Em eucariotos, o processamento de pré-rRNA depende de vários fatores como endonucleases, exonucleases, RNA helicases, enzimas modificadoras de rRNA e componentes de snoRNPs. Com o objetivo de caracterizar novas proteínas envolvidas no processamento de pré-rRNA, foi identificada a proteína Nop53p interagindo com a proteína nucleolar Nop17p a partir de uma varredura da biblioteca de cDNAs de Saccharomyces cerevisiae. A cepa condicional contendo a seqüência da ORF NOP53 sob controle do promotor de galactose não cresce em meio contendo glicose, indicando que Nop53p seja uma proteína essencial para a viabilidade celular. Os resultados deste trabalho demonstram que Nop53p está envolvida nas etapas iniciais de clivagem do pré-rRNA, assim como nas clivagens responsáveis pela formação dos rRNAs maduros 5.8S e 25S. Análise mais detalhada do processamento de pré-RNA por Northern blot e \"pulse-chase labeling\", revelou também que Nop53p afeta principalmente o processamento do rRNA intermediário 27S, que origina os rRNAs maduros 5.8S e 25S. Nop53p participa do processamento desses rRNAs afetando a poliadenilação dos precursores dos rRNAs 5.8S e 25S. Experimentos de co-imunoprecipitação de RNA com a proteína de fusão ProtA-Nop53p confirmaram o envolvimento de Nop53p no processamento do 27S rRNA, indicando que essa proteína possa ligar RNA diretamente. A capacidade de Nop53p de ligar RNA foi confirmada através de testes in vitro, enquanto que ensaios de co-imunoprecipitação de cromatina revelaram que Nop53p liga-se ao rRNA 5.8S durante a transcrição. Nop53p regula a função do exossomo através da sua interação direta com a subunidade exclusivamente nuclear deste complexo, Rrp6p. / In eukaryotes, the rRNA processing depends on several factors, such as, endonucleases, exonucleases, RNA helicases, rRNA modifying enzymes and components of the snoRNPs. With the purpose of characterizing new proteins involved in pre-rRNA processing, Nop53p was identified interacting with the nucleolar protein Nop17p in a two hybrid assay. The conditional yeast strain containing the sequence of the ORF NOP53 under the control of the galactose promoter cannot grow in medium containing glucose, indicating that the protein is essential for cell viability. The results of this work demonstrate that Nop53p is involved in the initial steps of pre-rRNA processing and in the cleavages responsible for the formation of the mature rRNAs 5.8S and 25S. A more detailed analysis of the pre-rRNA processing, by Northern blot and pulse-chase labeling, revealed that Nop53p affects the processing of the 27S precursor, that originates the rRNAs 5.8S and 25S. Nop53p participates in the processing of these RNAs by affecting the polyadenylation of the precursors of the rRNAs 5.8S and 25S. RNA co-imunoprecipitation assays with the fusion protein A-Nop53p confirmed the involvement of Nop53p in the processing of the 27S pre-rRNA, indicating that the protein may interact directly with the RNA. The capacity of Nop53p to bind RNA was confirmed by in vitro assays, while chromatin imunoprecipitation assays demonstrated that Nop53p binds the 5.8S rRNA co- transcriptionally. Nop53p regulates the function of the exosome by interacting directly with the exclusively nuclear subunit of the complex, Rrp6p.

As RNA helicases da família DEAD-box são enzimas que alteram as estruturas secundárias do RNA e auxiliam a formação de complexos ribonucleoproteicos, e são muito importantes em processos basais como a degradação dos RNAs e a biogênese dos ribossomos. A α-proteobactéria criotolerante Caulobacter crescentus é um modelo experimental interessante para compreender o papel destas enzimas em baixa temperatura. A caracterização fenotípica de linhagens mutantes simples de quatro RNA helicases DEAD-box permitiu demonstrar que a RNA helicase RhlE é necessária para o crescimento em baixa temperatura. Os mutantes duplos mostraram redução do crescimento à temperatura normal e em baixa temperatura, com perda de viabilidade e alterações morfológicas. Através de ensaios de complementação cruzada mostrou-se que seus papéis fisiológicos são até certo ponto redundantes. O mutante rhlE também apresentou redução na formação de biofilme. A medida da expressão relativa dos genes que codificam as RNA helicases mostrou um aumento na expressão de três destes genes em estresse frio, e a análise dos perfis ribossomais mostrou a possível participação destas três RNA helicases na biogênese do ribossomo. / The RNA helicases of the DEAD-box family are enzymes that modify RNA secondary structures and help the formation of ribonucleoprotein complexes, and are very important in basal processes such as RNA degradation and ribosome biogenesis. The cryotolerant α-proteobacterium Caulobacter crescentus is an interesting experimental model to understand the role of these enzymes at low temperature. The phenotypic characterization of strains with single mutations of four DEAD-box RNA helicases showed that RNA helicase RhlE is required for growth at low temperature. The double mutants showed reduction in growth at both normal and low temperatures, with loss of viability and morphological changes. Through cross-complementation assays it has been shown that their physiological roles are to some extent redundant. The rhlE mutant also showed reduction in biofilm formation. The relative expression of the genes encoding the RNA helicases showed an increase in the expression of three of these genes under cold stress, and the analysis of the ribosomal profiles showed the possible participation of these three RNA helicases in ribosome biogenesis.

Pulchellina é uma proteína inativadora de ribossomo (RIP) isolada de sementes de Abrus pulchellus fragmento que codifica a cadeia A da pulchellina (PAC) foi clonado e inserido no vetor pGEX-5X para expressar a cadeia A recombinante (rPAC) como uma proteína de fusão em Escherichia coli. A análise da seqüência de aminoácidos mostrou que a rPAC apresenta uma alta identidade seqüencial (&#62 86%) com a cadeia A da abrina-c. A habilidade que a rPAC possui para depurinar rRNA em ribossomos de levedura também foi demonstrada em testes in vitro. Objetivando verificar a atividade tóxica do produto heterólogo, nós promovemos a associação in vitro da rPAC com a cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC). Ambas as cadeias foram incubadas na presença de um sistema de redução/oxidação, originando um heterodímero ativo (rPAB). O rPAB apresentou uma massa molecular aparente de aproximadamente 60 kDa, similar a pulchellina nativa. As atividades tóxicas do rPAB e da pulchellina nativa foram comparadas através da injeção intraperitonial em camundongos, usando diferentes diluições de cada proteína. O rPAB foi capaz de matar 50% dos animais testados com doses de 45&#956g.kg-1. Nossos resultados mostraram que o heterodímero recombinante apresenta tanto toxicidade quanto um padrão conformacional similar a pulchellina nativa. Estudos usando cultura de tecidos também foram realizados com o objetivo de investigar a presença da pulchellina em calos obtidos a partir de sementes de A. pulchellus. Segmentos de cotilédones de sementes imaturas foram inoculados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de auxina, citocinina e sacarose para promover a indução dos calos. A expressão da pulchellina nos calos foi monitorada através de RT-PCR e testes de atividade biológica. Os calos obtidos após 35 dias foram congelados, macerados e submetidos a extração de RNA total e proteínas. Um fragmento específico de DNA que codifica a cadeia A da pulchellina foi amplificado a partir do RNA total sugerindo a síntese da proteína nos calos. Isto foi confirmado no extrato bruto de calos, que mostrou atividade hemaglutinante contra sangue de coelho e uma alta toxicidade quando injetado via intraperitoneal em camundongos.O extrato bruto também foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose-4B. A fração retida na coluna apresentou duas bandas protéicas quando analisadas em gel de poliacrinamida, sob condições desnaturantes, apresentando um padrão similar ao obtido com a pulchellina de semente. / Pulchellin is a type 2 ribosome-inactivating protein (RIP) isolated from seeds of the Abrus pulchellus tenuiflorus plant. The DNA fiagment encoding Pulchellin A-chain (PAC) was cloned and inserted in pGEX-5X to express the recombinant pulchellin Achain (rPAC) as a fusion protein in Escherichin coli. The deduced amino acid sequence analyses of the rPAC presented a high sequential identity (&#62 86%) with the A-chain of abrin-c. The ability of the rPAC to depurinate rRNA in yeast ribosome was also demonstrated in vitro. Intending to validate the toxic activity we promoted the in vitro association of the rPAC with the recombinant pulchellin binding chain (rPBC). Both chains were incubated in the presence of a reducedloxidized system, yielding an active heterodimer (rPAB). The rPAB showed an apparent molecular mass of about 60 D a similar to the native pulchellin. The toxic activities of the rPAB and native pulchellin were compared by intraperitoneal injection in mice using different dilutions. The rPAB was able to kill 50% of the tested mice with doses of 45&#956g.kg-1. Our results indicated that the recombinant heterodimer presented toxic activity and a conformational pattern similar to pulchellin. Studies using tissue cultures were also performed to investigate the presence of the pulchellin in callus established from seed explants of A. pulchellus. Cotyledon segments of immature seeds were inoculated in basal medium MS supplemented with different concentrations of auxin, citokinin and sucrose in order to determine the best callus induction. The pulchellin expression was monitored in callus cultures by RT-PCR and biological activity. The calli obtained aRer 35 days were freeze dried, macerated and submitted to extraction of total RNA and proteins. A specific DNA fragment codifying the A-chain pulchellin was amplified from callus RNA suggesting the synthesis of the protein. This was confirmed in the calli crude extract that showed haemagglutinating activity against rabbit blood cells and a high intraperitoneal toxicity to mice. The crude extract was also submitted to affinity chromatography on a Sepharose-4B column. The retained protein, showed to be composed by two main bands in polyacrylamide gel electrophoresis, in denaturating conditions, with a similar pattern to the results obtained with seeds pulchellin.

Pulchellina é uma proteína inativadora de ribossomo (RIP) isolada de sementes de Abrus pulchellus fragmento que codifica a cadeia A da pulchellina (PAC) foi clonado e inserido no vetor pGEX-5X para expressar a cadeia A recombinante (rPAC) como uma proteína de fusão em Escherichia coli. A análise da seqüência de aminoácidos mostrou que a rPAC apresenta uma alta identidade seqüencial (&#62 86%) com a cadeia A da abrina-c. A habilidade que a rPAC possui para depurinar rRNA em ribossomos de levedura também foi demonstrada em testes in vitro. Objetivando verificar a atividade tóxica do produto heterólogo, nós promovemos a associação in vitro da rPAC com a cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC). Ambas as cadeias foram incubadas na presença de um sistema de redução/oxidação, originando um heterodímero ativo (rPAB). O rPAB apresentou uma massa molecular aparente de aproximadamente 60 kDa, similar a pulchellina nativa. As atividades tóxicas do rPAB e da pulchellina nativa foram comparadas através da injeção intraperitonial em camundongos, usando diferentes diluições de cada proteína. O rPAB foi capaz de matar 50% dos animais testados com doses de 45&#956g.kg-1. Nossos resultados mostraram que o heterodímero recombinante apresenta tanto toxicidade quanto um padrão conformacional similar a pulchellina nativa. Estudos usando cultura de tecidos também foram realizados com o objetivo de investigar a presença da pulchellina em calos obtidos a partir de sementes de A. pulchellus. Segmentos de cotilédones de sementes imaturas foram inoculados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de auxina, citocinina e sacarose para promover a indução dos calos. A expressão da pulchellina nos calos foi monitorada através de RT-PCR e testes de atividade biológica. Os calos obtidos após 35 dias foram congelados, macerados e submetidos a extração de RNA total e proteínas. Um fragmento específico de DNA que codifica a cadeia A da pulchellina foi amplificado a partir do RNA total sugerindo a síntese da proteína nos calos. Isto foi confirmado no extrato bruto de calos, que mostrou atividade hemaglutinante contra sangue de coelho e uma alta toxicidade quando injetado via intraperitoneal em camundongos.O extrato bruto também foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose-4B. A fração retida na coluna apresentou duas bandas protéicas quando analisadas em gel de poliacrinamida, sob condições desnaturantes, apresentando um padrão similar ao obtido com a pulchellina de semente. / Pulchellin is a type 2 ribosome-inactivating protein (RIP) isolated from seeds of the Abrus pulchellus tenuiflorus plant. The DNA fiagment encoding Pulchellin A-chain (PAC) was cloned and inserted in pGEX-5X to express the recombinant pulchellin Achain (rPAC) as a fusion protein in Escherichin coli. The deduced amino acid sequence analyses of the rPAC presented a high sequential identity (&#62 86%) with the A-chain of abrin-c. The ability of the rPAC to depurinate rRNA in yeast ribosome was also demonstrated in vitro. Intending to validate the toxic activity we promoted the in vitro association of the rPAC with the recombinant pulchellin binding chain (rPBC). Both chains were incubated in the presence of a reducedloxidized system, yielding an active heterodimer (rPAB). The rPAB showed an apparent molecular mass of about 60 D a similar to the native pulchellin. The toxic activities of the rPAB and native pulchellin were compared by intraperitoneal injection in mice using different dilutions. The rPAB was able to kill 50% of the tested mice with doses of 45&#956g.kg-1. Our results indicated that the recombinant heterodimer presented toxic activity and a conformational pattern similar to pulchellin. Studies using tissue cultures were also performed to investigate the presence of the pulchellin in callus established from seed explants of A. pulchellus. Cotyledon segments of immature seeds were inoculated in basal medium MS supplemented with different concentrations of auxin, citokinin and sucrose in order to determine the best callus induction. The pulchellin expression was monitored in callus cultures by RT-PCR and biological activity. The calli obtained aRer 35 days were freeze dried, macerated and submitted to extraction of total RNA and proteins. A specific DNA fragment codifying the A-chain pulchellin was amplified from callus RNA suggesting the synthesis of the protein. This was confirmed in the calli crude extract that showed haemagglutinating activity against rabbit blood cells and a high intraperitoneal toxicity to mice. The crude extract was also submitted to affinity chromatography on a Sepharose-4B column. The retained protein, showed to be composed by two main bands in polyacrylamide gel electrophoresis, in denaturating conditions, with a similar pattern to the results obtained with seeds pulchellin.

A síntese de ribossomos é um dos principais processos celulares e na levedura Saccharomyces cerevisiae são necessários 75 snoRNAs e mais de 200 proteínas não-ribossomais para que o ribossomo seja corretamente formado. Para o processamento do precursor dos RNAs ribossomais, chamado pré-rRNA 35S, ocorre o pareamento deste com o U3 snoRNA e outros snoRNAs e diversas proteínas se associam de maneira orquestrada e transitória, formando o complexo SSU processomo. Tal complexo é necessário para o processamento da região 5\' do pré-rRNA 35S e para a correta montagem e maturação da subunidade menor ribossomal. Estudos anteriores do nosso laboratório identificaram a proteína nucleolar Utp25, essencial em S. cerevisiae, como integrante do complexo SSU processomo. Foi demonstrado que a depleção de Utp25 afeta a formação da subunidade menor ribossomal e que Utp25 interage com as proteínas Sas10 e Mpp10, componentes do SSU processomo, além de Utp25 co-imunoprecipitar o snoRNA U3. A partir desses dados, este trabalho teve como objetivo identificar interações da proteína Utp25 com outros componentes do complexo SSU processomo e investigar o papel de tais interações na formação e funcionamento do mesmo. Para purificação do complexo SSU processomo nós utilizamos o método Tandem Affinity Purification-tag (TAP-tag) utilizando TAP-Utp25 como isca. Após análise do purificado resultante por espectrometria de massas, obtivemos como resultado as proteínas Rrp5, Snu13 e Nop56, sendo as duas últimas pertencentes ao subcomplexo U3 snoRNP. / The ribosome synthesis is one of the main cellular processes and in the yeast Saccharomyces cerevisiae 75 snoRNAs and more than 200 non-ribosomal proteins are involved in ribosome maturation. During processing, the pre-rRNA 35S base pairs with the U3 snoRNA and other snoRNAs and several proteins associate, forming the SSU processome complex. This complex is required for the processing of the pre-rRNA 35S 5\' region and for the correct assembly and maturation of the ribosome small subunit. Previous studies from our laboratory identified the nucleolar protein Utp25, essential in S. cerevisiae, as a member of the SSU processome complex. Utp25 depletion affects small ribosomal subunit formation. Utp25 interacts with proteins Sas10 and Mpp10, components of the SSU processome, and Utp25 co-immunoprecipitates U3 snoRNA. From these data, this study aimed to identify Utp25 interactions with other components of the SSU processome complex and to investigate the role of these interactions in this complex formation and function. For the SSU processome complex purification we used the Tandem Affinity Purification-tag method (TAP-tag) and TAP-Utp25 as the bait. After the resulting purified analysis by mass spectrometry, we obtained as results the Rrp5, Snu13 and Nop56 proteins, the last two being U3 snoRNP subcomplex components.

A Mata Atlântica é um bioma constituído de vários ecossistemas e considerado um hotspot da biodiversidade mundial. Sua extensão vai do Rio Grande do Sul até o Piauí, compondo cerca de 15% do território nacional. Porém, aproximadamente 93% da formação original da Mata atlântica já foi devastada. Seus solos são comumente pobres (baixa disponibilidade de nutrientes), mas apresenta alta taxa de decomposição do material orgânico, baixas perdas de nutrientes por lixiviação e grande ciclagem de nutrientes. Portanto, esse ambiente é composto por comunidades microbianas complexas e eficientes nestes processos, apesar do papel delas ser ainda pouco descrito. Desta maneira, no presente trabalho foram avaliados vários fatores que estão diretamente relacionados com a composição da comunidade de bactérias e arquéias em três áreas presentes num gradiente altitudinal de Mata Atlântica; Santa Virgínia, Picinguaba e Restinga. Com base em análises independentes de cultivo, foi demonstrado por PCR-DGGE que a estruturação da comunidade de bactérias e arquéias nestas áreas é mais dependente da vegetação do que das características físicas e químicas do solo. Adicionalmente, a abundância de tais comunidades, determinada por PCR em tempo real mostrou-se similar nas três áreas amostradas, com valores de 109 e 108 cópias do gene ribossomal 16S DNAr de bactérias e arquéias, respectivamente. Em relação aos grupos taxonômicos presentes em tais áreas, bactérias mostraram-se predominantemente pertencentes aos filos Acidobacteria, Verrucomicrobia e Proteobacteria (com destaque para Acidobacteria, que foi o grupo dominante com média de 55,9%) e arquéias foram semelhantes aos grupos Euryarchaeota e Crenarchaeota, com destaque para Crenarchaeota que compôs uma média de 84%. Desta forma, este trabalho mostrou de maneira pioneira, a detalhada composição da comunidade de Bacteria e Archaea em solos de Mata Atlântica, destacando alterações nestas comunidades devido às diferenciações nas características das áreas, principalmente guiadas pela composição florística da vegetação. / The Atlantic Forest biome consists of many ecosystems and is considered one of the world\'s biodiversity hotspots. It extends from Rio Grande do Sul to Piauí, covering nearly 15% of the country. However, approximately 93% of the original Atlantic Forest has been devastated. Soils are often poor (low nutrient availability) in this biome, but exhibit high rates of organic matter decomposition, low nutrient loss by leaching, and high nutrient cycling. Therefore, this environment harbors complex and efficient microbial communities that participate in these processes, although their role is still poorly described. Thus, this study assessed several factors directly related to bacterial and archaeal community composition at 3 Atlantic Forest sites in an altitudinal gradient: Santa Virgínia, Picinguaba, and Restinga. Based on culture-independent analyses, PCR-DGGE profiles indicated that bacterial and archaeal community structures at these sites are more dependent on vegetation than soil physical and chemical attributes. Additionally, abundance of these communities, determined by real-time PCR, was similar at the 3 sampling sites, with 109 and 108 copies of 16S rDNA gene for Bacteria and Archaea, respectively. Regarding the taxonomic groups present at these sites, bacteria predominantly belonged to the phyla, Acidobacteria, Verrucomicrobia, and Proteobacteria (highlighting Acidobacteria, the dominant group with an average of 55.9%) and archaea were similar to Euryarchaeota and Crenarchaeota groups, highlighting Crenarchaeota with an average of 84%. Thus, this study took a novel approach to illustrate the detailed composition of Bacteria and Archaea in Atlantic Forest soil, pointing out alterations in these communities due to different characteristics specific to each sampling site, mainly driven by vegetative floristic composition.

A síntese de ribossomos é um dos principais processos celulares e na levedura Saccharomyces cerevisiae são necessários 75 snoRNAs e mais de 200 proteínas não-ribossomais para que o ribossomo seja corretamente formado. Para o processamento do precursor dos RNAs ribossomais, chamado pré-rRNA 35S, ocorre o pareamento deste com o U3 snoRNA e outros snoRNAs e diversas proteínas se associam de maneira orquestrada e transitória, formando o complexo SSU processomo. Tal complexo é necessário para o processamento da região 5\' do pré-rRNA 35S e para a correta montagem e maturação da subunidade menor ribossomal. Estudos anteriores do nosso laboratório identificaram a proteína nucleolar Utp25, essencial em S. cerevisiae, como integrante do complexo SSU processomo. Foi demonstrado que a depleção de Utp25 afeta a formação da subunidade menor ribossomal e que Utp25 interage com as proteínas Sas10 e Mpp10, componentes do SSU processomo, além de Utp25 co-imunoprecipitar o snoRNA U3. A partir desses dados, este trabalho teve como objetivo identificar interações da proteína Utp25 com outros componentes do complexo SSU processomo e investigar o papel de tais interações na formação e funcionamento do mesmo. Para purificação do complexo SSU processomo nós utilizamos o método Tandem Affinity Purification-tag (TAP-tag) utilizando TAP-Utp25 como isca. Após análise do purificado resultante por espectrometria de massas, obtivemos como resultado as proteínas Rrp5, Snu13 e Nop56, sendo as duas últimas pertencentes ao subcomplexo U3 snoRNP. / The ribosome synthesis is one of the main cellular processes and in the yeast Saccharomyces cerevisiae 75 snoRNAs and more than 200 non-ribosomal proteins are involved in ribosome maturation. During processing, the pre-rRNA 35S base pairs with the U3 snoRNA and other snoRNAs and several proteins associate, forming the SSU processome complex. This complex is required for the processing of the pre-rRNA 35S 5\' region and for the correct assembly and maturation of the ribosome small subunit. Previous studies from our laboratory identified the nucleolar protein Utp25, essential in S. cerevisiae, as a member of the SSU processome complex. Utp25 depletion affects small ribosomal subunit formation. Utp25 interacts with proteins Sas10 and Mpp10, components of the SSU processome, and Utp25 co-immunoprecipitates U3 snoRNA. From these data, this study aimed to identify Utp25 interactions with other components of the SSU processome complex and to investigate the role of these interactions in this complex formation and function. For the SSU processome complex purification we used the Tandem Affinity Purification-tag method (TAP-tag) and TAP-Utp25 as the bait. After the resulting purified analysis by mass spectrometry, we obtained as results the Rrp5, Snu13 and Nop56 proteins, the last two being U3 snoRNP subcomplex components.

Orientadores: Ana Carolina de Mattos Zeri, Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T05:56:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_JulianaFerreirade_D.pdf: 4266971 bytes, checksum: b6c93b83027283390194f44df501c5b2 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Proteínas da família SBOS (Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome) ocorrem largamente na natureza e s.ão bastante conservadas, apresentando ortólogas em Archaea e eucariotos. Estudos de análises genômica e biofísica tem relacionado a SBOS com o metabolismo de RNA e biosíntese de ribossomos. O gene ortólogo da SBOS de Archaea está localizado em um operon conservado que contém genes do processamento de RNA; estudos de perfil de expressão gênica tem agrupado o gene da proteína SBOS de Saccharomyces cerevisiae, Sdo1p, com fatores do processamento de rRNA e estudos de análise proteômica identificaram a interação da proteína Sdo1p com fatores da biossíntese de ribossomos; ortólogas de planta contém um C-terminal estendido apresentando motivo de ligação a RNA. Mutações identificadas no gene SBDS tem sido relacionadas com a síndrome Shwachman-Oiamond (80S), uma doença caracterizada por insuficiência exócrina pancreática e disfunção na medula óssea, cujos pacientes apresentam grandes chances de desenvolver leucemia. SOS representa, portanto, um importante modelo para entender os processos envolvidos no desenvolvimento da leucemia. O objetivo principal desse trabalho consistiu na caracterização estrutural e funcional de proteínas da família SBOS. Foram realizados ensaios de cristalização com ortólogas ; da SBOS de Archaea, levedura, tripanossoma e humana. A SBOS de Pyrococcus abyssi foi cristalizada, porém os cristais difrataram a baixa resolução (3,50 A). A ' caracterização da SBOS ortóloga de Trypanosoma cruzi (TcSBOS) mostrou que esta, proteína contém uma região C-terminal estendida. Ensaios de proteólise limitada,' dicroismo circular e espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) indicaram que a região adicional da TcSBOS se comporta como um fragmento de proteína intrinsicamente desenovelado, responsável pela interação da TcSBOS com RNA, verificada por ensaios de Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Também foi realizada a determinação da estrutura da ortóloga humana (HsSBOS) em solução por espectroscopia de RMN. A proteína HsSBOS é composta de três domínios bem estruturados, apresentando mobilidade conformacional entre os domínios N-terminal e central. Experimentos de titulação de RNA, novamente utilizando-se RMN, possibilitaram a confirmação da interação direta da SBOS humana com RNA. A região de ligação ao RNA foi identificada no N-terminal da proteína, região bastante conservada na família e considerada o principal alvo das mutações relacionadas à doença SDS / Abstract: The Shwachman-Bodian-Oiamond syndrome (SBOS) protein family occurs widely in nature and is highly conserved, with orthologues in Archaea and eukaryotes. Genomic and biophysical studies have suggested involvement of this protein in RNA metabolism and in ribosome biogenesis. Archaeal SBOS orthologue genes are located within highly conserved operons that include RNA-processing genes; transcriptional profiling analysis has clustered the yeast ortholog protein Sdo 1 p with rRNA processing factors and proteomic analysis have identified potential interactions between Sd01 p and ribosome biogenesis factors; several plant SBOS orthologues contain extended C-terminal region with putative RNA binding motif. Mutations in the SBDS gene are associated to the Shwachman-Oiamond syndrome (SOS), arare multisystem disorder characterized by exocrine pancreatic insufficiency, bone marrow dysfunction, and an increased risk of acute myeloid leukemia. SOS therefore represents an extremely useful model for understanding leukaemogenesis. The objective of the present work was the structural and functional characterization of the SBOS protein family. SBOS orthologues from Archaea, yeast, trypanosomatid and human were assayed for crystallization. The Archaeal SBOS orthologue, PaUPF0023 in Pyrococcus abyssi, was crystallized, but the crystals 'diffracted to a relatively low resolution (3.50 A). Characterization of the Trypanosoma cruzi SBOS ortholog (TcSBOS) by using limited proteolysis, circular dichroism and NMR analyses indicated that the C-terminal additional region of TcSBOS behaves as a natively unfolded protein segment, responsible for TcSBOS-RNA interaction activity in electrophoretic mobility shift assays. We have also determined the solution structure and backbone dynamics of the human SBOS protein using NMR spectroscopy. The overall structure of human SBOS comprises three well-folded domains with conformational exchange in the linker between the N-terminal and the central domains. RNA titration experiments using NMR spectroscopy provide evidence that human SBOS interacts with RNA via the N-terminal domain, a conserved region in the SBOS family and the most frequent target for SOSassociated mutations / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T15:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coltri_PatriciaPereira_D.pdf: 4564852 bytes, checksum: f11b831da981a8969c20f8f03ae8c617 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A síntese de ribossomos é um processo conservado em eucariotos e se inicia com a transcrição dos rRNAs no nucléolo. Mais de 170 fatores atuam de forma transitória no processamento dos precursores para gerar os rRNAs maduros que formarão as subunidades ribossomais no citoplasma. Entre as proteínas envolvidas na síntese de ribossomos está a Nip7p, uma proteína nucleolar de 21 kDa associada ao complexo pré-60S em Saccharomyces cerevisiae. Nip7p é conservada e possui ortólogas em eucariotos e em Archaea. A análise da seqüência primária revela a presença de um domínio conservado na região C-terminal, denominado PUA, encontrado em diversas proteínas associadas a modificações no RNA. Neste trabalho, foram realizadas análises estruturais e funcionais com o objetivo de investigar a função molecular da proteína Nip7 no processamento e modificação do rRNA. A estrutura tri-dimensional de PaNip7, ortóloga de Nip7p em Pyrococcus abyssi foi resolvida por difração de raios-X até 1,8Å de resolução, utilizando o método SIRAS. Comparação estrutural seguida por ensaios in vitro confirmaram o envolvimento do domínio PUA na interação com RNA. Além disso, tanto Nip7p como suas ortólogas PaNip7 e HsNip7 interagem com seqüências ricas em uridina, indicando que atuam de forma semelhante no processamento do rRNA. Essa preferência por uridina pode ainda explicar a afinidade da proteína Nip7p de S. cerevisiae pelo RNA da região ITS2, conforme observado em ensaios de interação utilizando UV-crosslinking. De fato, uma análise funcional realizada por primer extension comprovou que ocorre um bloqueio no processamento da região espaçadora ITS2 na ausência de Nip7p. Nip7p interage com várias proteínas do complexo pré-60S, entre as quais Nop8p e Nop53p, ambas associadas ao processamento do pré-27S. Embora os ensaios de co-purificação tenham confirmado a interação com as proteínas do complexo H/ACA box, deficiência em Nip7p não afeta a pseudo-uridinilação do rRNA. O duplo-híbrido realizado com a ortóloga humana de Nip7p, HsNip7, revelou interações com FTSJ3 e com a proteína SUMO-2. A interação direta de HsNip7 com estas proteínas foi confirmada por ensaios in vitro. HsNip7 e FTSJ3 colocalizaram na região nucleolar de células HEK293. FTSJ3 é uma proteína não caracterizada que possui o domínio FtsJ, descrito inicialmente para rRNA metiltransferases de procariotos. Além disso, FTSJ3 apresenta similaridade de sequência à proteína Spb1p de levedura, cuja função na metilação do rRNA 25S na posição Gm2922 já foi estabelecida. Embora a Nip7p não interaja com a Spb1p, estes dados indicam que FTSJ3 deve ser a ortóloga humana da Spb1p. As proteínas SUMO estão envolvidas na modificação pós-traducional (sumoylation) que regula a localização subcelular de proteínas. Em levedura, a provável ortóloga de SUMO, Smt3p, foi descrita na partícula pré-60S, portanto a interação HsNip7-SUMO-2 pode ser específica. Estes dados sugerem que as proteínas atuem no mesmo complexo da formação da subunidade 60S também em células humanas / Abstract: Ribosome biogenesis is conserved throughout eukaryotes and takes place in the nucleolus, a specialized nuclear compartment where the rRNA precursors are transcribed. More than 170 trans-acting factors coordinately interact to generate the mature rRNAs. Among the proteins identified in the pre-60S particle in Saccharomyces cerevisiae is Nip7p. Highly conserved Nip7p orthologues are found in all eukaryotes and Archaea. The analysis of Nip7p sequence reveals a conserved C-terminal domain named PUA, also found in a number of RNA-interacting proteins. In this work, we performed structural and functional analysis to investigate Nip7p molecular role on rRNA processing and modification. The structure of Pyrococcus abyssi Nip7p ortholog, PaNip7, was solved using X-ray diffraction data to 1,8Å resolution. Structural analysis followed by in vitro assays confirmed the involvement of PUA domain in RNA interaction. S. cerevisiae Nip7p and its archaeal and human counterparts show preference for binding uridine-rich sequences, indicating conserved functional features among the orthologues. The preference for uridine can explain the higher affinity of S. cerevisiae Nip7p for ITS2 sequence, as observed by UV-crosslinking assays. Consistently, functional analysis revealed pre-rRNA processing in the ITS2 region is seriously impaired. Yeast two-hybrid analysis confirmed by pull down assays revealed Nip7p interacts with Nop8p and Nop53p, two nucleolar proteins involved in pre-27S processing and components of pre-60S particle. Although yeast two-hybrid and pull down assays indicated that Nip7p interacts with H/ACA box core proteins, pseudouridylation is not affected under conditions of Nip7p depletion. In addition, yeast two-hybrid analysis confirmed by GST-pull down revealed HsNip7 interaction with FTSJ3 and SUMO-2. Both HsNip7 and FTSJ3 showed nucleolar subcellular localization in HEK293 cells. FTSJ3 is an uncharacterized protein containing the FtsJ domain, initially described in prokaryotic rRNA methyl-transferases. FTSJ3 shows sequence similarity to yeast Spb1p, an rRNA methyl-transferase involved in methylation of Gm2922, indicating that FTSJ3 may be the human orthologue of Spb1p. Sumoylation is a post-transcriptional covalent modification involved in regulation of protein subcellular localization. Putative yeast orthologues of SUMO, such as Smt3p, have been described in the pre-60S ribosomal particle, suggesting that SUMO-2 might play a specific role in 60S subunit biogenesis / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A Mata Atlântica é um bioma constituído de vários ecossistemas e considerado um hotspot da biodiversidade mundial. Sua extensão vai do Rio Grande do Sul até o Piauí, compondo cerca de 15% do território nacional. Porém, aproximadamente 93% da formação original da Mata atlântica já foi devastada. Seus solos são comumente pobres (baixa disponibilidade de nutrientes), mas apresenta alta taxa de decomposição do material orgânico, baixas perdas de nutrientes por lixiviação e grande ciclagem de nutrientes. Portanto, esse ambiente é composto por comunidades microbianas complexas e eficientes nestes processos, apesar do papel delas ser ainda pouco descrito. Desta maneira, no presente trabalho foram avaliados vários fatores que estão diretamente relacionados com a composição da comunidade de bactérias e arquéias em três áreas presentes num gradiente altitudinal de Mata Atlântica; Santa Virgínia, Picinguaba e Restinga. Com base em análises independentes de cultivo, foi demonstrado por PCR-DGGE que a estruturação da comunidade de bactérias e arquéias nestas áreas é mais dependente da vegetação do que das características físicas e químicas do solo. Adicionalmente, a abundância de tais comunidades, determinada por PCR em tempo real mostrou-se similar nas três áreas amostradas, com valores de 109 e 108 cópias do gene ribossomal 16S DNAr de bactérias e arquéias, respectivamente. Em relação aos grupos taxonômicos presentes em tais áreas, bactérias mostraram-se predominantemente pertencentes aos filos Acidobacteria, Verrucomicrobia e Proteobacteria (com destaque para Acidobacteria, que foi o grupo dominante com média de 55,9%) e arquéias foram semelhantes aos grupos Euryarchaeota e Crenarchaeota, com destaque para Crenarchaeota que compôs uma média de 84%. Desta forma, este trabalho mostrou de maneira pioneira, a detalhada composição da comunidade de Bacteria e Archaea em solos de Mata Atlântica, destacando alterações nestas comunidades devido às diferenciações nas características das áreas, principalmente guiadas pela composição florística da vegetação. / The Atlantic Forest biome consists of many ecosystems and is considered one of the world\'s biodiversity hotspots. It extends from Rio Grande do Sul to Piauí, covering nearly 15% of the country. However, approximately 93% of the original Atlantic Forest has been devastated. Soils are often poor (low nutrient availability) in this biome, but exhibit high rates of organic matter decomposition, low nutrient loss by leaching, and high nutrient cycling. Therefore, this environment harbors complex and efficient microbial communities that participate in these processes, although their role is still poorly described. Thus, this study assessed several factors directly related to bacterial and archaeal community composition at 3 Atlantic Forest sites in an altitudinal gradient: Santa Virgínia, Picinguaba, and Restinga. Based on culture-independent analyses, PCR-DGGE profiles indicated that bacterial and archaeal community structures at these sites are more dependent on vegetation than soil physical and chemical attributes. Additionally, abundance of these communities, determined by real-time PCR, was similar at the 3 sampling sites, with 109 and 108 copies of 16S rDNA gene for Bacteria and Archaea, respectively. Regarding the taxonomic groups present at these sites, bacteria predominantly belonged to the phyla, Acidobacteria, Verrucomicrobia, and Proteobacteria (highlighting Acidobacteria, the dominant group with an average of 55.9%) and archaea were similar to Euryarchaeota and Crenarchaeota groups, highlighting Crenarchaeota with an average of 84%. Thus, this study took a novel approach to illustrate the detailed composition of Bacteria and Archaea in Atlantic Forest soil, pointing out alterations in these communities due to different characteristics specific to each sampling site, mainly driven by vegetative floristic composition.