O transplante de ilhotas pancreáticas é uma terapia promissora para o tratamento da diabetes mellitus tipo 1 (DM1). No entanto, ilhotas transplantadas estão sujeitas à rejeição pelo sistema imune dos pacientes receptores, portanto faz-se necessário o desenvolvimento de mecanismos moleculares que protejam essas células. Estudos mostraram que o hormônio prolactina (PRL) é capaz de inibir a apoptose desencadeada por citocinas pró-inflamatórias sobre células beta pancreáticas e que este processo citoprotetor depende da presença da chaperona HSPB1. Foi observado que durante o desenvolvimento do DM1, as células beta pancreáticas sofrem estresse de retículo endoplasmático e que isso contribui para desencadear apoptose. O estresse de retículo endoplasmático é caracterizado pelo acúmulo de proteínas mal dobradas nessa organela resultando na ativação da resposta a proteínas mal dobradas (UPR) que tem como finalidade recuperar a homeostase celular. No presente estudo mostramos, pela primeira vez, que PRL foi capaz de proteger células beta pancreáticas contra estresse de retículo endoplasmático promovido tanto por citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IFNγ e IL1β) quanto pelos estressores de retículo endoplasmático: tunicamicina e tapsigargina; e que HSPB1 é essencial nesse mecanismo de citoproteção. No contexto do DM1, esse hormônio parece ter um efeito modulador da UPR aumentando os níveis de BiP, antecipando a ativação de ATF6 e PERK, mantendo a via de PERK ativa por mais tempo, inibindo a via de IRE1α, e diminuindo os níveis de CHOP em tempos maiores. Coletivamente, os resultados aqui apresentados aprofundam os conhecimentos sobre a função de HSPB1, conduzindo para o desenvolvimento de estratégias que visam à atenuação da morte de células beta por meio da modulação de uma via de proteção endógena, a qual é independente da modulação do sistema imunológico. / The islet transplantation is a promising therapy for the treatment of type 1 diabetes mellitus (T1DM). However, transplanted islets are subject to rejection by the immune system of the recipient patients, therefore the development of molecular mechanisms that protect these cells is necessary. Studies have shown that the hormone prolactin (PRL) is capable of inhibiting apoptosis triggered by pro-inflammatory cytokines on pancreatic beta cells and that this cytoprotective process depends on the presence of the chaperone HSPB1. It was observed that during the development of type 1 diabetes, pancreatic beta cells undergo endoplasmic reticulum stress and that this contributes to trigger apoptosis. The endoplasmic reticulum stress is characterized by accumulation of misfolded proteins in this organelle resulting in the activation of unfolded protein response (UPR) that aims to restore cellular homeostasis. In the present study, we show for the first time that PRL was able to protect pancreatic beta cells against endoplasmic reticulum stress promoted by both pro-inflammatory cytokines (TNFα, IFNγ and IL1β) as the endoplasmic reticulum stressors: tunicamycin and thapsigargin; and HSPB1 is essential that cytoprotective mechanism. In the context of T1DM, PRL appears to have a modulating effect of the UPR by increasing the levels of BiP, anticipating the activation of ATF6 and PERK, keeping the PERK pathway active for longer, inhibiting the pathway IRE1α, and decreasing the levels of CHOP for longer times. Collectively, the results presented here deepen the knowledge of the HSPB1 function, leading to the development of strategies inducing attenuation of beta cells death through modulation of endogenous protection means, which are independent of the modulation of the immune system.

Orientador: Fabíola Freitas de Paula Lopes / Resumo: A série de eventos desencadeados durante o período de maturação oocitária é muito susceptível ao estresse ambiental. Condições adversas tais como agentes pró-oxidantes e temperatura ambiente comprometem a função oocitária, reduzindo a capacidade de fertilização e o posterior desenvolvimento embrionário. O efeito negativo do estresse térmico sobre a fertilidade de bovinos já foi bem caracterizado. Entre os efeitos celulares do estresse térmico no oócito bovino podemos destacar a desorganização do citoesqueleto, aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), danos mitocondriais e ativação da morte celular por apoptose. Um efeito conservado do choque térmico em diferentes tipos celulares é a desnaturação de proteínas, ativando mecanismos de proteção no citoplasma celular e no retículo endoplasmático (RE) para manutenção da proteostasis. O RE funciona como sensor de estresse ambiental ativando a Unfolded Protein Response (UPR), podendo desencadear autofagia e/ou apoptose, dependendo da intensidade do estresse. Apesar da importância do RE para a função oocitária, os efeitos do choque térmico nesta organela nunca foram investigados. Portanto, os objetivos gerais desta dissertação foram determinar o papel do estresse do RE na função de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico (Capítulo 2) e o papel da autofagia na expressão gênica e competência de desenvolvimento de oócitos bovinos submetidos a choque térmico durante a maturação in vitro (MIV) (Capítulo 3). Para os ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The series of events triggered during the oocyte maturation is very susceptible to environmental stress. Adverse conditions such as pro-oxidant agents and environmental temperature compromise oocyte function, reducing fertilization capacity and subsequent embryonic development. The negative effect of heat stress on bovine fertility has been well characterized. Among the cellular effects of heat stress on bovine oocytes, one can highlight cytoskeletal disorganization, increased production of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial damage, and activation of cell death by apoptosis. A conserved effect of heat shock on different cell types is protein denaturation, activating protection mechanisms in the cytoplasm and endoplasmic reticulum (ER) to maintain proteostasis. The ER acts as an environmental stress sensor activating Unfolded Protein Response (UPR), which can trigger autophagy and/or apoptosis, depending on the intensity of the stress. Despite the importance of ER for oocyte function, the effects of heat shock on this organelle have never been investigated. Therefore, the general objectives of this dissertation were to determine the role of ER stress on function of bovine oocytes submitted to heat shock (Chapter 2) and the role of autophagy on gene expression and developmental competence of bovine oocytes submitted to heat shock during in vitro maturation (IVM) (Chapter 3). For the ER studies, cumulus-oocyte complexes (COCs) were initially distributed in the followin... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

de tumorigênese em melanomas, ainda não há tratamento eficaz para melanomas metastáticos. Esta ineficácia terapêutica pode estar relacionada com a adaptação e seleção de células de melanoma à indução de estresse de RE. Ultrapassar os níveis sustentados de estresse de RE, interferindo nas vias de adaptação a este estresse, foi o alvo deste estudo na tentativa de propor uma nova estratégia terapêutica para sensibilizar células de melanoma a morte induzida por cisplatina. Mostramos que GADD153, um dos componentes da via de UPR (Unfolded Protein Response) responsável por induzir apoptose em reposta ao estresse de RE, está excluída do núcleo em melanomas primários, metástases ganglionares e viscerais. Este dado sugere que a localização citoplasmática do fator de transcrição GADD153 possa estar envolvida na resposta adaptativa de melanomas ao estresse de RE, uma vez que se sabe que GADD153 se acumula no núcleo em resposta a este estresse. Investigamos se a indução de estresse de RE seria capaz de induzir a translocação de GADD153 para o núcleo e resultar na sensibilização de células de melanoma a morte induzida por cisplatina (CDDP). Realizamos o tratamento de células de melanoma (SbCl2, Mel85, SK-MEL- 29, SK-MEL-28 e SK-MEL-147) com tunicamicina (Tuni), indutor clássico de estresse de RE, previamente ao tratamento com CDDP. Demonstramos que em todas as linhagens exceto em SK-MEL-29, houve um aumento na porcentagem de células hipodiploides (>50%) no tratamento combinado (Tuni>CDDP) comparado ao tratamento com CDDP. As células SK-MEL-147 se mostraram mais sensíveis à indução de estresse de RE e as células SK-MEL-29 mais resistentes. Algumas diferenças entre estas linhagens como a expressão de GRP78 de superfície e presença de oligossacarídeos ?1-6 ligados de superfície podem estar relacionadas com esta resposta diferencial ao estresse de RE. Em todas as linhagens verificamos a acúmulo dos marcadores de UPR, GRP78 e GADD153, após o tratamento com tunicamicina. Além disso, GADD153 foi direcionada para o núcleo em reposta ao tratamento com tunicamicina. O acúmulo de vacúolos acídicos, da proteína autofágica LC3-II e de ROS após o tratamento com Tuni>CDDP, sugerem que tanto a autofagia quanto o estresse oxidativo parecem estar envolvidos na resposta de sensibilização. A inibição de autofagia com cloroquina aumentou a morte induzida por Tuni>CDDP, sugerindo que autofagia desempenha função protetora neste esquema terapêutico. Testamos um segundo agente genotóxico, temozolomida (TMZ), uma droga equivalente à dacarbazina, e a mesma capacidade de sensibilização foi observada pelo prévio tratamento com tunicamicina. A validação deste conceito in vivo foi dificultada pela acentuada toxicidade apresentada por tunicamicina. Avaliamos alguns candidatos a agentes estressores do RE que poderiam apresentar menor toxicidade celular, como swainsonina, atorvastatina, metformina e o composto de cobre [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4. No entanto, não obtivemos resultados promissores com nenhum destes candidatos. Estes resultados mostram que as células tumorais podem ser pré-condicionadas à morte celular se expostas a um prévio estressor de RE, como Tuni, o que leva ao comprometimento da resposta adaptativa a indutores de morte celular como CDDP e TMZ. No entanto, ainda é necessário o estudo de agentes indutores de estresse de RE pouco tóxicos para que esta estratégia terapêutica possa ser utilizada em pacientes com melanoma / Melanoma is among the most aggressive malignancies with increasing worldwide incidence and there is no effective treatment for the metastatic disease. The absence of an effective therapy may be due to adaptation and selection of melanoma cells to endoplasmic reticulum (ER) stress. We showed that GADD153, one of the components of the ER stress-mediated apoptosis pathway, was mostly excluded from the nucleus of primary and metastatic melanoma cells compared to nevus cells. These data suggest that the unexpected GADD153 cellular localization could be involved in melanoma cell adaption to ER stress, since GADD153 accumulates in the nucleus during ER stress. Unfolded protein response (UPR) signaling induced in response to ER stress, is a dual process that induces a protective response to restore ER homeostasis or cell death if ER stress is severe or persistent. We investigated if induction of ER stress was a potential strategy to chemosensitize melanoma cells to a second insult by surpassing the adaptive levels to ER stress. We first treated human melanoma cells (SbCl2, SK-MEL-28, Mel85, SK-MEL-29 and SK-MEL-147) with tunicamycin (Tuni), an ER stress inducer, before cisplatin (CDDP) treatment. CDDP is a low cost chemotherapeutic drug currently used in Brazil as a second line for melanoma treatment, especially in youngsters. All cell lines, except SK-MEL-29, demonstrated an >50% increase in the percentage of hypodiploid cells with Tuni>CDDP treatment when compared to CDDP only. The same results were obtained with temozolomide (TMZ), equivalent drug to the active form of dacarbazine, the first line of cytotoxic treatment of melanomas. UPR markers, GRP78 and nuclear translocation of GADD153 were induced by Tuni. Differences between SK-MEL-29 and SK-MEL-147 as cell surface GRP78 and ?1-6 oligossacharides can be related with the differential ER stress sensitization observed in these cells. One of the cellular mechanisms that are regulated by ER stress is autophagy. Accordingly, we observed an increase in the acidic vesicular organelles and accumulation of LC3II in response to Tuni>CDDP treatment. Autophagy inhibition with chloroquine increased Tuni>CDDP induced-cell death, suggesting that autophagy plays a protective role in this response. Oxidative stress can be involved in this scenario since we demonstrated an accumulation of reactive oxygen species in response to Tuni>CDDP. Tunicamycin was cytotoxic in vivo and we investigated alternatives to this antibiotic as swainsonine, atorvastatin, metformin and [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4 but we did not observed ER stress induction. These results indicate that tumor cells could be preconditioned to cell death if exposed to a first ER stressor, such as Tuni, which would compromise an effective adaptive response to a cell death inducer, as CDDP and TMZ. This combined approach may be a promising strategy for melanoma therapy but further studies are necessary to find noncytotoxic alternatives to tunicamycin

A Síndrome de Marfan (SMF) é a enfermidade hereditária mais comum dentre as que afetam o sistema conjuntivo, causada por mutações da glicoproteína fibrilina-1, o principal componente estrutural das microfibrilas elásticas da matriz extracelular. As manifestações fenotípicas da SMF são sistêmicas e acometem tipicamente os sistemas ocular, esquelético e cardiovascular, este uma importante causa de morbi-mortalidade. Entretanto, não está claro como a mutação induz a doença. Estudos anteriores sugerem anomalias morfológicas do retículo endoplasmático (RE) ou retenção intracelular da fibrilina-1 nos estágios avançados da SMF. Entretanto, a contribuição do enovelamento da fibrilina-1 mutada e do estresse do RE na fisiopatologia celular da SMF não é conhecida. Proteínas mal-enoveladas podem levar à retenção intracelular e/ou aumento da degradação através da via de degradação associada ao RE (ERAD), além da indução da resposta a proteínas mal-enoveladas (UPR), ambas com potencial contribuição à fisiopatologia de doenças, incluindo a SMF. Assim, estudamos em fibroblastos embrionários isolados de camundongos (MEFs) com SMF se a fibrilina-1 mutada é reconhecida pelo controle de qualidade do RE pelo seu mal- enovelamento e induz estresse do RE por sua retenção intracelular. Demonstramos que a mutação na fibrilina-1 per se não promoveu chaperonas marcadoras de UPR ou geração de oxidantes. Além disso, não levou a uma maior sensibilização das células à indução exógena de estresse do RE, nem promoveu maior morte celular após inibição do proteassoma. Além disso, não foi observada retenção intracelular da fibrilina-1 nas células SMF, e mesmo após inibição da via secretora ou indução de estresse do RE, a inibição da secreção da fibrilina-1 foi similar nos MEFs SMF e wild-type (WT). A dissulfeto isomerase proteica (PDI), uma importante chaperona redox do RE, interage com fibrilina-1, e seu silenciamento levou a um aumento na secreção da fibrilina-1 pelos MEFs WT, mas não SMF. Além disso, o silenciamento da PDI promoveu a desorganização da matriz extracelular depositada de fibrilina-1 nos MEFs WT, enquanto nos MEFs SMF, a desorganização basal da matriz não foi adicionalmente alterada. Em paralelo, investigações in vivo mostraram que o estresse do RE não é induzido em camundongos SMF com 1 ou 3 meses de idade, apesar de manifestações fenotípicas evidentes. Entretanto, concomitante à progressão da doença, detectamos a ocorrência de estresse do RE nas aortas ascendentes dos camundongos aos 6 meses. Esta detecção foi exclusiva desta região da aorta e não ocorreu em outros órgãos afetados ou não afetados pela SMF. Assim, a manifestação do fenótipo clássico da SMF não requer uma perda da homeostase do RE diretamente induzida pela fibrilina-1 mutada. Ao contrário, esta é capaz de evadir mecanismos de controle de qualidade mediados pela PDI, sendo secretada normalmente. Assim, esta evasão do controle de qualidade pela PDI é uma condição permissiva essencial para o fenótipo da SMF. Por outro lado, o estresse do RE é uma característica evolutiva do aneurisma da aorta ascendente na SMF concomitante ao agravamento do fenótipo neste tecido / Marfan syndrome (MFS) is the most common connective tissue hereditary disease, caused by mutations in the glycoprotein fibrillin-1, the main structural component of extracellular matrix elastic microfibrils. MFS phenotypic manifestations are systemic and typically involve the ocular, skeletal and cardiovascular systems, the latter a major cause of morbidity/mortality. However, how gene mutation induxes disease is yet unclear. Previous studies suggest endoplasmic reticulum (ER) morphological abnormalities or fibrillin-1 intracellular retention in advanced MFS stages. However, the contribution of mutated fibrillin-1 folding and ER stress to MFS cellular pathophysiology is unknown. Un/misfolded proteins may associate with their intracellular retention and/or increased degradation through ER-associated degradation (ERAD), in addition to inducing the unfolded protein response (UPR), both sharing potential contributions to disease pathophysiology, including MFS. Thus, we studied in embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from WT and MFS mice, if mutated fibrillin-1 can be recognized by ER quality control as a misfolded protein, able to induce ER stress due to its intracellular retention. We showed that fibrillin-1 mutation by itself did not promote UPR chaperone markers or oxidant generation. Moreover, it did not sensitize cells to exogenous ER stress nor affected cell survival curves after proteasome inhibition. Furthermore, no intracellular retention of fibrillin-1 was observed in MFS cells, and even after secretory pathway inhibition or ER stress induction, fibrillin-1 secretion inhibition was similar in MFS and wild-type (WT) MEFs. Protein disulfide isomerase (PDI), an important ER redox chaperone, interacts with fibrillin-1 and its silencing induced an increased fibrillin-1 secretion in WT, but not MFS MEFs. Besides, PDI silencing promoted fibrillin-1 extracellular matrix disorganization in WT MEFs, whereas in MFS MEFs, the basal matrix disorganization was not further modified. Parallel in vivo evaluations demonstrated that ER stress is also not induced in 1 and 3 month-old mice MFS, despite evident phenotypical manifestations. However, concomitant to accelerated disease progression at 6 months, ER stress was detectable in ascendant aorta, but not in other disease-affected or unaffected organs. Thus, classic MFS phenotype manifestations do not require loss of ER homeostasis directly induced by mutated fibrillin-1. Contrarily, the latter can evade a PDI-mediated quality control mechanism to be normally secreted. Therefore, evading such PDI-mediated quality control is an essential permissive condition for enabling the MFS phenotype. On the other hand, ER stress is an evolutive feature of MFS ascendant aorta aneurysm concomitant to phenotype progression in this tissue

O melanoma é o tipo de câncer de pele mais letal, apesar de ser o menos incidente. Em virtude de sua alta letalidade e de sua crescente incidência, estudos sobre melanoma são de fundamental importância nos dias de hoje. Assim como células tumorais em geral, células de melanoma apresentam características metabólicas diferenciadas, como, por exemplo, altos níveis de espécies reativas de oxigênio e alta taxa de síntese proteica. Essas modificações no metabolismo dispararam vias de resposta a estresse, como a \"Unfolded Protein Response\" (UPR), contudo, essas células se adaptam a esse estresse constante, que não culmina com a morte das mesmas. Além disso, o padrão de glicosilação em células tumorais também é sabidamente alterado, entre outros motivos, pela expressão diferencial de enzimas da via de glicosilação, como a N-acetilglicosaminiltransferase 5 (MGAT5). Relacionando essas duas características de células de melanoma, propusemo-nos a avaliar se a alta expressão de MGAT5A ( e/ou MGAT5B) funcionaria como uma resposta adaptativa de células de melanoma ao estresse de retículo endoplasmático, e seria, portanto, responsável por manter o equilíbrio diferenciado nessas células. Durante o desenvolvimento desse estudo, foi possível comprovar que a indução de estresse de retículo por meio de tratamento com tunicamicina, um inibidor da N-glicosilação e indutor clássico de UPR, sensibilizou as células de melanoma ao posterior tratamento com cisplatina. Contudo, o tratamento com swainsonina, um inibidor do processamento dos N-glicanos que ocorre no complexo de Golgi, não foi capaz nem de disparar \"Unfolded Protein Response\" nem de induzir morte nessas células e, talvez por esse motivo, não apresentou efeito sensibilizador frente à cisplatina. Além disso, foi observado que as linhagens tumorigênicas apresentam maior expressão de MGAT5A em comparação à linhagem não-tumorigênica melan-a. As tentativas de realização de silenciamento de MGAT5A não foram exitosas. Informações relacionando estresse de retículo e N-glicosilação aberrante em células tumorais ainda serão foco de estudo em nosso grupo. Com os resultados apresentados, é possível concluir que o equilíbrio diferencial dos níveis de estresse de retículo em que se encontram as linhagens tumorigênicas do nosso modelo é importante para a sobrevivência das mesmas. Além disso, é de nosso interesse avaliar a dependência de células tumorais das vias ativadas pela superexpressão de MGAT5A, caso ela realmente exista / Melanoma is the most lethal skin cancer, despite being the least prevalent. Due to its lethality and resistance to a variety of known chemotherapeutic drugs, studies on melanoma are paramount. Tumor cells in general, and melanoma cells particularly, commonly present a disturbed metabolic rate, e.g., altered metabolism of reactive oxygen species and increased rates of protein synthesis. Altogether these perturbations trigger the Unfolded Protein Response (UPR); however, tumor cells are adapted to these conditions and are able to survive. Besides, glycosylation of tumor cells is commonly altered, due to differentiated expression rates of N-glycosylation enzymes, like N-acetylglucosaminyltransferase 5 (MGAT5). Considering these information together, we proposed that the sustained overexpression of MGAT5A (and/or MGAT5B) observed in Tm1 and Tm5 melanoma cells is part of an adaptive response to reticulum stress, maintaining an unstable equilibrium in tumor cells. In this work, we observed that the induction of endoplasmic reticulum stress caused by tunicamycin treatment, a N-glycosylation inhibitor and UPR inducer, sensitized melanoma cells to further cisplatin treatment. In contrast, swainsonine treatment, an inhibitor of Golgi N-glycan processing pathway, did not cause cell death nor UPR signaling, and this may be the reason why this treatment did not sensitize cells to cisplatin treatment. MGAT5A silencing was not successful yet. Altogether, the results above show that the unstable equilibrium under which Tm1 and Tm5 tumor cells are seems necessary for their survival. Therefore, it seems that upon malignant transformation, melanoma cells present dependence of MGAT5A expression. Its our interest exploit this melanoma model to understand the concept of oncogenic dependence for MGAT5A expression in the case of melanomas, if it exists

Dissulfeto isomerase protéica (PDIA1 ou PDI) é uma chaperona e ditiol-dissulfeto oxido-redutase residente do reticulo endoplasmático (RE). PDI é essencial à regulação da proteostase por ter função no enovelamento oxidativo de proteínas e na via de degradação associada ao RE (ERAD). Além disso, PDI interage fisicamente e regula a atividade de NADPH oxidases, e fora da célula é um regulador redox essencial à atividade de proteínas extracelulares. Este pool epi/pericelular da PDI (pecPDI) regula função de proteínas de membrana/secretadas, como integrinas, glicoproteínas gp120 do virus HIV e outras, com múltiplas funções que incluem: trombose, ativação plaquetária, adesão celular, infecção viral e remodelamento vascular. A rota de externalização da PDI permanece obscura, e seu conhecimento pode indicar mecanismos dos efeitos (fisio)patológicos da PDI. A secreção da PDI pela rota RE-Golgi foi sugerida em células endoteliais infectadas pelo vírus da dengue, células pancreáticas e tireoideanas. No entanto, uma varredura sistemática das possíveis rotas de externalização da PDI não foi previamente realizada. Neste estudo, mostramos que células endoteliais (EC) externalizam constitutivamente, por rotas distintas, dois pools de PDI, de superfície celular e solúvel, enquanto na EC não estimulada PDI não foi detectada significativamente em micropartículas. PDI externalizada corresponde a ca.1,4% do pool total de PDI celular. Tanto a PDI de superfície celular como a solúvel foram majoritariamente secretadas pela via de secreção não-convencional do tipo IV independente de GRASP. Contudo, a via de secreção clássica também contribui para externalização basal da PDI de superfície celular, mas não da solúvel basal ou estimulada por PMA, ATP e trombina indicando que todas envolvem escape do Golgi. Além disso, a externalização constitutiva da PDI de superfície em célula muscular lisa vascular também ocorre por via independente de Golgi. Externalização da PDI não foi detectavelmente mediada pela secreção não-convencional do tipo I, II, III, lisossomos secretórios, endossoma de reciclagem e transporte ativo (dependente de ATP) em EC. Considerando que chaperonas são vias essenciais de resposta a estresses, investigamos o efeito de estresse do RE e choque térmico na pecPDI. Estresse do RE não altera a PDI de superfície celular, mas aumenta PDI solúvel. Ambos os pools de PDI não foram alterados por choque térmico, embora a recuperação desse estresse diminua a secreção de PDI. Estes dados sugerem que a liberação de PDI é um processo regulado, dependente da natureza do estresse. Bloqueio da síntese de proteínas com cicloheximida não altera pecPDI, indicando que PDI recém-sintetizada não é preferencialmente externalizada e que o tráfego da PDI independe de outras proteínas recém-sintetizadas. Um aspecto importante do estudo foi indicar uma resiliência da pecPDI à modulação individual de distintas vias secretoras, consistente com uma estrita auto-regulação e possibilidade de vias sinérgicas e complementares. Estes resultados indicam que a externalização da PDI de superfície e PDI secretada possam ser externalizadas por mecanismos independentes. Estes processos compõem um processo regulado estritamente, consistente com papel homeostático da pecPDI / Protein disulfide isomerase (PDIA1 or PDI) is dithiol-disulfide oxireductase chaperone resident in the endoplasmic reticulum (ER). PDI is essential for proteostasis, due to its support of oxidative protein folding and ER-associated protein degradation (ERAD). In addition, PDI associates with NADPH oxidase(s) and regulate its activity, while outside of the cell, PDI redox-dependently modulates extracellular proteins. This epi/pericellular PDI (pecPDI) pool is known to regulate membrane/secreted proteins such as integrins, HIV glycoprotein gp120 and others, with functions that involve thrombosis, platelet function, cell adhesion, viral infection and vascular remodeling. PDI externalization route remains enigmatic and its elucidation can help understand some (patho)physiological PDI effects. An ER-Golgi route for PDI secretion has been as described on dengue virus-infected endothelial cells pancreatic and thyroid) cells. However, none of these papers addressed PDI secretion routes in a systematic fashion. Here, we show that endothelial cells (EC) constitutively externalize, through different routes, two PDI pools, a cell-surface and a secreted one, while in nonstimulated ECs PDI was not significantly detected in microparticles. Externalized PDI corresponds to < 2% of total cellular PDI pool. Both cell-surface and soluble PDI were predominantly externalized through unconventional type IV GRASP-independent pathway(s). However, the classical secretory pathway also contributes to basal cell-surface, but not soluble, PDI externalization, as PMA, ATP or thrombin-stimulated secretion also involve Golgi bypass. Furthermore, constitutive cell-surface PDI externalization in vascular smooth muscle cells also occurs in a Golgi-independent way. PDI externalization was not detectably mediated by non-conventional type I, II and III secretion routes, secretory lysosomes, recycling endosomes and ATP dependent active transport in EC. Since chaperones are essential for cellular stress response, we assessed the effects of ER stress and heat-shock on pecPDI. ER stress did not affect cell-surface PDI but increased the soluble pool. Both PDI pools were unaltered by heat shock, while stress recovery decreased PDI secretion. These data suggest that PDI release is finely tuned and dependent on the type of stress. Blockade of protein synthesis with cycloheximide did not change pecPDI levels, suggesting that newly-synthesized PDI is not preferentially externalized and that PDI traffic does not require newly-synthesized proteins. An important aspect of the study was the evidence for pecPDI resilience to individual modulation of distinct secretion routes, consistent with strict auto-regulation and possible synergic or complementary pathways. Overall, our data suggest that cell-surface and secreted PDI pool externalization are regulated through independent mechanisms, which in both cases involve Type IV non-conventional routes, with some minor contribution of Golgi-dependent secretory pathway. These patterns compose a strictly regulated process, consistent with an important homeostatic role for pecPDI

O carcinoma hepatocelular (CHC) é a quarta causa mais frequente de morte por câncer em todo o mundo. Este estudo teve dois grandes objetivos, o primeiro foi estabelecer o carcinoma hpatocelular experimental por indução química e o segundo estudar os efeitos da melatonina sobre o estresse oxidativo, estresse de retículo endoplasmático e apoptose durante a hepatocarcinogênese. Foram realizados dois experimentos, ambos utilizaram dietilnitrosamina (DEN) mais acetilaminofluoreno (2-AAF) em ratos Wistar machos pesando 145-150 g. O primeiro estudo testou 3 protocolos de indução do câncer hepático. Os animais foram divididos em três grupos testes: DEN50: que recebeu DEN 50 mg duas vezes por semana até a 6ª semana e uma vez por semana nas semanas 11 a 13. DEN75: recebeu DEN 75mg uma vez por semana nas semanas até a 6ª semana e um reforço nas semanas de 11 a 13. DEN100: recebeu 5 doses de DEN 100mg uma a cada seis semanas por 28 semanas. Todos receberam 2- AAF dose única de 100 mg na 4ª semana. Após a indução foi comprovado por testes bioquímicos, macroscópico e histológico que o protocolo DEN50 desenvolve CHC avançado em 19 semanas, apresentou a fase inflamatória na 5ª semana e cirrose na 12ª semana. O protocolo DEN100 exibe padrão de lesões pré-cancerosas com cirrose em 28 semanas. O protocolo DEN75 foi o mais heterogêneo dos três, pois desenvolveu lesões pré-cancerosas, cancer inicial e CHC avançado. O segundo estudo, repetiu o protocolo DEN50 e administrou melatonina 20mg/L. Os tratamentos começaram nas semanas 5 e 12. Ao final de 19 semanas foi observado que animais do grupo que só recebeu DEN+2-AAF (DEN-CHC) desenvolveram carcinoma avançado, exibiram mais expressão de proteinas pró-inflamatórias (iNOS, COX-2 e NFkB). E animais tratados com Melatonina (DEN+MEL5 e DEN+MEL 12) apresentaram padrão histológico de cirrose e reduzida expressão destas proteinas. Quanto ao comportamento oxidativo foi observado que grupo DEN-CHC apresentou menor lipoperoxidação (LPO) por redução de ácidos graxos poliinsaturados, maior oxidação proteica, menor atividade da SOD e maior índice de danos ao DNA. O tratamento com melatonina ao longo da hepatocarcinogênese se mostrou efetivo para proteger a membrana lipidica, reduziu a oxidação proteica, aumentou a atividade da SOD e atenuou o dano ao DNA. Por fim, referente ao estresse de retículo endoplasmático e apoptose, animais com DEN-CHC não apresentaram ativação das proteinas de estresse de retículo (BiP, ATF6 e CHOP) nem acionaram as rotas apoptóticas. Entretanto, animais tratados com Melatonina tiveram aumento significativo na expressão de proteinas como BiP, ATF6 e CHOP, assim como proteinas pró-apoptóticas. Nossos resultados apontam que a melatonin, durante o processo de hepatocarcinogênese experimental, atuou como anti-inflamatório, antioxidante e pró-apoptótico. E estas ações contribuiram para evitar a progressão do carcinoma hepatocelular. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fourth most frequent cause of cancer death worldwide. This study had two main objectives, the first was to establish the experimental hpatocelular carcinoma by chemical induction and the second study the effects of melatonin on oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptosis during hepatocarcinogenesis. Two experiments were conducted, both used Diethylnitrosamine (DEN) + acetylaminofluorene (2-AAF) in male Wistar rats weighing 145-150 g. The first study tested three induction protocols of liver cancer. The animals were divided into three test groups: DEN50: DEN that received 50 mg twice a week until 6 weeks and once a week during the weeks 11 and 13. DEN75: DEN received 75mg once a week during the weeks to 6 weeks and another reinforcement in weeks 11 to 13 DEN100: DEN received 5 doses of 100mg one every six weeks for 28 weeks. All received 2 AAF single dose of 100 mg at week 4. After induction was confirmed by biochemical, macroscopic and histological tests that DEN50 protocol develops advanced HCC in 19 weeks, presents inflammatory phase in the 5th week and cirrhosis at 12 weeks. The default display protocol DEN100 of precancerous lesions and cirrhosis in 28 weeks. DEN75 The protocol was the most heterogeneous of the three, as developed precancerous lesions, early cancer and advanced HCC. The second study, repeated the DEN50 protocol and administered melatonin 20mg / L. The treatments began on week 5 and 12. At the end of 19 weeks was observed that animals in the group that received only DEN (DEN-CHC) developed advanced carcinoma exhibited over expression of proinflammatory proteins (iNOS, COX-2 and NFkB). And animals treated with melatonin (DEN+ MEL5W and DEN+MEL 12W) showed histological pattern of cirrhosis and reduced expression of these proteins. As for the oxidative behavior was observed that DEN-HCC group had lower lipid peroxidation (LPO) by reducing polyunsaturated fatty acids, higher protein oxidation, lower activity of SOD and higher rate of DNA damage. Treatment with melatonin throughout hepatocarcinogenesis was effective to protect the lipid membrane, protein oxidation decreased, increased SOD activity and attenuated DNA damage. Finally, referring to the endoplasmic reticulum stress and apoptosis, animal DEN-CHC did not show activation of reticulum stress protein (BiP, ATF6 and CHOP) or triggered apoptotic routes. However, melatonin treated animals had a significant increase in the expression of proteins and BiP, CHOP and ATF6, as well as pro-apoptotic proteins. Our results indicate that melatonin, during the process of experimental hepatocarcinogenesis, acted as anti-inflammatory, antioxidant and pro-apoptotic. And these actions contributed to prevent progression of hepatocellular carcinoma.

Como a clorexidina (CHX) tem sido recomendada como solução irrigadora de canais radiculares e como curativo de demora, o objetivo do presente estudo foi caracterizar in vivo a lesão induzida pela injeção de CHX a 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0% na pata de camundongos em intervalos de tempo selecionados (24 e 48 horas e 7 e 14 dias) e in vitro o modo e a causa morte celular (necrose e/ou apoptose) e o estresse causado pela exposição de fibroblastos L929 em cultura a concentrações crescentes da droga (0,000125, 0,00025, 0,0005, 0,001, 0,002, 0,004, 0,008 e 0,016%) por 24 horas. A proliferação celular foi avaliada por meio da incorporação de metil-3H-timidina ao DNA das células e imunomarcação para PCNA. A ultraestrutura foi analisada em microscópio eletrônico de transmissão e de varredura e o citoesqueleto das células por meio de marcação para actina e &#945;-tubulina. Citometria de fluxo (Anexina-V FITC/iodeto de propídeo) foi empregada para diferenciar células necróticas de apoptóticas. Também, foi efetuada marcação para retículo endoplasmático, Bcl-2 (B-célula CLL/linfoma 2), Hsp70 (proteína de choque térmico 70) e Grp78 (glucose-regulated protein 78). Quando injetada no espaço subplantar da pata traseira de camundongos, a CHX induziu alterações necróticas na epiderme, derme e tecido subcutâneo em associação com uma resposta inflamatória reacional, particularmente nas concentrações mais elevadas. Em cultura de fibroblastos, a CHX induziu a diminuição da proliferação celular, causou morte celular por apoptose e necrose, desestruturação do citoesqueleto, alteração da morfologia celular, aumento da área das células, dilatação do retículo endoplasmático rugoso e acúmulo de proteínas nas cisternas. Além disso, a CHX causou aumento da expressão de Hsp70, de Grp78 (indicadores de estresse celular) e de Bcl-2 (proteína anti-apoptótica). Em conclusão, a CHX injetada no espaço subplantar da pata traseira de camundongos induz efeitos tóxicos severos. Além disso, a CHX adicionada em cultura de fibroblastos causou estresse do retículo endoplasmático como consequência do acúmulo de proteínas nas cisternas e induziu a morte celular por necrose e apoptose via estresse do retículo endoplasmático, além de causar estresse celular. Os resultados sugerem que a CHX poderia ter um efeito desfavorável na resolução de lesões periapicais em decorrência de sua ação tóxica sobre as células do tecido em torno do ápice dentário. / Because chlorhexidine (CHX) has been recommended as either endodontic irrigant or root canal dressing, this study aimed to characterize in vivo the lesion induced by injection of CHX at concentrations of 0.125, 0.25, 0.5 and 1.0% in the paw of mice at selected time intervals (24 and 48 hours and 7 and 14 days) and in vitro the mode and the cause of cell death (necrosis and /or apoptosis), and the cellular stress caused by exposition of cultured L929 fibroblasts to ascending concentrations of the drug ( 0.000125, 0.00025, 0.0005, 0.001, 0.002, 0.004, 0.008 and 0.016%) for 24 hours. The cell proliferation assay was performed by measuring incorporation of metil-3H-thymidine to cell DNA and immunocytochemical staining analysis of PCNA. The cell ultrastructure was analyzed in transmission and scanning electron microscopes and the cell cytoskeleton by florescence analysis of actin and &#945;- tubulin. Apoptosis and necrosis were discriminated by flow cytometry with annexin V-FITC and PI. In addition endoplasmic reticulum, Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma 2), Hsp70 (heat shock protein 70) and Grp78 (glucoseregulated protein 78) were detected by fluorescence. CHX injected in the sub plantar space of the hind paw of mice induced necrotic changes in the epidermis, dermis and subcutaneous tissue in association with reactive inflammatory response, particularly at higher concentrations. In cultured fibroblasts, CHX decreased cellular proliferation, caused cell death by apoptosis and necrosis, disruption of the cytoskeleton, morphological cellular alterations, increased cells size (area), rough endoplasmic reticulum dilatation with accumulation of cysternal protein. In addition, CHX induced increased expression of Hsp 70, Grp78 (indicators of cellular stress) and Bcl-2 (anti-apoptotic protein). It was concluded that CHX injected in the sub plantar space of the hind paw of mice could induce severe toxic effect. In addition CHX caused endoplasmic reticulum stress as a consequence of accumulation of proteins in the endoplasmic reticulum cysterns and induced cell death by apoptosis and necrosis via endoplasmic reticulum stress and caused cellular stress. Taken together, these findings suggest that CHX may have an unfavorable effect on the resolution of apical periodontitis, due a toxic effect on the periapical tissue cells.

Como a clorexidina (CHX) tem sido recomendada como solução irrigadora de canais radiculares e como curativo de demora, o objetivo do presente estudo foi caracterizar in vivo a lesão induzida pela injeção de CHX a 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0% na pata de camundongos em intervalos de tempo selecionados (24 e 48 horas e 7 e 14 dias) e in vitro o modo e a causa morte celular (necrose e/ou apoptose) e o estresse causado pela exposição de fibroblastos L929 em cultura a concentrações crescentes da droga (0,000125, 0,00025, 0,0005, 0,001, 0,002, 0,004, 0,008 e 0,016%) por 24 horas. A proliferação celular foi avaliada por meio da incorporação de metil-3H-timidina ao DNA das células e imunomarcação para PCNA. A ultraestrutura foi analisada em microscópio eletrônico de transmissão e de varredura e o citoesqueleto das células por meio de marcação para actina e &#945;-tubulina. Citometria de fluxo (Anexina-V FITC/iodeto de propídeo) foi empregada para diferenciar células necróticas de apoptóticas. Também, foi efetuada marcação para retículo endoplasmático, Bcl-2 (B-célula CLL/linfoma 2), Hsp70 (proteína de choque térmico 70) e Grp78 (glucose-regulated protein 78). Quando injetada no espaço subplantar da pata traseira de camundongos, a CHX induziu alterações necróticas na epiderme, derme e tecido subcutâneo em associação com uma resposta inflamatória reacional, particularmente nas concentrações mais elevadas. Em cultura de fibroblastos, a CHX induziu a diminuição da proliferação celular, causou morte celular por apoptose e necrose, desestruturação do citoesqueleto, alteração da morfologia celular, aumento da área das células, dilatação do retículo endoplasmático rugoso e acúmulo de proteínas nas cisternas. Além disso, a CHX causou aumento da expressão de Hsp70, de Grp78 (indicadores de estresse celular) e de Bcl-2 (proteína anti-apoptótica). Em conclusão, a CHX injetada no espaço subplantar da pata traseira de camundongos induz efeitos tóxicos severos. Além disso, a CHX adicionada em cultura de fibroblastos causou estresse do retículo endoplasmático como consequência do acúmulo de proteínas nas cisternas e induziu a morte celular por necrose e apoptose via estresse do retículo endoplasmático, além de causar estresse celular. Os resultados sugerem que a CHX poderia ter um efeito desfavorável na resolução de lesões periapicais em decorrência de sua ação tóxica sobre as células do tecido em torno do ápice dentário. / Because chlorhexidine (CHX) has been recommended as either endodontic irrigant or root canal dressing, this study aimed to characterize in vivo the lesion induced by injection of CHX at concentrations of 0.125, 0.25, 0.5 and 1.0% in the paw of mice at selected time intervals (24 and 48 hours and 7 and 14 days) and in vitro the mode and the cause of cell death (necrosis and /or apoptosis), and the cellular stress caused by exposition of cultured L929 fibroblasts to ascending concentrations of the drug ( 0.000125, 0.00025, 0.0005, 0.001, 0.002, 0.004, 0.008 and 0.016%) for 24 hours. The cell proliferation assay was performed by measuring incorporation of metil-3H-thymidine to cell DNA and immunocytochemical staining analysis of PCNA. The cell ultrastructure was analyzed in transmission and scanning electron microscopes and the cell cytoskeleton by florescence analysis of actin and &#945;- tubulin. Apoptosis and necrosis were discriminated by flow cytometry with annexin V-FITC and PI. In addition endoplasmic reticulum, Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma 2), Hsp70 (heat shock protein 70) and Grp78 (glucoseregulated protein 78) were detected by fluorescence. CHX injected in the sub plantar space of the hind paw of mice induced necrotic changes in the epidermis, dermis and subcutaneous tissue in association with reactive inflammatory response, particularly at higher concentrations. In cultured fibroblasts, CHX decreased cellular proliferation, caused cell death by apoptosis and necrosis, disruption of the cytoskeleton, morphological cellular alterations, increased cells size (area), rough endoplasmic reticulum dilatation with accumulation of cysternal protein. In addition, CHX induced increased expression of Hsp 70, Grp78 (indicators of cellular stress) and Bcl-2 (anti-apoptotic protein). It was concluded that CHX injected in the sub plantar space of the hind paw of mice could induce severe toxic effect. In addition CHX caused endoplasmic reticulum stress as a consequence of accumulation of proteins in the endoplasmic reticulum cysterns and induced cell death by apoptosis and necrosis via endoplasmic reticulum stress and caused cellular stress. Taken together, these findings suggest that CHX may have an unfavorable effect on the resolution of apical periodontitis, due a toxic effect on the periapical tissue cells.

Atualmente, a obesidade é considerada uma epidemia mundial. Está associada a um estado de inflamação crônica e ativação do estresse do retículo endoplasmático (ERE), relacionados à patogênese de diversas doenças como diabetes mellitus tipo 2, doenças cardiovasculares, câncer, hipertensão, dentre outras. Nesse contexto, são necessários estudos para encontrar alternativas que melhorem o processo inflamatório. Vários estudos em humanos e animais já demostraram as propriedades anti-inflamatórias do ácido graxo ômega-3. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do ácido alfa-linolênico (ALA) no metabolismo e no estresse do retículo endoplasmático em obesos grau III. Foi conduzido um estudo prospectivo, randomizado, placebo-controlado, duplo-cego. No total, 52 pacientes foram randomizados para a suplementação com 3g/dia de ALA ou placebo, sendo 27 indivíduos do grupo ômega-3/ALA e 25 do grupo controle. Foi avaliado perfil lipídico, glicídico e inflamatório antes e após suplementação. O tecido adiposo visceral (TAV) foi coletado durante cirurgia bariátrica após suplementação. O perfil de ácidos graxos incorporados no TAV foi avaliado por cromatografia gasosa. Os genes foram avaliados através de PCR em tempo real. Não houve alteração nos níveis séricos de IL-6 (p=0,2201), TNF-? (0.7703) e PCR (p=0,57) após suplementação com ômega-3/ALA, porém observamos diminuição nos níveis séricos de Leptina (p=0.0154) e IP-10 (p=0.0410), citocinas inflamatórias, e aumento na IL-4 (p=0,0211), citocina anti-inflamatória. Foi observado incorporação significativa do ALA (p=0,0002), EPA (p<0,0001) e DHA (p=0,0005) no TAV. Avaliação molecular evidenciou um aumento da expressão gênica do XBP1 (p=0,0013), sXBP1 (p<0,0001), EIF2-? (p=0,0063) e da chaperona CCT4 (p=0,0001) e diminuição na expressão gênica da leptina (p=0,0410). Podemos concluir que o ALA pode modular o ERE através da via da IRE1/XBP, levando ao aumento das chaperonas (CCT4), o que pode demonstrar um potencial terapêutico do ALA em pacientes obesos. / Currently, obesity is considered a worldwide epidemic. It is associated with chronic inflammation and stress activation of the endoplasmic reticulum (ERE), related to the pathogenesis of various diseases such as type 2 diabetes mellitus, cardiovascular diseases, cancer, hypertension, among others. In this context, studies are needed to find alternatives that improve the inflammatory process. Several studies in humans and animals have already demonstrated the anti-inflammatory properties of omega-3 fatty acid. The objective of our study was to evaluate the effects of alpha-linolenic acid (ALA) supplementation on the metabolism and stress of the endoplasmic reticulum in obese patients. A prospective, randomized, placebo-controlled, double-blind study was conducted. In total, 52 patients were randomized to supplementation with 3 g / day of ALA or placebo, 27 individuals from the omega-3 / ALA group and 25 from the control group. Lipid, glycidic and inflammatory profile were evaluated before and after supplementation. Visceral adipose tissue (TAV) was collected during bariatric surgery after supplementation. The fatty acid profile incorporated in the TAV was evaluated by gas chromatography. Genes were evaluated by real-time PCR. There was no change in serum levels of IL-6 (p = 0.2201), TNF-? (0.7703) and CRP (p = 0.57) after supplementation with ALA, but we observed a decrease in serum Leptin levels (P = 0.0154) and IP-10 (p = 0.0410), inflammatory cytokines, and increase in IL-4 (p = 0.0211), anti-inflammatory cytokine. Significant incorporation of ALA (p = 0.0002), EPA (p <0.0001) and DHA (p = 0.0005) into the TAV was observed. Molecular evaluation showed an increase in the gene expression of XBP1 (p = 0.0013), sXBP1 (p <0.0001), EIF2-? (p = 0.0063), GADD34 (p=0,0117) and CCT4 chaperone (p = 0.0001), decrease in the gene expression of leptin (p = 0.0410) and ATF-6 (p=0,0305) and a tendency to decrease the gene expression of CHOP. We can conclude that ALA can modulate ERE through the IRE1 / XBP, PERK and ATF-6 pathways, leading to increased chaperones (CCT4), which may demonstrate a therapeutic potential of ALA in obese patients.