Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo

Em janeiro de 2005, foram coletados 31 carrapatos adultos da espécie Amblyomma triste em uma propriedade rural da CESP, localizada no município de Paulicéia, Estado de São Paulo. Três carrapatos foram positivos para o teste de hemolinfa, demonstrando estruturas compatíveis com riquétsias no interior de hemócitos. Dois desses carrapatos foram submetidos à tentativa de isolamento de riquétsias em células Vero, através da técnica de Shell vial. Um isolado foi obtido com sucesso, estando já estabelecido em cultivo celular, com várias passagens e partidas congeladas. Do restante do carrapato utilizado para este isolamento, foi extraído o DNA e este foi submetido a PCR para um fragmento do gene ompA de Rickettsia spp. Foi realizada a caracterização molecular do isolado, através do sequenciamento genético de quatro genes de Rickettsia spp: gltA, htrA, ompA e ompB e os genes apresentaram 99,8 a 100% de identidade com as seqüências correspondentes de Rickettsia parkeri no GenBank. Todos os 31 carrapatos tiveram o DNA extraído, sendo processados pela PCR para um fragmento do gene gltA e para um fragmento do gene ompA. Três (9,7%) foram positivos a PCR para o gene gltA e os mesmos 3 carrapatos foram positivos para o ompA, sendo exatamente os 3 carrapatos previamente positivos ao teste de hemolinfa). O material amplificado destes 3 carrapatos para o fragmento de gene ompA foi processado para o sequenciamento automático de nucleotídeos resultando em 100% de identidade com a seqüência correspondente de Rickettsia parkeri no GenBank. Este trabalho relata pela primeira vez a bactéria R. parkeri no Brasil, o que foi confirmado pelo isolamento do agente em cultivo de células / In January 2005, 31 adult free-living ticks of the species Amblyomma triste were collected in the CESP rural farm located in the city of Paulicéia, state of São Paulo, Brazil. In the laboratory, 3 of these ticks were positive by the hemolymph test, showing structures compatible with Rickettsia within the hemocytes. Attempts to isolate Rickettsia were performed in two hemolymph-positive ticks by the Shell-vial technique. One isolate was successful obtained, being established in Vero cell culture, with several passages performed. DNA extracted from infected cells was submitted to PCR targeting fragments of four Rickettsia genes: gltA, htrA, ompA and ompB. DNA sequences obtained from PCR products of these four genes showed 99.8 to 100% of similarity with corresponding sequences of Rickettsia parkeri in the Genbank. DNA was extracted from all 31 ticks and processed by PCR targeting a fragment of the rickettsial gltA gene and a fragment of ompA gene. Three (9.7%) ticks were positive for both genes, being the same ticks previously positive by the hemolymph test. PCR products of these ticks were sequenced, being 100% identical to the corresponding sequence of Rickettsia parkeri in GenBanK. This study perfoms the first report of R. parkeri in Brazil, confirmed by the isolation of the agent in cell culture

L’Identification rapide et la classification microbienne précise sont cruciales en microbiologie médicale pour la surveillance de la santé humaine et animale, établir un diagnostic clinique approprié et choisir des mesures thérapeutiques et de contrôle optimales. Cependant, les seuils universels utilisés pour la définition des espèces ne sont pas applicables à de nombreux genres bactériens. C'est notamment le cas des espèces du genre Rickettsia, qui expriment peu de caractéristiques phénotypiques distinctives. Compte tenu de la disponibilité des séquences de près de 100 génomes de Rickettsia, nous avons voulu évaluer une gamme de paramètres taxonomiques basés sur l’analyse des séquences génomiques afin de mettre au point des recommandations pour la classification des isolats au niveau de l’espèce et du genre. En comparant le degré de similarité des séquences de 78 génomes de Rickettsia et 61 génomes de 3 genres étroitement apparentés en utilisant 4 paramètres génomiques, nous avons montré que les outils taxonomiques basés sur les séquences génomiques sont simples à utiliser et rapides, et permettent une classification taxonomique fiable et reproductible des isolats de rickettsies avec des seuils spécifiques. Les résultats obtenus nous ont permis d'élaborer des recommandations pour la classification des isolats de rickettsies au niveau du genre et de l'espèce. À l'aide de la taxono-génomique, nous avons également pu décrire 17 nouvelles espèces bactériennes associées à l'homme. L'utilisation des outils génomiques est donc parfaitement adaptée à la classification taxonomique et peut changer radicalement notre vision de la taxonomie et de l'évolution bactérienne à l'avenir. / Rapid identification and precise microbial classification are crucial in medical microbiology for human and animal health monitoring, appropriate clinical diagnosis and selection of optimal therapeutic and control measures. Indeed, the universal used for the definition of species are not applicable to many bacterial genera. This is particularly true of species of the genus Rickettsia which are strictly intracellular alpha-proteobacteria that express few phenotypic characteristics. Given the availability of genomic sequences of nearly 100 rickettsial genomes, we wanted to evaluate a range of taxonomic parameters based on genomic sequence analysis, to develop guidelines for the classification of Rickettsia isolates at the genus and species levels. By comparing the degree of similarity of the sequences of 78 genomes from Rickettsia species and 61 genomes from 3 closely related genera using several genomic parameters, we have shown that genome-based taxonomic tools are simple to use and fast, and allow for a reliable and reproducible taxonomic classification of isolates within species of the genus Rickettsia, with specific thresholds. The obtained results enabled us to develop guidelines for classifying rickettsial isolates at the genus and species levels. Using taxono-genomics, we have also been able to describe 17 new human-associated bacterial species on the basis of a combination of genomic analysis and phenotypic properties. The use of genomic tools is therefore perfectly adapted to taxonomic classification and can dramatically change our vision of taxonomy and bacterial evolution in the future.

Rickettsia rickettsii é o agente etiológico da febre maculosa das Montanhas Rochosas, a mais letal dentre as riquetsioses que acometem o homem. A principal espécie de carrapato-vetor de R. rickettsii na área metropolitana da cidade de São Paulo é Amblyomma aureolatum. Quando um carrapato em jejum no solo encontra um hospedeiro vertebrado e inicia a alimentação sanguínea, R. rickettsii é exposta a uma elevação da temperatura e aos componentes da refeição sanguínea. Ambos os estímulos foram previamente associados à reativação da virulência da bactéria em carrapatos, porém, os fatores responsáveis por essa conversão do fenótipo avirulento em virulento não foram completamente elucidados até o momento. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo determinar os efeitos desses dois estímulos ambientais sobre o perfil de expressão gênica dessa bactéria durante a infecção de A. aureolatum. Inicialmente, estabelecemos um sistema de propagação de riquétsias para obter material genético suficiente para a padronização dos procedimentos de preparação de amostras para os experimentos de microarranjos. Para tal, estabelecemos, pela primeira vez, a infecção de uma cepa patogênica brasileira de R. rickettsii em células embrionárias do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus (BME26). Através da utilização de microarranjos de oligonucleotídeos customizados, analisamos os efeitos da elevação da temperatura em 10°C e da alimentação sanguínea sobre o perfil transcricional da bactéria infectando o conjunto de órgãos de fêmeas de A. aureolatum. Esse é o primeiro estudo da expressão gênica global de uma bactéria do gênero Rickettsia infectando um carrapato-vetor natural. Apesar de ambos os estímulos terem promovido um aumento da carga bacteriana, a alimentação sanguínea teve um efeito maior, também modulando cinco vezes mais genes que a elevação da temperatura. Dentre os genes induzidos, alguns codificam fatores de virulência, tais como componentes do sistema de secreção do tipo IV (T4SS), sugerindo que esse importante sistema de secreção bacteriano seja utilizado para secretar efetores durante a ingestão de sangue pelo carrapato. Através de análises in silico de domínios conservados das proteínas hipotéticas, identificamos outros componentes do T4SS de R. rickettsii ainda não descritos na literatura. A alimentação sanguínea também induziu a expressão de genes codificadores de enzimas antioxidantes, o que pode corresponder a uma tentativa de R. rickettsii de se proteger contra os efeitos deletérios de radicais livres produzidos pelos carrapatos alimentados. Por fim, analisamos a transcrição de uma seleção de genes de R. rickettsii em glândulas salivares e intestinos de carrapatos machos e fêmeas através de RT-qPCR microfluídica. Os resultados mostraram que a elevação da temperatura e a alimentação modulam um conjunto específico de genes em cada tecido analisado, tendo sido possível definirem-se assinaturas transcricionais tecido-específicas. Os genes diferencialmente expressos identificados neste estudo devem ser caracterizados funcionalmente, podendo ser considerados como futuros alvos para o desenvolvimento de vacinas. / Rickettsia rickettsii is the causative agent of Rocky Mountain Spotted Fever, which is the most lethal spotted fever rickettsiosis that affects humans. The main tick species that transmits R. rickettsii in the metropolitan area of São Paulos city is Amblyomma aureolatum. When an infected and starving tick begins blood feeding from a vertebrate host, R. rickettsii is exposed to a temperature elevation and to components in the blood meal. These two environmental stimuli have been previously associated with the reactivation of rickettsial virulence in ticks, but the factors responsible for this phenotype conversion have not been completely elucidated. The main aim of the present work was to determine the effects of these two environmental stimuli on the R. rickettsii transcriptional profile during A. aureolatum infection. We initially established an effective system for rickettsia propagation to generate a substantial quantity of genetic material for microarray standardization. For that, for the first time, we established an in vitro infection of the virulent Brazilian R. rickettsii strain in the BME26 tick embryonic cell line from Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Using customized oligonucleotide microarrays, we analyzed the effects of a 10°C temperature elevation and a blood meal on the transcriptional profile of R. rickettsii infecting whole organs of Amblyomma aureolatum female ticks. This is the first bacterial transcriptome study of the Rickettsia genus when infecting a natural tick vector. Although both stimuli significantly increased the bacterial load, blood feeding had a greater effect, also modulating five-fold more genes than the temperature upshift. Among the genes induced by blood-feeding, some encode virulence factors, such as Type IV Secretion System (T4SS) components, suggesting that this important bacterial transport system is used to secrete effectors during the acquisition of the blood meal by the tick. Using an in silico conserved domain analysis of hypothetical proteins, we identified additional T4SS components of R. rickettsii that were never previously described. Blood-feeding also up-regulated the expression of antioxidant enzymes, which might correspond to an attempt by R. rickettsii to protect itself against the deleterious effects of free radicals produced by fed ticks. Finally, we studied the transcriptional profile of selected genes of R. rickettsii on the salivary glands and midguts of male and female ticks by microfluidic RT-qPCR. Results showed that temperature upshift and blood feeding modulate specific sets of genes in each tissue, allowing for the establishment of a tissue-specific transcriptional signature. The modulated genes identified in this study require further functional analysis and may have potential as future targets for vaccine development.

Considered the most abundant carnivore in the world, the domestic dog can cause negative impacts when he is present in forested areas. Dogs can develop different roles in the environment in which they live as hunter, shepherd, guardian, companion and even more affective relationships in which the dog is seen like a family member. These roles are closely linked to the way of life of their owners. In Caraguatatuba City, dogs that live in the vicinity of Serra do Mar, an important Atlantic Rainforest Conservation Unit, are commonly parasitized by Amblyomma ovale. From data obtained through three years of monitoring in three different areas around the Serra do Mar State Park Caraguatatuba City, it has been possible to generate results that help in understanding the causes and consequences of the dog presence in the surroundings of the forest as well as its participation in the epidemiology of riquetsiosis and rangeliosis. Comparing the lifestyle of the owners and the role of their dogs in the environment in which they are inserted, it has been possible to estimate the risk of transmission of Rickettsia parkeri to these dogs. In addition, through the molecular analysis of the A. ovale individuals collected on dogs and also in free life, it has been possible to infer about the population structure and genetics of this parasite in Serra do Mar, which is an important ecological corridor for the Atlantic Rainforest wild fauna. / Considerado o carnívoro mais abundante do mundo, o cão doméstico pode causar impactos negativos quando presente em áreas florestadas. Cães podem desenvolver diferentes papéis no ambiente em que vivem desde caçador, pastor, guardião, companheiro e até mesmo relações mais afetivas em que o cão é visto como um membro da família. Estes papéis estão intimamente ligados ao modo de vida de seus proprietários. Em Caraguatatuba, cães que vivem no entorno da Serra do Mar, uma importante Unidade de Conservação da Mata Atlântica, são comumente parasitados por Amblyomma ovale. A partir de dados obtidos através de três anos de monitoramento em três diferentes áreas do entorno do Parque Estadual Serra do Mar Núcleo Caraguatatuba, foi possível gerar resultados que auxiliam no entendimento das causas e consequências da presença do cão no entorno da floresta e sua participação na epidemiologia da riquetsiose e rangeliose. Comparando o estilo de vida dos proprietários e o papel do cão no ambiente em que ele está inserido, foi possível estimar o risco de transmição de Rickettsia parkeri para estes cães. Além disso, através da análise molecular dos indivíduos de A. ovale coletados em cães e também coletados em vida livre, foi possível inferir sobre a estrutura e genética populacional deste parasita na Serra do Mar em Caraguatatuba, importante corredor ecológico para a fauna silvestre da Mata Atlântica.

Febre Maculosa Brasileira (FMB), doença causada por riquétsias do grupo da febre maculosa (RGFM) transmitidas por Amblyomma cajennense, é geralmente fatal quando não tratada precocemente. Métodos laboratoriais usuais (cultura em células Vero e RIFI) não permitem diagnósticos conclusivos da maioria dos casos verificados no Estado de São Paulo, onde o agente ainda não está devidamente caracterizado. Através da PCR e Southern blotting, foram pesquisados genes riquetsiais (gltA, ompA e ompB), em 20 amostras de coágulos sanguíneos humanos sintomáticos (São Paulo), 19 com resultados prévios negativos por métodos convencionais. Cerca de 95% dos pacientes foram positivos pela PCR. A seqüência de bases do gene ompB, a amostra 3, apresentou similaridade de 98% com Rickettsia ricketsii. Dos 75 lotes de A. cajennense (n=1483), coletados na mesma região endêmica, 09 resultaram positivos em células Vero e, em 22 detectou-se o gene ompA (RGFM). Sequenciamento e análise das amostras amplificadas poderão contribuir para o completo esclarecimento do ciclo das riquétsias na região. / Brazilian spotted fever (BSF), a disease caused by spotted fever group rickettsiae (SFGR) transmitted by Amblyomma cajennense, is generally fatal when not early treated. Common laboratory methods (Vero cell culture and immunofluorescence indirect assay) are not efficient on the diagnosis in most of the cases observed in State of São Paulo, where the agent is not well characterized yet. By means of PCR and Southern Blotting rickettsial genes (gltA, ompB and ompA) were searched in samples of coagulum sanguineous from 20 presenting symptom patients (São Paulo), from these, 19 of them have presented negative results by conventional methods. About 95% of the patients were positive and the ompB base pair sequences amplified showed 98% of similarity with Rickettsia ricketsii. From the 75 lots of A. cajennense (n=1483), collected at the same endemic region, 9 were positive in Vero cell cultures and in 22 it was possible to detect the ompA gene (SFGR). Sequencing and analysis of the amplified samples can contribute to the complete understanding of the rickettsiae biological cycle.

No início de 2010, uma nova riquetsiose foi descrita em um paciente humano, que foi infestado por carrapato em Barra do Una, no litoral sul do Estado de São Paulo. Técnicas moleculares indicaram que esta nova doença foi causada por uma nova cepa de riquétsia, que foi denominada de Rickettsia parkeri cepa Mata Atlântica. Estudos mais recentes demonstraram que 10 a 15% dos carrapatos Amblyomma ovale, coletados em áreas de Mata Atlântica nos estados de São Paulo (incluindo a área do caso índice da infecção humana em Barra do Una) e Santa Catarina estavam infectados com R. parkeri cepa Mata Atlântica. Desta forma, o presente estudo iniciou-se a partir de fêmeas ingurgitadas de A. ovale, coletadas de cães naturalmente infestados em Barra do Una. No laboratório, foi constatado por PCR que parte dessas fêmeas (6,25%) estavam naturalmente infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica; os ovos dessas fêmeas foram utilizados para formar uma colônia de A. ovale naturalmente infectada por R. parkeri. Ovos de fêmeas não infectadas, foram utilizados para formar uma colônia não infectada. As duas colônias foram estudadas de forma paralela no laboratório, visando analisar e quantificar a transmissão transestadial e transovariana de R. parkeri cepa Mata Atlântica e a competência vetorial do A. ovale. As infestações por larvas foram realizadas em roedores (Calomys callosus), enquanto ninfas e adultos foram alimentados em Oryctolagus cunicullus (coelho doméstico). Amostras de 10 indivíduos de cada uma das fases (larvas, ninfas e adultos F1, ovos, larvas e ninfas F2) foram testadas individualmente por um sistema de taqman real-time PCR, para presença de Rickettsia spp. Os soros sanguíneos de todos animais infestados foram testados por imunofluorescência indireta com antígeno de R. parkeri, no dia zero e 21 dias após a infestação por carrapatos, a fim de verificar soroconversão para antígenos de Rickettsia. Os resultados obtidos demonstraram 100% de transmissões transestadial (larva para ninfas e ninfas para adultos) e transovariana de R. parkeri em A. ovale, uma vez que todas as amostras de ovos, larvas, ninfas e adultos do grupo infectado foram positivas na PCR. Larvas e ninfas de A. ovale demonstraram alta competência vetorial, pois todos animais infestados por esses estágios infectados soroconverteram para R. parkeri. Por outro lado, adultos foram parcialmente competentes, pois apenas metade dos coelhos soroconverteu após ser infestada com carrapatos adultos infectados. Nenhum carrapato do grupo controle foi positivo na PCR, assim como nenhum animal deste grupo soroconverteu para R. parkeri. Fêmeas infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica tiveram parâmetros reprodutivos inferiores aos das fêmeas não infectadas, indicando algum efeito deletério da infecção por este agente sobre os carrapatos. Os resultados sugerem a importância do carrapato A. ovale na epidemiologia desta nova riquetsiose brasileira, assim como sugerem uma capacidade vetorial de A. ovale para R. parkeri cepa Mata Atlântica, uma vez que este carrapato é frequentemente encontrado infestando humanos no bioma de Mata Atlântica. / In early 2010, a novel rickettsiosis was described in a human patient that had been infested by a tick in Barra do Una, southern coast of the state of São Paulo, Brazil. Molecular tests indicated that the disease was caused by a new rickettsial strain, named Rickettsia parkeri strain Atlantic rainforest. More recent studies demonstrated that 10 to 15% of Amblyomma ovale ticks, collected in Atlantic rainforest areas in the states of São Paulo (including the human index case area in Barra do Una) and Santa Catarina were infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest. Within this context, the present study started with A. ovale engorged females collected from naturally infested dogs in Barra do Una. In the laboratory, it was shown by PCR that part of these females (6.25%) were naturally infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest; the eggs of these females were used to form a lab colony of A. ovale, naturally infected by R. parkeri. Eggs laid by uninfected females were used to form an uninfected tick colony. Both colonies were evaluated in parallel in the lab, aiming to verify and quantify the transstadial and transovarian transmissions of R. parkeri strain Atlantic rainforest in A. ovale ticks, and the vector competence of the different parasitic stages of this tick. Larval infestations were done on rodents (Calomys callosus), while nymphal and adult infestations were done on rabbits (Oryctolagus cunicullus). Samples of 10 individuals of each tick stage (F1 larvae, nymphs and adults; F2, eggs, larvae, and nymphs) were tested individually by a taqman real-time PCR targeting the genus Rickettsia. Blood serum samples from all infested animals were tested through immunofluorescence assay employing R. parkeri antigens, on zero and 21 days post tick infestation, in order to verify seroconversion to rickettsial antigens. The results demonstrated 100% of transstadial (larvae to nynphs; nymphs to adults) and transovarian transmissions of R. parkeri in A. ovale ticks, since all egg, larval, nymphal, and adult samples from the infected colony were PCR-positive. A. ovale larvae and nymphs demonstrated high vector competence because all animals infested by these tick infected stages seroconverted to R. parkeri. On the other hand, adult ticks were partially competent since only half of the animals seroconverted after being infested by infected adult ticks. None tick of the uninfected control colony was PCR positive, as well as no animal from this group seroconverted to R. parkeri. Tick females infected by R. parkeri strain Atlantic rainforest had lower reproductive parameters than uninfected females, indicating some deleterious effect of the infection on these ticks. The results suggest an important role of A. ovale ticks in the epidemiology of this novel Brazilian rickettsiosis, and also suggest that A. ovale are capable to transmit R. parkeri strain Atlantic rainforest under natural conditions, since this tick is frequently found infesting humans on the Atlantic rainforest biome.

A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é uma zoonose que tem como agente patogênico bactérias da espécie Rickettsia rickettsii, que são transmitidas por carrapatos da espécie Amblyomma aureolatum na Região Metropolitana de São Paulo, onde a letalidade da doença pode chegar a 80 por cento . Carrapatos dessa espécie realizam seu ciclo no interior das matas e cães domésticos - principais hospedeiros do estágio adulto desse carrapato em áreas degradadas - podem auxiliar na manutenção do ciclo da doença, ao transferir carrapatos infectados das matas para o ambiente antrópico. Este estudo teve como objetivo, analisar a relação entre fragmentação florestal, e sua possível influência na distribuição da soroprevalência de R. rickettsii em cães domésticos, na zona de contato entre Mata Atlântica e ambiente antrópico. Nove áreas com diferentes perfis ambientais foram selecionadas para o estudo: duas áreas em São Paulo, três áreas em Santo André, duas áreas em São Bernardo do Campo, uma área em Ribeirão Pires e uma área em Diadema. Uma amostra única de sangue foi coletada em trinta cães por área de estudo, num total de 270 cães amostrados. Todas as amostras foram submetidas a teste sorológico de imunofluorescência indireta para determinação do título de anticorpos contra R. rickettsii e todos os cães do estudo foram inspecionados em busca de carrapatos, que quando encontrados, foram levados ao laboratório para devida identificação de espécies e posterior pesquisa de riquétsias por PCR. Os dados de parasitismo por carrapatos em cães foi determinado pelo cálculo de abundância e intensidade parasitaria média. A soroprevalência encontrada variou de 0 a 37 por cento , e quando comparada aos dados ambientais, resultantes de análise multivariada de componentes principais, demonstrou que áreas mais preservadas, com maior área de mata e borda reduzida tem menores chances de ocorrência de casos de FMB do que áreas com área de mata reduzida e grande quantidade de borda. Somente as espécies A. aureolatum e R. sanguineus foram encontradas parasitando os cães do estudo, sendo que nenhum espécime foi considerado reagente na PCR. Os resultados sugerem que existe uma relação entre a soroprevalência de infecção por R. rickettsii em cães e as características de paisagem de cada região. A análise de estrutura de paisagem - parâmetro que pode favorecer a transmissão da bactéria R. rickettsii, uma vez que favorece o contato de cães e carrapatos vetores é uma ferramenta que pode auxiliar na determinação de áreas de maior ou menor risco para ocorrência de casos humanos de FMB, sendo útil na vigilância da doença. / The Brazilian Spotted Fever (BSF) is a zoonotic disease whose pathogen is the bacteria Rickettsia rickettsii, transmitted by Amblyomma aureolatum ticks in the Metropolitan Region of São Paulo, where the lethality of the disease can reach 80 per cent . The life cycle of those tiks occour in the forest and domestic dogs - main hosts of the adult stage of this tick in modify areas - can maintain the disease cycle, transferring infected ticks from the forest to the anthropic environment. This study aimed to analyze the relationship between forest fragmentation and its possible influence on the seroprevalence distribution of R. rickettsii in domestic dogs living at the contact zone between the Atlantic Forest and anthropic environment. Nine areas with different landscape profiles were selected for the study: two areas in São Paulo, three areas in Santo André, two areas in São Bernardo do Campo, an area in Ribeirão Pires and an area in Diadema. A single blood sample was collected in thirty dogs in each study area, with a total of 270 sampled dogs. All samples were submitted to serological test of indirect immunofluorescence to determine the antibodies titers against R. rickettsii, and all study animals were inspected for ticks, that when found, were taken to the laboratory for proper identification of species and further Ricketsia research through PCR reaction. Parasitism data of ticks on dogs was determined by the mean abundance and mean intensity. The seroprevalence found ranged from 0 to 37 per cent , and when compared to environmental data, resulted from the principal component analysis, showed that the most preserved areas, with larger amount of forest and less edge has lower chances of BSF occurrence, than areas with less forest and greather amount of edge. Only the species A. aureolatum and R. sanguineus were found parasitizing the study dogs, and no specimen was considered positive in the PCR reaction. The results suggest a relationship between the seroprevalence of infection with R. rickettsii in dogs and the landscape features on each region. The landscape structure analysis - parameter that can facilitate the transmission of the bacteria R. rickettsii, since it favors the contact between dogs and ticks - can assist in determining areas of higher or lower risk for the occurrence of human cases of BSF, being useful in monitoring the disease.

Em janeiro de 2005, foram coletados 31 carrapatos adultos da espécie Amblyomma triste em uma propriedade rural da CESP, localizada no município de Paulicéia, Estado de São Paulo. Três carrapatos foram positivos para o teste de hemolinfa, demonstrando estruturas compatíveis com riquétsias no interior de hemócitos. Dois desses carrapatos foram submetidos à tentativa de isolamento de riquétsias em células Vero, através da técnica de Shell vial. Um isolado foi obtido com sucesso, estando já estabelecido em cultivo celular, com várias passagens e partidas congeladas. Do restante do carrapato utilizado para este isolamento, foi extraído o DNA e este foi submetido a PCR para um fragmento do gene ompA de Rickettsia spp. Foi realizada a caracterização molecular do isolado, através do sequenciamento genético de quatro genes de Rickettsia spp: gltA, htrA, ompA e ompB e os genes apresentaram 99,8 a 100% de identidade com as seqüências correspondentes de Rickettsia parkeri no GenBank. Todos os 31 carrapatos tiveram o DNA extraído, sendo processados pela PCR para um fragmento do gene gltA e para um fragmento do gene ompA. Três (9,7%) foram positivos a PCR para o gene gltA e os mesmos 3 carrapatos foram positivos para o ompA, sendo exatamente os 3 carrapatos previamente positivos ao teste de hemolinfa). O material amplificado destes 3 carrapatos para o fragmento de gene ompA foi processado para o sequenciamento automático de nucleotídeos resultando em 100% de identidade com a seqüência correspondente de Rickettsia parkeri no GenBank. Este trabalho relata pela primeira vez a bactéria R. parkeri no Brasil, o que foi confirmado pelo isolamento do agente em cultivo de células / In January 2005, 31 adult free-living ticks of the species Amblyomma triste were collected in the CESP rural farm located in the city of Paulicéia, state of São Paulo, Brazil. In the laboratory, 3 of these ticks were positive by the hemolymph test, showing structures compatible with Rickettsia within the hemocytes. Attempts to isolate Rickettsia were performed in two hemolymph-positive ticks by the Shell-vial technique. One isolate was successful obtained, being established in Vero cell culture, with several passages performed. DNA extracted from infected cells was submitted to PCR targeting fragments of four Rickettsia genes: gltA, htrA, ompA and ompB. DNA sequences obtained from PCR products of these four genes showed 99.8 to 100% of similarity with corresponding sequences of Rickettsia parkeri in the Genbank. DNA was extracted from all 31 ticks and processed by PCR targeting a fragment of the rickettsial gltA gene and a fragment of ompA gene. Three (9.7%) ticks were positive for both genes, being the same ticks previously positive by the hemolymph test. PCR products of these ticks were sequenced, being 100% identical to the corresponding sequence of Rickettsia parkeri in GenBanK. This study perfoms the first report of R. parkeri in Brazil, confirmed by the isolation of the agent in cell culture

Amblyomma cajennense é a principal espécie de carrapato incriminada na transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB), no Brasil e outros países da América do Sul. O presente trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar e quantificar a ocorrência das transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii em A. cajennense, verificando o efeito da infecção nos parâmetros biológicos do carrapato, e finalmente, a capacidade de larvas, ninfas e adultos transmitirem a bactéria para vertebrados. Para tal, cobaias (Cavia porcellus) infectadas experimentalmente com R. rickettsii foram infestadas com larvas e ninfas, para alimentação dos adultos de A. cajennense foram utilizados coelhos infectados. A biologia desses carrapatos expostos à R. rickettsii foi acompanhada até a geração seguinte de ninfa. Amostras de cada estágio evolutivo (larva, ninfa, adulto, ovo, larva, ninfa) foram testadas por PCR em tempo real para determinar a freqüência de carrapatos infectados por Rickettsia. Também foram quantificadas as transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii no carrapato A. cajennense. Cobaias e coelhos não infectados, utilizadas para infestação de cada um dos estágios parasitários do carrapato, foram avaliadas clinicamente e por sorologia, a fim de verificar a ocorrência da transmissão de R. rickettsii para esses animais. Em todas as infestações com carrapatos expostos previamente a R. rickettsii dentro de uma mesma geração, os animais adoeceram com febre alta (temperatura retal >40oC), lesão escrotal e alta letalidade, indicando a transmissão transestadial de R. rickettsii nos carrapatos, sendo esta confirmada por PCR e sorologia dos animais. Quanto à transmissão transovariana, esta ocorre em baixa quantidade nos grupos GL (infectado na fase de larva) e GN (infectado na fase de ninfa), pois das 12 cobaias (seis do grupo GL e seis do grupo GN), apenas três apresentaram sinais clínicos, e somente uma veio a óbito. Um total de oito animais foram positivos à RIFI (reação de imunofluorescência indireta), porém destes, seis apresentaram títulos baixos, entre 128 e 512, provavelmente devido a um pequeno desafio imunológico. As cobaias infestadas com larvas oriundas de fêmeas pertencentes ao grupo GA (infectado na fase adulta) não se apresentaram clinicamente alteradas nem sorologicamente reativas. Sugerindo que transmissão transovariana no grupo GA seja algo raro, pois apesar da progênie de uma das fêmeas ter sido positiva à PCR, nenhuma das cobaias infestadas com larvas ou ninfas de segunda geração manifestou quaisquer evidências do contato com R. rickettsii. Paralelamente, carrapatos não expostos a R. rickettsii (grupo controle GC) foram mantidos nas mesmas condições dos carrapatos infectados, para avaliar a existência de um possível efeito deletério da infecção por R. rickettsii na biologia do carrapato, os quais foram evidenciados com a maior mortalidade de larvas infectadas do grupo GL na primeira e na segunda gerações, além de alterações nos parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas dos grupos expostos a R. rickettsii. Os resultados encontrados comprovam que a R. rickettsii é maléfica ao A. cajennense, bem como a existência de transmissão transestadial e transmissão transovariana, porém esta ultima em baixa quantidade. Isto ressalta a importância de hospedeiros amplificadores e de outros carrapatos na epidemiologia da Febre Maculosa Brasileira. / Amblyomma cajennense is the main tick species incriminated in the transmission of Rickettsia rickettsii, the etiological agent of Brazilian spotted fever, in Brazil and in other South American countries. The present work aimed to evaluate and quantify the transovarial and transstadial of R. rickettsii in A. cajennense, verifying the effect of the infection on biological parameters of the tick, and finally, to evaluate the capacity of larvae, nymphs, and adults to transmit the bacterium to vertebrates. For these purposes, guinea pigs (Cavia porcellus), experimentally infected with R. rickettsii, were artificially infested with uninfected larvae and nymphs, while adult ticks were allowed to infest experimentally-infected rabbits (Oryctolagus cuniculus). The biology of these R. rickettsii-exposed ticks was accomplished until the next generation of nymphs, always having samples of each developmental stage (F1 larva, nymph, and adult, and F2 egg, larva, and nymph) tested by real-time PCR to determine the frequency of infected ticks. In parallel, uninfected control ticks were exposed simultaneous to the same protocols. Infested guinea pigs and rabbits were evaluated clinically and for serology, to verify the occurrence of transmission of R. rickettsii to these animals. In all infestations with ticks previously exposed to R. rickettsii, within the same generation, there were infested animals that presented high fever (rectal temperature >40oC), scrotal lesion, and high lethality, indicating transstadial transmission of R. rickettsii in the ticks, confirmed by PCR on ticks and serology of the animals. Regarding transovarial transmission, it occurred at low levels in females that had been exposed to R. rickettsii during the larval stage (GL) and during the nymphal stage (GN), since only 3 out of 12 guinea pigs (six from GL, and six from GN) infested with F2 larvae presented clinical alterations, with a single lethality. However, eight animals became seropositive by IFA (immunofluorescence assay), from which six had low titers anti-R. rickettsii, between 128 and 512, possibly due to weaker immunological challenges. Guinea pigs exposed to larvae derived from GA females (exposed to R. rickettsii during the adult stage) did not ´present any clinical alteration nor became serologically positive, indication that transovarial transmission is rare in this group. Despite of a single progeny that became PCR-positive, out of others that were all negative, no guinea pig infested with F2 larvae or nymphs from GA females showed evidence that they were in contact with R. rickettsii, similarly to the control group. In relation to a possible effect of R. rickettsii in the tick survival and developmental, there were a higher mortality of infected larvae from the GL group in both first and second laboratory generations, and lower reproductive performance of engorged females from the infected groups. The results show that R. rickettsii has deleterious effects to A. cajennense. There are both trasstadial and transovarial transmissions of R. rickettsii in A. cajennense, however transovarial transmission is at low rates, highlighting the importance that amplifier hosts and other tick species should have in the epidemiology Brazilian spotted fever.