A hemorragia intracerebral (HIC) é uma das principais causas de mortalidade em todo mundo, desencadeando eventos adversos e déficits neurológicos graves. A partir disso, essa tese teve como objetivo avaliar as respostas celulares e suas interações envolvidas na HIC e investigar os possíveis mecanismos que contribuem para os déficits sensório-motores relacionados, principalmente, à habilidade dos membros anteriores dos animais. Para isso foram realizados dois experimentos. Em ambos os animais de 90 dias foram submetidos à HIC induzida por colagenase no estriado dorsolateral. No primeiro experimento, após 24h, 72h e 7 dias os animais foram avaliados funcionalmente, e histologicamente quanto ao volume da lesão. Ainda, durante 6h, 24h, 72h e 7 dias, o estriado e o córtex foram avaliados quanto ao número de células neuronais, gliais, e em apoptose; a expressão de GFAP e S100B, no estriado e no córtex, a secreção de S100B, no soro e líquido cérebro-espinhal (LCE). A HIC provocou déficits sensório-motores e perda tecidual; induziu morte neuronal e gliose reativa no estriado. O córtex obteve uma resposta astrocitária similar, mas quanto à microglia houve um aumento apenas em 6h. A S100B correlacionou-se positivamente com o número de células gliais; e negativamente com a força e função dos membros anteriores dos animais lesados. No segundo experimento, foram avaliados o estado oxidativo, o nível de TNF-α, a atividade da glutamina sintetase (GS) e a captação de glutamato nos tempos de 6h, 24h, 72h e 7 dias pós-lesão. Após 6h da HIC houve aumento no nível de TNF-α e excitotoxicidade glutamatérgica; entretanto, a função de clearence astrocitário foi restabelecida 7 dias após o dano. A HIC gerou estresse oxidativo e aumento de antioxidantes endógenos, além disso, as espécies reativas de oxigênio (ERO) inibiram a atividade da GS em 24h e 7 dias após a lesão. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que a S100B atua na lesão hemorrágica produzindo respostas distintas, região dependente, contribuindo para o aumento das células gliais no estriado e córtex, correlacionando-se positivamente com os déficits funcionais. Este é o primeiro relato descrevendo a relação da S100B com as alterações celulares e funcionais durante a progressão da HIC experimental. Além disso, os mecanismos envolvidos na HIC demonstraram padrões e respostas envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica e inflamação, que colaboraram para o dano oxidativo; em resposta ao estresse houve o aumento de antioxidantes endógenos que podem ter contribuído para o reestabelecimento da função astrocitária. / Intracerebral haemorrhage (ICH) is a major cause of mortality worldwide, triggering adverse events and serious neurological deficits. From this standpoint, this thesis aimed to evaluate the cellular responses and interactions involved in ICH and investigate the possible mechanisms that contribute to sensory-motor deficits, mainly related to the ability of the forelimbs of animals. For this, two experiments were conducted. In both, animals of 90 days of age were subjected to ICH induced by collagenase in dorsolateral striatum. In the first experiment, after 24h, 72h and 7 days, the animals were evaluated functionally, and histologically about the lesion volume. Also, at 6h, 24h, 72h and 7 days, the striatum and the cortex was evaluated as the number of neuronal, glial and apoptotic cells; the expression of GFAP and S100B, the striatum and cortex, S100B secretion in serum and cerebrospinal fluid (CSF). ICH caused sensorimotor deficits and tissue loss; induced neuronal death and reactive gliosis in the striatum. The cortex astrocyte obtained a similar response, but about the microglia there was an increase only at 6h. S100B was positively correlated with the number of glial cells; and negatively correlated with the strength and function of the forelimbs of injured animals. In the second experiment, were evaluated the oxidative state, the level of TNF-α, the activity of glutamine synthetase (GS) and glutamate uptake at 6h, 24h, 72h and 7 days post-injury. After 6h from ICH, there was an increase in TNF-α levels and glutamatergic excitotoxicity; however, the astrocyte clearance function was established 7 days after the damage. HIC generated oxidative stress and increase of endogenous antioxidants, in addition, reactive oxygen species (ROS) inhibited the activity of GS in 24h and 7 days after injury. Based on the results obtained, we can conclude that S100B acts in hemorrhagic lesions producing different responses, region-dependent, contributing to the increase in glial cells in the striatum and cortex, correlating positively with functional deficits. This is the first report describing the relation of S100B with cellular and functional changes during the progression of experimental ICH. Furthermore, the mechanisms involved in ICH displayed patterns and responses involving glutamatergic excitotoxicity and inflammation, that contributed to oxidative damage; in response to stress there was an increase of endogenous antioxidants which may have contributed to the re-establishment of astrocyte function.

Proteins perform an incredible array of functions facilitated by a diverse set of biochemical properties. Changing these properties is an essential molecular mechanism of evolutionary change, with major questions in protein evolution surrounding this topic. How do new functional biochemical features evolve? How do proteins change following gene duplication events? I used the S100 protein family as a model to probe these aspects of protein evolution. The S100s are signaling proteins that play a diverse range of biological roles binding Calcium ions, transition metal ions, and other proteins. Calcium drives a conformational change allowing S100s to bind to diverse peptide regions of target proteins. I used a phylogenetic approach to understand the evolution of these diverse biochemical features. Chapter I comprises an introduction to the disseration. Chapter II is a co-authored literature review assessing available evidence for global trends in protein evolution. Chapter III describes mapping of transition metal binding onto a maximum likelihood S100 phylogeny. Transition metal binding sites and metal-driven structural changes are a conserved, ancestral features of the S100s. However, they are highly labile at the amino acid level. Chapter IV further characterizes the biophysics of metal binding in the S100A5 lineage, revealing that the oft–cited Ca2+/Cu2+ antagonism of S100A5 is likely due to an experimental artifact of previous studies. Chapter V uses the S100 family to investigate the evolution of binding specificity. Binding specificity for a small set of peptides in the duplicate S100A5 and S100A6 clades. Ancestral sequence reconstruction reveals a pattern of clade-level conservation and apparent subfunctionalization along both lineages. In chapter VI, peptide phage display, deep-sequencing, and machine-learning are combined to quantitatively reconstruct the evolution of specificity in S100A5 and S100A6. S100A5 has subfunctionalized from the ancestor, while S100A6 specificity has shifted. The importance of unbiased approaches to measure specificity are discussed. This work highlights the lability of conserved functions at the biochemical level, and measures changes in specificity following gene duplication. Chapter VII summarizes the results of the dissertation, considers the implications of these results, and discusses limitations and future directions. This dissertation includes both previously published/unpublished and co- authored material.

Muitos trabalhos têm demonstrado que a deficiência cerebral de insulina ou um estado de resistência cerebral a esta são parte da fisiopatogenia da Doença de Alzheimer (DA). A estreptozotocina é uma substância que vem sendo utilizada, por administração intracerebroventricular, para produzir um modelo de doença de Alzheimer esporádica com características neuroquímicas e fisiopatológicas semelhantes à DA em roedores através da dessenbililização dos receptores de insulina, especialmente em hipocampo e córtex cerebral. Dessa forma, este trabalho tem como principal objetivo, avaliar as alterações neurogliais em hipocampo de ratos expostos à estreptozotocina intracerebroventricular, bem como o efeito de estratégias terapêuticas, através da medida da secreção da proteína S100B, medida de GFAP, GSH, GS, captação de glutamato, estresse oxidativo e nitrosativo e análise comportamental. Como resultado, encontramos declínio cognitivo, estresse oxidativo e nitrosativo e alterações astrocíticas hipocampais, especialmente relacionadas ao metabolismo do glutamato, à defesa antioxidante e à secreção da proteína S100B, a qual pode atuar tanto na sinalização neurônio-astrócito, em condições fisiológicas e patológicas, quanto em diversas doenças neurodegenerativas, incluindo a Doença de Alzheimer. Ainda, observou-se o efeito neuroprotetor do composto anti-glicação aminoguanidina, bem como do exercício físico em esteira sobre os animais expostos à estreptozotocina intracerebroventricular. Ambos mostraram-se eficazes na recuperação do déficit cognitivo causado pelo modelo, bem como das alterações astrocíticas e do estresse oxidativo/nitrosativo. Além disso, mostrou-se que a aminoguanidina e a corrida em esteira são importantes estratégias antioxidantes, podendo servir de agentes potenciais na busca de alternativas para o tratamento de doenças tão incapacitantes e incidentes como a Doença de Alzheimer. Por fim, este trabalho confirma o comprometimento cognitivo e o estresse oxidativo presentes no modelo, os quais se somam às alterações funcionais encontradas nos astrócitos. Tais alterações também estão presentes na DA, apontando a interação neuroglial como um importante alvo de estudo na doença e na busca por alternativas terapêuticas. / Many studies have been shown that a brain´s insulin deficiency and/or a resistance state participate of the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). Streptozotocin is a drug that has been used via intracerebroventricular to produce a model of dementia in rodents with neurochemical and morphological characteristics similar to DA by desensitization of insulin receptors, especially in the hippocampus and cerebral cortex. In this way, the main aim of the present study is to investigate the neuroglial changes in hippocampus of rats submitted to intracerebroventricular streptozotocin, as well as therapeutic strategies by measuring secretion of S100B, content of GFAP, GSH and GS, glutamate uptake, oxidative and nitrosative stress as well behavioral analysis. The results show cognitive decline, oxidative/nitrosative stress and hippocampal astrocytic changes, particularly related to glutamate metabolism, antioxidant defense and secretion of S100B protein, which can act in the astrocyte-neuron signaling over physiological and several pathological disorders, including Alzheimer's disease. Besides, it was observed the neuroprotective effect of the anti-glycation compound aminoguanidine, as well as treadmill running on intracerebroventricular streptozotocin treated animals. Both were effective in the recovery of cognitive deficit caused by the model, as well as the astrocytic changes and oxidative/nitrosative stress. Moreover, it was shown that aminoguanidine and treadmill running are important antioxidant strategies, being potential agents in the search for alternatives to the treatment of debilitating and incidents disorders such as Alzheimer's disease. Finally, this study confirms the cognitive impairment and oxidative stress of this model, associated to the alterations in the functioning of astrocytes. Such changes are also present in AD, pointed to the neuroglial interaction as an important target of study in this condition and in the search for alternative therapies.

O diabetes mellitus tipo I é uma enfermidade autoimune relacionada com anormalidades genéticas, influenciada por fatores ambientais, que resultam na destruição de células β-pancreáticas, mediadas por células T. O diabetes durante a gravidez aumenta o risco a alterações no sistema nervoso central. O processo de gliogênese é importante para o desenvolvimento e funcionamento do SNC e começa na segunda semana de gestação, em ratos. A glia é composta por astrócitos, oligodendrócitos, células ependimais e microglia. Os astrócitos são as células mais abundantes e responsáveis pela integração do cérebro com o sistema vascular e imunológico, estando relacionados com as funções cognitivas, além de uma importância física e estrutural na barreira hemato-encefálica. Duas proteínas astrocíticas foram estudadas aqui: a proteína glial fibrilar acida e a S100B, uma proteína ligante de cálcio, produzida e secretada por astrócitos. A S100B está envolvida na comunicação neurônio-glia, possuindo propriedades neurotróficas ou neurotóxicas de acordo com a concentração extracelular. A expressão da proteína glial fibrilar ácida é essencial para a estrutura encefálica e para a integridade da barreira hemato-encefálica. Assim avaliamos essas proteínas gliais na prole oriunda de mães diabéticas (PoD) no desenvolvimento corporal e do sistema nervoso central. Foram utilizadas ratas Wistar-Kyoto diabéticas induzidas por estreptozotocina para obtenção da prole. As fêmeas diabéticas induzidas apresentaram ninhadas menores do que o controle, e os filhotes apresentam menor peso ao nascer A hiperglicemia materna induz aumento da produção insulínica no feto, que leva a um quadro de hipoglicemia pós-natal. Os níveis glicêmicos do PoD foram superiores ao controle (PoC) com 1 dia, e inferiores com 21 dias. A mensuração da proteína S100B no soro de animais PoD14 apresentou diminuição em relação ao controle. A S100B no líquor mostrou valores foram maiores no PoD7. Já a S100B no hipocampo mostrou um crescimento progressivo, com diminuição no PoD14 e um aumento no PoD28. Na quantificação da proteína glial fibrilar acida os animais do grupo PoD7 e PoD14 apresentaram valores menores, em seguida os níveis começaram a subir. No teste de campo aberto os animais PoD apresentaram comportamento ansioso. Já no reconhecimento de objetos os ratos PoD exploraram menos o objeto novo, tanto na memória de curta como de longa duração. As mudanças astrogliais observadas nos animais do grupo PoD estão muito provavelmente relacionadas a alterações da plasticidade neuroglial e ao déficit cognitivo observado. / The type I diabetes mellitus is an autoimmune disease associated with genetic abnormalities, influenced by environmental factors which result in the destruction of pancreatic β-cells, mediated by T cells. Diabetes during pregnancy increases the risk of changes in the central nervous system. The gliogenesis process is important to the development and functioning of the central nervous system and starts the second week of rat gestation. The glia is composed of astrocytes, oligodendrocytes, ependymal cells and microglia. The astrocytes are more abundant cells and responsible for the integration of the brain with vascular and immune systems, being connected with the cognitive functions, as well as a physical and structural importance of the blood-brain barrier. Two astrocity proteins were studied: glial acidic fribrilar protein and S100B, a binding protein of calcium produced and secreted by astrocytes. S100B is involved in neuron-glia communication, having neurotoxic or neurotrophic properties according to the extracellular concentration. Expression of glial acidic fribrilar protein is essential for brain structure and integrity of the blood-brain barrier. So we evaluated this glial proteins the offspring derived from diabetic mothers (PoD) on body development and central nervous system. Wistar-Kyoto rats with diabetes induced by streptozotocin to obtain offspring. Induced diabetic females had smaller litters then the control, and the offsprig have a lower birth weigth Maternal hyperglycemia induces increased insulin production in the fetus. Blood glucose levels were higher in PoD than the control (PoC) with 1 day and less than 21 days. The measurement of S100B protein in PoD14 animal serum showed a decrease compared to the control. The S100B in cerebrospinal fluid showed values were higher in PoD7. Since S100B in the hippocampus showed a progressive increase with decrease in PoD14 and increase in PoD28. Glial acidic fribrilar protein quantification in animals of PoD7 and PoD14 group showed lower values, and then levels began to rise. In the open field test the PoD animals showed anxious behavior. Since the object recognition (RO) least rats explored the new object in both short and long term memory. Induced diabetic females had smaller litters than the control, and the chicks have a lower birth weight. Maternal hyperglycaemia induces increased insulin production in the fetus, which leads to a postnatal hypoglycemia. The variations observed in the animals of group PoD caused biochemical changes related to astroglial plasticity, which caused cognitive impairment.

Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos, exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas. O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6 representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas, porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína. / Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability. This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed, considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures. This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases. The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC. Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as the role of astrocytes in this regulation.

A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a um dos casos mais frequente epilepsia em humanos e de maior refratariedade nos pacientes. A maioria dos fármacos antiepilépticos são moduladores da atividade neuronal e atuam sobre canais iônicos do receptor GABAA. Estudos vêm demonstrando o papel das células gliais e da neuroinflamação na epileptogênese e a modulação desta resposta pode ser um alvo potencial para drogas adjuvantes aos fármacos anti-epilépticos. Astrócitos são células gliais participantes da sinapse tripartite, moduladores da atividade neuronal. Os astrócitos são capazes de promover a homeostase de íons e de neurotransmissores, são responsáveis pelo metabolismo energético e da produção de fatores neurotróficos, glutationa, glutamina, S100B e citocinas. Neste trabalho, induzimos status epilepticus (SE) em ratos jovens (PN28) através do modelo lítio-pilocarpina que mimetiza alterações neuronais, bioquímicas e morfológicas similares à ELT em humanos. Os animais foram divididos nos tempos 1, 14 e 56 dias após a indução de status epilepticus (SE). Estes períodos são caracterizados respectivamente como a fase aguda, latente e crônica da epilepsia. Inicialmente, analisamos as mudanças neuroquímicas e astrocitárias ao longo do tempo. Foi observada neuroinflamação inicial e transitória que promove morte neuronal e mudanças ao longo do tempo de astrogliose e disfunção astrocitária. Também foi observado que a proteína S100B, proteína ligante de cálcio, predominantemente astrocitária, pode ser considerado um marcador da disfunção neuronal e astrocitária promovida neste modelo de epilepsia. Em seguida, demonstramos que a modulação da secreção de S100B pelo anti-inflamatório dexametasona um dia após indução de SE reverte a neuroinflamação, astrogliose e disfunção astrocitária à curto e à longo prazo. Por conseguinte, observamos que a modulação do receptor GABAA através de agonistas e antagonistas GABAérgicos altera a secreção de S100B em fatias hipocampais agudas e em cultura de astrócitos. Portanto, pode-se sugerir que as alterações astrogliais e a neuroinflamação dependentes do tempo podem estar ligadas à excitabilidade neuronal e/ou à morte neuronal em ratos jovens em modelo de epilepsia; que a proteína S100B pode ser considerada um marcador deste modelo de epilepsia e que a modulação da sua secreção pode ser um possível alvo farmacológico no tratamento da epilepsia. / Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent type of epilepsy in humans and is more associated to refractory to anti-epileptic drugs (AED) in patients. The most AEDs are modulators of neuronal activity and act on ion channels, such as GABAA receptor. Studies have been demonstrating the role of glial cells and neuroinflammation in epileptogenesis. The modulation of this response may be a potential target for adjunctive drugs to anti-epileptic drugs. Astrocytes are glial cells that participated in the tripartite synapse and modulated neuronal activity. Astrocytes are able to promote homeostasis of ions and neurotransmitters, are responsible for energy metabolism and the production of neurotrophic factors, glutathione, glutamine, S100B and cytokines. In this work, we induced status epilepticus (SE) in young rats (PN28) through the lithiumpilocarpine model that mimics neuronal, biochemical and morphological alterations similar to ELT in humans. The animals were divided at times 1, 14 and 56 days after the induction of SE. These periods are characterized respectively as the acute, latent and chronic phase of epilepsy. Initially, we analyzed neurochemical and astrocytic changes over time. Initial and transient neuroinflammation was observed and promoted over time neuronal death, astrogliosis and astrocytic dysfunction. It has also been observed that the protein S100B, a calcium-binding protein, predominantly astrocytic, can be considered a marker of neuronal and astrocytic dysfunction promoted by this model of epilepsy. Next, we demonstrate that the modulation of S100B secretion by the antiinflammatory dexamethasone one day after SE induction reverses neuroinflammation, astrogliosis and astrocytic dysfunction in the acute and chronic time. Therefore, we analyzed that modulation of the GABAA receptor through GABAergics agonists and antagonists alters the secretion of S100B in acute hippocampal slices and in astrocyte culture. Therefore, it may be suggested that astroglial changes and time dependent neuroinflammation may be related to neuronal excitability and/or neuronal death in young rats in this epilepsy model; that S100B protein can be considered a marker of this epilepsy model and that the modulation of its secretion may be a possible pharmacological target in the treatment of epilepsy.

Durante o desenvolvimento fetal, o sistema nervoso central (SNC) apresenta-se mais vulnerável aos efeitos tóxicos do etanol. Sabe-se que a exposição pré-natal sob altas doses de álcool aumenta a propensão de síndromes fetais. No entanto, muitas gestantes optam por manter o “beber social”, mesmo que estudos mostrem que doses moderadas de etanol na fase do desenvolvimento possa causar danos ao SNC associados a transtornos cognitivos, sociais e neuroquímicos. O objetivo desta tese é avaliar parâmetros astrogliais e comportamentais no período da adolescência em fatias hipocampais de ratos Wistar machos submetidos a um modelo animal de exposição pré e pós-natal sob doses moderadas de etanol. O modelo animal utilizou cerveja sem álcool para administração por via oral de etanol. As ratas foram expostas ao tratamento durante toda a gestação até o final do desmame. Ratas prenhas foram divididas em três grupos de tratamento: apenas água (grupo controle), cerveja sem álcool (grupo veículo) ou cerveja sem álcool adicionado de 10%v.v. etanol (MPAE group 9 moderate prenatal alcohol exposure). Filhotes adolescentes machos foram submetidos a tarefa de esquiva discriminativa passiva com o objetivo de avaliar o comportamento de aprendizado/memória e de ansiedade. No dia pós-natal 30 (DPN 30) o hipocampo foi dissecado e fatias foram obtidas para a imunoquantificação de GFAP, NeuN, S100B, receptores NMDA e para os transportadores gliais de glutamato, EAAT1 e EAAT2. O ensaio para dosagem da captação de glutamato, bem como o conteúdo de glutationa (GSH) também foram realizados. Os filhotes do grupo MPAE apresentaram comportamento do tipo ansiolítico, mesmo tendo aprendido a evitar o braço aversivo. Observamos neste grupo uma diminuição da captação de glutamato, que parece ser dose 9 dependente, além de alterações na quantificação dos receptores NMDA e dos transportadores de glutamato EAAT1 e EAAT2, que podem ter contribuído para os efeitos comportamentais encontrados. Os níveis da proteína S100B estavam claramente elevados no líquido cefalorraquidiano apenas no grupo MPAE e alterações na expressão de GFAP também foram evidenciadas neste grupo. Contudo, este trabalho mostra que mesmo doses moderadas de etanol, administradas durante o período do desenvolvimento fetal, podem interferir no comportamento de risco associado a diminuição da ansiedade, visto na fase da adolescência. Além disso, os resultados ressaltam uma maior vulnerabilidade do sistema glutamatérgico à toxicidade do etanol, bem como da possibilidade das células da glia participarem de uma resposta de ativação e reparo após o tratamento pré-natal com etanol. / The central nervous system (CNS) is more vulnerable to ethanol effects during fetal development. It is known that high doses of prenatal ethanol exposure increases the probability of fetal alcohol syndromes. Women have chosen to continue drinking socially despite being pregnant, even with studies demonstrating that moderate doses of ethanol during development can impact the CNS leading to cogitive, social and neurochemical impairments. The aim of this thesis is evaluate glial and behavior parameters during adolescence period on hippocampal slices of male Wistar rats submitted to an animal model of prenatal and postnatal ethanol exposure under moderate dose. An animal model of oral self-administration of etanol through a non-alcoholic beer was performed during the role gestation period until weaning. The pregnant rats were divided in three treatment groups: only water (control group), non-alcoholic beer (vehicle group) or non-alcoholic beer with 10% v.v. added (MPAE group – moderate prenatal alcohol exposure). Adolescent male offspring were subjected to the discriminative passive avoidance task to evaluate the learning/memory and anxiety-like behavior. On postnatal day 30 (PND 30) hippocampi were dissected and slices were obtained for immunoquantification of GFAP, NeuN, S100B, NMDA receptors and for glial glutamate transporters, EAAT1 and EAAT2. In addition, we measured the glutamate uptake, as well as the GSH content. Offspring from MPAE group presented an anxiolytic-like behavior, even though they had learned how to avoid the aversive arm. We observed a decrease in glutamate uptake, that seems to be dose-dependent, and alterations in the quantification of glutamate NMDA receptors and EAAT1 and EAAT2 transporters, that could contribute to the behavior findings. The S100B protein levels were clearly increased in the cerebrospinalfluid only for MPAE group and alterations in GFAP expression were also seen for this group. Nevertheless, this thesis shows that even moderate ethanol doses administred during fetal development can impact the rink taking behavior associated to reducement in anxiety, common seen during adolescence. Moreover, the results highlight a vulnerability of glutamate system associated to etanol toxicity, as well as the possibility of glial cells are involved in an activated and repair response after prenatal etanol treatment.

Os astrócitos são células conhecidas por sua capacidade dinâmica e versatilidade, participando não somente da manutenção da homeostase cerebral em condições fisiológicas, mas também respondendo em condições patológicas, como por exemplo, na encefalopatia hepática (EH). Esta patologia neurológica está associada principalmente à hiperamonemia, decorrente de uma falência hepática aguda ou crônica. A toxicidade da amônia no sistema nervoso central (SNC) é mediada por uma série de alterações celulares e metabólicas, principalmente nas células astrogliais. Nesse sentido, a busca por moléculas com potencial terapêutico no SNC é extremamente relevante. Trabalhos do nosso grupo mostraram que o resveratrol e o ácido lipoico, duas moléculas conhecidas pelos seus efeitos antioxidantes, modulam importantes funções gliais, relacionadas principalmente ao metabolismo glutamatérgico, à defesa antioxidante e à resposta inflamatória. Neste sentido, esta tese teve como objetivo avaliar os efeitos do resveratrol e do ácido lipoico em células astrogliais e neuronais expostas à amônia, assim como seus possíveis mecanismos protetores. Primeiramente, nós observamos que o resveratrol e o ácido lipoico foram capazes de prevenir as alterações induzidas pela amônia em células astrogliais C6, sobre parâmetros do metabolismo glutamatérgico, dentre os quais podemos destacar a captação de glutamato, a atividade da enzima glutamina sintetase (GS) e o conteúdo de glutationa (GSH). Além disso, o ácido lipoico também exerceu um efeito antiinflamatório nestas células, prevenindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IL- 1β, IL-6, IL-18) e da proteína S100B, através da diminuição da ativação do fator de transcrição NFκB. Nós também verificamos que a maioria dos efeitos protetores do resveratrol e do ácido lipoico foram dependentes da heme oxigenase 1 (HO1), uma enzima associada com a defesa celular em situações de estresse. Por fim, foram avaliados os efeitos do resveratrol e do ácido lipoico sobre células neuronais expostas à amônia. Novamente, ambos apresentaram um efeito benéfico, prevenindo tanto o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) quanto a diminuição do conteúdo de GSH induzidos pela amônia. Nas células neuronais, a proteína HO1 também participou dos efeitos protetores do resveratrol e do ácido lipoico. Em conjunto, esses resultados nos mostram que o resveratrol e o ácido lipoico são capazes de modular positivamente o funcionamento tanto de células astrogliais quanto de células neuronais em situações de hiperamonemia, compartilhando também alguns mecanismos de ação, como a indução da HO1. Este estudo in vitro sugere que o resveratrol e o ácido lipoico são potenciais agentes terapêuticos para doenças do SNC, as quais envolvam produção de espécies reativas e resposta inflamatória, como a EH. / Astrocytes are dynamic and versatile cells which participate in the maintenance of brain homeostasis in physiological conditions and also in response to pathological conditions, such as hepatic encephalopathy. This neurological disease is mainly associated with hyperamonnemia, resulting from acute or chronic liver failure. Ammonia toxicity in the central nervous system (CNS) is mediated by several cellular and metabolic alterations, primarily in astroglial cells. In this sense, the search for molecules with therapeutical potential for CNS becomes highly relevant. Our group has shown that resveratrol and lipoic acid, two molecules known for their antioxidant activities, are able to modulate important glial functions mainly related to glutamate metabolism, antioxidant defense and inflammatory response. In this sense, this study aimed to evaluate the effects of resveratrol and lipoic acid in astroglial and neuronal cells exposed to ammonia, as well as their possible protective mechanisms. Firstly, we observed that resveratrol and lipoic acid were able to prevent ammonia-induced alterations in C6 astroglial cells functioning, such as glutamate uptake, glutamine synthetase (GS) activity and intracellular GSH content. Moreover, lipoic acid also exerted an anti-inflammatory effect in C6 astroglial cells, preventing the ammonia-stimulated release of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-1β, IL-6, IL-18) and S100B protein, by decreasing the activation of the transcription factor NFκB. We also verified that the most protective effects of resveratrol and lipoic acid involved the heme oxygenase 1 (HO1), an enzyme associated with protection against stressful conditions. Finally, we evaluated the effects of resveratrol and lipoic acid on neuronal cells exposed to ammonia. Again, both showed beneficial roles, preventing the increase of reactive oxygen species (ROS) and decrease of GSH content induced by ammonia. In neuronal cells, HO1 also mediated the protective effects of resveratrol and lipoic acid. Taken together, these results show that resveratrol and lipoic acid are able to positively modulate the functioning of both astroglial and neuronal cells in hyperamonemmia conditions, sharing some mechanisms of action, such as HO1. This study in vitro suggests that resveratrol and lipoic acid may represent potential therapeutic agents for CNS, during oxidative and inflammatory damages, as the induced by ammonia.

As respostas inflamatórias no cérebro são mediadas principalmente pela microglia, mas evidências crescentes sugerem uma importância crucial dos astrócitos. A S100B, uma proteína ligante de cálcio e secretada por astrócitos, tem propriedades neurotróficas e de citocina inflamatória. No entanto, não se sabe se sinais primários que ocorrem durante a indução de uma resposta inflamatória como, por exemplo, lipopolissacarídeo (LPS) modulam diretamente a S100B. A neuroinflamação está implicada na patogênese ou na progressão de uma variedade de distúrbios neurodegenerativos e muitos estudos procuram uma conexão entre S100B e doenças degenerativas, incluindo a doença de Alzheimer e esquizofrenia. O uso terapêutico de fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) para estas doenças tem aumentado. No entanto, existem poucos estudos sobre o efeito desses fármacos em relação à proteína S100B. Neste trabalho, nós avaliamos se os níveis de S100B no líquido cefalorraquidiano (LCR) e soro de ratos Wistar são afetados por injeção de LPS administrado por via intraperitoneal (IP) ou intracerebroventricular (ICV), bem como se as culturas primárias de astrócitos respondem diretamente ao LPS. Além disso, nós avaliamos o conteúdo e a secreção de S100B medido por ELISA (bem como o conteúdo de GFAP e secreção de TNF-α) em culturas primárias de astrócitos expostos a dexametasona e quatro classes químicas diferentes de AINEs (ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenaco e nimesulida) durante 24 h. Os nossos dados sugerem que a secreção de S100B no tecido cerebral é estimulada rapidamente e persistentemente (durante pelo menos 24 h) por administração ICV de LPS. Este aumento da S100B no LCR foi transitório quando o LPS foi administrado IP. Em contraste com estes resultados de S100B, observou-se um aumento nos níveis de TNF-α no soro, mas não no LCR, após a administração IP de LPS. Em astrócitos isolados e em fatias de hipocampo frescas, observou-se uma estimulação direta da secreção de S100B por LPS numa concentração de 10 ug/ml. Um envolvimento de TLR4 foi confirmado pelo uso de antagonistas específicos deste receptor. No entanto, baixas concentrações de LPS em culturas de astrócitos foram capazes de induzir uma diminuição na secreção de S100B após 24 h, sem alteração significativa no conteúdo intracelular de S100B. Além disso, após 24 horas de exposição ao LPS, observou-se um decréscimo na glutationa e um aumento na proteína ácida fibrilar glial. Também foi observado que os AINEs apresentam diferentes efeitos sobre parâmetros gliais. O ácido acetilsalicílico e o diclofenaco foram capazes de aumentar a GFAP, enquanto que a nimesulida, um inibidor seletivo de COX-2, e a dexametasona diminuiram a secreção de S100B. No entanto, todos os AINEs reduziram os níveis de PGE2. Juntos, esses dados contribuem para a compreensão dos efeitos de LPS em astrócitos, especialmente sobre a secreção de S100B, e nos ajuda a interpretar mudanças nesta proteína no LCR e soro em doenças neuroinflamatórias. Além disso, tecidos periféricos que expressam S100B talvez devam ser regulados diferentemente, uma vez que a administração IP de LPS não foi capaz de aumentar os níveis séricos de S100B. Em relação aos AINEs, a PGE2 parece estar envolvida no mecanismo de secreção de S100B, mas vias adicionais, não claras neste momento, necessitam de uma maior caracterização. O papel inflamatório de S100B em doenças degenerativas, onde também são observados níveis elevados da COX-2 e PGE2, poderia ser atenuado por inibidores de COX-2. / Inflammatory responses in brain are primarily mediated by microglia, but growing evidence suggests a crucial importance of astrocytes. S100B, a calciumbinding protein secreted by astrocytes, may act as a neurotrophic or an inflammatory cytokine. However, it is not known whether primary signals occurring during induction of an inflammatory response (e.g. lipopolysaccharide, LPS) directly modulate S100B. Neuroinflammation has been implicated in the pathogenesis or progression of a variety of neurodegenerative disorders and several studies have looked for a connection of S100B, and degenerative diseases including Alzheimer’s disease and schizophrenia. The therapeutic use of non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAID) to these diseases has growth up. However, there are few reports about the effect of these drugs on S100B. In this work, we evaluated whether S100B levels in cerebrospinal fluid (CSF) and serum of Wistar rats are affected by LPS administered by intraperitoneal (IP) or intracerebroventricular (ICV) injection, as well as whether primary astrocyte cultures respond directly to lipopolysaccharide. Moreover we evaluated S100B content and secretion measured by ELISA (as well as GFAP content and TNF-α secretion) in primary astrocyte cultures exposed to dexamethasone and 4 different chemical classes of NSAID (acetyl salicylic acid, ibuprofen, diclofenac and nimesulide) for 24 h. Our data suggest that S100B secretion in brain tissue is stimulated rapidly and persistently (for at least 24 h) by ICV LPS administration. This increase in CSF S100B was transient when LPS was IP administered. In contrast to these S100B results, we observed an increase in in TNFα levels in serum, but not in CSF, after IP administration of LPS. In isolated astrocytes and in acute hippocampal slices, we observed a direct stimulation of S100B secretion by LPS at a concentration of 10 μg/mL. An involvement of TLR4 was confirmed by use of specific inhibitors. However, lower levels of LPS in astrocyte cultures were able to induce a decrease in S100B secretion after 24 h, without significant change in intracellular content of S100B. In addition, after 24 h exposure to LPS, we observed a decrease in astrocytic glutathione and an increase in astrocytic glial fibrillary acidic protein. We also observe that NSAIDs have distinct effects on glial parameters. ASA and diclofenac are able to increase GFAP, while nimesulide, a selective COX-2 inhibitor, and dexamethasone were able to decrease S100B secretion. However, all anti-inflammatories were able to reduce levels of PGE2. Together, these data contribute to the understanding of the effects of LPS on astrocytes, particularly on S100B secretion, and help us to interpret cerebrospinal fluid and serum changes for this protein in neuroinflammatory diseases. Moreover, non-brain S100B-expressing tissues may be differentially regulated, since LPS administration did not lead to increased serum levels of S100. With respect to NSAIDs, PGE2 is possibly involved in the mechanism of S100B secretion but additional pathways, unclear at this moment, demand further characterization. The inflammatory role of S100B in degenerative diseases, where also is observed elevated levels of COX-2 and PGE2, could be attenuated by COX-2 inhibitors in which elevated levels of COX-2.

O transtorno do humor bipolar (THB) é uma doença de curso recorrente, crônica e altamente incapacitante e está associado com o aumento da morbidade e da mortalidade por condições médicas gerais, como câncer e diabetes, as quais podem estar associadas com o aumento do dano ao DNA. Marcadores periféricos vêm sendo utilizados para verificarmos alterações bioquímicas que possam estar associadas com o THB e/ou possivelmente associadas à patofisiologia do THB. Diversos grupos têm proposto o envolvimento da S100B nos transtornos psiquiátricos. Outros marcadores bioquímicos, particularmente os associados como o dano oxidativo, também estão sendo estudados nesses trastornos. No presente estudo, nós avaliamos marcadores de dano neuronal, estresse oxidativo e dano ao DNA em pacientes com THB. As aterações astrocíticas foram verificadas através dos níves séricos de S100B; espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividade das enzimas antioxidantes foram medidas para verificar os níveis séricos de estresse oxidativo nos paciente com THB nas diferentes fases da doença. O dano ao DNA foi avaliado utilizando-se o ensaio Cometa em trinta e dois pacientes bipolares tipo-I. Nós encontramos um aumento significativo dos níveis de S100B, atividade da Superóxido dismutase (Sod) e da razão entre Sod/(glutationa peroxidase + catalase) nos pacientes maníacos e deprimidos. Os pacientes bipolares tipo-I apresentaram elevação da freqüencia de dano ao DNA em comparação ao grupo controle. Estes resultados sugerem um potencial dano oxidativo nos pacientes bipolares. A variação oxidativa periférica pode estar indicando que estas ocorram durante as fases ativas da doença (depressão e mania) e estejam realcionadas ao aumento do dano ao DNA dos pacientes. Além disso, alterações astrocíticas também foram relatadas pelas alterações dos níveis de S100B. / Bipolar disorder (BD) is a chronic, severe, and highly disabling psychiatric disorder that is associated with increased morbidity and mortality due to general medical conditions. There is an emerging body of evidence correlating chronic medical conditions to DNA damage. Peripheral markers have been used to assess biochemical alterations associated with BD and/or possibly involved in its pathophysiology. Many groups have proposed the involvement of S100B in psychiatric disorders. Other biochemical markers, particularly associated with oxidative stress have been studied in this disorder. In the present study we evaluated markers of brain injury, oxidative stress and DNA damage in patients with BD. Brain injury was assessed using serum S100B content; oxidative stress was assessed using serum thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and activities of antioxidant enzymes in BD patients in different episodes of disease. The DNA damage was assessed using Comet assay in thirty-two bipolar-I outpatients. We found a significant increment of serum S100B during episodes of mania and depression but not in euthymic patients. Superoxide dismutase (Sod) activity, as well the Sod/glutathione peroxidase plus catalase ratio, was also increased in manic and depressed patients. On the other hand, TBARS levels were increased in BD patients regardless of the phase of the disorder. Bipolar-I outpatientes present an increase frequency of DNA damage as compared to controls. These findings suggest a potential oxidative damage in BD patients. This peripheral oxidative imbalance indicates that systemic changes are taking place during the active phases (depressive and mania) of the illness, and this may be increases DNA damage in BD patients. Such changes seem to relate to astrocyte function, as assessed using serum S100B.