Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo

Febre Maculosa Brasileira (FMB), doença causada por riquétsias do grupo da febre maculosa (RGFM) transmitidas por Amblyomma cajennense, é geralmente fatal quando não tratada precocemente. Métodos laboratoriais usuais (cultura em células Vero e RIFI) não permitem diagnósticos conclusivos da maioria dos casos verificados no Estado de São Paulo, onde o agente ainda não está devidamente caracterizado. Através da PCR e Southern blotting, foram pesquisados genes riquetsiais (gltA, ompA e ompB), em 20 amostras de coágulos sanguíneos humanos sintomáticos (São Paulo), 19 com resultados prévios negativos por métodos convencionais. Cerca de 95% dos pacientes foram positivos pela PCR. A seqüência de bases do gene ompB, a amostra 3, apresentou similaridade de 98% com Rickettsia ricketsii. Dos 75 lotes de A. cajennense (n=1483), coletados na mesma região endêmica, 09 resultaram positivos em células Vero e, em 22 detectou-se o gene ompA (RGFM). Sequenciamento e análise das amostras amplificadas poderão contribuir para o completo esclarecimento do ciclo das riquétsias na região. / Brazilian spotted fever (BSF), a disease caused by spotted fever group rickettsiae (SFGR) transmitted by Amblyomma cajennense, is generally fatal when not early treated. Common laboratory methods (Vero cell culture and immunofluorescence indirect assay) are not efficient on the diagnosis in most of the cases observed in State of São Paulo, where the agent is not well characterized yet. By means of PCR and Southern Blotting rickettsial genes (gltA, ompB and ompA) were searched in samples of coagulum sanguineous from 20 presenting symptom patients (São Paulo), from these, 19 of them have presented negative results by conventional methods. About 95% of the patients were positive and the ompB base pair sequences amplified showed 98% of similarity with Rickettsia ricketsii. From the 75 lots of A. cajennense (n=1483), collected at the same endemic region, 9 were positive in Vero cell cultures and in 22 it was possible to detect the ompA gene (SFGR). Sequencing and analysis of the amplified samples can contribute to the complete understanding of the rickettsiae biological cycle.

A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é uma zoonose que tem como agente patogênico bactérias da espécie Rickettsia rickettsii, que são transmitidas por carrapatos da espécie Amblyomma aureolatum na Região Metropolitana de São Paulo, onde a letalidade da doença pode chegar a 80 por cento . Carrapatos dessa espécie realizam seu ciclo no interior das matas e cães domésticos - principais hospedeiros do estágio adulto desse carrapato em áreas degradadas - podem auxiliar na manutenção do ciclo da doença, ao transferir carrapatos infectados das matas para o ambiente antrópico. Este estudo teve como objetivo, analisar a relação entre fragmentação florestal, e sua possível influência na distribuição da soroprevalência de R. rickettsii em cães domésticos, na zona de contato entre Mata Atlântica e ambiente antrópico. Nove áreas com diferentes perfis ambientais foram selecionadas para o estudo: duas áreas em São Paulo, três áreas em Santo André, duas áreas em São Bernardo do Campo, uma área em Ribeirão Pires e uma área em Diadema. Uma amostra única de sangue foi coletada em trinta cães por área de estudo, num total de 270 cães amostrados. Todas as amostras foram submetidas a teste sorológico de imunofluorescência indireta para determinação do título de anticorpos contra R. rickettsii e todos os cães do estudo foram inspecionados em busca de carrapatos, que quando encontrados, foram levados ao laboratório para devida identificação de espécies e posterior pesquisa de riquétsias por PCR. Os dados de parasitismo por carrapatos em cães foi determinado pelo cálculo de abundância e intensidade parasitaria média. A soroprevalência encontrada variou de 0 a 37 por cento , e quando comparada aos dados ambientais, resultantes de análise multivariada de componentes principais, demonstrou que áreas mais preservadas, com maior área de mata e borda reduzida tem menores chances de ocorrência de casos de FMB do que áreas com área de mata reduzida e grande quantidade de borda. Somente as espécies A. aureolatum e R. sanguineus foram encontradas parasitando os cães do estudo, sendo que nenhum espécime foi considerado reagente na PCR. Os resultados sugerem que existe uma relação entre a soroprevalência de infecção por R. rickettsii em cães e as características de paisagem de cada região. A análise de estrutura de paisagem - parâmetro que pode favorecer a transmissão da bactéria R. rickettsii, uma vez que favorece o contato de cães e carrapatos vetores é uma ferramenta que pode auxiliar na determinação de áreas de maior ou menor risco para ocorrência de casos humanos de FMB, sendo útil na vigilância da doença. / The Brazilian Spotted Fever (BSF) is a zoonotic disease whose pathogen is the bacteria Rickettsia rickettsii, transmitted by Amblyomma aureolatum ticks in the Metropolitan Region of São Paulo, where the lethality of the disease can reach 80 per cent . The life cycle of those tiks occour in the forest and domestic dogs - main hosts of the adult stage of this tick in modify areas - can maintain the disease cycle, transferring infected ticks from the forest to the anthropic environment. This study aimed to analyze the relationship between forest fragmentation and its possible influence on the seroprevalence distribution of R. rickettsii in domestic dogs living at the contact zone between the Atlantic Forest and anthropic environment. Nine areas with different landscape profiles were selected for the study: two areas in São Paulo, three areas in Santo André, two areas in São Bernardo do Campo, an area in Ribeirão Pires and an area in Diadema. A single blood sample was collected in thirty dogs in each study area, with a total of 270 sampled dogs. All samples were submitted to serological test of indirect immunofluorescence to determine the antibodies titers against R. rickettsii, and all study animals were inspected for ticks, that when found, were taken to the laboratory for proper identification of species and further Ricketsia research through PCR reaction. Parasitism data of ticks on dogs was determined by the mean abundance and mean intensity. The seroprevalence found ranged from 0 to 37 per cent , and when compared to environmental data, resulted from the principal component analysis, showed that the most preserved areas, with larger amount of forest and less edge has lower chances of BSF occurrence, than areas with less forest and greather amount of edge. Only the species A. aureolatum and R. sanguineus were found parasitizing the study dogs, and no specimen was considered positive in the PCR reaction. The results suggest a relationship between the seroprevalence of infection with R. rickettsii in dogs and the landscape features on each region. The landscape structure analysis - parameter that can facilitate the transmission of the bacteria R. rickettsii, since it favors the contact between dogs and ticks - can assist in determining areas of higher or lower risk for the occurrence of human cases of BSF, being useful in monitoring the disease.

Amblyomma cajennense é a principal espécie de carrapato incriminada na transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB), no Brasil e outros países da América do Sul. O presente trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar e quantificar a ocorrência das transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii em A. cajennense, verificando o efeito da infecção nos parâmetros biológicos do carrapato, e finalmente, a capacidade de larvas, ninfas e adultos transmitirem a bactéria para vertebrados. Para tal, cobaias (Cavia porcellus) infectadas experimentalmente com R. rickettsii foram infestadas com larvas e ninfas, para alimentação dos adultos de A. cajennense foram utilizados coelhos infectados. A biologia desses carrapatos expostos à R. rickettsii foi acompanhada até a geração seguinte de ninfa. Amostras de cada estágio evolutivo (larva, ninfa, adulto, ovo, larva, ninfa) foram testadas por PCR em tempo real para determinar a freqüência de carrapatos infectados por Rickettsia. Também foram quantificadas as transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii no carrapato A. cajennense. Cobaias e coelhos não infectados, utilizadas para infestação de cada um dos estágios parasitários do carrapato, foram avaliadas clinicamente e por sorologia, a fim de verificar a ocorrência da transmissão de R. rickettsii para esses animais. Em todas as infestações com carrapatos expostos previamente a R. rickettsii dentro de uma mesma geração, os animais adoeceram com febre alta (temperatura retal >40oC), lesão escrotal e alta letalidade, indicando a transmissão transestadial de R. rickettsii nos carrapatos, sendo esta confirmada por PCR e sorologia dos animais. Quanto à transmissão transovariana, esta ocorre em baixa quantidade nos grupos GL (infectado na fase de larva) e GN (infectado na fase de ninfa), pois das 12 cobaias (seis do grupo GL e seis do grupo GN), apenas três apresentaram sinais clínicos, e somente uma veio a óbito. Um total de oito animais foram positivos à RIFI (reação de imunofluorescência indireta), porém destes, seis apresentaram títulos baixos, entre 128 e 512, provavelmente devido a um pequeno desafio imunológico. As cobaias infestadas com larvas oriundas de fêmeas pertencentes ao grupo GA (infectado na fase adulta) não se apresentaram clinicamente alteradas nem sorologicamente reativas. Sugerindo que transmissão transovariana no grupo GA seja algo raro, pois apesar da progênie de uma das fêmeas ter sido positiva à PCR, nenhuma das cobaias infestadas com larvas ou ninfas de segunda geração manifestou quaisquer evidências do contato com R. rickettsii. Paralelamente, carrapatos não expostos a R. rickettsii (grupo controle GC) foram mantidos nas mesmas condições dos carrapatos infectados, para avaliar a existência de um possível efeito deletério da infecção por R. rickettsii na biologia do carrapato, os quais foram evidenciados com a maior mortalidade de larvas infectadas do grupo GL na primeira e na segunda gerações, além de alterações nos parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas dos grupos expostos a R. rickettsii. Os resultados encontrados comprovam que a R. rickettsii é maléfica ao A. cajennense, bem como a existência de transmissão transestadial e transmissão transovariana, porém esta ultima em baixa quantidade. Isto ressalta a importância de hospedeiros amplificadores e de outros carrapatos na epidemiologia da Febre Maculosa Brasileira. / Amblyomma cajennense is the main tick species incriminated in the transmission of Rickettsia rickettsii, the etiological agent of Brazilian spotted fever, in Brazil and in other South American countries. The present work aimed to evaluate and quantify the transovarial and transstadial of R. rickettsii in A. cajennense, verifying the effect of the infection on biological parameters of the tick, and finally, to evaluate the capacity of larvae, nymphs, and adults to transmit the bacterium to vertebrates. For these purposes, guinea pigs (Cavia porcellus), experimentally infected with R. rickettsii, were artificially infested with uninfected larvae and nymphs, while adult ticks were allowed to infest experimentally-infected rabbits (Oryctolagus cuniculus). The biology of these R. rickettsii-exposed ticks was accomplished until the next generation of nymphs, always having samples of each developmental stage (F1 larva, nymph, and adult, and F2 egg, larva, and nymph) tested by real-time PCR to determine the frequency of infected ticks. In parallel, uninfected control ticks were exposed simultaneous to the same protocols. Infested guinea pigs and rabbits were evaluated clinically and for serology, to verify the occurrence of transmission of R. rickettsii to these animals. In all infestations with ticks previously exposed to R. rickettsii, within the same generation, there were infested animals that presented high fever (rectal temperature >40oC), scrotal lesion, and high lethality, indicating transstadial transmission of R. rickettsii in the ticks, confirmed by PCR on ticks and serology of the animals. Regarding transovarial transmission, it occurred at low levels in females that had been exposed to R. rickettsii during the larval stage (GL) and during the nymphal stage (GN), since only 3 out of 12 guinea pigs (six from GL, and six from GN) infested with F2 larvae presented clinical alterations, with a single lethality. However, eight animals became seropositive by IFA (immunofluorescence assay), from which six had low titers anti-R. rickettsii, between 128 and 512, possibly due to weaker immunological challenges. Guinea pigs exposed to larvae derived from GA females (exposed to R. rickettsii during the adult stage) did not ´present any clinical alteration nor became serologically positive, indication that transovarial transmission is rare in this group. Despite of a single progeny that became PCR-positive, out of others that were all negative, no guinea pig infested with F2 larvae or nymphs from GA females showed evidence that they were in contact with R. rickettsii, similarly to the control group. In relation to a possible effect of R. rickettsii in the tick survival and developmental, there were a higher mortality of infected larvae from the GL group in both first and second laboratory generations, and lower reproductive performance of engorged females from the infected groups. The results show that R. rickettsii has deleterious effects to A. cajennense. There are both trasstadial and transovarial transmissions of R. rickettsii in A. cajennense, however transovarial transmission is at low rates, highlighting the importance that amplifier hosts and other tick species should have in the epidemiology Brazilian spotted fever.

Febre Maculosa Brasileira (FMB), doença causada por riquétsias do grupo da febre maculosa (RGFM) transmitidas por Amblyomma cajennense, é geralmente fatal quando não tratada precocemente. Métodos laboratoriais usuais (cultura em células Vero e RIFI) não permitem diagnósticos conclusivos da maioria dos casos verificados no Estado de São Paulo, onde o agente ainda não está devidamente caracterizado. Através da PCR e Southern blotting, foram pesquisados genes riquetsiais (gltA, ompA e ompB), em 20 amostras de coágulos sanguíneos humanos sintomáticos (São Paulo), 19 com resultados prévios negativos por métodos convencionais. Cerca de 95% dos pacientes foram positivos pela PCR. A seqüência de bases do gene ompB, a amostra 3, apresentou similaridade de 98% com Rickettsia ricketsii. Dos 75 lotes de A. cajennense (n=1483), coletados na mesma região endêmica, 09 resultaram positivos em células Vero e, em 22 detectou-se o gene ompA (RGFM). Sequenciamento e análise das amostras amplificadas poderão contribuir para o completo esclarecimento do ciclo das riquétsias na região. / Brazilian spotted fever (BSF), a disease caused by spotted fever group rickettsiae (SFGR) transmitted by Amblyomma cajennense, is generally fatal when not early treated. Common laboratory methods (Vero cell culture and immunofluorescence indirect assay) are not efficient on the diagnosis in most of the cases observed in State of São Paulo, where the agent is not well characterized yet. By means of PCR and Southern Blotting rickettsial genes (gltA, ompB and ompA) were searched in samples of coagulum sanguineous from 20 presenting symptom patients (São Paulo), from these, 19 of them have presented negative results by conventional methods. About 95% of the patients were positive and the ompB base pair sequences amplified showed 98% of similarity with Rickettsia ricketsii. From the 75 lots of A. cajennense (n=1483), collected at the same endemic region, 9 were positive in Vero cell cultures and in 22 it was possible to detect the ompA gene (SFGR). Sequencing and analysis of the amplified samples can contribute to the complete understanding of the rickettsiae biological cycle.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CELSO EDUARDO DE SOUZA1.pdf: 1961117 bytes, checksum: 9c58964339128b2a9f91e38568ada01c (MD5) Previous issue date: 2010-04-22 / Brazilian spotted fever (BSF) is an acute infectious disease and its etiologic agent Rickettsia rickettsii is a gram negative intracellular binding and transmitted through the bite of infected ticks. In the epidemiology of spotted fever, the amplifying hosts in general are wild animals. They play an important role for developing temporary rickettsemia, thus contributing to the possibility of infection of new generations of ticks. This study aims to verify the occurrence of anti rickettsiae IgG antibodies of the spotted fever group in the serum of wild rodents. The presence of rickettsiae of the brazilian spotted fever group in fragments of the spleen of wild rodents was studied by PCR and clarify the involvement of small rodents as amplifying hosts of R. rickettsii in endemic areas in the region of Campinas in S?o Paulo state. Thus, we selected the municipalities of Jaguari?na, Pedreira and Piracicaba, where human been cases were detected. Through the use of one hundred traps distributed in Sharm lines, 222 rodents were captured the following species: Akodon sp 35 (15.6%), Necromys lasiurus 61 (27,1%), Calomys tener 35 (15,6%), Mus muscullus 19 (8,4%), Nectomys squamipes 1 (0,4%), Oligoryzomys nigripes 63 (28,0%), Oxymycterus nigripes 1 (0,4%), Rattus rattus 7 (3,1%). All rodents were examined, but no tick was found. We analyzed a total of 186 serum samples for antibodies of the IgG class anti-Rickettsia rickettsii, R. parkeri, R. felis, R. amblyommii, R. rhipicephali and R. bellii. It was found that 39 (20.97%) sera were reactive to at least one Rickettsia spp. with titers ranging from 1:64 to 1:512 and 147 (79.03%) were negative. The prevalence of anti R. rickettsii spp antibodies IgG found in these mice was 9.34%. Of the 186 animals examined were positive only 17 of these, 15 animals showed evidence of 1/64 and only one animal reacted to the title of 1/512.One hundred and fifty six spleens were processed by PCR and was not detected in Rickettsia spp in any of them. Considering the results presented we can conclude that small rodents are not amplifying hosts of Rickettsia of Brazilian spotted fever group in the study area. / A febre maculosa brasileira (FMB) ? uma doen?a infecciosa aguda e tem como agente etiol?gico a Rickettsia rickettsii que ? uma bact?ria gram negativa intracelular obrigat?ria e transmitida atrav?s da picada de carrapatos infectados. Na epidemiologia da febre maculosa, os hospedeiros amplificadores em geral s?o animais silvestres, os quais exercem fun??o importante por desenvolverem rickettsemia tempor?ria. Este estudo teve como objetivos estudar a ocorr?ncia de anticorpos da classe IgG anti Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa no soro dos pequenos roedores silvestres, detectar atrav?s da PCR a presen?a de esp?cies de Rickettsia do grupo da febre maculosa em fragmentos de ba?o dos roedores e esclarecer a participa??o destes animais como hospedeiros amplificadores de R. rickettsii em ?reas end?micas na regi?o de Campinas estado de S?o Paulo. Foram selecionados os munic?pios de Jaguari?na, Pedreira e Piracicaba por situarem-se em ?rea end?mica e com registro de casos em seres humanos. Foram utilizadas um total de cem armadilhas tipo Sharm distribu?das em linhas. Um total de 222 roedores das seguintes esp?cies foram capturadas: 35 (15,6%) Akodon sp, 61 (27,1%) Necromys lasiurus, 35 (15,6%) Calomys tener, 19 (8,4%)Mus muscullus, 1 (0,4%) Nectomys squamipes, 63 (28,0%) Oligoryzomys nigripes, 1 (0,4%) Oxymycterus nigripes e 7 (3,1%) Rattus rattus. Todos os roedores foram examinados, mas nenhum carrapato foi encontrado. Foram analisados um total de 186 soros para detec??o de anticorpos da classe IgG anti- Rickettsia rickettsii, R. parkeri, R. felis, R. amblyommii, R. rhipicephalus e R. bellii. Verificou-se que 39 (20,97%) dos soros foram reativos a pelo menos para uma das esp?cies Rickettsia com t?tulos variando de 1:64 a 1:512 e 147 (79,03%) foram negativos. A preval?ncia de anticorpos da classe IgG anti R. rickettsii encontrada nestes roedores foi de 9,34%. Dos 186 animais examinados apenas 17 foram positivos, destes, 15 animais apresentaram t?tulos de 1/64 e apenas um animal reagiu at? o t?tulo de 1/512. Foram processados 182 ba?os pela t?cnica da PCR e n?o foi detectado Rickettsia spp. em nenhum deles. Diante dos resultados apresentados podemos concluir que os pequenos roedores n?o s?o os hospedeiros amplificadores de Rickettsia do grupo da Febre Maculos na ?rea estudada.

Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo

A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é uma zoonose que tem como agente patogênico bactérias da espécie Rickettsia rickettsii, que são transmitidas por carrapatos da espécie Amblyomma aureolatum na Região Metropolitana de São Paulo, onde a letalidade da doença pode chegar a 80 por cento . Carrapatos dessa espécie realizam seu ciclo no interior das matas e cães domésticos - principais hospedeiros do estágio adulto desse carrapato em áreas degradadas - podem auxiliar na manutenção do ciclo da doença, ao transferir carrapatos infectados das matas para o ambiente antrópico. Este estudo teve como objetivo, analisar a relação entre fragmentação florestal, e sua possível influência na distribuição da soroprevalência de R. rickettsii em cães domésticos, na zona de contato entre Mata Atlântica e ambiente antrópico. Nove áreas com diferentes perfis ambientais foram selecionadas para o estudo: duas áreas em São Paulo, três áreas em Santo André, duas áreas em São Bernardo do Campo, uma área em Ribeirão Pires e uma área em Diadema. Uma amostra única de sangue foi coletada em trinta cães por área de estudo, num total de 270 cães amostrados. Todas as amostras foram submetidas a teste sorológico de imunofluorescência indireta para determinação do título de anticorpos contra R. rickettsii e todos os cães do estudo foram inspecionados em busca de carrapatos, que quando encontrados, foram levados ao laboratório para devida identificação de espécies e posterior pesquisa de riquétsias por PCR. Os dados de parasitismo por carrapatos em cães foi determinado pelo cálculo de abundância e intensidade parasitaria média. A soroprevalência encontrada variou de 0 a 37 por cento , e quando comparada aos dados ambientais, resultantes de análise multivariada de componentes principais, demonstrou que áreas mais preservadas, com maior área de mata e borda reduzida tem menores chances de ocorrência de casos de FMB do que áreas com área de mata reduzida e grande quantidade de borda. Somente as espécies A. aureolatum e R. sanguineus foram encontradas parasitando os cães do estudo, sendo que nenhum espécime foi considerado reagente na PCR. Os resultados sugerem que existe uma relação entre a soroprevalência de infecção por R. rickettsii em cães e as características de paisagem de cada região. A análise de estrutura de paisagem - parâmetro que pode favorecer a transmissão da bactéria R. rickettsii, uma vez que favorece o contato de cães e carrapatos vetores é uma ferramenta que pode auxiliar na determinação de áreas de maior ou menor risco para ocorrência de casos humanos de FMB, sendo útil na vigilância da doença. / The Brazilian Spotted Fever (BSF) is a zoonotic disease whose pathogen is the bacteria Rickettsia rickettsii, transmitted by Amblyomma aureolatum ticks in the Metropolitan Region of São Paulo, where the lethality of the disease can reach 80 per cent . The life cycle of those tiks occour in the forest and domestic dogs - main hosts of the adult stage of this tick in modify areas - can maintain the disease cycle, transferring infected ticks from the forest to the anthropic environment. This study aimed to analyze the relationship between forest fragmentation and its possible influence on the seroprevalence distribution of R. rickettsii in domestic dogs living at the contact zone between the Atlantic Forest and anthropic environment. Nine areas with different landscape profiles were selected for the study: two areas in São Paulo, three areas in Santo André, two areas in São Bernardo do Campo, an area in Ribeirão Pires and an area in Diadema. A single blood sample was collected in thirty dogs in each study area, with a total of 270 sampled dogs. All samples were submitted to serological test of indirect immunofluorescence to determine the antibodies titers against R. rickettsii, and all study animals were inspected for ticks, that when found, were taken to the laboratory for proper identification of species and further Ricketsia research through PCR reaction. Parasitism data of ticks on dogs was determined by the mean abundance and mean intensity. The seroprevalence found ranged from 0 to 37 per cent , and when compared to environmental data, resulted from the principal component analysis, showed that the most preserved areas, with larger amount of forest and less edge has lower chances of BSF occurrence, than areas with less forest and greather amount of edge. Only the species A. aureolatum and R. sanguineus were found parasitizing the study dogs, and no specimen was considered positive in the PCR reaction. The results suggest a relationship between the seroprevalence of infection with R. rickettsii in dogs and the landscape features on each region. The landscape structure analysis - parameter that can facilitate the transmission of the bacteria R. rickettsii, since it favors the contact between dogs and ticks - can assist in determining areas of higher or lower risk for the occurrence of human cases of BSF, being useful in monitoring the disease.

O agente etiológico da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (RMSF), conhecida no Brasil como Febre Maculosa Brasileira, é a bactéria Rickettsia rickettsii. Essa bactéria é transmitida ao homem pela picada de diferentes espécies de carrapatos ixodídeos. No Brasil, os vetores são Amblyomma cajennense e A. aureolatum. As taxas de prevalência de R. rickettsii nas populações de carrapatos de áreas endêmicas para RMSF são baixas, em geral abaixo de 1%. Essa baixa prevalência parece estar associada a menores taxas reprodutivas e de sobrevivência de linhagens infectadas, sugerindo que R. rickettsii seja patogênica também para os seus vetores. Infecções experimentais demonstraram que 80-100% dos indivíduos de uma colônia de A. aureolatum mantida em laboratório são infectados por R. rickettsii, enquanto apenas 10-60% de A. cajennense adquirem a bactéria. Esses dados indicam que as respostas dessas duas espécies de carrapatos à infecção sejam diferentes, resultando em diferentes taxas de prevalência da bactéria. Dessa maneira, a caracterização molecular das interações entre carrapatos do gênero Amblyomma e a bactéria R. rickettsii é importante, podendo gerar informações não somente para o esclarecimento acerca dos mecanismos de patogenicidade de R. rickettsii para os carrapatos, mas também para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pela aparente restringência de A. cajennense à infecção. Assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) analisar os efeitos da infecção por R. rickettsii sobre o perfil de expressão gênica de carrapatos A. cajennense por hibridação subtrativa por supressão (SSH), (ii) validar os dados de SSH por reação em cadeia de polimerase quantitativa precedida por transcrição reversa (RT-qPCR) e (iii) caracterizar funcionalmente dois genes com expressão induzida pela infecção por RNA de interferência (RNAi). Após a análise bioinformática dos dados de SSH, 44 sequências únicas foram obtidas, das quais 36 representam genes com expressão induzida e 8 genes com expressão reprimida pela infecção. A indução dos genes codificadores da subunidade I da citocromo c oxidase (COX1), da subunidade IV da NADH desidrogenase, de uma proteína com domínio de inibidor de serina-proteases Kunitz-type (papilina-like), identificados por SSH, e de um peptídeo antimicrobiano (hebraeína), foi confirmada por RT-qPCR. O silenciamento gênico da hebraeína e da papilina-like não teve nenhum efeito na aquisição de R. rickettsii pelo vetor, indicando que, isoladamente, não são responsáveis pela proteção de A. cajennense contra a infecção. Os dados gerados pelo presente estudo abrem perspectivas para que outros genes sejam avaliados quanto ao seu papel na aquisição de R. rickettsii, os quais, no futuro, podem ser considerados como alvos para o desenvolvimento de vacinas. / The etiologic agent of the Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF), also known as Brazilian Spotted Fever in Brazil, is the bacterium Rickettsia rickettsii. This rickettsia is transmitted to humans by the bite of various tick species. In Brazil, Amblyomma cajennense and A. aureolatum are known as vectors. The prevalence rates of R. rickettsii infected ticks in RMSF endemic areas are low, oscillating around 1%. These low prevalence rates seems to be associated with lower reproductive and survival rates of infected ticks, suggesting that R. rickettsii is also pathogenic to its vectors. Experimental infections with R. rickettsii have demonstrated that 80 to 100% of A. aureolatum ticks from a laboratory colony acquire this bacterium, whereas only 10 to 60% of A. cajennense ticks become infected. These results indicate that the responses of these two tick species against infection are different, resulting in different prevalence rates of the bacterium. Therefore, the elucidation of the interactions between ticks of the genera Amblyomma and the bacterium R. rickettsii at a molecular level is important to provide information to better understand the mechanisms of pathogenicity of R. rickettsii against ticks as well as for the elucidation of the mechanisms responsible for the apparent refractoriness of A. cajennense against infection. Therefore, the objectives of the current study were: (i) analyze the effets of the infection with R. rickettsii on the gene expression of ticks A. cajennense by suppression subtractive hybridization (SSH), (ii) validate SSH data by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and (iii) functionally characterize two genes induced by infection using RNA interference (RNAi). After bioinformatics analysis of SSH data, 44 unique sequences were obtained, among which 36 represent genes with expression induced and 8 repressed genes by infection. The induction of genes encoding subunit I of cytochrome c oxidase (COX1), the NADH dehydrogenase subunit IV, a protein containing Kunitz-type inhibitor domain (papilin-like), identified by SSH, and an antimicrobial peptide (hebraein), was confirmed by RT-qPCR. The effects of knockdown of hebraein and papilin-like encoding genes had no effect on the acquisition of R. rickettsii by the vector. Data of the current study may be used to evaluate the role of other genes in acquisition of R. rickettsii, which, in the future, may be considered as target for vaccine development.

Neste projeto, objetivou-se o diagnóstico de riquétsias, utilizando metodologia molecular, em material de humanos, carrapatos, pulgas, cães e equinos de áreas endêmicas dos estados de São Paulo (SP) e Rio de Janeiro (RJ). Diagnosticou-se Rickettsia rickettsii infectando Amblyomma cajennense e humanos no estado de SP, indicando ser esta a única espécie responsável pela doença. Rickettsia conorii foi diagnosticada em um paciente procedente de Portugal. No estado do RJ, Rickettsia felis foi detectada Ctenocephalides felis e em Am. cajennense enquanto que R. rickettsii em Amblyomma aureolatum, Am. cajennense, Anocentor nitens, Boophilus microplus, Ct. felis e Rhipicephalus sanguineus. As frequências mínimas de vetores infectados do estado do RJ apresentaram valores superiores àqueles registrados em outras regiões do país. Demonstrou-se, de forma inédita, o envolvimento de algumas destas espécies no ciclo da bactéria. R. rickettsii foi diagnosticada em cães e equinos indicando a importância dos animais domésticos na manutenção do ciclo da riquetsiose. / This project aimed to diagnose rickettsial diseases using molecular analysis methods on human, tick, flea, dog and horse samples from endemic areas in the States of São Paulo (SP) and Rio de Janeiro (RJ). A diagnosis of Rickettsia rickettsii infecting Amblyomma cajennense and humans in the State of SP was made, indicating that this is the only species responsible for the disease. Rickettsia conorii was diagnosed in a patient from Portugal. In RJ, Rickettsia felis was detected in Ctenocephalides felis and Am. cajennense, while R. rickettsii was detected in Amblyomma aureolatum, Am. cajennense, Anocentor nitens, Boophilus microplus, Ct. felis and Rhipicephalus sanguineus. In the State of RJ the minimum frequency of infected vectors presented higher values than those recorded in other regions of the country. The involvement of some of these species in the bacterium cycle has been demonstrated for the first time. R. rickettsii was diagnosed in dogs and horses indicating the importance of livestock in the maintenance cycle of rickettsial infection.