Submitted by Fabrizio Grandi (fgrandivet@gmail.com) on 2016-03-10T14:56:58Z No. of bitstreams: 1 Doutorado.pdf: 5138229 bytes, checksum: cf3859209f1985d48832ef7e89af5b94 (MD5) / Approved for entry into archive by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br) on 2016-03-10T17:08:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 grandi_f_dr_bot.pdf: 5138229 bytes, checksum: cf3859209f1985d48832ef7e89af5b94 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-10T17:08:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 grandi_f_dr_bot.pdf: 5138229 bytes, checksum: cf3859209f1985d48832ef7e89af5b94 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O tumor venéreo transmissível (TVT) canino é uma neoplasia transplantável, considerada um alo-enxerto. Entretanto, pouco se sabe a respeito da origem e processo de cacinogênese. Atualmente, postula-se que alguns tumores originem-se de células iniciadoras tumorais, classicamente descritas nas leucemias mielóide humanas. As características intrínsecas do TVT fornecem indícios de uma possível participação de células iniciadores tumorais no processo de carcinogênese nesse tumor. Foi realizado estudo de fenotipagem do TVT canino para avaliar a marcação das proteínas CD44, CD133, CD90 e CD34, comumente associadas ao potencial iniciador tumoral. Para tanto utilizou-se a citometria de fluxo, imuno-histoquímica e RTq-PCR. Foram analisados também as frações de crescimento pelo Ki-67) e o número de células em apoptose pela caspase-3 clivada. Trinta e oito amostras de TVT foram obtidas de pacientes sem tratamento quimioterápico prévio. As amostras foram classificadas em plasmocitóide ou mistas, de acordo com o subtipo citológico; as células positivas na citometria de fluxo foram representadas em termos percentuais para os marcadores CD44, CD34, CD90 e CD133; a fração de crescimento foi representada pela técnica do H-Score; a quantidade de células apoptóticas foi representada pelo somatório de células positivas para a caspase-3 clivada; as imuno-marcações das proteínas CD44 e CD34 foram representadas por escores semi-quantitativos baseados na intensidade e percentual de células positivas; as expressões de RNAm foram calculadas em termos relativos; ainda, os pacientes foram divididos em grupos resistente e não resistente e comparados quanto a expressão dos marcadores de células iniciadoras supracitados. Não foram observadas diferenças significativas entre os marcadores e os grupos citológicos plasmocitóide e misto; o percentual de células CD44+ comumente foi superior a 90%, enquanto que o percentual de células CD34+, menor que 0,5%; o percentual de células CD90+ e CD133+ variou amplamente; houve uma tendência em termos de diferença estatística entre os grupos quimiorresistente e não resistente; houve correlação forte entre o percentual de células CD133+ e CD90+ na citometria de fluxo. O estudo permitiu verificar diferentes níveis de expressão protéica e gênica nas amostras de TVT canino; ainda, os grupos citológicos aparentam não possuir diferenças com relação a expressão dos marcadores CD44, CD90, CD133 e CD34; os grupos quimiorresistentes e não-resistentes parecem diferir com relação a expressão dos marcadores de células iniciadoras tumorais. / The canine transmissible venereal tumor (CTVT) is a transplantable neoplasia considered an allograft. Information about the origin and carcinogenesis process is scarcely known. Currently, some neoplasms are believed to arise from a tumor-initiating cell (TIC´s) classically described in human myeloid leukemia. TVT intrinsic characteristics provide evidence of a possible TIC´s participation in carcinogenesis process of this malignancy. Thus, a phenotyping study of CTVT was conducted to assess the immunophenotyping properties of the proteins CD44, CD133, CD90 and CD34, already known to be associated to tumor initiator potential. The use of flow cytometry and immunohistochemistry contributed to this purpose. In addition, growth fractions and cells undergoing apoptosis were examined by Ki-67 and caspase-3 cleaved, respectively. Thirty-eight samples were chosen from patients having no previous chemotherapy and cytological diagnosis of CTVT. Samples were classified into plasmacytoid or mixed according to cytological subtype. Positive cells in the flow cytometry were expressed in percentage for the markers CD44, CD34, CD90 and CD133. H-score technique helped to represent growth fractions. Apoptotic cell quantity was calculated by summing positive cells. Immunohistochemical marking of CD44 and CD34 proteins were determined by semiquantitative scores based on the intensity and percentage of positive cells. Moreover, specimens were divided into resistant and non-resistant groups and compared according cell marker expressions cited before. No significant differences appeared between the markers, and cytological plasmacytoid and mixed groups. The CD44 + cells and CD34 + percentages showed up high and low values, respectively. CD90 + and CD133 + cell percentages presented variable values. Amplitudes of the gene expression values among markers were similar to those observed in flow cytometry with a low expression of CD34, and a high expression of CD44. There was a positive statistical tendence between chemo-resistant and non-resistant groups, as well as a strong correlation between the percentage of CD133 + and CD90 + in flow cytometry. Besides, cytological groups apparently have no differences with the marker expression of CD44, CD90, CD133 and CD34. Resistant and non-resistant groups to chemotherapy seems to differ with respect to the marker expression of TIC´s.

Orientador: Ricardo Barini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T01:59:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferraz_UbirajaraCosta_M.pdf: 1594344 bytes, checksum: e8aa86e55cf5506e54d472671ae37ff1 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Objetivo: Avaliar a associação do intervalo de tempo entre coleta e processamento do sangue de cordão umbilical e a qualidade da amostra. Sujeitos e métodos: As amostras de sangue de cordão umbilical, colhidas no terceiro período do parto, foram acondicionadas em caixas homologadas para transporte de material biológico, com monitoração da temperatura, e enviadas ao Banco de Sangue de Cordão Umbilical, onde foram submetidas à contagem do número de células nucleadas, do número de células viáveis, do número de células CD 34+ e pesquisa de contaminação, nos intervalos de tempo de até 24, até 48 e até 72 horas. Os dados foram analisados pelo teste de variância para medidas repetidas MANOVA e comparados através do teste qui-quadrado de McNemar, considerando-se o nível de significância de 5%. Resultados: As médias e as medianas do número de células nucleadas, número de células viáveis e número de células CD34+ tiveram quedas significativas (P <0,0001) com o aumento do intervalo de tempo coleta/processamento, sendo entre 24 e 48 horas menor do que a comparação entre 24 e 72 horas. Constatada correlação linear entre as médias de células viáveis e células CD34+ nos três momentos da análise. A pesquisa de contaminação foi negativa em todas as amostras. Conclusões: O aumento do intervalo de tempo coleta/processamento influenciou negativamente na contagem de células nucleadas, células viáveis e CD34+ e não esteve associado à contaminação das amostras. Foi constatada correlação linear entre a queda do número de células viáveis e de células CD34+ / Abstract: Objective: To evaluate the association between the time interval from umbilical cord blood sampling until analysis and the quality of the sample. Materials and methods: Umbilical cord blood samples collected during the third stage of labor were placed in temperature-controlled boxes for the transport of biological material and sent to an umbilical cord blood bank, where the number of nucleated cells, the number of viable cells and the number of CD34+ cells were counted, and samples were additionally tested for contamination, at the following time intervals: up to 24 hours, up to 48 hours and up to 72 hours following sampling. The data were analyzed using the multivariate analysis of variance (MANOVA) and compared using McNemar's chi-square test. Significance was defined at p<0.05. Results: Means and medians of the number of nucleated cells, number of viable cells and number of CD34+ cells decreased significantly (p<0.0001) as a function of the increased time between sampling and analysis, the difference between 24 and 48 hours being less than the difference between 24 and 72 hours. A linear correlation was found between the mean number of viable cells and CD34+ cells at the three moments of analysis. Contamination testing was negative in all samples. Conclusions: The increase in the interval of time from sampling until analysis negatively affected the number of nucleated cells, viable cells and CD34+ cells but was not associated with specimen contamination. A linear correlation was found between the decrease in the number of viable cells and CD34+ cells / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia

Introdução. A possiblidade de restauração do Sistema Nervoso Central representa um desafio em Neurociências, e a integração bem sucedida de células-tronco no cérebro adulto tem se tornado um importante objetivo. Objetivo. Testar a hipótese de que a sobrevivência e diferenciação de células-tronco mesenquimais (CTMs) sejam dependentes de condições microambientais de acordo com o alvo de implante no cérebro. Métodos. CTMs foram isoladas de ratos adultos e geneticamente modificadas por meio de transfecção lentiviral para expressarem GFP. O fenótipo neuronal foi satisfatoriamente induzido in vitro. Uma suspensão de células foi implantada estereotaxicamente no cérebro de 40 ratos da mesma linhagem, em uma área neurogênica (hipocampo) e outra não-neurogênica (estriado). Os animais foram sacrificados 6 e 12 semanas após a cirurgia, e os cérebros foram corados com marcadores de neurônios maduros. Células co-expressando NeuN e GFP foram contadas estereologicamente nos dois alvos. Resultados. A população de célula isolada foi capaz de gerar 14,5 ± 1,1 % de neurônios NF200-positivos in vitro. Uma vez implantados no hipocampo, as células migraram além do enxerto e geraram neurônios maduros (1634±231 células GFP/NeuN+). Por outro lado, maciça degeneração celular foi vista no estriado, onde não ocorreu migração significativa, sendo que somente 108±24 NeuN/GFP+ neurônios (p<0.001) foram contados. Conclusão. Nossos dados demonstraram que a sobrevivência e diferenciação de CTMs são altamente dependentes do sítio de implante no cérebro hospedeiro, indicando assim a importância de um microambiente permissivo. Futuros estudos para identificação dos fatores pró-neurogênicos presentes no hipocampo poderão subsequentemente permitir a integração de células-tronco em áreas do SNC nãopermissivas, assim contribuindo para se alcançar o objetivo de introduzir a restauração do SNC na prática clínica. / The possibility of CNS restoration represents a challenge in Neuroscience, and the successful integration of stem cells in adult brain has become an important goal. The working hypothesis of the present study is that survival and neurodifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) may be dependent upon microenvironmental conditions according to the site of implant in the brain. Methods: MSCs were isolated from adult rats and labeled with eGFP lentivirus. The neuronal phenotype was successfully induced in vitro. A cell suspension was implanted stereotactically into the brain of 40 young rats of the same strain, in neurogenic (hippocampus) and non-neurogenic (striatum) areas. Animals were sacrificed six or twelve weeks after surgery, and brains were stained for mature neuronal markers. Cells co-expressing NeuN-GFP were counted stereologically at both targets. Results: The isolated cell population was able to generate 14.5±1.1% of NF200+-neurons in vitro. Once implanted into the hippocampus, cells migrated away from the graft and gave rise to mature neurons (1634±231 cells GFP/NeuN+). By contrast, massive cell degeneration was seen in the striatum, with no significant migration, while only 108±24 NeuN/GFP+ neurons (p<0.001) were counted. Conclusions: Our data demonstrated that survival and differentiation of MSCs are strongly dependent upon the site of implant in the brain, thus indicating the importance of a permissive microenvironment. Future studies for identification of the pro-neurogenic factors present in the hippocampus could subsequently allow the integration of stem cells into non-permissive areas of the CNS and thus contribute for the challenging goal of introducing CNS repair in the clinical practice.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-11T13:33:41Z No. of bitstreams: 1 joaovitorpaesrettore.pdf: 1725080 bytes, checksum: 556b0f06a7899831fa634e0324dbc517 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-14T17:08:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 joaovitorpaesrettore.pdf: 1725080 bytes, checksum: 556b0f06a7899831fa634e0324dbc517 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T17:08:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaovitorpaesrettore.pdf: 1725080 bytes, checksum: 556b0f06a7899831fa634e0324dbc517 (MD5) Previous issue date: 2013-09-09 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A clonagem de animais representa um grande avanço tecnológico, mas ainda é uma técnica em experimento que necessita de aperfeiçoamento para que possa realmente ser difundida no meio agropecuário e social. Entre essas técnicas, uma que tem merecido destaque é a Clonagem por Transferência Nuclear (NT) pelo seu uso em técnicas de transgênese, entre outros, tornando-se uma alternativa viável frente aos métodos convencionais, como a microinjeção pró-nuclear. Porém, um problema frequentemente associado à NT é a baixa eficiência do processo, sendo pequena a proporção de embriões viáveis que são reconstruídos a partir de células somáticas como doadoras de núcleo. Muitos fatores podem influenciar nessa baixa taxa de sucesso, entre eles a incompleta reprogramação do núcleo da célula somática doadora, podendo levar a uma expressão anormal de importantes genes relacionados ao desenvolvimento do embrião. Isso significa que, para a clonagem funcionar, o núcleo da célula doadora precisa ser totalmente reprogramado após sua transferência, cessando sua programação própria de expressão gênica. O grau de diferenciação celular e comprometimento epigenético da célula doadora pode comprometer esse processo, levando-se a pensar na utilização de células menos comprometidas a fim de obter-se uma maior eficiência, tais como as células-tronco adultas. No presente trabalho isolamos, caracterizamos e testamos o potencial de diferenciação de células-tronco isoladas a partir do tecido adiposo da glândula mamária bovina (CTGMB), e sua caracterização semelhante a células-tronco mesenquimais torna interessante o potencial dessas células para terapia celular em bovinos, ou mesmo para clonagem por transferência nuclear, já que sua aplicação na técnica pode contribuir para aumentar sua eficiência, por se tratarem de células mais progenitoras. Além disso, por não terem comprometimento com um dado tipo celular, talvez possam contornar problemas epigenéticos. O know-how e os dados aqui apresentados são inéditos e inovadores, pois na literatura não há registro de algum grupo de pesquisa que tenha chegado a tal caracterização com riqueza de detalhes em células bovinas, e tais protocolos para obtenção das CTGMB podem ser patenteados. / Animal cloning represents a major technological breakthrough, but.it is still an experimental technique and needs some improvement so it can truly be diffused in the agricultural and social environment. Among these techniques, one that has been highlighted is Cloning by nuclear transfer (NT) because of its use in transgenesis techniques, among others, becoming one viable alternative compared to the conventional methods such as pro-nuclear microinjection. However, the low efficiency of the process is a common problem associated with NT, being small the proportion of viable embryos that are reconstructed using somatic cells as nuclear donors. There are many factors playing roles on this low success rate, one of them being the incomplete reprogramming of donor’s somatic cell nucleus, leading to an abnormal expression of important genes related to embryo development. So, for the cloning to work properly, the donor cell nucleus must be completely reprogrammed after its transfer, ceasing its own gene expression programme. The actual stage of cell differentiation and epigenetic commitment of the donor cell may compromise the process, leading to think of using less committed cells in order to obtain a higher efficiency, such as adult stem cells. In the present work we isolate, characterize and test the differentiation potential of stem cells isolated from the adipose tissue of bovine mammary gland (CTGMB), and their characterization as similar to mesenchymal stem cells make interesting their potential use on cattle cell therapy, or even nuclear transfer cloning, once their application in such technique could help increasing its efficiency because CTGMB are more progenitor cells. Furthermore, since they are not committed to a specific cell type, they may be able to bypass epigenetic issues. The know-how and data presented here are novel and innovative, since in literature there is no record of any research group that has come to reach such a detailed characterization in bovine cells, and such protocols for obtaining CTGMB are patentable.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-21T13:39:52Z No. of bitstreams: 1 mariziatrevizani.pdf: 1220027 bytes, checksum: 70abc77309c910bd7507cd8ebeed0526 (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: on 2017-08-24T11:31:11Z (GMT) / Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-24T15:20:42Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-30T14:33:33Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-08-30T14:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2017-02-22 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A evolução das técnicas de cultura de células levaram à necessidade de eliminar componentes de origem animal, de modo a evitar a contaminação bacteriana, viral ou priônica. As células-tronco da polpa dentária são células-tronco multipotentes que apresentam alta plasticidade, sendo capazes de se diferenciar em linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. O presente trabalho tem como objetivo testar a utilização de peptonas vegetais (ervilha, trigo e soja) nas concentrações de 0,5%; 1% e 5% como possíveis substitutos para 10% de soro bovino fetal (SFB) em cultura de CTs. A proliferação celular foi avaliada pelo método de MTT analisado em espectrofotómetro (VarioSkan). Realizou-se a diferenciação osteogênica e empregou-se a coloração Vermelho de Alizarina para testar o suporte de diferenciação. Medimos a concentração de deposição de cálcio ressuspendendo o conteúdo de Vermelho de Alizarina em solução alcoólica e analisando espectrofotometricamente. O ensaio de MTT e ensaios de diferenciação osteogênica permitiram concluir que a peptona de trigo a 1% foi a mais eficiente nas condições empregadas. A concentração de 5% de todas as peptonas utilizadas foi tóxica. Ao analisar os aminogramas das três peptonas, foi possível inferir que a maior eficiência da peptona de trigo pode estar relacionada à maior proporção de prolina e ácido glutâmico. / The evolution of cell culture techniques led to the necessity of eliminating components with animal origin, in order to prevent bacterial, viral or prionic contamination. Deciduous teeth dental pulp stem cells are multi potent stem cells which present high plasticity, being able to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. The present work aims at testing the utilization of vegetal peptones (pea, wheat and soy) at the concentrations 0.5%; 1%, and 5% as possible substitutes for 10% Fetal Bovine Serum (FBS) in SCs culture. Cell proliferation was assayed by the MTT method analyzed on spectrophotometer (VarioSkan). We performed osteogenic differentiation and employed Alizarin Red staining in order to test the differentiation support. We measured the concentration of calcium deposition by ressuspending the alizarin red content in alcoholic solution and by analyzing spectrophotometrically. MTT and osteogenic differentiation essays allowed to conclude that wheat peptone at 1% was the most efficient in the conditions employed. The concentration of 5% of all the peptones utilized was toxic. Upon analyzing the aminograms of the three peptones, it was possible to infer that the higher efficiency of wheat peptone may relate to the greater proportion of proline and glutamic acid.

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Asciutti_AugustoCesarSpadaccia_M.pdf: 1128451 bytes, checksum: ed87729f9d44f5ffd0d06e755272756f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Introdução: Durante o desenvolvimento e a vida adulta de um organismo, células troncoindiferenciadas, capazes de dar origem a um ou mais tipos celulares, proliferam e se diferenciam para, tanto produzir os tecidos de um organismo em desenvolvimento, quanto repor células perdidas pelo envelhecimento, doença ou injúria. Essas células residem em um nicho especializado contendo células diferenciadas e elementos responsáveis por manter o estado predominantemente quiescente. Acredita-se que as células tronco da próstata contribuam para o desenvolvimento de câncer através da desregulação dos elementos do nicho. ps20 é um elemento secretado por células musculares lisas da próstata, o qual demonstra capacidade de inibir o crescimento da linhagem de células prostáticas cancerígenas PC3 em cultura. Evidências sugerem uma possível relação entre ps20 com a adesão celular. No entanto, seu funcionamento é pouco conhecido. Objetivos: Analisar o efeito do silenciamento do gene WFDC1/ps20 sobre o comportamento das células p63+ e arquitetura tecidual durante o desenvolvimento prostático pós-natal. Materiais e métodos: Próstatas ventrais de ratos Wistar recém nascidos foram cultivadas sobre membranas flutuantes permeáveis, na presença de RNA de interferência para reduzir a expressão de ps20. Os órgãos foram cultivados por sete dias e em seguida analisados através da contagem da formação de estruturas epiteliais, colorações histológicas, imunohistoquímica e PCR em Tempo Real. Resultados: O silenciamento de WFDC1/ps20 levou a uma redução de 36% na quantidade de mRNA de WFDC1/ps20. Foi observada redução no número de pontas de ductos epiteliais entre o segundo e quarto dia cultura e entre o quarto e sétimo dia. A análise histológica revelou ductos com ramificação reduzida e com as pontas mais dilatadas, em resposta a redução de WFDC1/ps20. Foi observada polarização celular prejudicada e cavitação reduzida. A imunohistoquímica para p63 revelou que os níveis reduzidos de ps20 promoveram a concentração das células p63+ nas pontas dilatadas dos ductos epiteliais. Real Time PCR revelou que o silenciamento do gene WFDC1/ps20 promoveu um aumento de nove vezes na quantidade do mRNA de MMP9.Discussão: O silenciamento de WFDC1/ps20afetou o desenvolvimento prostático com um efeito sem ambiguidade no comportamento das células basais p63+, como representado pelo seu acumulo nas pontas dos ductos e diminuição ao longo dos ductos estendidos. O tratamento também prejudicou a polarização de células luminais e comprometeu a cavitação.O conteúdo elevado de mRNA de MMP9 pode estar relacionado com o acumulo da proteína e a degradação descontrolada da matriz extracelular ao redor pontas dos ductos, levando ao fenótipo dilatado. Como a degradação correta da matriz em locais específicos é requerida para a formação do ponto de ramificação, é sugerido que a ps20 regula o balanço da atividade de MMP9 necessária durante o desenvolvimento prostático. Essa ideia coloca o sistema uPA/uPAR acima da regulação e ativação de MMP9.Conclusões:A redução deWFDC1/ps20comprometeu a morfogênese em ramos, polarização das células epiteliais e cavitação. Esses aspectos estão associados com a desestabilização do comportamento das células p63+, como sugerido pelo seu acumulo nas pontas dilatadas e diminuição do compartimento de células basais ao longo dos ductos estendidos / Abstract: Introduction: During the development and adult life of an organism, undifferentiated stem cells, capable of giving rise to one or more cell types in an adult organism, proliferate and differentiate to both produce the tissues of an developing organism and replace cells lost by aging, disease or injury. These cells reside in a specialized niche containing differentiated cells and elements responsible for maintaining their predominantly quiescent state. Prostate stem cells are believed to contribute to cancer development via deregulation of niche elements. ps20 is a protein secreted by prostate smooth muscle cells which was shown to inhibit the growth of prostatic PC3 cancer cell line in culture. Evidences exist favoring a possible relationship between ps20 and cell adhesion. However its functioning is still poorly known. Objectives: Analyze the effect of the silencing of the WFDC1/ps20 gene in the behavior of p63-positive cells and tissue architecture during the post-natal prostatic development. Materials and methods: Ventral prostate of newborn Wistar rats were cultured on floating permeable membranes, in the presence of small interference RNA to reduce ps20 expression. The organs were cultured for seven days, and then analyzed by counting of epithelial structures formation, histological and immunohistochemical staining and Real Time PCR. Results: The silencing of WFDC1/ps20 led to a 36% reduction in WFDC1/ps20 mRNA amount. It was observed reduction in the number of epithelial duct tips between the second and fourth day of culture, and between the fourth and seventh day. Histological analysis revealed reduced branching and dilated tips in response toWFDC1/ps20knocking down. It was observed hindered polarization and reduced cavitation. Immunohistochemistry for p63 revealed that reduced levels of ps20 promoted the concentration of p63+ cells at the enlarged ductal tips. Real Time PCR revealed that the knocking down the WFDC1/ps20 gene promoted a 9-fold increase in the amount of MMP9 mRNA. Discussion: The silencing of WFDC1/ps20affected prostate development with an unambiguous effect on p63+ cells behavior, as represented by their accumulation at the ductal tips and depletion along the extended ducts. The treatment also hampered the differentiation of luminal cells and compromised cavitation. The increased MMP9 mRNA content might be correlated with the accumulation of the protein and uncontrolled degradation of the extracellular matrix around the duct tips, leading to the dilated phenotype. Since the correct degradation of the matrix in specific sites is required for the branch point formation we suggest that ps20 regulates the balance for MMP9 activity required during prostate development. This idea places the uPA/uPAR system upstream of MMP-9 regulation and activation. Conclusions: The reduction in the WFDC1/ps20expressioncompromised branching morphogenesis, epithelial cell polarization and cavitation. These aspects are associated with a destabilization of p63+cell behavior, as suggested by their accumulation at the dilated tips and depletion from the basal cell compartment along the extended ducts / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

O osteossarcoma é um tumor ósseo maligno, de maior ocorrência em cães, possui rápido crescimento e alto potencial metastático. Assim, o cão é um modelo útil para o estudo da doença em humanos, tendo em vista as semelhanças clínicas e histopatológicas que ocorrem em ambas às espécies. Atualmente, os estudos a respeito de células-tronco são promissores considerando seu alto potencial terapêutico. Entretanto, ainda prevalecem muitas dúvidas referentes ao tratamento de tumores utilizando a terapia celular. Este tema é pouco conhecido e estudado, por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre células-tronco obtidas da polpa dentária canina com as células derivadas osteossarcoma canino. Foram realizados cocultivos celulares das células derivadas de polpa dentária canina, osteossarcoma canino e derivadas de osso normal canino. Analisou-se os aspectos morfológicos das células cocultivadas e controle, assim como a atividade proliferativa, a morte celular, o potencial elétrico mitocondrial e a expressão gênica. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que a interação entre a célula-tronco da polpa dentária canina imatura e as células de osteosarcoma canino não apresentam alterações morfológicas. Entretanto, as células-tronco derivadas da polpa dentária canina e de osso fetal canino sadio parecem servir de suporte para o crescimento tumoral. Além disso, a cocultura celular, em todos os grupos testados, promove alterações na expressão gênica e proteica. / Osteosarcoma is a malignant bone tumor most frequent in dogs. It has fast growth and high metastatic potential. Thus, the dog is an useful model for the study of human disease, due to the clinical and histological similarities found in both species. Currently, studies about stem cells are promising considering its high therapeutic potential. However, many doubts still exist regarding the treatment of tumors using cell therapy. This theme is little known and studied. Therefore, the aim of this study was to evaluate the interaction between stem cells obtained from canine immature dental pulpstem cells with osteosarcoma cells derived from dogs. Cellular coculture were performed using cells derived from canine dental pulp, canine osteosarcoma and canine normal bone. The morphological aspects of cocultured cells and control were analyzed, as well as proliferative activity, cell death, the mitochondrial membrane electric potential and gene expression. In summary, it was concluded that the interaction between stem cells from canine immature dental pulp and canine osteosarcoma cells did not show morphological changes. However, stem cells derived from canine dental pulp and healthy canine fetal bone serve to support tumor growth. Furthermore, the cell coculture in all groups tested, causes changes in gene and protein expression.

Les cellules souches assurent le développement des tissus, leur renouvellement ainsique leur réparation suite à des blessures. L’une des questions clés du domaine de labiologie des cellules souches est l’identification des différents types cellulaires qu’unecellule souche peut donner. Les cellules souches peuvent être multipotentes, c’est-à-direcapables de donner naissance à plusieurs types cellulaires différents, ou unipotentes,c’est-à-dire qu’elles ne peuvent alors se différencier qu’en un seul type cellulaire. Lesexpériences de traçage cellulaire sont réalisées quotidiennement en biologie dudéveloppement et en biologie des cellules souches afin d’évaluer le devenir des cellulessouches in vivo. Cependant, il n’existe à ce jour aucune méthode rigoureuse permettantd’interpréter les résultats d’expériences de traçage cellulaire de manière non ambigüe etde déterminer la multipotence ou l’unipotence des cellules souches avec grande précisionet de manière statistiquement fiable. Nous avons développé de nouvelles méthodes afind’évaluer avec une très grande précision le caractère unipotent ou multipotent descellules souches du sein et de la prostate. Ces nouvelles découvertes démontrent demanière non ambigüe que la prostate provient de cellules souches multipotentes, alorsque seules des cellules souches unipotentes contribuent au développement et auremodelage de la glande mammaire au stade adulte. D’autre part, nous montrons que cesont des cellules souches multipotentes qui sont responsables des phases précoces dudéveloppement embryonnaire de la glande mammaire, et que ces cellules deviennentunipotentes peu avant la naissance. Nous avons étudié les mécanismes régulant le passagede l’état multipotent à l’état unipotent et démontrons que le facteur de transcription p63joue un rôle crucial dans la restriction du potentiel de différenciation des cellules souchesmammaires embryonnaires. Enfin, nous montrons que les cellules souches mammairesadultes, normalement unipotentes, peuvent redevenir multipotentes en conditionsphysiopathologiques telles que l’ablation spécifique d’une lignée cellulaire mammaire ouau cours de l’initiation tumorale. Nous essayons donc de comprendre de manière généraleles mécanismes impliqués dans le passage de l’état unipotent à l’état multipotent descellules souches mammaires adultes, et d’élucider les similarités existant entre lesdifférentes conditions dans lesquelles des cellules souches mammaires multipotentessont observées. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les glioblastomes (GBM) sont des tumeurs astrocytaires au pronostic défavorable. L’échec des thérapies actuelles (chimio et radiothérapies) est principalement lié à la résistance des cellules souches cancéreuses (CSCs). Ces cellules ont besoin de communiquer en permanence avec leur microenvironnement pour leur survie et pour maintenir une niche favorable à leur développement. Le transfert de matériel entre les CSC, les cellules tumorales et le microenvironnement contribue à l’échappement thérapeutique. Des travaux récents révèlent l’importance des récepteurs aux neurotrophines TrkB et TrkC dans la survie et la croissance des CSC de GBM. Nos travaux préliminaires dans le cancer bronchique démontrent que les récepteurs aux neurotrophines sont transférés aux cellules du microenvironnement via les exosomes afin de les contrôler. Cependant, le mécanisme de diffusion de récepteurs oncogéniques à partir de CSC n’a jamais été étudié. Notre objectif principal était donc de déterminer l’implication des récepteurs des neurotrophines dans le transfert du phénotype agressif des CSC vers les cellules du microenvironnement afin de favoriser la résistance thérapeutique du glioblastome. Nos résultats ont permis d’établir un lien entre le stade de différenciation des cellules tumorales, l’expression des neurotrophines et leur interaction avec le microenvironnement tumoral via les exosomes. Le transfert de TrkB au sein des exosomes joue un rôle clé dans la progression tumorale du GBM et dans l’agressivité cellulaire. Néanmoins, le transfert des récepteurs aux neurotrophines via les exosomes pourrait également être impliqué dans les mécanismes de radiorésistance. Des études menées sur des cellules de GBM humain irradiées et traitées par des exosomes démontrent l’implication de ces derniers dans l’échappement thérapeutique. Parmi les cellules du microenvironnement ciblées par les exosomes, les CSM sont celles qui ont été les moins étudiées bien qu’elles possèdent un tropisme spécifique pour le GBM. Nos travaux démontrent que les exosomes de GBM modifient le phénotype des CSM et augmentent leurs capacités prolifératives et migratoires. La fonction exacte du transfert des récepteurs des neurotrophines devra être analysée dans ces différents modèles afin de préciser son importance dans la physiopathologie du glioblastome et sa progression. L’expression des récepteurs aux neurotrophines dans ces exosomes permet d’envisager leur utilisation en tant que biomarqueurs diagnostiques et/ou pronostiques dans le GBM. Mots clés : Glioblastomes, cellules souches cancéreuses, neurotrophines, TrkB, radiothérapie, cellules souches mésenchymateuses, exosomes. / Glioblastoma are tumors derived from astrocytes with a dark prognosis. Current therapies fail to inhibit relapses due to radioresistant properties of cancer stem cells (CSC). Communication between CSC and their microenvironment is required for maintain “stem cells niche” and cell survival . The transfer of materials between CSC, tumor cells and microenvironment contributes to therapeutic resistance. In glioma, recent studies reveal the major role of TrkB and TrkC in survival of CSC. Our previous work, in lung cancer, have shown that neurotrophin receptors exhibits a control on microenvironment cells and angiogenesis through exosome transfer. However, similar mechanism of oncogenic receptor transfer from CSC has never been studied. Our main goal was to determine the involvement of neurotrophin receptors in the transfer of biological aggressiveness to microenvironment cells in order to promote therapeutic resistance in glioblastoma. Our findings suggest a relationship between cell differentiation status, expression of neurotrophin receptors and their interaction with the microenvironment through exosomes. TrkB-containing exosomes play a key role in the control of glioblastoma progression and cell aggressiveness. Mechanisms of radioresistance might also be dependent of the transfer of neurotrophin receptors through exosomes. Indeed, our results on irradiated human GBM cells and treated by exosomes demonstrate the involvement of exosome in radioresistance mechanisms. Although mesenchymal stem cells (MSCs) are considered as stromal components of glioblastoma, their communication with CSC, particularly through exosomes, remain largely undefined. Our results show that GBM-derived exosomes modify the phenotype of MSCs and increase their proliferative and migratory abilities. The putative function of neurotrophin receptors transfer should be analyzed in these models to determine their prime role in glioblastoma pathogenesis and progression. This finding suggest that the neurotrophin receptor expression in exosomes could be used as diagnostis and prognosis biomarkers of GBM.

During embryonic development, multipotent cardiovascular progenitor cells (MCPs) are specified from early mesoderm. Although the core cardiac transcriptional machinery acting during cardiac cell differentiation is relatively well known, the molecular mechanism acting upstream of these cardiac transcriptional factors, and promoting cardiac progenitor specification from early mesoderm remains poorly understood. We used embryonic stem cell (ESC) differentiation as a model to dissect the molecular mechanisms implicated in cardiovascular progenitor specification. Using ESCs, in which gene expression can be temporally regulated, we showed that transient expression of Mesp1 dramatically accelerates and enhances multipotent cardiovascular progenitor specification through an intrinsic and cellular autonomous mechanism. Using genome wide transcriptional analysis, we found that Mesp1 rapidly activates and represses a discrete set of genes. Using chromatin immunoprecipitation, we showed that Mesp1 directly binds to regulatory DNA sequences located in the promoter of many key genes belonging to the core cardiac transcriptional machinery, resulting in their rapid upregulation. Mesp1 also directly and strongly represses the expression of key genes regulating other early mesoderm and endoderm cell fates. Using engineered ESC expressing the green fluorescent protein under the control of the Mesp1 promoter, we isolated Mesp1 expressing cells in differentiating ESCs allowing characterization of the cellular and molecular mechanisms underlying cardiovascular specification. Our results demonstrate that Mesp1 acts as a key regulatory switch during cardiovascular specification, residing at the top of the hierarchy of the gene network responsible for cardiovascular cell fate determination. Moreover our results place Mesp1 upstream of the specification of both first and second heart fields and provide novel and important insights into the molecular mechanisms underlying the earliest step of cardiovascular specification. We identified cell surface markers expressed allowing the isolation of early cardiovascular progenitors and provide potentially novel methods for dramatically increasing the number of cardiovascular cells for cellular therapy in humans. / Doctorat en sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished