Em eucariotos, o processamento de pré-rRNA depende de vários fatores como endonucleases, exonucleases, RNA helicases, enzimas modificadoras de rRNA e componentes de snoRNPs. Com o objetivo de caracterizar novas proteínas envolvidas no processamento de pré-rRNA, foi identificada a proteína Nop53p interagindo com a proteína nucleolar Nop17p a partir de uma varredura da biblioteca de cDNAs de Saccharomyces cerevisiae. A cepa condicional contendo a seqüência da ORF NOP53 sob controle do promotor de galactose não cresce em meio contendo glicose, indicando que Nop53p seja uma proteína essencial para a viabilidade celular. Os resultados deste trabalho demonstram que Nop53p está envolvida nas etapas iniciais de clivagem do pré-rRNA, assim como nas clivagens responsáveis pela formação dos rRNAs maduros 5.8S e 25S. Análise mais detalhada do processamento de pré-RNA por Northern blot e \"pulse-chase labeling\", revelou também que Nop53p afeta principalmente o processamento do rRNA intermediário 27S, que origina os rRNAs maduros 5.8S e 25S. Nop53p participa do processamento desses rRNAs afetando a poliadenilação dos precursores dos rRNAs 5.8S e 25S. Experimentos de co-imunoprecipitação de RNA com a proteína de fusão ProtA-Nop53p confirmaram o envolvimento de Nop53p no processamento do 27S rRNA, indicando que essa proteína possa ligar RNA diretamente. A capacidade de Nop53p de ligar RNA foi confirmada através de testes in vitro, enquanto que ensaios de co-imunoprecipitação de cromatina revelaram que Nop53p liga-se ao rRNA 5.8S durante a transcrição. Nop53p regula a função do exossomo através da sua interação direta com a subunidade exclusivamente nuclear deste complexo, Rrp6p. / In eukaryotes, the rRNA processing depends on several factors, such as, endonucleases, exonucleases, RNA helicases, rRNA modifying enzymes and components of the snoRNPs. With the purpose of characterizing new proteins involved in pre-rRNA processing, Nop53p was identified interacting with the nucleolar protein Nop17p in a two hybrid assay. The conditional yeast strain containing the sequence of the ORF NOP53 under the control of the galactose promoter cannot grow in medium containing glucose, indicating that the protein is essential for cell viability. The results of this work demonstrate that Nop53p is involved in the initial steps of pre-rRNA processing and in the cleavages responsible for the formation of the mature rRNAs 5.8S and 25S. A more detailed analysis of the pre-rRNA processing, by Northern blot and pulse-chase labeling, revealed that Nop53p affects the processing of the 27S precursor, that originates the rRNAs 5.8S and 25S. Nop53p participates in the processing of these RNAs by affecting the polyadenylation of the precursors of the rRNAs 5.8S and 25S. RNA co-imunoprecipitation assays with the fusion protein A-Nop53p confirmed the involvement of Nop53p in the processing of the 27S pre-rRNA, indicating that the protein may interact directly with the RNA. The capacity of Nop53p to bind RNA was confirmed by in vitro assays, while chromatin imunoprecipitation assays demonstrated that Nop53p binds the 5.8S rRNA co- transcriptionally. Nop53p regulates the function of the exosome by interacting directly with the exclusively nuclear subunit of the complex, Rrp6p.

Introdução: Os anticorpos antiproteína P ribossomal (anti-P) são considerados marcadores sorológicos específicos do Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) e estão associados a acometimento hepático nesta doença. As semelhanças entre a hepatite autoimune (HAI) e a hepatite associada ao LES levou ao questionamento se o anticorpo anti-P também estaria presente na HAI. Objetivo: Avaliar a frequência e significância clínica do anticorpo anti-P em uma grande coorte de pacientes com HAI. Métodos: Foram analisados os soros de 96 pacientes com HAI, coletados no diagnóstico e comparados com 82 soros de indivíduos saudáveis. Todos os soros foram testados para a presença do anticorpo anti-P pelo método de ELISA, do anticorpo anti-DNA de dupla fita pelo método de imunofluorescência indireta usando Crithidia luciliae e do anticorpo anti-Sm pelo método de ELISA. Os critérios de exclusão adotados foram a presença de outros anticorpos específicos de LES como o anti-DNA de dupla fita (n=1) e o anti-Sm (n=2) ou se o paciente apresentasse o diagnóstico de LES definido pelo Colégio Americano de Reumatologia (n=0). Os prontuários médicos foram revisados para dados demográficos, clínicos e resultados de exames laboratoriais relacionados a hepatopatia e anticorpos específicos de HAI. Resultado: Títulos moderados ou alto (> 40 U) de anti-P foram encontrados em 9,7% (9/93) dos pacientes com HAI e em nenhum dos controles (p = 0,003). No diagnóstico, os pacientes com anti-P positivo ou negativo apresentavam características demográficas/clínicas semelhantes, como a frequência de cirrose (44,4% vs 28,5%, p = 0,44) e exames laboratoriais relacionados a hepatite (p > 0,05). Entretanto, ao final do seguimento destes pacientes (média de 10,2 ± 4,9 anos), os pacientes positivos para anticorpos anti-P apresentaram uma maior frequência de cirrose quando comparados a pacientes negativos para anti-P (100% vs 60%, p = 0,04). Conclusão: a demonstração da presença do anticorpo anti-P em pacientes com HAI sem evidência de LES sugere um mecanismo comum de acometimento hepático nestas duas doenças. Além disso, a presença deste anticorpo parece predizer um pior prognóstico nos pacientes com HAI / Background: Autoantibodies to ribosomal P proteins (anti-rib P) are specific serological markers for systemic lupus erythematosus (SLE) and are associated with liver involvement in this disease. The similarity in autoimmune background between autoimmune hepatitis (AIH) and SLE- associated hepatitis raises the possibility that anti-rib P antibodies might also have relevance in AIH. Aims: To evaluate the frequency and clinical significance of anti-rib P antibodies in a large AIH cohort. Methods: Sera obtained at diagnosis of 96 AIH patients and of 82 healthy controls were tested for IgG anti-ribosomal P protein by ELISA. All of the sera were also screened for other lupus-specific autoantibodies, three patients with the presence of anti-dsDNA (n=1) and anti-Sm (n = 2) were excluded. Results: Moderate to high titers (> 40 U) of anti-rib P antibody were found in 9.7% (9/93) of the AIH patients and none of the controls (P = 0.003). At presentation, AIH patients with and without anti-rib P antibodies had similar demographic/clinical features, including the frequency of cirrhosis (44.4% vs. 28.5%, P = 0.44), hepatic laboratorial findings (p > 0.05). Importantly, at the final observation (follow-up period 10.2 ± 4.9 years), the AIH patients with anti-rib P had a significantly higher frequency of cirrhosis compared to the negative group (100% vs. 60%, P = 0.04). Conclusion: The novel demonstration of anti-rib P in AIH patients without clinical or laboratory evidence of SLE suggests a common underlying mechanism targeting the liver in these two diseases. In addition, this antibody appears to predict the patients with worse AIH prognoses

Introdução: Os anticorpos antiproteína P ribossomal (anti-P) são considerados marcadores sorológicos específicos do Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) e estão associados a acometimento hepático nesta doença. As semelhanças entre a hepatite autoimune (HAI) e a hepatite associada ao LES levou ao questionamento se o anticorpo anti-P também estaria presente na HAI. Objetivo: Avaliar a frequência e significância clínica do anticorpo anti-P em uma grande coorte de pacientes com HAI. Métodos: Foram analisados os soros de 96 pacientes com HAI, coletados no diagnóstico e comparados com 82 soros de indivíduos saudáveis. Todos os soros foram testados para a presença do anticorpo anti-P pelo método de ELISA, do anticorpo anti-DNA de dupla fita pelo método de imunofluorescência indireta usando Crithidia luciliae e do anticorpo anti-Sm pelo método de ELISA. Os critérios de exclusão adotados foram a presença de outros anticorpos específicos de LES como o anti-DNA de dupla fita (n=1) e o anti-Sm (n=2) ou se o paciente apresentasse o diagnóstico de LES definido pelo Colégio Americano de Reumatologia (n=0). Os prontuários médicos foram revisados para dados demográficos, clínicos e resultados de exames laboratoriais relacionados a hepatopatia e anticorpos específicos de HAI. Resultado: Títulos moderados ou alto (> 40 U) de anti-P foram encontrados em 9,7% (9/93) dos pacientes com HAI e em nenhum dos controles (p = 0,003). No diagnóstico, os pacientes com anti-P positivo ou negativo apresentavam características demográficas/clínicas semelhantes, como a frequência de cirrose (44,4% vs 28,5%, p = 0,44) e exames laboratoriais relacionados a hepatite (p > 0,05). Entretanto, ao final do seguimento destes pacientes (média de 10,2 ± 4,9 anos), os pacientes positivos para anticorpos anti-P apresentaram uma maior frequência de cirrose quando comparados a pacientes negativos para anti-P (100% vs 60%, p = 0,04). Conclusão: a demonstração da presença do anticorpo anti-P em pacientes com HAI sem evidência de LES sugere um mecanismo comum de acometimento hepático nestas duas doenças. Além disso, a presença deste anticorpo parece predizer um pior prognóstico nos pacientes com HAI / Background: Autoantibodies to ribosomal P proteins (anti-rib P) are specific serological markers for systemic lupus erythematosus (SLE) and are associated with liver involvement in this disease. The similarity in autoimmune background between autoimmune hepatitis (AIH) and SLE- associated hepatitis raises the possibility that anti-rib P antibodies might also have relevance in AIH. Aims: To evaluate the frequency and clinical significance of anti-rib P antibodies in a large AIH cohort. Methods: Sera obtained at diagnosis of 96 AIH patients and of 82 healthy controls were tested for IgG anti-ribosomal P protein by ELISA. All of the sera were also screened for other lupus-specific autoantibodies, three patients with the presence of anti-dsDNA (n=1) and anti-Sm (n = 2) were excluded. Results: Moderate to high titers (> 40 U) of anti-rib P antibody were found in 9.7% (9/93) of the AIH patients and none of the controls (P = 0.003). At presentation, AIH patients with and without anti-rib P antibodies had similar demographic/clinical features, including the frequency of cirrhosis (44.4% vs. 28.5%, P = 0.44), hepatic laboratorial findings (p > 0.05). Importantly, at the final observation (follow-up period 10.2 ± 4.9 years), the AIH patients with anti-rib P had a significantly higher frequency of cirrhosis compared to the negative group (100% vs. 60%, P = 0.04). Conclusion: The novel demonstration of anti-rib P in AIH patients without clinical or laboratory evidence of SLE suggests a common underlying mechanism targeting the liver in these two diseases. In addition, this antibody appears to predict the patients with worse AIH prognoses

As Proteínas Inativadoras de Ribossomos (RIPs) compreendem uma família de enzimas que inibem a síntese protéica através da depurinação de uma adenina específica do RNA ribossomal. Os membros desta família são classificados como RIPs do tipo I, quando possuem somente o RNA-N-Glicosidase e RIPs do tipo II quando além do domínio glicosidase, também apresentam um domínio de lectina. As RIPs foram mais estudadas em plantas, onde a ricina e a aglutinina, ambas RIP do tipo II de mamona (Ricinus communis), estão entre as primeiras descritas. O presente trabalho teve o objetivo de identificar parálogos da ricina e aglutinina, bem como RIPs do tipo I de mamona e analisar as suas relações filogenéticas. Além disso, validar o uso de 14 potenciais genes de referência para qRT-PCR em cinco estádios do desenvolvimento da semente de mamona. O padrão de expressão gênica por RT-qPCR de todas RIPs de mamona identificadas, também foram analisados nestes mesmos estádios. Um total de 18 genes de RIPs foi identificado em mamona (Rcom RIPs), dos quais 10 foram classificados como do tipo II e 8 do tipo I. As topologias das árvores filogenéticas sugerem que as Rcom RIPs foram originadas a partir de múltiplos eventos de duplicação gênica. Dois modelos evolutivos foram propostos para a radiação das Rcom RIPs, baseados em processos de fusão gênica associado ou não a eventos de duplicação parcial. Os genes Act 2/7, EF β, Ubi, TIP e UBC foram os que apresentaram perfil de expressão mais estável e foram selecionados para subsequente normalização dos dados de expressão das Rcom RIPs. Os genes que codificam as Rcom RIPI 3, 4, 5, 7 e 8 e as Rcom RIPII 1, 2, 4, 5, 6 e 8 são transcritos em sementes, sendo que a Rcom RIPII 1 (ricina) e a Rcom RIPII 2 (aglutinina) foram as mais expressas. O presente trabalho apresenta um modelo evolutivo das Rcom RIPs, o qual pode ser extrapolado para outras espécies de plantas. Este trabalho também demonstra o primeiro esforço para a padronização de genes de referência para RT-qPCR em mamona e o primeiro que apresenta a expressão outras Rcom RIPs, além da ricina e aglutinina. / Ribosome inactivating proteins (RIPs) comprise a family of enzymes that inhibit protein synthesis, after depurination of an adenine-specific ribosomal RNA. The members of this family are classified as type I RIPs, which have a RNA-Nglycosidase domain and type II RIPs encompassing a RNA-N-glycosidase and a lectin domain.The RIPs were more studied in plants, where ricin and agglutinin, both type II RIP of castor bean (Ricinus communis), were the first to be described. This work aimed to: 1) identifine paralogous of ricin and agglutinin, as well as the type I RIPs of castor bean; 2) analyze their phylogenetic relationships; 3) validate the use of 14 potential housekeeping genes for qRT-PCR for five developmental stages of R. communis seeds; 4) analyze the pattern of gene expression by RTqPCR of all RIPs castor identified in these same stages. A total of 18 genes that encode RIPs were identified in castor bean (Rcom RIPs), 10 of which were classified as type II and 8 as type I. The phylogenetic trees topologies suggest that Rcom RIPs were originated from multiple events of gene duplications. Two evolutionary models have been proposed for the radiation of Rcom RIPs based on gene fusion processes associated or not to events of partial duplication. The genes Act 2/7, EF β, Ubi, TIP and UBC presented the more stable expression profile and were selected for further RT- qPCR normalization experiments. The Rcom RIPI 3, 4, 5, 7 and 8 and Rcom RIPI 1, 2, 4, 5, 6 and 8 genes are actively transcribed in seeds, whereas the Rcom RIPI 1 (ricin) and Rcom RIPI 2 (agglutinin) were the most expressed. This paper presents an evolutionary model of Rcom RIPs, which can be extrapolated to other plant species. Also, corresponds to the first effort to standardize housekeeping genes for RT-qPCR in castor bean and the first that shows the expression Rcom RIPs, other than ricin and agglutinin.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-20Bitstream added on 2014-06-13T20:40:27Z : No. of bitstreams: 1 matos_dc_dr_arafcf.pdf: 766440 bytes, checksum: d75671cd6c4bdad30b7d9a66e5d5621d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O termo “câncer” corresponde ao conjunto de cerca de 100 doenças que têm em comum uma divisão celular desordenada invadindo os tecidos e órgãos, podendo metastatisar para outras regiões do corpo. Os tumores de mama e de colo do útero são os tipos mais frequentes no sexo feminino, e as estimativas para 2012, no Brasil, são de 52.680 e 17.540 novos casos, respectivamente. Abrina, obtida de sementes de Abrus precatorius é uma proteína inativadora de ribossomos (RIPs) do tipo 2, compostas por duas cadeias peptídicas, uma apresentando atividade enzimática N-glicosidase e a outra atividade lectínica com afinidade a β-D-galactose. Neste estudo, avaliamos o potencial antitumoral contra o câncer de mama de abrina em um modelo de câncer mamário murino já estabelecido em nosso laboratório, concomitante à avaliação dos efeitos imunológicos do tumor e da proteína testada no animal. Para isso avaliamos a partir dos tumores e células do sistema imunológico retirados dos animais do estudo, o percentual de inibição do crescimento e angiogênese tumorais, o percentual de células imunes e de células apoptóticas no peritôneo e baço, a produção de citocinas e mediadores químicos produzidos pelas células imunes. Com base nos resultados obtidos, observou-se que o tratamento com abrina (7,5μg/kg) apresentou eficácia similar ao da droga padrão pois apresentou infiltrado inflamatório misto dentro tumor, percentuais de inibição de crescimento e de angiogênese tumorais, e de células NK e NKT esplênicas similares ao tratamento padrão (doxorrubicina - 6mg/kg); em contrapartida apresentou menor quantidade de macrófagos peritoneais e células dendríticas esplênicas ativadas, células T CD8+ citotóxicas e células T regs (CD25+Foxp3+), e maior percentual de células T CD4+, maior produção de H2O2, IL- 1β, IL-6 e IL-12 por células peritoneais... / The word Cancer corresponds to a group with about 100 diseases which have in common a disordered cell division, resulting in tissues and organs invasion and also metastasis to other body regions. Breast and cervix tumours are the most common type in women and, in Brazil, the estimates for 2012 are of 52,680 and 17,540 new cases respectively. Abrin is obtained from Abrus precatorius seeds being type 2 ribosome inactivating protein (RIP) composed of two peptide chains, one of them possessing N-glycosylase enzyme activity and the other a lectinic activity with affinity for β-D-galactose. In the present work, the antitumour potencial of abrin against breast cancer was evaluated employing a murine breast cancer model already established in our laboratory and concomitantly determining the immunologic effects of the tumour and the protein in mice. From tumours and immune cells isolated from mice belonging to the different experimental groups, the tumour growth inhibition rate and angiogenesis were determined, the percentage of immune and apoptotic cells in the peritoneum and spleen, and also the production of immunologic mediators by immune cells. Based on the results it was found that treatment with abrin (7.5μg/kg) was as effective as the standard drug (doxorubicin - 6 mg/kg) considering that inflammatory tumour infiltrate, tumour growth inhibition and angiogenesis rate, as well as splenic NK and NKT cells percentage were similar. However, abrin-treated animals had a lower percentage of cytotoxic CD8+ and Treg (CD25+Foxp3+) cells as well as activated peritoneal macrophages and splenic dendritic cells accompanied by a higher percentage of CD4+ T cells and increased production of H2O2, IL-1β, IL-6 and Il-12 by peritoneal macrophages and IL-10, IFNγ and TGF-β by splenic lymphocytes. Moreover, abrin-treated animals presented a higher percentage... (Complete abstract click electronic access below)

As Proteínas Inativadoras de Ribossomos (RIPs) compreendem uma família de enzimas que inibem a síntese protéica através da depurinação de uma adenina específica do RNA ribossomal. Os membros desta família são classificados como RIPs do tipo I, quando possuem somente o RNA-N-Glicosidase e RIPs do tipo II quando além do domínio glicosidase, também apresentam um domínio de lectina. As RIPs foram mais estudadas em plantas, onde a ricina e a aglutinina, ambas RIP do tipo II de mamona (Ricinus communis), estão entre as primeiras descritas. O presente trabalho teve o objetivo de identificar parálogos da ricina e aglutinina, bem como RIPs do tipo I de mamona e analisar as suas relações filogenéticas. Além disso, validar o uso de 14 potenciais genes de referência para qRT-PCR em cinco estádios do desenvolvimento da semente de mamona. O padrão de expressão gênica por RT-qPCR de todas RIPs de mamona identificadas, também foram analisados nestes mesmos estádios. Um total de 18 genes de RIPs foi identificado em mamona (Rcom RIPs), dos quais 10 foram classificados como do tipo II e 8 do tipo I. As topologias das árvores filogenéticas sugerem que as Rcom RIPs foram originadas a partir de múltiplos eventos de duplicação gênica. Dois modelos evolutivos foram propostos para a radiação das Rcom RIPs, baseados em processos de fusão gênica associado ou não a eventos de duplicação parcial. Os genes Act 2/7, EF β, Ubi, TIP e UBC foram os que apresentaram perfil de expressão mais estável e foram selecionados para subsequente normalização dos dados de expressão das Rcom RIPs. Os genes que codificam as Rcom RIPI 3, 4, 5, 7 e 8 e as Rcom RIPII 1, 2, 4, 5, 6 e 8 são transcritos em sementes, sendo que a Rcom RIPII 1 (ricina) e a Rcom RIPII 2 (aglutinina) foram as mais expressas. O presente trabalho apresenta um modelo evolutivo das Rcom RIPs, o qual pode ser extrapolado para outras espécies de plantas. Este trabalho também demonstra o primeiro esforço para a padronização de genes de referência para RT-qPCR em mamona e o primeiro que apresenta a expressão outras Rcom RIPs, além da ricina e aglutinina. / Ribosome inactivating proteins (RIPs) comprise a family of enzymes that inhibit protein synthesis, after depurination of an adenine-specific ribosomal RNA. The members of this family are classified as type I RIPs, which have a RNA-Nglycosidase domain and type II RIPs encompassing a RNA-N-glycosidase and a lectin domain.The RIPs were more studied in plants, where ricin and agglutinin, both type II RIP of castor bean (Ricinus communis), were the first to be described. This work aimed to: 1) identifine paralogous of ricin and agglutinin, as well as the type I RIPs of castor bean; 2) analyze their phylogenetic relationships; 3) validate the use of 14 potential housekeeping genes for qRT-PCR for five developmental stages of R. communis seeds; 4) analyze the pattern of gene expression by RTqPCR of all RIPs castor identified in these same stages. A total of 18 genes that encode RIPs were identified in castor bean (Rcom RIPs), 10 of which were classified as type II and 8 as type I. The phylogenetic trees topologies suggest that Rcom RIPs were originated from multiple events of gene duplications. Two evolutionary models have been proposed for the radiation of Rcom RIPs based on gene fusion processes associated or not to events of partial duplication. The genes Act 2/7, EF β, Ubi, TIP and UBC presented the more stable expression profile and were selected for further RT- qPCR normalization experiments. The Rcom RIPI 3, 4, 5, 7 and 8 and Rcom RIPI 1, 2, 4, 5, 6 and 8 genes are actively transcribed in seeds, whereas the Rcom RIPI 1 (ricin) and Rcom RIPI 2 (agglutinin) were the most expressed. This paper presents an evolutionary model of Rcom RIPs, which can be extrapolated to other plant species. Also, corresponds to the first effort to standardize housekeeping genes for RT-qPCR in castor bean and the first that shows the expression Rcom RIPs, other than ricin and agglutinin.

As Proteínas Inativadoras de Ribossomos (RIPs) compreendem uma família de enzimas que inibem a síntese protéica através da depurinação de uma adenina específica do RNA ribossomal. Os membros desta família são classificados como RIPs do tipo I, quando possuem somente o RNA-N-Glicosidase e RIPs do tipo II quando além do domínio glicosidase, também apresentam um domínio de lectina. As RIPs foram mais estudadas em plantas, onde a ricina e a aglutinina, ambas RIP do tipo II de mamona (Ricinus communis), estão entre as primeiras descritas. O presente trabalho teve o objetivo de identificar parálogos da ricina e aglutinina, bem como RIPs do tipo I de mamona e analisar as suas relações filogenéticas. Além disso, validar o uso de 14 potenciais genes de referência para qRT-PCR em cinco estádios do desenvolvimento da semente de mamona. O padrão de expressão gênica por RT-qPCR de todas RIPs de mamona identificadas, também foram analisados nestes mesmos estádios. Um total de 18 genes de RIPs foi identificado em mamona (Rcom RIPs), dos quais 10 foram classificados como do tipo II e 8 do tipo I. As topologias das árvores filogenéticas sugerem que as Rcom RIPs foram originadas a partir de múltiplos eventos de duplicação gênica. Dois modelos evolutivos foram propostos para a radiação das Rcom RIPs, baseados em processos de fusão gênica associado ou não a eventos de duplicação parcial. Os genes Act 2/7, EF β, Ubi, TIP e UBC foram os que apresentaram perfil de expressão mais estável e foram selecionados para subsequente normalização dos dados de expressão das Rcom RIPs. Os genes que codificam as Rcom RIPI 3, 4, 5, 7 e 8 e as Rcom RIPII 1, 2, 4, 5, 6 e 8 são transcritos em sementes, sendo que a Rcom RIPII 1 (ricina) e a Rcom RIPII 2 (aglutinina) foram as mais expressas. O presente trabalho apresenta um modelo evolutivo das Rcom RIPs, o qual pode ser extrapolado para outras espécies de plantas. Este trabalho também demonstra o primeiro esforço para a padronização de genes de referência para RT-qPCR em mamona e o primeiro que apresenta a expressão outras Rcom RIPs, além da ricina e aglutinina. / Ribosome inactivating proteins (RIPs) comprise a family of enzymes that inhibit protein synthesis, after depurination of an adenine-specific ribosomal RNA. The members of this family are classified as type I RIPs, which have a RNA-Nglycosidase domain and type II RIPs encompassing a RNA-N-glycosidase and a lectin domain.The RIPs were more studied in plants, where ricin and agglutinin, both type II RIP of castor bean (Ricinus communis), were the first to be described. This work aimed to: 1) identifine paralogous of ricin and agglutinin, as well as the type I RIPs of castor bean; 2) analyze their phylogenetic relationships; 3) validate the use of 14 potential housekeeping genes for qRT-PCR for five developmental stages of R. communis seeds; 4) analyze the pattern of gene expression by RTqPCR of all RIPs castor identified in these same stages. A total of 18 genes that encode RIPs were identified in castor bean (Rcom RIPs), 10 of which were classified as type II and 8 as type I. The phylogenetic trees topologies suggest that Rcom RIPs were originated from multiple events of gene duplications. Two evolutionary models have been proposed for the radiation of Rcom RIPs based on gene fusion processes associated or not to events of partial duplication. The genes Act 2/7, EF β, Ubi, TIP and UBC presented the more stable expression profile and were selected for further RT- qPCR normalization experiments. The Rcom RIPI 3, 4, 5, 7 and 8 and Rcom RIPI 1, 2, 4, 5, 6 and 8 genes are actively transcribed in seeds, whereas the Rcom RIPI 1 (ricin) and Rcom RIPI 2 (agglutinin) were the most expressed. This paper presents an evolutionary model of Rcom RIPs, which can be extrapolated to other plant species. Also, corresponds to the first effort to standardize housekeeping genes for RT-qPCR in castor bean and the first that shows the expression Rcom RIPs, other than ricin and agglutinin.

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Danielle Cardoso Geraldo Maia / Banca: Ana Paula Ulian de Araújo / Banca: Luis Carlos Spolidorio / Banca: Luciana Simon Pereira Crott / Resumo: O termo "câncer" corresponde ao conjunto de cerca de 100 doenças que têm em comum uma divisão celular desordenada invadindo os tecidos e órgãos, podendo metastatisar para outras regiões do corpo. Os tumores de mama e de colo do útero são os tipos mais frequentes no sexo feminino, e as estimativas para 2012, no Brasil, são de 52.680 e 17.540 novos casos, respectivamente. Abrina, obtida de sementes de Abrus precatorius é uma proteína inativadora de ribossomos (RIPs) do tipo 2, compostas por duas cadeias peptídicas, uma apresentando atividade enzimática N-glicosidase e a outra atividade lectínica com afinidade a β-D-galactose. Neste estudo, avaliamos o potencial antitumoral contra o câncer de mama de abrina em um modelo de câncer mamário murino já estabelecido em nosso laboratório, concomitante à avaliação dos efeitos imunológicos do tumor e da proteína testada no animal. Para isso avaliamos a partir dos tumores e células do sistema imunológico retirados dos animais do estudo, o percentual de inibição do crescimento e angiogênese tumorais, o percentual de células imunes e de células apoptóticas no peritôneo e baço, a produção de citocinas e mediadores químicos produzidos pelas células imunes. Com base nos resultados obtidos, observou-se que o tratamento com abrina (7,5μg/kg) apresentou eficácia similar ao da droga padrão pois apresentou infiltrado inflamatório misto dentro tumor, percentuais de inibição de crescimento e de angiogênese tumorais, e de células NK e NKT esplênicas similares ao tratamento padrão (doxorrubicina - 6mg/kg); em contrapartida apresentou menor quantidade de macrófagos peritoneais e células dendríticas esplênicas ativadas, células T CD8+ citotóxicas e células T regs (CD25+Foxp3+), e maior percentual de células T CD4+, maior produção de H2O2, IL- 1β, IL-6 e IL-12 por células peritoneais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The word "Cancer" corresponds to a group with about 100 diseases which have in common a disordered cell division, resulting in tissues and organs invasion and also metastasis to other body regions. Breast and cervix tumours are the most common type in women and, in Brazil, the estimates for 2012 are of 52,680 and 17,540 new cases respectively. Abrin is obtained from Abrus precatorius seeds being type 2 ribosome inactivating protein (RIP) composed of two peptide chains, one of them possessing N-glycosylase enzyme activity and the other a lectinic activity with affinity for β-D-galactose. In the present work, the antitumour potencial of abrin against breast cancer was evaluated employing a murine breast cancer model already established in our laboratory and concomitantly determining the immunologic effects of the tumour and the protein in mice. From tumours and immune cells isolated from mice belonging to the different experimental groups, the tumour growth inhibition rate and angiogenesis were determined, the percentage of immune and apoptotic cells in the peritoneum and spleen, and also the production of immunologic mediators by immune cells. Based on the results it was found that treatment with abrin (7.5μg/kg) was as effective as the standard drug (doxorubicin - 6 mg/kg) considering that inflammatory tumour infiltrate, tumour growth inhibition and angiogenesis rate, as well as splenic NK and NKT cells percentage were similar. However, abrin-treated animals had a lower percentage of cytotoxic CD8+ and Treg (CD25+Foxp3+) cells as well as activated peritoneal macrophages and splenic dendritic cells accompanied by a higher percentage of CD4+ T cells and increased production of H2O2, IL-1β, IL-6 and Il-12 by peritoneal macrophages and IL-10, IFNγ and TGF-β by splenic lymphocytes. Moreover, abrin-treated animals presented a higher percentage... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Mário Henrique Bengtson / Banca: Erich Birelli Tahara / Banca: Iran Malavazi / Banca: Flávio Henrique da Silva / Resumo: O fator de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que sofre uma modificação pós-traducional que gera um resíduo de hipusina, essencial para sua função. Apesar de eIF5A já ter sido envolvida em diferentes vias celulares, estudos mais recentes reforçam seu papel no processo de síntese proteica, mais especificamente na etapa de elongação da tradução. Resultados do nosso grupo revelaram uma relação funcional entre eIF5A e o Fator de Elongação da Tradução 2 (eEF2). No intuito de melhor compreender o papel de eIF5A com o processo de elongação da tradução, o presente trabalho buscou aprofundar os estudos de interação física entre eIF5A e eEF2. Foi mostrado que eIF5A não interage fisicamente de forma direta com eEF2 e que a interação física destes dois fatores é dependente de complexos ribossomais. Ainda, foi revelado que eIF5A e eEF2 não estão presentes no ribossomo simultaneamente ou não ocupam o mesmo ribossomo por muito tempo. Além disso, como foi mostrado que o homólogo de eIF5A em bactéria, EF-P, interage físicamente com a proteína ribossomal L1, foi investigada a relação funcional entre eIF5A e L1 em levedura. Os resultados obtidos mostraram uma forte interação genética entre estes fatores e uma possível dependência da presença de L1 para a ligação de eIF5A no ribossomo. Por fim, como foi mostrado que eIF5A é necessária para a tradução de sequências de prolinas, as quais causam stalling do ribossomo durante a tradução, e que outros tipos de stalling do ribossomo recrutam e ativam o complexo Ribossome Quality Control (RQC), foi estudada também a interação funcional entre o eIF5A e os fatores do RQC, Ltn1 e Tae2. Apesar de ter sido identificada interação genética entre mutantes de eIF5A e destes fatores... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid residue hypusine, generated by a post-translational modification. Although eIF5A has been involved in different cellular pathways, recent studies have strengthened its role in protein synthesis, more specifically in the translation elongation step. Results of our group revealed a functional correlation between eIF5A and the Translation Elongation Factor 2 (eEF2). To further investigate the role of eIF5A in translation elongation, we carried out new experiments to study the physical interaction between eIF5A and eEF2. eIF5A does not interact directly with eEF2 and their physical interaction is dependent on ribosomal complexes. Moreover, eIF5A and eEF2 do not bind simultaneously to the same ribosome or they do not occupy the same ribosome for a long time. Additionally, as it was shown that the homolog of eIF5A in bacteria, EF-P, interacts physically with the Large Ribosome Protein 1 (L1). We evaluated a functional interaction between eIF5A and L1. The results demonstrated a strong genetic interaction between these factors and a possible dependency of L1 in the eIF5A ribosome binding. Finally, as eIF5A was recently involved in translation of polyproline stretches, which cause ribosome stalling, and other types of ribosome stalling recruit and activate the Ribosome Quality Control (RQC) complex, we also investigated the functional interaction between eIF5A and the RQC factors Ltn1 and Tae2. Although it was identified genetic interaction between mutants of eIF5A and mutants of these RQC factors, ribosome stalled at polyproline residues does not recruit the RQC complex. Curiously, it was observed that eIF5A is important for the formation of cellular aggregates... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:37:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morello_LuisGustavo_D.pdf: 80024877 bytes, checksum: 1848ac9901b4322b786b1dcd7a521a69 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram a interação entre as proteínas humanas SBDS e NIP7. SBDS participa da biogênese de ribossomos e sua deficiência está associada à síndrome de Shwachman- Bodian-Diamond. NIP7 é uma proteína conservada e já foi caracterizada em levedura, onde participa da formação da subunidade ribossomal 60S. Neste trabalho, nós investigamos o papel de NIP7 na síntese de ribossomos em células humanas. A depleção de NIP7 revelou defeitos no processamento do pré-rRNA associado à produção do rRNA 18S, causando déficit na formação da subunidade ribossomal 40S. Essa divergência de resultados entre a função de NIP7 em levedura e células humanas é consistente com o fato de que NIP7 humana não complementa levedura deficiente em Nip7p. Ainda, um rastreamento em sistema de duplo-híbrido tendo NIP7 humana como isca revelou parceiros de interação diferentes daqueles reportados para Nip7p em levedura. FTSJ3 foi a parceira isolada com maior frequência. FTSJ3 é a provável ortóloga de Spb1p em levedura, a qual está envolvida na formação da subunidade ribossomal 60S. A associação entre FTSJ3 e NIP7 foi demonstrada por ensaios de pull-down e imunoprecipitação, como sendo dependente de RNA. A co-localização nucleolar e co-sedimentação dessas proteínas em fracionamento em gradiente de sacarose corroboram a associação. Além disso, células humanas deficientes em FTSJ3 revelaram defeitos na via de maturação do rRNA 18S, mesma via afetada pela depleção de NIP7. Em adição, a caracterização proteômica de complexos contendo FTSJ3 e NIP7 revelaram que essas proteínas co-purificam complexos pré-ribossomais. Uma comparação entre o conjunto de proteínas que interagem com Spb1p e as proteínas identificadas nos ensaios de pull-down com FLAG-FTSJ3 revelou que elas apresentam apenas um ortólogo em comum, o qual, incrivelmente, é Nip7/NIP7. Essas observações revelaram diferenças significativas na função desses fatores durante a síntese de ribossomos em levedura e células humanas, adicionando NIP7 e FTSJ3 na lista crescente de fatores com funções divergentes nas vias de processamento do rRNA em levedura e humanos / Abstract: Previous studies from our laboratory have demonstrated the interaction between the SBDS and NIP7 human proteins. SBDS play a role in ribosome biogenesis and its deficiency is associated to the Shwachman-Bodian-Diamond syndrome. NIP7 is a conserved protein and has already been characterized in yeast, where it participates in the 60S ribosomal subunit formation. In this work, we investigated the role of NIP7 in ribosome biogenesis in human cells. NIP7 knockdown caused pre-rRNA processing defects associated to the 18S rRNA maturation, leading to deficiency in 40S ribosomal subunit synthesis. The divergence between NIP7 function in yeast and human cells is further supported by the fact that human NIP7 does not complement yeast deficient in Nip7p. In addition, a two-hybrid screen using human NIP7 as bait revealed interaction partners different from those reported for yeast Nip7p. FTSJ3 was isolated as one of the most frequent human NIP7-interacting candidates. FTSJ3 is a putative ortholog of yeast Spb1p, which has been implicated in 60S ribosomal subunit synthesis. The association between FTSJ3 and NIP7 was showed by pull-down and immunoprecipitation assays as an RNA-dependent interaction. Nucleolar colocalization and co-sedimentation on a sucrose gradiente fractionation corroborate this association. Furthermore, RNAi-mediated knockdown revealed that depletion of FTSJ3 causes pre-rRNA processing defects in the pathway leading to 18S rRNA maturation, the same pathway affected by NIP7 downregulation. In additon, proteomic characterization of FTSJ3- and NIP7- containing complexes showed that these proteins copurify pre-ribosomal complexes. A comparison of the set of Spb1p-interacting proteins with the proteins identified in the pulldown with FLAG-FTSJ3 showed that they share only one ortholog which, incredibly, is Nip7/NIP7. These observations revealed significant differences in the function of these factors during the synthesis of ribosomes in yeast and human cells, adding NIP7 and FTSJ3 to the growing list of factors with different functions in yeast and human rRNA processing pathways / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular