Orientadores: Everardo Magalhães Carneiro, Rosane Aparecida Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T15:27:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos-Silva_JuniaCarolinaRebelo_D.pdf: 1918048 bytes, checksum: 70dc34ec9c47cef2caa60225a914173e (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A obesidade é um importante fator que predispõe ao desenvolvimento do diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). A transição da obesidade para o T2DM é precedida pela resistência à insulina que pode se manifestar em resposta a influências ambientais, como a ingestão de dietas ricas em gorduras, ou por fatores genéticos, como a deficiência na produção do hormônio leptina. Camundongos obesos ob/ob são caracterizados pela ausência da produção do hormônio leptina e apresentam obesidade por hiperfagia. A taurina (Tau) é um aminoácido sulfatado não essencial e dentre suas várias ações biológicas destaca-se seu envolvimento na regulação da homeostase glicêmica e metabolismo energético. Nosso objetivo foi avaliar o efeito da suplementação com Tau sobre o desenvolvimento da obesidade, homeostase da glicose, estrutura e função do pâncreas endócrino em camundongos ob/ob. Foram utilizados camundongos C57 e ob/ob que beberam água (C e ob) ou 5% de Tau (CT e obT) dos 30 aos 90 dias de vida. Camundongos ob apresentaram massivo acúmulo de gordura corporal, intolerância à glicose e resistência à insulina. Essas alterações na homeostase à glicose foram acompanhadas por alterações morfológicas e funcionais adaptativas na ilhota pancreática dos camundongos ob, sendo evidenciada hipersecreção de insulina em resposta à glicose associada ao maior influxo de Ca 2+ e redução da ação da somatostina sobre a célula ?. Essa maior resposta secretória também pode estar associada à maior ação do sistema nervoso parassimpático, visto que ilhotas ob secretaram mais insulina em resposta ao agonista colinérgico, carbacol (Cch), e quando as proteínas kinases (PK)-A e C foram ativadas. Contudo, ilhotas de fêmeas ob não apresentaram redução da secreção de insulina em resposta à fenilefrina, o que sugere menor sensibilidade simpática nesse grupo. A suplementação com Tau não preveniu o desenvolvimento da obesidade, mas melhorou a tolerância à glicose, reduziu a produção hepática de glicose e aumentou a sensibilidade à insulina. Ilhotas de camundongos obT apresentaram atenuação da hipersecreção de insulina em resposta à glicose. Tal efeito pode estar associado à melhora na sensibilidade da ilhota obT à somatostatina e ao menor influxo de Ca 2+ em resposta a glicose, bem como redução da amplificação da secreção em resposta à ação da via colinérgica/PKC e a maior sensibilidade simpática na ilhota de fêmeas obT. Ainda, foi observada maior secreção de glucagon em ilhotas de camundongos ob. Essa alteração pode ser devida a alterações na excitação da célula ?, pois o grupo ob apresentou aumento da frequência de oscilações de Ca 2+ em resposta a concentrações basais e estimulatórias de glicose. Todas as alterações fisiológicas da ilhota pancreática foram acompanhadas por aumento da massa de ilhotas, células ? e ? no pâncreas de camundongos ob. A Tau reduziu a massa de ilhotas e células ?, contudo no pâncreas do grupo obT houve maior massa de células ? e ?. As modificações morfofuncionais da ilhota ob foram acompanhadas por redução da expressão gênica do glucagon, somatostatina, do GLUT-2, TRPM5, do SSTR2, e MafB, porém aumento do conteúdo de mRNA de insulina, PAX6, PDX-1 e Ngn3. A Tau normalizou a expressão dos genes do glucagon, Glut-2 e TRPM5 e aumentou a expressão de MafA, Ngn3 e NeuroD. Nossos resultados, pela primeira vez, demonstraram que a suplementação com Tau melhorou a homeostase glicêmica regulando a morfo-fisiologia das células ?, ? e ? em camundongos geneticamente obesos, indicando um possível papel do aminoácido na preservação da função pancreática endócrina e também da interação parácrina de seus hormônios na obesidade e T2DM / Abstract: Obesity is an important factor that predisposes to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). The transition from obesity to T2DM is preceded by insulin resistance which can manifest in response to environmental influences such as the intake of high-fat diets or genetic factors, such as deficiency in the production of leptin. Obese (ob/ob) mice are characterized by the absence of production of leptin and become obese due to severe hyperfagia. Taurine (Tau) is a non-essential amino acid and among its various biological actions stands out its involvement in the regulation of glucose homeostasis and energy metabolism. Our aim was to evaluate the effect of Tau supplementation upon the development of obesity, glucose homeostasis, structure and function of the endocrine pancreas in ob/ob mice. We used C57 and ob/ob who drank water (C and ob) or 5% of Tau (CT and obT) from 30 to 90 days of age. Ob mice showed massive accumulation of body fat, glucose intolerance and insulin resistance. These changes in glucose homeostasis were followed by adaptive morphological and functional changes in the pancreatic islet from ob mice with hypersecretion of insulin in response to glucose associated with increased Ca 2+ influx and a reduction in somatostatin action on the ? cell. This increased secretory response was also associated with increased activity of the parasympathetic nervous system, as ob islets secrete more insulin in response to the cholinergic agonist carbachol (Cch), and when protein kinases (PK) -A and C pahtways were activated. However, female ob islets showed no reduction in insulin secretion in response to phenylephrine, suggesting diminished sympathetic sensitivity in this group. Tau supplementation did not prevent the development of obesity, but improved glucose tolerance, reduced hepatic glucose production and increased insulin sensitivity. Islets from obT mice showed attenuation of hypersecretion of insulin in response to glucose. This effect may be associated with improved sensitivity of obT islet to somatostatin and lower Ca 2+ influx in response to glucose and reduced the amplification of insulin secretion in response to cholinergic/PKC pathway and increased sympathetic sensitivity in islets from female obT mice. Moreover, we observed higher glucagon secretion in islets from ob mouse and this change may be due to changes in the excitement of ? cell because the ob group increased frequency of Ca 2+ oscillations in response to basal and stimulatory concentrations of glucose. All physiological changes were accompanied by an increase in islet, ? and ? cells masses in the pancreas from ob mice. Tau reduced the mass of islets and ? cells, however there was a higher content of ? and ? cells masses in obT. Morphological and functional modifications in islets from ob mice were accompanied by reduced gene expression of glucagon, somatostatin, GLUT-2, TRPM5, SSTR2, and MafB, but increased mRNA content of insulin, PAX6, PDX-1 and Ngn3. Tau normalized gene expression of glucagon, TRPM5 and GLUT-2 and increased the expression of MafA, Ngn3 and NeuroD. Our results indicate, for the first time, that supplementation with Tau improves glucose homeostasis by regulating the morphology and physiology of ?, ? and ? cells in ob mice, indicating a possible therapeutic role for preservation of pancreatic endocrine function in obesity and T2DM / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Silvia Rodrigues Machado / Resumo: O gênero Jacaranda Juss. (Bignoniaceae), um representante da tribo Jacarandeae, é constituído por 47 espécies, das quais 39 são endêmicas para o Brasil. Este gênero se destaca dos demais gêneros de Bignoniaceae principalmente por apresentar estaminódio alongado glandular e forte potencial etnobotânico e fitoquímico em várias espécies ocorrentes no Brasil. Estruturas secretoras são sítios de produção de substâncias bioativas, estudos sobre distribuição, morfologia e organização anatômica e sua composição química podem contribuir para conhecimento de Jacaranda no âmbito biológico, químico e farmacológico. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi realizar uma descrição anatômica foliar de 24 espécies de Jacaranda ressaltando características capazes de agrupar espécies e comparar com ambientes de ocorrência e evidenciar características diagnósticas para as espécies. Dentre elas, também foi objetivo desse estudo, realizar uma prospecção das estruturas secretoras foliares e florais em seis espécies associando o morfotipo das glândulas com sua localização, organização anatômica e as principais classes de compostos produzidos. Para isso, usamos técnicas rotineiras para o processamento de material herborizado e material coletado fresco para estudos anatômicos, micromorfológicos de superfície, histoquímicos e analises de agrupamento. Características morfológicas e anatômicas foliares, tais como, o tamanho, forma, tipo da margem e textura dos foliólulos, assim como a estrutura da ala... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The genus Jacaranda Juss. (Bignoniaceae), a representative of the Jacarandeae tribe, consists of 47 species, 39 of which are endemic to Brazil. This genus stands out from the other genera of Bignoniaceae mainly for presenting elongated glandular staminode and strong ethnobotanical and phytochemical potential in several species occurring in Brazil. Secretory structures are sites of production of bioactive substances, studies on distribution, morphology and anatomical organization and their chemical composition can contribute to Jacaranda knowledge in the biological, chemical and pharmacological fields. In this context, the objective of this study was to perform a leaf anatomical description of 24 species of Jacaranda highlighting characteristics capable of grouping species and comparing with occurrence environments and highlighting diagnostic characteristics for the species. Among them, it was also the aim of this study, to prospect for leaf and floral secretory structures in six species associating the gland morphotype with its location, anatomical organization and the main classes of compounds produced. For this, we use routine techniques for the processing of herborized material and fresh collected material for anatomical, surface micromorphological, histochemical and cluster analysis studies. Leaf morphological and anatomical characteristics, such as the size, shape, type of margin and texture of the leaflets, as well as the structure of the wing and edge, as well as the t... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Jose Roberto Bosqueiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T18:48:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rafacho_Alex_D.pdf: 17852608 bytes, checksum: ee7b970220681b508fc5519d53e49655 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A resistência à insulina (RI) é uma condição que exige maiores níveis de insulina circulante e que normalmente são providenciados pelo aumento da função e população de células ß. A RI pode ser observada a partir de diversos modelos experimentais em roedores tais como os modelos transgênicos, de gravidez, submetidos às dietas hiperlipídicas e hipercalóricas e a partir de infusão venosa de glicose. Estes modelos têm sido úteis para a compreensão dos mecanismos compensatórios observados durante a RI. Os glicocorticóides são amplamente utilizados na indução farmacológica da RI em modelos animais e em seres humanos, com fins científicos. A ativação da sinalização da insulina e das proteínas reguladoras do ciclo celular é crucial para a função e crescimento das células ß adultas. No presente trabalho, apresentamos modelos para investigação da função e crescimento de células ß pancreáticas in vivo a partir da administração diária de três concentrações distintas de dexametasona (DEX) (0,1, 0,5 e 1,0 mg/kg, peso corpóreo, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 e DEX 1.0, respectivamente) por 5 dias consecutivos. A sensibilidade periférica à glicose e à insulina, parâmetros de secreção de insulina e histomorfométricos foram investigados. A análise dos níveis de proteínas relacionados à função e crescimento de células ß foi realizada por Western blotting. O tratamento com DEX induziu RI de maneira dose- dependente. Aumento da secreção de insulina em resposta à glicose foi observado tanto in vivo quanto ex vivo nos três grupos tratados com DEX. Ratos DEX 1.0, que apresentam hiperglicemia moderada e marcante hiperinsulinemia, exibiram aumento de 5,1 vezes na proliferação além de hipertrofia de células ß, com aumento significativo na massa de células ß comparado aos ratos CTL. Os ratos DEX 0.5, hiperinsulinêmicos, porém normoglicêmicos, também apresentaram aumento significante de 3,6 vezes na proliferação e modesta hipertrofia de células ß. Entretanto, os ratos DEX 0.1, que desenvolveram o menor grau de RI, compensaram à demanda de insulina apenas com aumento da função de células ß. Nenhuma alteração da freqüência de morte celular foi observada nas células ß dos três grupos DEX comparados ao grupo CTL. Foi observada ativação da via IRS-2/PI3- K/Akt/p70S6K, bem como da proteína retinoblastoma nas ilhotas do grupo DEX 1.0 e, em menor grau, no grupo DEX 0.5 quando comparados com as ilhotas do grupo CTL. Assim, aumentando a concentração de dexametasona induzem-se três graus de requerimento de insulina in vivo, servindo como modelo para investigação de alterações compensatórias em células ß. O aumento da demanda de insulina é compensado por aumento da função das células ß (em todos os GRUPOS DEX) e por hiperplasia e hipertrofia de células ß nos GRUPOS DEX 1.0 e DEX 0.5. Baseado nos presentes resultados concluímos que o aumento dos níveis circulantes de insulina parece ser o maior estímulo para proliferação e hipertrofia das células de células ß observado na RI induzida pela dexametasona. / Abstract: Insulin resistance (IR) is a condition that demand increased levels of circulating insulin that are normally provided by increase of ß-cell function and mass. The IR can be observed in several experimental rodent models such as transgenic, pregnancy, high-fat or high-caloric diet and from glucose infusion model. These models have aided in elucidating the compensatory mechanisms observed during the IR. The glucocorticoids are widely used to induce the pharmacological IR in animal models and in humans, with scientific purpose. Activation of insulin signaling and cell cycle proteins are crucial to the function and growth of adult ß-cells. At the present study, we showed models to investigation of pancreatic ß-cell function and growth in vivo from the daily administration of three different dexamethasone (DEX) concentration (0.1, 0.5 e 1.0 mg/kg, body weight, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 and DEX 1.0, respectively) for 5 consecutive days. The peripheral sensibility to glucose and insulin, insulin secretion and histomorphometrical parameters were investigated. The analyses of proteins related to ß -cell function and growth were done by Western blotting. DEX treatment induced IR in a dose-dependent manner. Incease of glucose-stimulated insulin secretion was observed in vivo as well as ex vivo in the three DEX groups. DEX 1.0 rats, that present moderate hyperglicemya and marked hyperinsulinemia, ehibited a 5.1-fold increase in ß-cell proliferation besides hypertrophy, with significant increase of ß -cell mass compared to CTL rats. DEX 0.5 rats, that are hiperinsulinemic and normoglicemic, also exhibited a significant 3.6-fold increase in ß-cell proliferation as well as ß -cell hypertophy. However, DEX 0.1 rats, which exhibited the lowest degree of insulin resistance, compensate for insulin demand by improving only ß -cell function. No alteration in cell death frequency was noted in ß -cells from the three DEX groups compared to CTL group. Activation of IRS-2/PI3-K/Akt/p70S6K pathway as well as the retinoblastoma protein in islets from DEX 1.0 and, in lesser extend, in DEX 0.5 group was observed compared to islets from CTL group. Therefore, increasing doses of dexamethasone induce three different degrees of insulin requirement in living rats, serving as a model to investigate compensatory beta-cell alterations. The increased insulin demand is compensated by increase of ß-cell function (in all DEX groups) and ß -cell hyperplasia and hypertrophy in DEX 0.5 and DEX 1.0 groups. Based on the present results we concluded that the augmented levels of circulating insulin seem to be the major stimulus for ß-cell proliferation and hypertrophy observed in dexamethasone-induced insulin resistance. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carmem Silvia Fontanetti Christofoletti / Coorientador: Lucilene Delazari dos Santos / Banca: Ana Maria Costa Leonardo / Banca: Roberta Cornelio Ferreira Nocelli / Resumo: Diplópodos são animais intimamente envolvidos com a manutenção do ecossistema, pois apresentam uma contribuição bastante significativa para o meio ambiente; revolvem o solo durante a locomoção, o que ocasiona aeração do mesmo e melhora a ação de microrganismos, na medida em que auxiliam no aumento da microflora através de suas fezes e através da alimentação de matéria orgânica em decomposição. Estes animais não apresentam populações numerosas, mas podem ocorrer explosões populacionais, decorrentes de mudanças climáticas, utilização de pesticidas entre outros desequilíbrios ambientais. Apresentam poucos predadores devido ao exoesqueleto resistente que os tornam impalatáveis, além da presença de glândulas de defesa que liberam fortes substâncias de ação repulsiva. As estratégias de defesa dos milípedes podem ser classificadas em físicas e químicas, onde se destacam o ato de enrolar-se e o fluído defensivo, respectivamente. O milípede Urostreptus atrobrunneus tem apresentado pontos de infestação em centros urbanos do estado de São Paulo, causando muitos transtornos à população humana. Por se tratar de uma espécie pouco conhecida, realizar um estudo sobre as glândulas de defesa destes animais é interessante, uma vez que a mesma vem apresentando um maior contato com populações humanas e de outros animais. Face ao exposto foi objetivo deste trabalho: 1) Realizar uma revisão sobre os mecanismos de defesa dos milípedes, comparando-os com os encontrados nos artrópodes e correlacionando as semelhanças observadas entre os grupos. 2) Descrever a morfologia da glândula de defesa do milípede U. atrobrunneus por meio de técnicas histológica, histoquímica e ultraestrutural. 3) Analisar os compostos voláteis presentes na secreção defensiva do milípede por meio da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). As análises permitiram verificar que a glândula de defesa... / Abstract: Diplopods are animals intimately involved in ecosystem maintaining since they show a very significant contribution to the environment; revolve the ground during transportation, which leads to aeration of the same and improves the action of microorganisms, to the extent that assist in the microflora increase a through their feces and by feeding on decaying organic matter. These animals do not have large populations, but population explosions resulting from climate change, use of pesticides and other environmental imbalances. Have few predators due to the tough exoskeleton that make them unpalatable, and the presence of defensive glands that release substances of strong repulsive action. The defense strategies of millipedes can be classified into physical and chemical, which highlights the act of rolling up and defensive fluid, respectively. The millipede Urostreptus atrobrunneus have presented points of infestation in urban centers of the São Paulo state, Brazil, causing much disruption to the human population. Because it is a little-known species, conduct a study on the defense glands of these animals is interesting, since it has shown greater contact with human populations and other animals. Given the above, the objective of this study was: 1) Conduct a review of the millipedes defense mechanisms, comparing them with those found in arthropods and correlating the similarities observed between the groups. 2) Describe the morphology of the defense gland millipede U. atrobrunneus by histological, histochemical and ultrastructural techniques. 3) Analyze the volatile compounds present in the defensive secretion of the millipede by coupled mass spectrometry gas chromatography (GC- MS). The analysis allows to verify that the gland 's defense of U. atrobrunneus is of type 2, according to the classification proposed in the literature by Eisner et al. (1978) for glands defense diplopods; this gland is composed of a spherical glandular bag fitted... / Mestre

O aparecimento de cepas microbianas com resistência aos antibióticos comumente usados em âmbito mundial constitui um sério problema de saúde pública, estimulando a busca por novos compostos antimicrobianos para os quais a resistência ainda não foi adquirida. A secreção cutânea de várias espécies de anuros (rãs, sapos e pererecas) é uma rica fonte de peptídeos com amplo espectro de atividade antibacteriana e antifúngica, com grande potencial para o desenvolvimento de fármacos. O presente trabalho visou à investigação da presença de agentes antimicrobianos na secreção cutânea das espécies brasileiras Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. Utilizando a estimulação mecânica do tegumento para extração e posteriormente a liofilização dessas secreções. Os testes antimicrobianos foram realizados através da técnica de disco difusão, onde as secreções testadas foram solubilizadas em diferentes solventes e em placas contendo bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. As secreções com maior potencial antibacteriano foram fracionadas por Cromatografia líquida de alta eficiência fase reversa em uma coluna C8 e C18 5μm. Tendo suas frações também testadas em disco-difusão. As frações que formaram halos de inibição foram submetidas à espectrometria de massa para a identificação de suas moléculas. Desta forma foi comprovado a ação antimicrobiana das secreções de Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri e Trachycephalus resinifictrix e de suas receptivas frações. / The appearance of microbial strains that are resistant to common antibiotics used in a global scope represents a serious public health issue, stimulating the search for new antimicrobial compounds that resistance was not acquired yet. The cutaneous secretion of several anurans species (frogs, toads and tree frogs) is a rich source of peptides with a broad spectrum of antimicrobial and antifungal activity, with a big potential to drug development. The present work aimed the investigation of the presence of antimicrobial agents in the cutaneous secretion of the Brazilian species Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. For the extraction of these secretions it was utilized the integument mechanical stimulation and later on these secretions were lyophilized. For the antimicrobial tests it was used the disk diffusion technique, where the test secretions were solubilized in different solvents and in plates containing Gram-negative and Gram-positive bacteria. The secretions with the highest antimicrobial potential were fractionated by a high-performance liquid chromatography reverse phase in the columns C8 and C18 5μm. These fractions were also tested in disk diffusion. The fractions that formed inhibition zones were submitted to mass spectrometry for the identification of their molecules. This way it was evidenced antimicrobial activity of secretions from Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri and Trachycephalus resinifictrix and from their respective fractions.

Sistemas de Secreção Tipo IV (T4SSs), normalmente compostos por 12 proteínas (VirB1-VirB11 e VirD4) são tipicamente associados às funções de conjugação bacteriana e transferência de fatores de patogenicidade para células hospedeiras. Mas também, muitas espécies da ordem Xanthomonadales possuem um T4SS associado a matar bactérias. O modelo atual de morte de uma célula-alvo mediada pelo T4SS é baseado na secreção de toxinas denominadas XVIPs (\"Xanthomonas VirD4 interacting proteins\") ou X-Tfe (Xanthomonadaceae-T4SS effector) no qual cada XVIP/X-Tfe apresenta uma proteína de imunidade cognata denominada X-Tfi (Xanthomonadaceae-T4SS immunity protein). Demonstramos que um XVIP, XAC2609, é secretado através do T4SS de modo que depende de contato célula-célula e do seu domínio XVIPCD (\"XVIP conserved domains\"). A porção N-terminal de XAC2609 codifica um domínio GH19 que cliva a peptideoglicana de E. coli, mas perde a sua atividade na presença do seu inibidor cognato, o X-Tfi XAC2610. Portanto, XAC2609/XAC2610 formam um par de proteínas efetora/imunidade associado ao T4SS de X. citri. Através de diferentes técnicas de microscopias utilizando a cepa Δxac2610, foi observado que XAC2610 protege o envelope celular de X. citri contra efeitos de autólise celular promovidos pela atividade de XAC2609. Ensaios funcionais baseados nas observações de fenótipos de colônias e de formação de biofilme mostraram que XAC2610 confere imunidade para X. citri contra uma atividade 7 intrínseca de XAC2609. A proteína com o papel de reconhecer os substratos através da interação com os sinais de secreção do T4SS é VirD4. No T4SS de X. citri, existe a hipótese de que o domínio XVIPCD seja o sinal de secreção presente nas XVIPs. Logo, os aspectos bioquímicos e biofísicos da interação VirD4-XVIPCD foram investigados através de experimentos de co-purificação por cromatografia de afinidade e exclusão molecular, RMN e SAXS. Demonstramos que o domínio AAD de VirD4 (VirD4AAD) está associado a interagir especificamente com o domínio XVIPCD de XAC2609 (XAC2609XVIPCD), formando um heterodímero em solução. VirD4AAD é um domínio globular e monomérico e XAC2609XVIPCD é desenovelado mas se enovela concomitante à interação com VirD4AAD. Construções de XAC2609 contendo mutações pontuais no domínio XVIPCD foram utilizadas em ensaios in vivo de secreção pela X. citri e ensaios in vitro de interação com VirD4AAD por titulação monitorada por calorimetria isotérmica (ITC). Através desses experimentos, observamos que uma forte interação entre VirD4AAD-XAC2609XVIPCD é essencial para secreção de XAC2609 via o T4SS. Esses resultados permitem concluir que o domínio XVIPCD é o sinal de secreção dos substratos do T4SS de X. citri e que o AAD confere especificidade à VirD4 por interagir com o XVIPCD. Finalmente, através de ensaios de competições bacterianas entre E. coli e X. citri, foram observados diferentes fenótipos associados à função do T4SS: i) nocautes gênicos das subunidades estruturais VirB5, VirB11 abolem a função do T4SS em X. citri.; ii) nocautes de xac2611, apresentaram uma maior vantagem adaptativa do que a cepa selvagem de X. citri em competições e a expressão epissomal de XAC2611 inibe fortemente a função do T4SS e iii) a atividade ATPásica de VirD4 é essencial para a função do sistema e a expressão de mutantes 8 de VirD4 exerce um fenótipo de dominância negativa sobre a função do T4SS em X. citri. / The Type IV secretion System (T4SS) is typically associated with the function of bacterial conjugation and as a pathogenicity factor. T4SSs are normally composed of 12 proteins, VirB1-VirB11 and VirD4. Many species of the order Xanthomonadales possess a T4SS associated with killing bacteria. The current model of the T4SS killing is based on the secretion of toxins denominated XVIPs/X-Tfes (Xanthomonas VirD4 interacting proteins) /(Xanthomonadaceae-T4SS effector) in which each XVIP/X-Tfe has a cognate immunity protein denominated X-Tfi (Xanthomonadaceae-T4SS immunity protein). We demonstrate that an XVIP, XAC2609, is secreted through the T4SS so that it depends on cell-cell contact and its XVIPCD domain (\"XVIP conserved domains\"). The N-terminal portion of XAC2609 encodes a GH19 domain which cleaves the E. coli peptidoglycan but loses its activity in the presence of its cognate inhibitor, X-Tfi XAC2610. Therefore, XAC2609 /XAC2610 form a pair of effector/immunity proteins associated with X. citri T4SS. By using the X. citri Δxac2610 strain, has been shown through different microscopic techniques that XAC2610 protects the cell envelope of X. citri against the effects of cellular autolysis promoted by XAC2609 activity. Functional assays based on observations of colony phenotypes and biofilm formation has shown that XAC2610 confers immunity to X. citri against an intrinsic activity of XAC2609. VirD4 is the protein that recognizes the substrates through the interaction with the T4SS secretion signals. In the T4SS of X. citri, is hypothesized that the XVIPCD domain is the secretion signal present in the XVIPs. Here, the biochemical and biophysical aspects of the VirD4-XVIPCD interaction were investigated through Pull- Down, Molecular Exclusion Chromatography, NMR and SAXS assays. It has been shown the AAD domain of VirD4 (VirD4AAD) is associated with specifically interacting with the XAC2609XVIPCD domain (XAC2609XVIPCD), forming a heterodimer in solution. VirD4AAD is a globular and monomeric domain while XAC2609XVIPCD is elongated, but upon interaction with VirD4AAD goes through structural compaction process. Constructs of XAC2609 containing point mutations in the XVIPCD domain were used to perform secretion experiments in X. citri and Isothermal titration calorimetry against VirD4AAD. Through these assays, it has been characterized that a strong interaction between VirD4AAD-XAC2609XVIPCD is essential for secretion of XAC2609 via T4SS. Consequently, these results allow concluding that the XVIPCD domain is the secretion signal of X. citri T4SS substrate and the AAD confer specificity to VirD4 by interact with the XVIPCD domains. Finally, bacterial competitions between E. coli and X. citri showed different phenotypes associated with T4SS function: i) virB5, virB11 knockouts abolish the function of T4SS in X. citri.; ii) knockouts of xac2611 exhibited a higher adaptive efficiency than the wild-type X. citri strain in competitions, but the expression of XAC2611 abolishes the function of T4SS in the wild strain of X. citri; iii) The ATPase activity of VirD4 is essential and exerts a negative dominance over the T4SS function in X.citri.

Os genes relógio são responsáveis pelo ritmo circadiano e homeostase de diversos sistemas biológicos, incluindo o pâncreas endócrino. Nas células β são de grande importância para a regulação do metabolismo e da secreção de insulina (SI), e sua ausência pode levar ao desenvolvimento do diabetes. A NADPH oxidase (NOX) é um complexo enzimático responsável pela produção do ânion superóxido através da redução do oxigênio molecular. Em ilhotas pancreáticas, a NOX participa da regulação do metabolismo da glicose e da SI, através da modulação do estado redox intracelular. O objetivo do nosso estudo foi verificar se a desregulação dos genes relógio mediada pela ausência de Bmal1 seria capaz de modular a NOX e o estado redox nas células β pancreáticas, influenciando assim a SI. Observamos que a ausência de Bmal1 alterou a atividade e expressão da NOX, desregulando o estado redox intracelular. Essas alterações levaram à redução da viabilidade celular e mudanças na resposta à estimulação com glicose, resultando em uma deficiência na principal função da célula β a SI. / Clock genes are responsible for homeostasis and circadian rhythm in various biological systems, including endocrine pancreas. In β -cells, they are important for the regulation of metabolism and insulin secretion (IS), and its absence can lead to development of diabetes. NADPH oxidase (NOX) is an enzymatic complex responsible for production of superoxide anion by reducing molecular oxygen. In pancreatic islets, NOX regulates glucose metabolism and IS through modulation of the intracellular redox state. The aim of our study was to investigate whether dysregulation of clock genes mediated by Bmal1 suppression would be able to modulate NOX activity and redox state in pancreatic β cells, thus influencing the SI. In this work, the lack of Bmal1 altered the activity and expression of NOX, deregulating the intracellular redox state. These changes led to reduced cell viability and changes in cell response after stimulation with glucose, resulting in a deficiency in β cell main function, GSIS.

O aparecimento de cepas microbianas com resistência aos antibióticos comumente usados em âmbito mundial constitui um sério problema de saúde pública, estimulando a busca por novos compostos antimicrobianos para os quais a resistência ainda não foi adquirida. A secreção cutânea de várias espécies de anuros (rãs, sapos e pererecas) é uma rica fonte de peptídeos com amplo espectro de atividade antibacteriana e antifúngica, com grande potencial para o desenvolvimento de fármacos. O presente trabalho visou à investigação da presença de agentes antimicrobianos na secreção cutânea das espécies brasileiras Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. Utilizando a estimulação mecânica do tegumento para extração e posteriormente a liofilização dessas secreções. Os testes antimicrobianos foram realizados através da técnica de disco difusão, onde as secreções testadas foram solubilizadas em diferentes solventes e em placas contendo bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. As secreções com maior potencial antibacteriano foram fracionadas por Cromatografia líquida de alta eficiência fase reversa em uma coluna C8 e C18 5μm. Tendo suas frações também testadas em disco-difusão. As frações que formaram halos de inibição foram submetidas à espectrometria de massa para a identificação de suas moléculas. Desta forma foi comprovado a ação antimicrobiana das secreções de Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri e Trachycephalus resinifictrix e de suas receptivas frações. / The appearance of microbial strains that are resistant to common antibiotics used in a global scope represents a serious public health issue, stimulating the search for new antimicrobial compounds that resistance was not acquired yet. The cutaneous secretion of several anurans species (frogs, toads and tree frogs) is a rich source of peptides with a broad spectrum of antimicrobial and antifungal activity, with a big potential to drug development. The present work aimed the investigation of the presence of antimicrobial agents in the cutaneous secretion of the Brazilian species Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. For the extraction of these secretions it was utilized the integument mechanical stimulation and later on these secretions were lyophilized. For the antimicrobial tests it was used the disk diffusion technique, where the test secretions were solubilized in different solvents and in plates containing Gram-negative and Gram-positive bacteria. The secretions with the highest antimicrobial potential were fractionated by a high-performance liquid chromatography reverse phase in the columns C8 and C18 5μm. These fractions were also tested in disk diffusion. The fractions that formed inhibition zones were submitted to mass spectrometry for the identification of their molecules. This way it was evidenced antimicrobial activity of secretions from Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri and Trachycephalus resinifictrix and from their respective fractions.

A via de amplificação da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) é um fenômeno discutido na literatura, cujos componentes são amplamente debatidos. Evidências sugerem que a condutância a Cl- compõe parte desta via. Porém, o mecanismo pelo qual essa condutância desempenharia papel na via de amplificação ainda é debatido, e, além disso, as ferramentas farmacológicas para estudo dessas afeta o transporte de outros ânions, como bicarbonato (HCO3-). Buscamos neste trabalho compreender a contribuição do transporte desses ânions para a via de amplificação da GSIS levando em consideração a distribuição de Cl- e HCO3- extracelular em células INS-1E. Concluímos que o transporte de ânions nas células INS-1E não contribui para a via de amplificação da GSIS, porém essas células não expressaram os canais CFTR e Anoctamina 1 que foram relacionados com esse fenômeno. Acreditamos que em células secretoras de insulina que expressem esses canais, o transporte de ânions possua alguma relevância funcional. / The amplification pathway of glucose stimulated insulin secretion (GSIS) is a phenomenon discussed in the literature, which components are broadly debated. Evidence suggests that Cl- conductance composes part of this pathway. However, the mechanism that this conductance would play role on the amplification pathway still is debated, and, besides that, the pharmacological tools to study these affects transport of other anions, such as bicarbonate (HCO3-). We aimed in this study to understand the contribuition of anion transport for the amplification of GSIS considering the Cl- and HCO3- extracellular distribuition in INS-1E cells. We concluded that anion transport in INS-1E cell line do not contribute for the amplification pathway of GSIS, however those cells do not express CFTR and Anoctamin 1 channels which were related with this phenomenon. We believe that in insulin secretin cells that express those channels, the anion transport may have a functional relevance.

O sorotipo O125ac:H6 compreende amostras de Escherichia coli enteropatogênica atípicas que apresentam o padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2. A construção de um banco de mutantes da amostra protótipo Ec292/84 com o transposon TnphoA gerou quatro mutantes não aderentes. O objetivo deste estudo foi a caracterização genotípica e fenotípica desses mutantes. As regiões adjacentes à inserção do TnphoA no mutante Ec2921/84::01 foram amplificadas, clonadas e seqüenciadas, revelando que a inserção do TnphoA ocorreu no gene secD, parte do sistema de secreção de proteínas do tipo 2 (SST2). O perfil de proteínas de membrana externa (OMP) dos mutantes, em comparação com a amostra selvagem, revelou a ausência de proteínas de 21 e 30 kDa nos mutantes. Um antissoro obtido contra o extrato de OMP da amostra protótipo inibiu o padrão AA e reconheceu a proteína de 30 kDa em immunoblottings com extratos de OMP. Esses dados indicam que esta proteína está envolvida no estabelecimento do padrão AA de E. coli O125ac:H6 e que essa proteína é transportada através do SST2. / The serotype O125ac:H6 comprises atypical Enteropathogenic Escherichia coli strains that express the aggregative adherence (AA) pattern to HEp-2 cells. We obtained four nonadherent mutants using TnphoA insertion in the Ec292/84 strain. The aim of this study was the genetic and phenotypic characterization of these mutants. The genetic analysis of the mutants revealed that the insertion of TnphoA ocurred in the secD gene, part of the bacterial type 2 secretion system (T2SS). The mutant outer membrane proteins (OMP) profile, in comparison to the prototype strain, demonstrated the lack of expression of proteins of 21 and 30 kDa in the mutant profile. An antiserum raised against the OMP extract of the prototype strain, in addition to inhibit the AA pattern, recognized the 30 kDa protein in immunoblotting assays with OMP extract. These data indicate this OMP is involved in the establishment of the AA pattern presented by the atypical EPEC strains of the O125ac:H6 serotype, and that this protein is transported via the T2SS.