. Scaffolds produced by electrospinning (ES) technique act as supports for cell proliferation and differentiation, providing an alternative to reconstitute the damaged tissue. The process of neural tissue regeneration can be improved through the controlled release of neurotrophic factors from the scaffolds. Among these factors, NGF (Nerve Growth Factor) plays a central role in the development, maintenance and survival of neurons. Furthermore, surface characteristics of nanofibers, such as alignment, can stimulate neural differentiation. The main objective of this study was to develop aligned nanofiber scaffolds and random nanofiber scaffolds with and without NGF incorporated through emulsion ES. In addition it was aimed to characterize the physico-chemical properties of the scaffolds, related to the extracellular matrix (ECM) and evaluate the cell behavior, as well as the neural differentiation on these three-dimensional devices. The MSCs were extracted from the dental pulp of human exfoliated deciduous teeth. Four groups of scaffolds were developed, characterized and evaluated: scaffolds with randomized fibers and with aligned fibers, each type with and without NGF incorporated. The physico-chemical analyzes performed were morphology, fiber diameter and degradability of the biomaterial. The biological parameters evaluated were cell morphology, adhesion, proliferation and viability, as well as cytotoxicity by the biomaterial. The neural differentiation was quantified by measuring gene expression for the neural genes nestin, β-III tubulin and NSE (neuron-specific enolase). The scaffolds produced demonstrated a satisfactory environment for MSC growth, mimicking the ECM physical structure. Furthermore, the technique allowed for the production of scaffolds with aligned and with randomized nanofibers. MSCs cultured on scaffolds were able to adhere and proliferate, with better adhesion performance on aligned nanofiber scaffolds with NGF incorporated, when compared to aligned nanofiber scaffolds control. The devices produced showed nontoxic characteristics permitting MSCs to maintain their viability over time. The evaluation of MSC neural differentiation indicated that all groups of scaffolds were able to upregulate neural genes expression. Such ability was observed for both MSCs cultured on scaffolds with control medium as on scaffolds under neural induction medium. These features provided by this artificial ECM permit proper MSC response to microenvironment, leading to neuronal genes expression, which could improve tissue regeneration when applied to nerve lesions.

Danos ao sistema nervoso central (SCN) resultam em perda de conexões axonais, das funções motoras e sensoriais. Uma das estratégias para seu reparo é o transplante de células-tronco mesenquimais (CTMs). Porém essa alternativa requer uma adequada via de aplicação. Nesse sentido, o uso de matrizes alinhadas pode ser usado para apoiar o crescimento e diferenciação das CTMs e, quando incorporadas com fatores de crescimento, otimizam o processo de regeneração tecidual. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diferenciação neural das CTMs cultivadas sobre matrizes de nanofibras orientadas com o fator de crescimento epidermal (EGF) incorporado. Os scaffolds com fibras alinhadas foram produzidos por electrospinning de emulsão e avaliados conforme a sua morfologia, o diâmetro das nanofibras, a degradabilidade e a liberação do EGF. As CTMs utilizadas foram provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Essas células foram cultivadas nos scaffolds e avaliadas conforme os testes biológicos: adesão, viabilidade, proliferação, citotoxicidade e diferenciação neural. Os scaffolds com fibras alinhadas controle (AC) e contendo o EGF (AE) apresentaram morfologia, diâmetro das nanofibras e tempo de degradação semelhantes. Com base no total de EGF presente na matriz AE, 90,14% foi liberado após 28 dias. O citoesqueleto e o núcleo das CTMs cultivadas nos scaffolds AC e AE estavam mais alongados e alinhados quando comparado com as CTMs cultivadas no poço de cultura (controle). As CTMs aderiram mais nas matrizes AE em relação às matrizes AC, porém a proliferação e viabilidade celular foram similares, exceto no tempo de 72 horas, o qual a viabilidade no grupo controle foi maior, em comparação aos demais grupos. Os scaffolds AC e AE não foram tóxicos para as CTMs. Em relação aos resultados da neuro-diferenciação, a expressão de nestina e neurofilamentos consideravelmente maior em todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle. A expressão de βIII-tubulina e GFAP foi maior em todos os grupos diferenciados quando comparada ao grupo controle. A maioria das CTMs cultivadas nas matrizes AC e AE, induzidas ou não à diferenciação neural, apresentaram correntes dependente de voltagem para sódio. O valor de condutância máxima foi maior para todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle onde as células não foram diferenciadas. Portanto, as matrizes com nanofibras orientadas induzem à diferenciação neural das CTMs em neurônios funcionais tanto na ausência como na presença de EGF incorporado. As matrizes AE ainda mostraram ser capazes de melhorar a adesão celular. Dessa forma, conclui-se que as matrizes de nanofibras estudadas são uma possível estratégia para otimização da regeneração de lesões neurológicas. / Damage to the central nervous system (CNS) results in loss of axonal connections and motor and sensory functions. One of the strategies for its repair is the transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs). However, this requires a suitable application route. Accordingly, the use of scaffolds support the growth of MSCs and, when incorporated with growth factors, optimize the regeneration process. The purpose of this study was to evaluate the neural differentiation of MSCs cultured on nanofiber matrices oriented with epidermal growth factor (EGF) incorporated. Aligned scaffolds were produced by electrospinning emulsion and evaluated according to their degradation, the morphology and diameter of the nanofibers, and release of EGF from the nanofibers. MSCs used were from human exfoliated deciduous teeth (SHED). These cells were cultured on the scaffolds and evaluated according to biological tests: adhesion, viability, proliferation, cytotoxicity and neural differentiation. The aligned control scaffolds (AC) containing EGF (AE) presented similar morphology, diameter of nanofibers and degradation time. Based on the total EGF present in the scaffold AE, 90.14% was released after 28 days. The cytoskeleton and the core of the MSCs cultured on scaffolds AC and AE were more aligned and elongated when compared to the MSCs grown on plate wells (control). MSCs adhered more to matrices AE when compared to matrices AC, although proliferation and cell viability were similar, except after 72 hours. In this period, the viability of the control group was higher when compared to the rest of the groups. Scaffolds AC and AE were not toxic to MSCs. In regard to the results of neuro-differentiation, the expression of nestin and neurofilament was much higher in all groups than the control group. The expression of βIII tublin and GFAP was higher in all differentiated groups than the control group. Most of the MSCs grown in matrices AC and AE, induced or not to neural differentiation, showed voltage-dependent sodium currents. The maximum value of conductance of these groups was higher for the cells in all groupscompared to the control group, where the cells were not differentiated. Therefore, oriented nanofiber matrices induce neural differentiation of MSCs into functional neurons both in the absence and in the presence of incorporated EGF. The matrices AE also showed improved cell adhesion. Thus, these matrices are a possible strategy for optimizing the regeneration of neurologic lesions.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The double-strand DNA breaks are considered one of the most lethal forms of damage that can compromise the ability of stem cells self-renew and differentiate. Therefore, additional studies are necessary to identify genome damage biomarkers that help the researchers to choice the better cell line to apply in clinical use. Here, we evaluated the potential use of DNA Comet Assay, DNA fragmentation fluorimetric assay using Picogreen dye and reactive oxygen species (ROS) level by DCFH-DA fluorimetric assay as potential biomarkers to identify the genome conditions of dental stem cells (DSCs) isolated from dog´s canine teeth. The results showed important differences among the three initial DSCs passage when compared to > 4th passages. In general, the initial DSCs passages presented higher cell proliferation, lower DNA damage and ROS. However, we noticed a large number of nucleus with some level of DNA damage (30 to 40% in the initial DSCs passage and > 50% in the late passage) that indicates an in vitro DSCs genomic fragility. The results suggest that these relatively simple and inexpensive approaches as Comet, DNA fragmentation could to help for sorting stem cell with less DNA damage used to research or therapeutic use. / Quebras na dupla-fita do DNA são consideradas uma das formas mais letais de dano que podem comprometer a capacidade das células-tronco de se autorenovarem ou de se diferenciarem. Portanto, estudos adicionais são necessários para identificar biomarcadores de danos genômicos que possam ajudar os pesquisadores a escolher as melhores linhagens celulares para estudos e seu uso clínico veterinário. Para tanto o presente estudo teve como objetivo implantar uma técnica de obtenção de células-tronco a partir de polpa de dente (dental stem-cells, DSCs) de cães avaliando a taxa de proliferação celular, a morfologia das células e a qualidade celular através de indicadores de dano de DNA e estresse oxidativo em oito diferentes passagens de cultura em fase indiferenciada. A escolha de obtenção de células-tronco a partir da polpa dentária se deu por ser de fácil acesso, as células possuírem crescimento rápido e ótimo potencial de diferenciação celular. Para avaliar a qualidade das células em oito diferentes passagens foi feita análise da taxa de proliferação celular, de danos no DNA por duas técnicas complementares (Ensaio do DNA Cometa e Fragmentação do DNA por análise fluorimétrica utilizando-se o corante Picogreen) e dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) que causam estresse oxidativo via ensaio fluorimétrico do DCFH-DA. Os resultados mostraram importantes diferenças entre as passagens iniciais em relação as mais tardias. Em geral até terceira passagem a taxa de proliferação celular foi mais alta, com menor dano genômico e produção de EROs, sendo a segunda passagem a que apresentou melhor qualidade. Entretanto outra questão observada foi o grande número de células com DNA danificado observado em todas as passagens. Os resultados sugerem que testes relativamente simples e baratos como o DNA cometa e a análise de fragmentação do DNA podem ajudar na escolher a passagem celular em que as células apresentam melhor qualidade genômica e funcional tanto para as pesquisas quanto na aplicação clínica regenerativa.

Orientador: Hamilto Akihissa Yamamoto / Coorientador: José Carlos Sozua Trindade Filho / Coorientador: Eunice Deffune / Banca: Juliany Gomes Quitzan / Banca: Paulo Roberto Kawano / Banca: Wagner José Fávaro / Banca: Renata Aparecida de Camargo Bittencourt / Resumo: A engenharia de tecidos tem se mostrado promissora para o tratamento de lesões e doenças da uretra. No presente estudo, foi demonstrada a caracterização das células de músculo liso de bexiga de coelhos e seu implante em matrizes acelulares de aorta de suínos para reparo de lesão na uretra de coelhos. Aortas de dez suínos foram obtidas, descelularizadas e colocadas em cultura com células de músculo liso provenientes de bexiga de dez coelhos, para servirem como modelo no reparo de tecido uretral. As aortas foram descelularizadas com sodium dodecyl sulfate (SDS) a 0,1% e tiveram seu coeficiente de rigidez testado, cujos resultados demonstraram a mesma resistência antes e depois do processo. As células de músculo liso cultivadas foram caracterizadas por citometria de fluxo com o anticorpo anti-CD90 e por imunocitoquímica usando o anticorpo Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (- SMA). Com os resultados da citometria de fluxo excluiu-se a possibilidade da presença de células-tronco mesenquimais ou fibroblastos junto à cultura de células de músculo liso, enquanto que com a imunocitoquímica comprovou-se o perfil das células de músculo liso. A viabilidade das células foi mantida em 99,31% quando em contato com a matriz, demonstrando que o modelo proposto é um excelente biomaterial para uso como scaffold de células. Seu uso na reconstrução de uretra com lesões complexas pode ser considerado com otimismo, podendo resolver problemas relacionados à quantidade insuficiente de tecido na região / Abstract: Tissue engineering has shown promise for treatment in urethras injuries and diseases. In the present study, we demonstrated the rabbits smooth muscle cells of the bladder characterization and their implantation in an acellular porcine aorta for repairing injuries in rabbits urethras. Ten porcine abdominal aortas were obtained and placed in culture with rabbit bladders smooth muscle cells from ten animals to serve as a template for the repair of urethral tissue. The aortas were deccelularized with 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and had a coefficient of stiffness test, whose results showed the same resistance before and after the process. The smooth muscle cultured cells were characterized by flow cytometry with anti-CD90 antibody and by immunocytochemistry using Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (-SMA) antibody. The results of flow cytometry excluded the possibility of the presence of mesenchymal stem cells or fibroblasts by the smooth muscle cells culture, whereas immunocytochemistry confirmed the profile of smooth muscle cells. When in contact with the matrix, cell viability was maintained at 99.31%, demonstrating that the proposed model is an excellent biomaterial for use as cell scaffold. Its use in urethral complex lesions reconstruction can be seen with optimism and solve problems related to insufficient quantities of urinary tissue / Doutor

Enxertos livres de pele de espessura total são indicados para cobrir grandes defeitos de pele em superfícies flexoras ou em extremidades distais e sofrem lesão por isquemia e reperfusão pela própria natureza do procedimento cirúrgico. O objetivo deste trabalho foi testar a associação de células tronco mesenquimais de origem adiposa (ADSCs) heterólogas a enxertos cutâneos autólogos de espessura total em ratos Wistar. Enxertos de 12 mm de diâmetro foram executados no dorso de 30 ratos, em dois locais: cranial e caudal. Os ratos foram distribuídos em seis grupos (n=5): grupo ADSC_G recebeu, no enxerto, 1x106 ADSCs em 200 μL de Solução Salina 0,9% (SS); grupo ADSC_B recebeu 1x106 ADSCs em 200 μL de SS na borda do leito receptor; grupo ADSC_GB, metade da mesma suspensão na borda e outra metade no enxerto. Os grupos controle, SS_G e SS_B, receberam apenas SS no enxerto ou nas bordas respectivamente. No grupo S, o enxerto não recebeu nenhum tratamento durante as cirurgias. Curativos do tipo tie-over permaneceram até o 5º dia. Na cirurgia (d0), aos 5 (d5) e 14 (d14) dias de pós-operatório, os desenhos dos enxertos foram digitalizados e suas áreas mensuradas (software ImageJ). As avalições clínicas consideraram peso, presença de secreções e ocorrência de epidermólise. A planimetria demonstrou a taxa de pele normal, de pele avermelhada e de ulceração, assim como a contração dos enxertos entre os intervalos d0–d5, d5-d14 e d0-d14. As amostras dos enxertos foram obtidas em d14 para coloração com Hematoxilina e eosina e Tricrômico de Masson. A epiderme foi avaliada para espessamento, ceratose, acantose, degeneração hidrópica, infiltrado inflamatório. A derme foi avaliada quanto a rarefação pilosa, tecido de granulação, infiltrado inflamatório, deposição de colágeno. Os resultados foram expressos em média e desvio padrão, e a análise estatística utilizou as Equações de Estimações Generalizadas (GEE), com nível de significância de 5%. O grupo ADSC_G apresentou melhores aspectos macroscópicos, menos ocorrência de epidermólise e de rarefação pilosa e uma das menores médias de área de ulceração, juntamente com os outros grupos tratados com ADSCs. O grupo ADSC_G demonstrou as menores médias de alterações histopatológicas como: espessamento da epiderme, degeneração hidrópica, tecido de granulação. O mesmo grupo ficou entre as menores médias de acantose e infiltrado inflamatório na derme, ao mesmo tempo que apresentou as maiores médias de VEGF no subcutâneo e no tecido de granulação. Dessa forma, pode-se concluir que as ADSCs protegeram os enxertos dos efeitos deletérios da isquemia, assim como e sugerem-se novos estudos em fases iniciais da cicatrização para compreensão dos mecanismos envolvidos. / Evaluation of adipose derived stem cells (ADSC) effect on full-thickness skin graft (FTSG) as a wound healing model in ischemic conditions. Two 12 mm diameter FTSGs were harvested and placed onto dorsal recipient beds of twenty-four Wistar rats, in two anatomic regions: cranial and caudal. Rats were randomized into five groups. Before grafting, group E FTSGs received subfascial injection of 1X106 ADSCs diluted in 200 μL of physiologic saline. Group EC FTSGs received only physiologic saline. Group B received ADSCs in the recipient bed edges; group C received physiologic saline in the edges. Group ADSC_GB received the same ADSCs number and volume, half in the graft and half in the edges. Using planimetry, grafts were analyzed for graft´s contraction rate (d0, d5, d14), normal skin rate and occurrence of epidermolysis and failure rate (d14). FTSGs samples were obtained on the d14 to hematoxylin-eosin and Masson’s Trichrome staining for epidermal analysis (epidermal thickening, keratosis, acanthosis, hydropic degeneration, inflammatory infiltrate) and dermal analysis (hairless, granulation tissue, inflammatory infiltrate, collagen deposition). The obtained results were expressed by mean (n=5). Statistical significance (p<0,05) was calculated using Generalized Estimating Equations. The ADSC_G group had better macroscopic aspects, less occurrence of epidermolysis and hairless and one of the lowest averages of ulceration area, along with the other groups treated with ADSCs. The ADSC_G group showed the lowest mean on the histopathological changes measured such as thickening of the epidermis, hydropic degeneration, less granulation tissue. The same group was among the lowest acanthosis and inflammatory infiltrate averages in the dermis, while presented with the greatest of VEGF average in the subcutaneous and in the granulation tissue. Thus it can be concluded that the ADSCs may have protected the grafts from the deleterious effects of ischemia and suggest new studies in the early stages of healing to understand the mechanisms involved.

O uso de células-tronco mesenquimais (CTMs) na medicina regenerativa, principalmente quando associado ao sistema nervoso, requer alternativas em relação à via de aplicação. A associação da terapia celular com a nanotecnologia para uso em neurociências, desenvolvida nesse trabalho, é uma abordagem inovadora no Brasil. Dessa forma, as matrizes de nanofibras, produzidas pela técnica de electrospinning (ES), funcionam como suportes para a proliferação e diferenciação celular proporcionando uma alternativa para a reconstituição do tecido lesado. O processo de regeneração do tecido neural pode ser aperfeiçoado com a liberação controlada de fatores neurotróficos, através do uso dessas matrizes. Entre esses fatores, encontra-se o NGF (Nerve Growth Factor – fator de crescimento neural), o qual exerce um papel central no desenvolvimento, manutenção e sobrevivência dos neurônios. Além disso, características de superfície das matrizes, como o alinhamento de nanofibras, podem estimular a diferencição neural. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver matrizes de nanofibras alinhadas e não alinhadas com e sem o NGF incorporado, através da técnica ES de emulsão. Além disso, objetivou-se avaliar o comportamento celular, bem como a capacidade de diferenciação neural das CTMs, sobre as estruturas tridimensionais desenvolvidas. As CTMs foram extraídas da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Quatro grupos de scaffolds foram desenvolvidos, caracterizados e avaliados: scaffolds com fibras randomizadas e com fibras alinhadas, sendo cada tipo com e sem o NGF incorporado. As análises físico-químicas realizadas foram morfologia, diâmetro das fibras e degradabilidade do biomaterial. Os parâmetros biológicos avaliados foram morfologia, adesão, viabilidade e proliferação celular, bem como a citotoxicidade frente ao biomaterial. A diferenciação neural foi quantificada através da expressão dos genes neurais nestina, β- III tubulina e NSE (enolase específica para neurônios). As matrizes de nanofibras produzidas mostraram-se satisfatórias para o cultivo de CTMs, mimetizando a estrutura física da matriz extracelular (MEC). Além disso, a técnica utilizada permitiu a obtenção de estruturas com nanofibras alinhadas e randomizadas. As CTMs cultivadas nas matrizes foram capazes de aderir e proliferar com vantagens para adesão nas matrizes alinhadas contendo o NGF, em relação às matrizes alinhadas controle. As estruturas produzidas não apresentaram características tóxicas permitindo que as CTMs mantivessem a viabilidade ao longo do tempo. A avaliação da diferenciação neural das CTMs indicou que todos os grupos de matrizes foram capazes de promover o aumento da expressão de genes neurais. Tal capacidade foi observada tanto para CTMs cultivadas sobre as matrizes com o meio controle quanto com o meio de indução neural. Esses achados mostram a possível influência das características químicas e topográficas providas pelos substratos produzidos. As características da matriz artificial permitem que as CTMs respondam adequadamente ao microambiente e expressem genes neurais, podendo auxiliar na regeneração tecidual quando aplicada em lesões do sistema nervoso. / The use of mesenchymal stem cells (MSCs) in regenerative medicine, particularly when associated with the nervous system, requires alternatives with respect to cell application methods. The association of cellular therapy with nanotechnology for use in neuroscience, developed with this work, is an innovative approach in Brazil. Scaffolds produced by electrospinning (ES) technique act as supports for cell proliferation and differentiation, providing an alternative to reconstitute the damaged tissue. The process of neural tissue regeneration can be improved through the controlled release of neurotrophic factors from the scaffolds. Among these factors, NGF (Nerve Growth Factor) plays a central role in the development, maintenance and survival of neurons. Furthermore, surface characteristics of nanofibers, such as alignment, can stimulate neural differentiation. The main objective of this study was to develop aligned nanofiber scaffolds and random nanofiber scaffolds with and without NGF incorporated through emulsion ES. In addition it was aimed to characterize the physico-chemical properties of the scaffolds, related to the extracellular matrix (ECM) and evaluate the cell behavior, as well as the neural differentiation on these three-dimensional devices. The MSCs were extracted from the dental pulp of human exfoliated deciduous teeth. Four groups of scaffolds were developed, characterized and evaluated: scaffolds with randomized fibers and with aligned fibers, each type with and without NGF incorporated. The physico-chemical analyzes performed were morphology, fiber diameter and degradability of the biomaterial. The biological parameters evaluated were cell morphology, adhesion, proliferation and viability, as well as cytotoxicity by the biomaterial. The neural differentiation was quantified by measuring gene expression for the neural genes nestin, β-III tubulin and NSE (neuron-specific enolase). The scaffolds produced demonstrated a satisfactory environment for MSC growth, mimicking the ECM physical structure. Furthermore, the technique allowed for the production of scaffolds with aligned and with randomized nanofibers. MSCs cultured on scaffolds were able to adhere and proliferate, with better adhesion performance on aligned nanofiber scaffolds with NGF incorporated, when compared to aligned nanofiber scaffolds control. The devices produced showed nontoxic characteristics permitting MSCs to maintain their viability over time. The evaluation of MSC neural differentiation indicated that all groups of scaffolds were able to upregulate neural genes expression. Such ability was observed for both MSCs cultured on scaffolds with control medium as on scaffolds under neural induction medium. These features provided by this artificial ECM permit proper MSC response to microenvironment, leading to neuronal genes expression, which could improve tissue regeneration when applied to nerve lesions.

Danos ao sistema nervoso central (SCN) resultam em perda de conexões axonais, das funções motoras e sensoriais. Uma das estratégias para seu reparo é o transplante de células-tronco mesenquimais (CTMs). Porém essa alternativa requer uma adequada via de aplicação. Nesse sentido, o uso de matrizes alinhadas pode ser usado para apoiar o crescimento e diferenciação das CTMs e, quando incorporadas com fatores de crescimento, otimizam o processo de regeneração tecidual. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diferenciação neural das CTMs cultivadas sobre matrizes de nanofibras orientadas com o fator de crescimento epidermal (EGF) incorporado. Os scaffolds com fibras alinhadas foram produzidos por electrospinning de emulsão e avaliados conforme a sua morfologia, o diâmetro das nanofibras, a degradabilidade e a liberação do EGF. As CTMs utilizadas foram provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Essas células foram cultivadas nos scaffolds e avaliadas conforme os testes biológicos: adesão, viabilidade, proliferação, citotoxicidade e diferenciação neural. Os scaffolds com fibras alinhadas controle (AC) e contendo o EGF (AE) apresentaram morfologia, diâmetro das nanofibras e tempo de degradação semelhantes. Com base no total de EGF presente na matriz AE, 90,14% foi liberado após 28 dias. O citoesqueleto e o núcleo das CTMs cultivadas nos scaffolds AC e AE estavam mais alongados e alinhados quando comparado com as CTMs cultivadas no poço de cultura (controle). As CTMs aderiram mais nas matrizes AE em relação às matrizes AC, porém a proliferação e viabilidade celular foram similares, exceto no tempo de 72 horas, o qual a viabilidade no grupo controle foi maior, em comparação aos demais grupos. Os scaffolds AC e AE não foram tóxicos para as CTMs. Em relação aos resultados da neuro-diferenciação, a expressão de nestina e neurofilamentos consideravelmente maior em todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle. A expressão de βIII-tubulina e GFAP foi maior em todos os grupos diferenciados quando comparada ao grupo controle. A maioria das CTMs cultivadas nas matrizes AC e AE, induzidas ou não à diferenciação neural, apresentaram correntes dependente de voltagem para sódio. O valor de condutância máxima foi maior para todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle onde as células não foram diferenciadas. Portanto, as matrizes com nanofibras orientadas induzem à diferenciação neural das CTMs em neurônios funcionais tanto na ausência como na presença de EGF incorporado. As matrizes AE ainda mostraram ser capazes de melhorar a adesão celular. Dessa forma, conclui-se que as matrizes de nanofibras estudadas são uma possível estratégia para otimização da regeneração de lesões neurológicas. / Damage to the central nervous system (CNS) results in loss of axonal connections and motor and sensory functions. One of the strategies for its repair is the transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs). However, this requires a suitable application route. Accordingly, the use of scaffolds support the growth of MSCs and, when incorporated with growth factors, optimize the regeneration process. The purpose of this study was to evaluate the neural differentiation of MSCs cultured on nanofiber matrices oriented with epidermal growth factor (EGF) incorporated. Aligned scaffolds were produced by electrospinning emulsion and evaluated according to their degradation, the morphology and diameter of the nanofibers, and release of EGF from the nanofibers. MSCs used were from human exfoliated deciduous teeth (SHED). These cells were cultured on the scaffolds and evaluated according to biological tests: adhesion, viability, proliferation, cytotoxicity and neural differentiation. The aligned control scaffolds (AC) containing EGF (AE) presented similar morphology, diameter of nanofibers and degradation time. Based on the total EGF present in the scaffold AE, 90.14% was released after 28 days. The cytoskeleton and the core of the MSCs cultured on scaffolds AC and AE were more aligned and elongated when compared to the MSCs grown on plate wells (control). MSCs adhered more to matrices AE when compared to matrices AC, although proliferation and cell viability were similar, except after 72 hours. In this period, the viability of the control group was higher when compared to the rest of the groups. Scaffolds AC and AE were not toxic to MSCs. In regard to the results of neuro-differentiation, the expression of nestin and neurofilament was much higher in all groups than the control group. The expression of βIII tublin and GFAP was higher in all differentiated groups than the control group. Most of the MSCs grown in matrices AC and AE, induced or not to neural differentiation, showed voltage-dependent sodium currents. The maximum value of conductance of these groups was higher for the cells in all groupscompared to the control group, where the cells were not differentiated. Therefore, oriented nanofiber matrices induce neural differentiation of MSCs into functional neurons both in the absence and in the presence of incorporated EGF. The matrices AE also showed improved cell adhesion. Thus, these matrices are a possible strategy for optimizing the regeneration of neurologic lesions.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-22Bitstream added on 2014-06-13T18:46:29Z : No. of bitstreams: 1 murador_p_dr_botfm.pdf: 1737625 bytes, checksum: 382b432b89ced80d3363c6e9187d9d58 (MD5) / A engenharia de tecidos tem se mostrado promissora para o tratamento de lesões e doenças da uretra. No presente estudo, foi demonstrada a caracterização das células de músculo liso de bexiga de coelhos e seu implante em matrizes acelulares de aorta de suínos para reparo de lesão na uretra de coelhos. Aortas de dez suínos foram obtidas, descelularizadas e colocadas em cultura com células de músculo liso provenientes de bexiga de dez coelhos, para servirem como modelo no reparo de tecido uretral. As aortas foram descelularizadas com sodium dodecyl sulfate (SDS) a 0,1% e tiveram seu coeficiente de rigidez testado, cujos resultados demonstraram a mesma resistência antes e depois do processo. As células de músculo liso cultivadas foram caracterizadas por citometria de fluxo com o anticorpo anti-CD90 e por imunocitoquímica usando o anticorpo Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (- SMA). Com os resultados da citometria de fluxo excluiu-se a possibilidade da presença de células-tronco mesenquimais ou fibroblastos junto à cultura de células de músculo liso, enquanto que com a imunocitoquímica comprovou-se o perfil das células de músculo liso. A viabilidade das células foi mantida em 99,31% quando em contato com a matriz, demonstrando que o modelo proposto é um excelente biomaterial para uso como scaffold de células. Seu uso na reconstrução de uretra com lesões complexas pode ser considerado com otimismo, podendo resolver problemas relacionados à quantidade insuficiente de tecido na região / Tissue engineering has shown promise for treatment in urethras injuries and diseases. In the present study, we demonstrated the rabbits smooth muscle cells of the bladder characterization and their implantation in an acellular porcine aorta for repairing injuries in rabbits urethras. Ten porcine abdominal aortas were obtained and placed in culture with rabbit bladders smooth muscle cells from ten animals to serve as a template for the repair of urethral tissue. The aortas were deccelularized with 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and had a coefficient of stiffness test, whose results showed the same resistance before and after the process. The smooth muscle cultured cells were characterized by flow cytometry with anti-CD90 antibody and by immunocytochemistry using Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (-SMA) antibody. The results of flow cytometry excluded the possibility of the presence of mesenchymal stem cells or fibroblasts by the smooth muscle cells culture, whereas immunocytochemistry confirmed the profile of smooth muscle cells. When in contact with the matrix, cell viability was maintained at 99.31%, demonstrating that the proposed model is an excellent biomaterial for use as cell scaffold. Its use in urethral complex lesions reconstruction can be seen with optimism and solve problems related to insufficient quantities of urinary tissue

Submitted by LINA MARIA DELGADO GARCIA (linadelgadomvz@gmail.com) on 2016-06-03T17:50:42Z No. of bitstreams: 1 Diss_LinaMDelgadoGarcia_PPG_MV_FMVZ.pdf: 5259973 bytes, checksum: 96b8449017ba967633f1d9ef9da7c741 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-06-06T18:25:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 delgado-garcia_lm_me_bot.pdf: 5259973 bytes, checksum: 96b8449017ba967633f1d9ef9da7c741 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T18:25:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 delgado-garcia_lm_me_bot.pdf: 5259973 bytes, checksum: 96b8449017ba967633f1d9ef9da7c741 (MD5) Previous issue date: 2016-05-02 / No final dos anos 60, os experimentos em proliferação celular anunciaram a neurogênese adulta em mamíferos. Três décadas depois a relação entre neurogênese e células-tronco neurais (NSCs) foi estabelecida. Atualmente, as NSCs são objeto de pesquisas na medicina como modelo de estudo de múltiplos estados anormais e distúrbios orgânicos, além de se propor como uma estratégia em condições com poucas alternativas terapêuticas. Contudo o desenvolvimento destas terapias depende do entendimento dos mecanismos moleculares, celulares e biológicos que controlam a neurogênese e as NSCs. Assim, o objetivo deste trabalho foi o estudo das teorias no funcionamento dos nichos neurogênicos e as NSCs com ênfase na proliferação, migração e diferenciação, além da descrição dos aspectos celulares in vitro dos precursores neurais (NPCs) dos nichos neurogênicos dos mamíferos. Os nichos são regiões do sistema nervoso adulto que apresentam neurogênese pela presença das NSCs e um microambiente celular apropriado. Nos mamíferos existem pelo menos dois nichos, a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e a zona subgranular (SGZ) do hipocampo. Os estudos revisados demostram que existem diferenças e semelhanças no comportamento das NSCs nos nichos neurogênicos adultos, levando a que a proliferação, migração e diferenciação seja menos efetiva quando comparada com o desenvolvimento embrionário. Para finalizar, se descreveu o protocolo para isolamento e cultivo dos NPCs e seus aspectos celulares. Os NPCs proliferaram como populações heterogêneas multipotentes. Após a diferenciação, as células migraram e apresentaram características morfológicas e imunofenotípicas de células neurais imaturas, com o predomínio de células gliais. Em conjunto, os NPCs in vitro mimetizam os aspectos gerais da neurogênese. / In the late 60`s, the experiments on cell proliferation announced adult neurogenesis in mammals. Three decades later, the link between neurogenesis and neural stem cells (NSCs) was recognized. Currently, NSCs are the matter of research in human and veterinary medicine as a model of multiple abnormal states and organic disorders, in addition to be proposed as a strategy for diseases and conditions with few therapeutic alternatives. However, the successful development of these therapies depends on the understanding of molecular, cellular and biological mechanisms that control neurogenesis and NSCs. Therefore, the aim of this work was the study of the theories on neurogenic niches and NSCs with focus in proliferation, migration and differentiation, beyond the description of the cellular aspects of in vitro neural precursors cells (NPCs) of the neurogenic niches of the mammals. The neurogenic niches are regions of the adult nervous system which display complete neurogenesis because of the presence of NSCs and an appropriate cell microenvironment. In mammals, there are at least two neurogenic niches, the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles and the subgranular zone (SGZ) of the hippocampus. The reviewed studies showed that exists differences and similarities in the behavior of the adult NSCs in the neurogenic niches that lead to less effective proliferation, migration and differentiation; when compared with the embryonic development. Finally, was described the protocol for isolation and cultivation of NPCs and their cellular aspects. NPCs proliferated as heterogeneous multipotent populations. Differentiation analyses showed that cells migrated and showed morphological and immunophenotypical characteristics of immature cells with the predominance of glial cells. Overall, NPCs effectively reproduce the general aspects of neurogenesis.

Submitted by DIEGO NOE RODRIGUEZ SANCHEZ null (dnr_51@hotmail.com) on 2016-06-22T16:49:29Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Diego_Final.pdf: 62116504 bytes, checksum: c5a01fb03474d162a65b0ca8041e5d46 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-23T19:11:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sanchez_dnr_me_bot.pdf: 62116504 bytes, checksum: c5a01fb03474d162a65b0ca8041e5d46 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-23T19:11:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sanchez_dnr_me_bot.pdf: 62116504 bytes, checksum: c5a01fb03474d162a65b0ca8041e5d46 (MD5) Previous issue date: 2016-05-12 / As lesões de nervos periféricos por neurotmese apresentam resultados paradoxais na recuperação pela ausência na regeneração. Assim, manter o ambiente permissivo de crescimento no coto distal após a lesão é essencial, sendo as células de Schwann chaves neste processo. A terapia celular apresenta potencial para a regeneração nervosa, baseado na substituição celular e promoção do crescimento axonal. As células tronco mesenquimais multipotentes de tecido adiposo (CTMM-TA) são uma fonte promissora pela fácil obtenção, expansão in vitro e por apresentarem propriedades imunomoduladoras e antinflamatórias. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi comparar os efeitos do transplante de CTMM caninas e murinas em combinação com a técnica de tubulação com veia descelularizada, na regerenaração do nervo ciático em modelo experimental de neurotmese em ratos. Ratos Wistar submetidos a neurotmese do nervo ciático foram divididos em 5 grupos: Grupo controle (GC), Grupo denervado (GD), Grupo Transplante de Veia descelularizada (GV), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes caninas (GCTMMc), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes murinas (GCTMMm). Após a marcação com nanocristais fluorescentes e viabilidade celular, 1 x 106 CTMM caninas e murinas foram injetadas depois da realização da lesão experimental por neurotmese com 10mm por tubulação com veia descelularizada nos grupos GCTMMc e GCTMMm, e solução tampão salina de Hank's (HBSS) no grupo veia (GV). Durante o período de 35 dias, o índice de funcionalidade do nervo ciático (IFNC) e a eletroneuromiografia (ENMG) foram realizadas para avaliar a recuperação funcional. Análises histológicas e imunohistoquímicas foram efetuadas para revelar a mielinização, a produção de fatores neurtróficos e a persistencia das CTMM. Observaram-se resultados positivos funcionais nos dias 27 e 35 no grupo tratado com GCTMMm. Os resultados eletrofisiológicos de latência (m/s) e amplitude (mV) no nervo ciático foram superiores nos grupos GCTMMc e GCTMMm. Na avaliação do número e a densidade de fibras nervosas, os grupos GCTMMm e GCTMMc, mostraram melhores resultados. Foi observado uma expressão significativamente alta de BDNF no grupo GCTMMc, associado com o incremento na expressão da proteína S-100 nos grupos GCTMMc e GCTMMm, comparado com o GD. Demonstrou-se, também, que as CTMM derivadas do tecido adiposo canino e murino apresentaram efeitos positivos na regeneração do nervo ciático após neurotmese em ratos. / The peripheral nerves injury by neurotmesis presents confusing results in the recovery by the lack of regeneration. Thus, it is essential to maintain a growth permissive microenvironment in the distal stump following injury for Schwann cells. The cell therapy has therapeutic potential for nerve regenertion, based on cell replacement and promotion of axonal growth. Adipose-derived multipotent mesenchymal stem cells (AdMSC) are a promising source for easy retrieval and expansion in vitro and have immunomodulatory and anti-inflammatory properties. The objective of this study was to compare the effects of canine and murine MSC transplantation in combination with the tubulization of decellularized vein in sciatic nerve regeneration. Wistar rats were divided into 5 groups: control group (CG), denervated group (DG), decellularized vein transplantation group (VG), vein + canine MSC group (cMSC) and vein + murine MSC group (mMSC). After labeling with fluorescent nanocrystals and cell viability, 1 x 106 canine and murine MSC were injected after experimental injury for neurotmesis with 10mm and tubulization with decellularized vein in the cMSC and mMSC groups. During a period of 35 days the sciatic nerve functional index (SFI) and electroneuromyography (EMG) were performed to access functional recovery. Histological analysis and immunohistochemistry were performed to evaluate myelination, neurotrophic factor production and persistence of MSC. It was observed functional postive results at 27th and 35th days in the group treated with mMSC. The electrophysiologycal results of latency (m/s) and amplitude (mV) in the sciatic nerve, they were higher in groups cMSC and mMSC. In assessing the number and density of nerve fibers, mMSC and cMSC groups showed better results. It was observed a significantly higher BDNF expression than the cMSC group, associated with increased xvi expression of S-100 protein in the cMSC and mMSC groups compared to the GD. Also, it has been shown that MSC canine and murine derived of adipose tissue (AdMSC) showed positive effects on the sciatic nerve regeneration in the rat model neurotmesis.