Gliomas são os mais comuns e devastadores tumores primários do sistema nervoso central. Nucleotídeos extracelulares estão envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Os níveis dos nucleotídeos da adenina podem ser controlados por hidrólise através da ação de vários membros da família das ectonucleotidases. O AMP formado pelas NTPDases é hidrolizado até adenosina por ação da ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT). A enzima ciclooxigenase (COX) está surgindo como um novo alvo na prevenção e no tratamento do câncer, sendo que substanciais evidências epidemiológicas, experimentais e clínicas sugerem que os antiinflamatórios não-esteróides (AINEs) possuem propriedades anticâncer. Vários estudos têm demonstrado que certos AINEs causam efeitos antiproliferativos independentes da atividade da COX. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos AINEs em linhagens celulares de gliomas e os possíveis mecanismos envolvidos neste efeito e avaliar a influência da indometacina na cascata de enzimas que catalisam a interconversão dos nucleotídeos. Indometacina, acetaminofeno, sulfeto de sulindaco e NS-398 induziram uma inibição da proliferação celular de modo tempo e dose dependente. Indometacina causou uma redução significativa na viabilidade celular. Nenhum dos AINEs testados induziu ativação de caspase 3/7. O tratamento com indometacina diminuiu a percentagem de células na fase S, com um aumento relativo nas fases G0/G1 e/ou G2/M, indicando uma parada na progressão do ciclo celular. A exposição de células de glioma à indometacina causou um aumento nas hidrólises de AMP e ATP. Um aumento significativo nos níveis de mRNA da ecto-5’-NT/CD73 foi observado após tratamento com indometacina Estes resultados suportam a hipótese que o aumento na atividade da ecto-5’-NT está relacionado com a superexpressão do mRNA com possíveis alterações no catabolismo das purinas extracelulares. Os dados sugerem ainda que o receptor A3 e a enzima ecto-5’-NT estão envolvidos no efeito antiproliferativo da indometacina nas linhagens celulares de gliomas. Considerando que a via das ectonucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna dos gliomas, os AINEs podem ser clinicamente importantes na intervenção farmacológica deste tipo de tumor.

Os fatores neurotróficos regulam o desenvolvimento neuronal e a plasticidade sináptica e possivelmente têm um importante papel na patofisiologia da esquizofrenia. Os níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) têm se mostrado alterados no cérebro e no soro de pacientes com esquizofrenia. Tem-se observado que a clozapina, um antipsicótico atípico, pode elevar a expressão do BDNF em nivel cerebral. No atual estudo, medimos os niveis de BDNF sérico em 44 pacientes esquizofrênicos, sendo 20 pacientes em uso de clozapina e 24 em uso de antipsicóticos típicos, além de 25 controles normais. Os grupos estavam pareados para sexo e idade. Os níveis do BDNF sérico dos pacientes e dos controles normais foram analisados por enzima imunoensaio. Os controles normais apresentaram níveis significativamente mais altos do BDNF quando comparado com o grupo de esquizofrênicos (p<0.001), assim como quando comparado com os subgrupos de pacientes em uso de clozapina e de típicos (p<0.001). Os níveis de BDNF dos pacientes em uso de clozapina se mostraram marginalmente superiores aos valores encontrados no grupo de típicos (p=0.056). O BDNF sérico foi fortemente correlacionado com a dose de clozapina (r=0.643; p=0.002), mas não com outras caracteristicas demográficas. Os nossos achados reforçam a idéia de achados em outros estudos em que os niveis séricos de BDNF estão reduzidos em pacientes esquizofrênicos e também sugere um efeito diferencial da clozapina comparada com antipsicóticos típicos em tais níveis.

O 3’3-ditrifluormetildifenil disseleneto (DFDD) é um composto organoselenado análogo ao disseleneto de difenila (DPDS). No entanto, diferentemente do DPDS, maiores estudos em relação às atividades biológicas do DFDD ainda permanecem escassos na literatura. Com o objetivo de ampliar o conhecimento dos efeitos biológicos do DFDD, nesse estudo investigou-se a interferência desta molécula no neurocomportamento em camundongos. Além disso, as atividades genotóxicas deste organoselenado em linhagens de Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae e em células de mamíferos em cultura (células V79) também foram avaliadas. Nos ensaios neurocomportamentais em camundongos, o DFDD apresentou uma interessante atividade bloqueadora da estereotipia induzida por apomorfina, que é um modelo animal de esquizofrenia, sem agir sobre outros parâmetros importantes como a memória, ansiedade, exploração e locomoção detectados nas tarefas de esquiva inibitória, campo aberto e habituação a um novo ambiente. Demonstrou-se também neste trabalho que o DFDD não foi mutagênico no Teste Salmonella/microssoma tanto na presença quanto na ausência de ativação metabólica. Entretanto, em linhagens de S. cerevisiae, o DFDD induziu mutações “forward” e reversa, porém lócus não-específico. Diferentemente do seu análogo estrutural DPDS, o DFDD não foi capaz de induzir mutações “frameshift” em S. typhimurium ou S. cerevisiae mesmo quando as linhagens foram tratadas em condições de crescimento. Deste modo, sugere-se que o DFDD não é capaz de se intercalar entre as bases do DNA e que, possivelmente, este efeito seja provocado por um impedimento alostérico causado pelos grupamentos CF3 presentes neste organoselenado. Além disso, o DFDD mostrou-se um fraco agente citotóxico e genotóxico em S. cerevisiae e células V79. Por outro lado, como foi demonstrado no Teste Salmonella/microssoma, o DFDD apresentou um efeito protetor contra a mutagenicidade induzida por peróxido de hidrogênio. De maneira interessante, utilizando um ensaio in vitro, mostrou-se que o DFDD possui uma atividade “catalase-like” até o momento não apresentada por nenhum outro composto organoselenado. No presente trabalho tornou-se evidente também que o DFDD atua de maneira distinta do seu análogo DPDS em vários modelos experimentais e que, provavelmente, os grupamentos CF3 presentes no DFDD sejam de fundamental importância para as interessantes atividades demonstradas por este disseleneto.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causado pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase, o que resulta no acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Pacientes afetados geralmente apresentam aterosclerose, retardo mental, convulsões e isquemia cerebral. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por estas manifestações são pouco conhecidos. A isquemia cerebral é caracterizada por uma redução grave ou pelo bloqueio completo do fluxo sanguíneo normal em alguma região do cérebro, geralmente causada por um trombo ou uma hemorragia. O estresse oxidativo parece ser um dos principais mecanismos envolvidos no dano celular induzido por isquemia e a administração de antioxidantes, em alguns casos, pode prevenir alguns desses danos. Considerando que: a) pacientes com homocistinúria apresentam alterações neurológicas e que são mais suscetíveis à isquemia, b) o estresse oxidativo parece estar envolvido na fisiopatogenia tanto da homocistinúria quanto da isquemia cerebral c) o ácido fólico reduz os níveis plasmáticos de homocisteína e pode ter efeitos antioxidantes, e) o pré-tratamento com vitaminas E e C previne os efeitos da Hcy sobre a Na+, K+-ATPase e sobre a memória, neste trabalho nós verificamos os efeitos in vivo e in vitro da homocisteína sobre fatias de hipocampo de ratos submetidas à privação de oxigênio e glicose, um modelo in vitro de isquemia cerebral, e também os efeitos do pré-tratamento com antioxidantes, vitamina E mais C e ácido fólico sobre o dano celular causado pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína in vitro (100 e 500 μM), aumentou a liberação de lactato desidrogenase (LDH) para o meio de incubação, sugerindo um aumento no dano celular causado pela isquemia. Além disso, tanto o modelo agudo quanto o crônico de hiperhomocisteinemia aumentou a morte celular quando os animais foram sacrificados 1 hora após a administração de homocisteína. Nossos resultados também mostraram que o pré-tratamento com ácido fólico foi capaz de prevenir completamente o dano causado pela administração aguda de homocisteína, enquanto que a vitamina E preveniu apenas parte deste efeito. Estes achados podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a maior susceptibilidade dos pacientes hiperhomocisteinêmicos de apresentar eventos issquêmicos e apontam uma possível estratégia de prevenção. / Homocystinuria is an inherited metabolic disorder caused by severe deficiency of cystationine β-synthase activity, resulting in the tissue accumulation of homocysteine and methionine. Affected patients usually present atherosclerosis, mental retardation, seizures, and stroke. However, the physiopatological mechanisms are not yet fully established. Cerebral ischemia is defined as a severe reduction or blockage of normal blood flow in the brain, usually caused by thrombosis or hemorrhage. Oxidative stress seem to be one of major mechanisms involved on cellular damage induced by ischemia, and antioxidants administration, sometimes, can prevent this damage. Considering that: a) homocystinuric patients present neurological alterations and are more susceptible to ischemia, b) oxidative stress is involved on pathogenia such of homocystinuria as of cerebral ischemia, c) folic acid reduces the serum levels of homocisteine and could have antioxidant effects, c) pretreatment with vitamins E and C prevent the effects of homocysteine on Na+, K+-ATPase activity and on memory, in this work we verified the in vivo and in vitro effects of homocysteine on rat hippocampal slices exposed to oxygen and glucose deprivation, an in vitro model of cerebral ischemia, we also investigated the effects of pretreatment with antioxidants, vitamin E plus C and folic acid on cellular damage caused by homocysteine. Results showed that homocysteine in vitro (100 and 500μM), both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the LDH release to the incubation medium, suggesting an increase of tissue damage caused by ischemia. Furthermore, results showed that both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the cellular death. Our results also demonstrated that pretreatment with folic acid completely prevented the damage caused by acute homocysteine administration, whereas vitamin E just partially prevented such effect. These findings may be relevant to explain, at least in part, the higher susceptibility of hyperhomocysteinemic patients to bear ischemic events and point to a possible preventive treatment.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio astrocítica que, além de sua função intracelular sobre o citoesqueleto, tem um efeito trófico ou apoptótico sobre neurônios, dependendo de sua concentração. Esta proteína é marcadora de ativação glial durante dano ao sistema nervoso central. O dano neurológico associado ao Diabetes Melito está sendo investigado em modelos experimentais usando estreptozotocina e, alterações neuronais são atribuídas ao déficit insulínico resultante. Recentemente, o efeito neurotóxico da estreptozotocina foi caracterizado. Ratos hiperglicêmicos apresentam alterações no conteúdo de S100B e condições hiperglicêmicas prejudicam a viabilidade de astrócitos, mas não a de células de glioma. Neste trabalho nós investigamos as alterações bioquímicas e morfológicas de astrócitos e células de glioma C6 cultivadas em um meio com alto conteúdo de glicose Nossos resultados demonstraram uma diminuição no imunoconteúdo de S100B (e de proteína ácida fibrilar glial) em astrócitos corticais e células de glioma C6 de ratos expostas a um meio com alto conteúdo de glicose. Entretanto, astrócitos exibiram uma redução na secreção basal de S100B, enquanto, células de glioma C6 demonstraram um aumento nesta secreção. Além disso, a captação de glutamato não foi modificada em astrócitos, mas aumentou significativamente em células de glioma C6. Estas mudanças astrocíticas podem contribuir para a patofisiologia das desordens do sistema nervoso central induzidas pelo diabetes, bem como, para as alterações neuronais associadas às atividades de tumores derivados de astrócitos. Tais alterações específicas nas atividades astrocíticas são devido a um efeito direto do meio com elevada concentração de glicose e não de um efeito tóxico da estreptozotocina ou devido a um déficit de insulina, como observado em outros modelos de estudo. / S100B is an astrocyte calcium-binding protein that, beyond its intracellular role in the cytoskeleton, has a trophic or apoptotic effect on neurones, depending on its concentration. This protein is a marker of glial activation during brain injury. Neurological damage associated with Diabetes mellitus has been commonly investigated in experimental models using the streptozotocin, and neural changes are attributed to the resulting insulin deficit. More recently, the direct neurotoxic effect of streptozotocin has also been characterized. Hyperglycaemic rats show changes in brain S100B content and a high-glucose supply impairs viability of astrocytes, but not of glioma cells. Here we investigated biochemical and morphological alterations in astrocytes and C6 glioma cells cultured in high-glucose medium. We found a decrease in the immunocontent of S100B (and glial fibrillary acidic protein) in both rat cortical astrocytes and C6 glioma exposed to high-glucose medium. However, astrocytes exhibited a decrease in basal S100B secretion, while glioma cells demonstrated an increment. Moreover, glutamate uptake was not modified in astrocytes, but was significantly increased in C6 glioma cells. These astrocyte changes may contribute to the underlying pathophysiology of diabetes-induced brain disorders, as well as neurological alterations associated with activities of astrocyte-derived tumors. Such specific alterations in astrocyte activities are due to a direct effect of high-glucose medium and not to a toxic effect of streptozotocin or to an insulin deficit, as observed in other models of investigation.

Ciclooxigenase (COX) é a enzima marca-passo na rota metabólica onde o ácido araquidônico é convertido em prostaglandinas. COX-2 é a isoforma que é induzida em sítios de lesão/inflamação e expressa constituivamente em alguns poucos tecidos, como o sistema nervoso central. Tem sido sugerido que a COX-2 tem um papel importante em várias doenças neurodegenerativas, incluindo epilepsia. Neste estudo nós testamos se o celecoxib, um inibidor seletivo da COX-2 (0,2; 2 ou 20 mg/kg, p.o.) protege contra as convulsões, carbonilação de proteínas e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), um agente convulsivante clássico que tem sido largamente usado para estudo da epilepsia e na busca de novos compostos com atividade anticonvulsivante. A administração de celecoxib (2 mg/kg) atenuou as convulsões comportamentais e eletrográficas e a inibição da atividade da Na+,K+- ATPase induzidas por PTZ no hipocampo e córtex cerebral de ratos, sugerindo um papel facilitatório para COX-2 nos efeitos do PTZ. Já que existem evidências que a PGE2 é um mediador chave na via de sinalização da COX-2, nós decidimos investigar o efeito da administração intracerebroventricular de anticorpos anti-PGE2 (4 μg/2 μl, i.c.v.) sobre os episódios convulsivos e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ. A administração de anticorpos anti- PGE2 atenuou as convulsões comportamentais e eletrográficas e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ no hipocampo e córtex cerebral de ratos. Em outro experimento, nós mostramos que a administração intracerebroventricular de PGE2 (100 ng/2 μl, i.c.v.) não causou convulsões per se, mas induziu o aparecimento de convulsões eletrográficas em combinação com uma dose subconvulsivante de PTZ (20 mg/kg, i.p.), reforçando um importante papel para PGE2 nas convulsões induzidas por PTZ. Em conjunto estes dados suportam um papel facilitatório para a via COX-2/PGE2 nas convulsões e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ. / Cyclooxygenase (COX) is the rate-limiting enzyme in the metabolic pathway where arachidonic acid is converted to prostaglandins. COX-2 is the isoform of cyclooxygenase which is inducible at injury/inflammation sites and expressed constitutively in a few tissues, such as the central nervous system. It has been suggested that COX-2 plays a role in several disorders, including convulsive behavior. In this study we tested whether celecoxib, a selective COX-2 inhibitor (0.2, 2 or 20 mg/kg, p.o.) protects against the convulsions, protein carbonylation and inhibition of Na+,K+- ATPase activity induced by pentylenetetrazol (PTZ; 60 mg/kg, i.p.), a classical convulsant agent that has been fairly used for the study of epilepsy and screening of new compounds with antiepileptic activity. The systemic administration of celecoxib (2 mg/kg) attenuated PTZ-induced behavioral and electroencephalographic seizures and Na+,K+-ATPase activity inhibition in the hippocampus and cerebral cortex of rats, suggesting a facilitatory role for COX-2 on the PTZ-induced effects. Since there is a bulk of evidence showing that PGE2 is a key mediator in COX-2 signaling, we decided to investigate the effect of the intracerebroventricular administration of anti-PGE2 antibodies (4 μg/2 μl, i.c.v.) on the convulsive episodes and inhibition of Na+,K+- ATPase activity induced by PTZ. Administration of anti-PGE2 antibodies attenuated PTZ-induced behavioral and electroencephalographic seizures and Na+,K+-ATPase activity inhibition in the hippocampus and cerebral cortex of rats. In a reverse approach, we showed that intracerebroventricular administration of PGE2 (100 ng/2 μl, i.c.v.) did not cause electrographic alterations per se, but elicits electroencephalographic convulsions if given in combination with a subconvulsant dose of PTZ (20 mg/kg, i.p.), further suggesting an important role for this prostaglandin in the convulsant effects of PTZ. Collectively, these data support a facilitatory role for the COX-2/PGE2 pathway in PTZ-induced convulsions and Na+,K+-ATPase activity inhibition.

Os hormônios da tireóide (HT) têm sido descritos agindo em sítios nucleares e extranucleares, induzindo respostas celulares através de diversos mecanismos. Também tem sido reportado que as proteínas do citoesqueleto são alvos para os HT durante o desenvolvimento do testículo e do sistema nervoso. Os efeitos dos HT durante o desenvolvimento são mediados principalmente por receptores nucleares modulando a expressão gênica. Entretanto, há diversas evidências de mecanismos não genômicos dos HT associados a vias de sinalização ativadas por Ca2+ e proteínas quinases. Nesse contexto, nosso estudo investigou as ações genômicas e não genômicas dos HT em células testiculares e neurais durante o desenvolvimento. Nós inicialmente demonstramos o envolvimento de mecanismos mediados por Ca2+ na fosforilação da vimentina induzida por T3 em testículos de ratos imaturos através de mecanismos independentes da síntese de proteínas. Também observamos um acúmulo de vimentina fosforilada em testículos de ratos hipertireoideos, podendo ser conseqüência da ativação da ERK regulando o citoesqueleto. Nós ainda demonstramos um aumento no metabolismo basal através da medida do consumo de O2 e dos níveis de TBARS. Além disso, as defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas modificaram-se aparentemente de acordo com o aumento no consumo de O2. E Esses resultados corroboram com a idéia de que um aumento na geração de ROS induz estresse oxidativo e pode ser responsável pelas alterações bioquímicas envolvidas no aumento da capacidade metabólica em testículos de ratos hipertireoideos. Além disso, o hipotireoidismo inibiu a atividade das NTPDases em culturas de células de Sertoli sem alterar a expressão das NTPDases 1, 2 e 3. Os HT modificaram a atividade NTPDásica, provavelmente através de mecanismos não genômicos e, consequentemente, podem influenciar a função reprodutiva durante o desenvolvimento. Considerando-se os efeitos dos HT em células neurais, nós primeiramente demonstramos que T3 e T4 estimularam a fosforilação dos filamentos intermediários (FI) através de mecanismos GABAérgicos via PKA e PKCaMII em córtex cerebral de ratos de 10 dias de idade. A dependência de PKA, PKC e canais de Ca2+ tipo-L e -T também foi evidenciada no efeito dos HT sobre a captação de 45Ca2+. Surpreendentemente, em córtex cerebral de ratos de 15 dias de idade, apenas o T4 estimulou a fosforilação dos FIs. Os mecanismos envolvidos na ação do T4 sobre o citoesqueleto dependem da ativação de um receptor acoplado a proteínas Gi, além da participação da PLC, PKC, MAPK, PKCaMII e níveis intracelulares de Ca2+. Estes dados demonstram que o T4 tem importantes funções fisiológicas modulando o citoesqueleto de células neurais durante o desenvolvimento. Nós também demonstramos a reorganização e a fosforilação do citoesqueleto induzidas por HT em células de glioma C6 e astrócitos, e a participação da via de sinalização da RhoA mediando a ação hormonal. Concluindo, nossos resultados evidenciaram ações genômicas e não genômicas dos HT promovendo a fosforilação dos FI, reorganização do citoesqueleto, influxo de Ca2+ e modulação da atividade das NTPDases via mecanismos mediados por Ca2+ e proteínas quinases. Estes resultados podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nas desordens observadas no hipo e hipertireoidismo durante o desenvolvimento e maturação do cérebro e do testículo. / Thyroid hormones (TH) have been shown to act at nuclear and extra nuclear sites, inducing cell responses by several mechanisms. It has also been reported that cytoskeletal proteins are a target for TH during hormone-induced differentiation and development of nervous system and testicular cells. The developmental effects of TH are mainly mediated by nuclear receptors regulating gene expression. However, there are increasing evidences of nongenomic mechanisms of TH associated with kinase- and Ca2+-activated signaling pathways. In this context, our study investigated the genomic and nongenomic actions of TH on testicular and neural cells from developing rats. We first described the involvement of Ca2+-mediated mechanisms on vimentin phosphorylation induced by T3 in immature rat testis. This effect was demonstrated to be independent of protein synthesis. Furthermore, we observed an accumulation of phosphorylated vimentin in hyperthyroid rat testes, which could be a consequence of the extracellular-regulated kinase (ERK) activation regulating the cytoskeleton. We also demonstrate increased basal metabolic rate, measured by tissue oxygen consumption, as well as, increased TBARS levels. Moreover, the enzymatic and non-enzymatic antioxidant defences were modified apparently to respond according to the augmented oxygen consumption. These results support the idea that an increase in mitochondrial ROS generation, underlying cellular oxidative damage, is a side effect of hyperthyroid-induced biochemical changes by which rat testis increase their metabolic capacity. In addition, hypothyroidism inhibited NTPDase activity in Sertoli cell cultures from young rats without alter the expression of NTPDase 1, 2 and 3. Our findings also demonstrate that TH modifies the NTPDase activities, probably via non-genomic mechanisms and consequently may influence the reproductive function throughout development. Concerning the effect of TH on neural cells, we first demonstrate that T3 and T4 stimulate the intermediate filament (IF) phosphorylation through PKA, PKCaMII and GABAergic mechanisms in cerebral cortex of 10 day-old rats. The dependence of PKA, PKC, L- and T-type Ca2+ channels were also evidenced on the effect of TH on 45Ca2+ uptake. Surprisingly, in cerebral cortex of 15 day-old rats, only T4 stimulate IF phosphorylation. The mechanisms underlying the action of T4 involve the activation of a Gi-protein coupled receptor. Moreover, we showed the participation of PLC, PKC, MAPK, PKCaMII and intracellular Ca2+ levels mediating the effects of T4 on the cytoskeleton. These findings demonstrate that T4 have important physiological roles modulating the cytoskeleton of neural cells during development. We further demonstrate that TH induce cytoskeleton reorganization and phosphorylation in C6 glioma cells and astrocytes and the participation of RhoA signaling pathway mediating this action. In conclusion, our results evidence genomic and nongenomic actions of TH promoting IF phosphorylation, cytoskeletal reorganization, Ca2+ influx and modulation of NTPDase activity by Ca2+- and kinase-mediated mechanisms. These results may contribute to a better knowledge of the mechanisms involved in the disorders observed in hyper and hypothyroidism during brain and testis maturation and development.

Sabe-se que o sistema canabinóide endógeno está envolvido com os processos de formação e evocação da memória. Agonistas dos receptores CB1 exibem diferentes efeitos conforme a via de infusão, seja ela sistêmica, seja local, atingindo estruturas específicas do encéfalo. Neste estudo pretendemos estabelecer o perfil farmacológico-comportamental e eletrofisiológico do agonista CP55,940 quando administrado no hipocampo dorsal de ratos, estrutura em que há poucos estudos prévios com este fármaco: diferente de outros agonistas como a WIN55,212 e mesmo a pouco seletiva anandamida, o CP55,940 restringe-se a receptores canabinóides e chega a ser mais potente que o Δ9-THC, embora não discrimine entre os receptores CB1 (central) e CB2 (periférico). Os fármacos foram infundidos bilateralmente, em diferentes concentrações, na área CA1 do hipocampo, imediatamente após o treino ou antes do teste na tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto (CAC), visando estudar seus efeitos, respectivamente, na consolidação e na evocação da memória. A CP55,940 pós-treino foi amnéstica apenas na concentração de 5 μg/μl, e esse efeito foi revertido pelo antagonista AM251, seletivo para CB1, em concentração sem efeito próprio, comprovando tal efeito dever-se à ação sobre os receptores CB1. O mesmo efeito foi observado 24h após o treino, na infusão pré-teste, se bem que agora a CP55,940 foi efetiva também em concentrações mais baixas, sugerindo que os receptores desse sistema endógeno tenham ficado mais sensíveis a seus ligantes em função do aprendizado; a seletividade por CB1 neste caso, porém, não ficou claramente atestada pois o efeito de 5 μg/μl de CP55,940 só foi revertido com uma concentração maior de AM251. Na eletrofisiologia, uma concentração de CP55,940 comparável à efetiva sobre a CAC (10μM), não foi capaz de inibir a indução da LTP, já que a potenciação só se sustentou por cerca de 30min – não passou de uma LTP. Esses resultados reforçam e diversificam estudos anteriores, inclusive de nosso grupo, que comprovam a participação dos receptores CB1 na formação e/ou evocação de novas memórias aversivas, bem como possíveis alterações plásticas na densidade desses receptores em função da experiência cognitiva, embora não necessariamente mediadas por eventos sinápticos plásticos como a LTP. / The endogenous cannabiboid system is known to be involved memory formation and retrieval processes. CB1 agonists may cause different effects according to the administration pathway, be it systemic or local/intrastructure. Here we try to establish the behavioral-pharmacologic and electrophysiologic profile of the agonist CP55,940 infused into the rat dorsal hippocampus, a structure less studied with this drug: different from other agonists such as WIN55,212 or even the poorly selective anandamida, CP55,940 sticks only to cannabinoid receptors and is more potent than Δ9-THC, but does not distinguish between central CB1 and peripherical CB2 receptors. The drug was infused bilaterally in different concentrations into the CA1 area of the hippocampus, right after training or pre-test in the Context Fear Conditioning (CFC) task, in order to study its effects upon memory consolidation and retrieval, respectively. Post-training CP55,940 was amnestic only at 5 μg/μl, and the CB1-selective antagonist AM251 reverted this effect in a concentration without action per se, which proves that the original effect is mediated by CB1 receptors. The same amnestic effect was observed 24h after training, in the pretest infusion, only that now CP55,940 was affective also with lower concentrations, suggesting that these receptors are now more sensitive to its endogenous ligands due to learning; CB1-selectivity, however, is not clearly proven here since 5 μg/μl of CP55,940 was reverted only by a higher concentration of AM251. In electrophysiology, a concentration of CP55,940 compatible with that found effective upon CFC (10μM), was not able to block LTP induction, since the potentiation was not sustained for more than 30min – it was only a STP. These results teinforce and diversify previous findings, including some from our own lab, that prove the involvement of CB1 receptors in memory consolidation and/or recall, as well as possible plastic changes in receptor density due to the cognitive experience, despite not necessarily mediated by plastic synaptic events such as LTP.

A linhagem de glioma de rato C6 tem sido amplamente utilizada para investigar vários aspectos da biologia celular. Esta linhagem apresenta variações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas de acordo com o número de passagens em cultivo. Segundo a literatura, culturas de passagens recentes apresentam características similares a glioblastomas, enquanto que culturas de passagens tardias assemelham-se à astroglia madura. Devido a isso, muitos estudos têm utilizado a linhagem C6 como modelo celular de glioblastoma e de astrócitos para investigar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico, como por exemplo, captação de glutamato. Entretanto, até o presente momento a caracterização e comparação desses parâmetros entre as culturas da linhagem C6 de passagens recentes e tardias ainda não foram avaliadas. O objetivo desta dissertação foi investigar e comparar alguns parâmetros do sistema glutamatérgico entre as culturas de C6 com passagens recentes e tardias. As passagens recentes apresentaram um conteúdo intracelular de [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu 55% maior quando comparadas às passagens tardias e ambas as culturas atingiram o platô a partir dos 120min de incubação. Além disso, ambas as culturas apresentaram, após incubação com glutamato, os mesmos níveis de incorporação de iodeto de propídeo. Este resultado indica que o menor nível intracelular de [3H] observado nas culturas de passagens tardias não se deve a uma alteração na permeabilidade ou integridade de membrana dessas células. Ambas as culturas expressam somente o transportador Na+ dependente de alta afinidade EAAC1 (carreador de aminoácido excitatórios 1), sendo que sua expressão total foi similar tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias. Para verificar se a captação de L-[3H]-Glu estava ocorrendo através de outro sistema de transporte, as culturas foram incubadas na presença ou ausência de PDC (L-trans-2,4--trans-Pyrrolidine-2,4-dicarboxylic acid ) ou TBOA (DL-threo-β-Benzyloxyaspartic acid). O tratamento com os inibidores reduziu de forma similar a captação de L-[3H]-Glu tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias, indicando que este aminoácido é captado principalmente através do transportador de alta afinidade EAAC1. Com relação à liberação de glutamato, observou-se que 50% da radioatividade incorporada na forma de L-[3H]-Glu foi liberada para o meio extracelular tanto nas passagens recentes quanto nas tardias após 2h de incubação. Este resultado pode estar relacionado com o estabelecimento do platô do conteúdo intracelular de [3H] observado após 120 min de captação de L-[3H]-Glu. Para investigar se a liberação de L-[3H]-Glu ocorreu via transporte reverso dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade, ambas as culturas foram incubadas na presença do inibidor não transportável TBOA. Não foi observada alteração no perfil de liberação de radioatividade intracelular nas culturas após incubação com TBOA. Para verificar se a metabolização do L-[3H]-Glu estaria relacionado com a diferença nos níveis intracelulares de [3H], ambas as culturas foram incubadas com o análogo não-metabolizável D-[3H]-Asp. Tanto as passagens recentes como as tardias apresentaram um aumento tempo-dependente do conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp, não atingindo o platô. Além disso, o bloqueio dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade por PDC ou TBOA reduziu a captação de D-[3H]-Asp em ambas as culturas, indicando que sua captação ocorreu principalmente através deste tipo de transporte. Além disso, diferentemente do observado com L-[3H]-Glu, apenas 10% do D-[3H]-Asp captado é liberado após 2h de incubação em ambas as culturas. Este resultado, juntamente com a não inibição por TBOA da liberação da radioatividade captada na forma de L-[3H]-Glu, indica que possivelmente o que está sendo liberado para o meio extracelular é um metabólito marcado com [3H] e não o próprio L-[3H]-Glu. Além disso, nas passagens tardias, o conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp foi menor quando comparado com as passagens recentes aos 60 e 120 min de incubação, sugerindo que as passagens recentes possuem intrinsecamente uma maior capacidade de transporte tanto de L-[3H]-Glu quanto de D-[3H]-Asp quando comparadas às passagens tardias. Os resultados dessa dissertação demonstram que as passagens recentes e tardias da linhagem de glioma C6 diferem na sua capacidade de acumular o [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu. A maior capacidade das passagens recentes da linhagem C6 em acumular a radioatividade não está relacionada a uma maior expressão dos transportadores de glutamato e nem a uma reduzida liberação de L-[3H]-Glu para o meio extracelular. Como conclusão, os resultados obtidos nesta dissertação indicam que o número de passagens deve ser considerado em futuros estudos que pretendam avaliar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico utilizando a linhagem C6 como modelo celular. / Rat C6 lineage has been widely used to investigate several aspects of cell biology. This lineage presents morphological, biochemical and physiological variations according to number of passages in culture. Early passage cells exhibit characteristics similar to glioblastomas, whereas later passage cells resemble mature astroglia. Thus, many studies have been using C6 lineage as astroglial and glioma model to investigate several parameters related to glutamatergic system, such as glutamate uptake. However, the characterization and comparison of these parameters between C6 cultures at early and late passages have not been evaluated. Therefore, the aim of this study was to investigate and compare some glutamatergic system parameters between early and late passage C6 cells in cultures. Early passages have an L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H] 55% higher when compared to later passages and both cultures reached plateau at 120 min. In addition, after incubation with glutamate, both cultures showed the same levels of propidium iodide incorporation. This result indicates that lower levels of intracellular [3H] in later passages are not due to an alteration of cellular membrane permeability. Both cultures expressed only the higher affinity Na+ dependent transporter EAAC1, and its total expression was similar in early and later passage cultures. To verify if L-[3H]-Glu uptake occurred through another kind of glutamate transport system, the cultures were incubated in the presence or absence of PDC or TBOA. Treatment with this inhibitors reduced the L-[3H]-Glu uptake in both cultures at same levels, indicating that glutamate is taken up mainly by the higher affinity transporter system. Regarding the release of glutamate, it was observed that 50% of the radioactivity incorporated as L-[3H]-Glu was released to extracellular medium in both early and late passages after 2 h of incubation. This result could be related to the establishment of the plateau observed after 120 min for intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake. To investigate if the release of L-[3H]-Glu occurred trough reverse transport, both cultures were incubated in the presence of non-transportable inhibitor TBOA. There was no alteration of intracellular radioactivity release in cultures after incubation with TBOA. In order to verify if the metabolism of L-[3H]-Glu could be related to the differences in intracellular levels of [3H], both cultures were incubated with the non-metabolizable analogue D-[3H]-Asp. Early and late passage C6 cells showed a time-dependent increase in intracellular content of [3H] derived from D-[3H]-Asp uptake, without reaching the plateau. Moreover, blockade of Na+ dependent transporters of high affinity by PDC or TBOA reduced D-[3H]-Asp uptake in both cultures, indicating that uptake occurred mainly through EAAC1. Moreover, differently from L-[3H]-Glu, only 10% of D-[3H]-Asp captured is released after 2 h of incubation in both cultures. This result, taken together with the fact that TBOA did not inhibit the release of radioactivity captured as L-[3H]-Glu, indicates that a [3H]-metabolite is being released to extracellular medium and not L-[3H]-Glu itself. Moreover, in later passages, D-[3H]-Asp-derived intracellular content of [3H] was lower when compared to early passages at 60 and 120 min of incubation, suggesting that early passage C6 cells intrinsically have a greater capacity to transport both L-[3H]-Glu and D-[3H]-Asp when compared to later passages. This study demonstrates that early and late passage C6 cells differ in their ability to accumulate L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H]. From 60 min of incubation, early passages have an intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake 55% higher in relation to later passages. This increased capacity is not related to a higher expression of glutamate transporters nether nor by reduced release of L-[3H]-Glu to extracellular medium. In conclusion, our results indicate that the number of passages should be considered in future studies that intent to evaluate parameters relating to glutamatergic system using Rat C6 lineage as cell model.

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