Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016.pdf: 1206354 bytes, checksum: fc07f54941a23475ae348908f318c08a (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / As serpinas são conhecidos inibidores de serino proteases, enzimas notáveis por participarem de inúmeros processos fisiológicos importantes. A proteólise não regulada pode levar ao surgimento de doenças e problemas funcionais e, portanto, a função dos inibidores é fundamental para o bom funcionamento do organismo. No genoma da cana-de-açúcar foi identificada uma ORF (Open Reading Frame) que codifica uma serpina. Visto que essa planta é de grande importância para a economia brasileira e muitos trabalhos vêm sendo desenvolvidos visando à melhora da produção e estratégias de defesa contra parasitas e, dado que na literatura não se tem descrita nenhuma serpina de cana-de-açúcar, o objetivo desse trabalho foi caracterizar uma serpina presente nessa planta, denominada cana-serpina. Para isso, a ORF contida no clone SCJLRT1015H07.g foi isolada e subclonada para posterior expressão recombinante e purificação da proteína. A canaserpina recombinante pura foi capaz de inibir a atividade enzimática da quimiotripsina e tripsina, com um valor de IC50 de 0,46 e 0,50 μM, respectivamente. Além disso, a formação do complexo covalente SDS-estável foi visualizado no ensaio com tripsina, embora fracamente e no ensaio com a quimiotripsina foi possível visualizar apenas um possível complexo clivado. Portanto, esse trabalho procura contribuir para a identificação e caracterização da primeira serpina descrita para a cana-de-açúcar e trabalhos posteriores poderão identificar a especificidade em relação a outras enzimas, buscando relacioná-las a possíveis alvos endógenos.

As serino-proteases autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATE) constituem uma família de proteases secretadas pelo sistema de secreção do tipo V, cujos genes foram estudados em Escherichia coli intestinal e extra-intestinal. Sat é uma SPATE citotóxica de 107 kDa, cujo gene foi identificado pela primeira vez em UPEC isolada da urina de um paciente com pielonefrite. A maioria dos estudos envolvendo Sat foram realizados em células renais e da bexiga, embora seu gene seja encontrado em DAEC, EAEC e, mais recentemente, em amostras bacterianas isoladas de septicemia neonatal e meningite. Os objetivos deste trabalho foram: i) purificar Sat; ii) determinar a ação da Sat purificada em diferentes tipos celulares e iii) caracterizar o papel de Sat na infecção in vitro por EAEC. Desta foram, a presença de Sat nos sobrenadantes do cultivo das cepas EAEC CV323 e DEC/Sat, isoladas de diarreia, foi confirmada por LC-MS/MS. Sat foi purificada da cultura de DEC/Sat+ e utilizada para a obtenção de anticorpos anti-Sat em coelho. O efeito citotóxico de Sat purificada foi investigado em células derivadas do endotélio (HUVEC) e do sistema urinário (Y1, LLC-PK1 e HEK-293) e gastrointestinal (Caco-2). Os parâmetros citotóxicos analisados foram: o descolamento celular e alterações na morfologia, permeabilidade e metabolismo mitocondrial das células. Para investigar o papel de Sat na infecção por EAEC, células Y-1 foram infectadas com EAEC CV323 e DEC/Sat+ na presença ou ausência de PMSF (inibidor de serino-protease) e anticorpos anti-Sat. Os parâmetros de citotoxicidade analisados nas culturas infectadas foram descolamento celular e alteração na morfologia. Os resultados demonstraram que: i) Sat é secretada por EAEC CV323 e DEC/Sat+ e, em ambas as cepas, há duas mutações em resíduos de aminoácidos que não interferiram na atividade enzimática; ii) as células do endotélio são mais sensíveis à Sat do que as células derivadas do trato urinário, sendo a linhagem gastrointestinal a mais resistente; iii) Sat secretada por EAEC CV323 durante a infecção induziu intenso dano celular, o qual, em presença de anticorpos anti-Sat e PMSF foi reduzido em cerca de 80 a 90%, respectivamente. Este é o primeiro trabalho que demonstra a expressão de Sat pela EAEC e a ação da toxina em células endoteliais sugerindo que o papel de Sat possa ser mais amplo na patogenia do que o proposto até o momento. / The serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae (SPATEs) constitute a family of proteases secreted by the type V secretion system whose genes have been studied in intestinal and extra intestinal Escherichia coli. Sat is a 107 kDa cytotoxic SPATE and its gene was first identified in UPEC isolated from the urine of a patient with pyelonephritis. Most studies involving Sat were performed in renal and bladder cells, although the gene encoding Sat is encountered in other strains of E. coli such as DAEC, EAEC and more recently, in bacterial samples isolated from neonatal septicemia and meningitis. The objectives of this work were: i) purify Sat; ii) to determine the action of Sat in different types of cells and iii) to characterize in vitro the role of Sat in EAEC infection. Accordingly, the presence of Sat in the culture supernatant of EAEC CV323 and DEC/Sat+ derived from diarrhea was confirmed by LCMS/MS. Sat was purified from the culture of DEC/Sat+ and utilized to produce rabbit antibodies anti-Sat. The cytotoxic effect of Sat was investigated in cells derived from the endothelium (HUVEC) and the urinary (Y1, LLC-PK1, HEK-293) and gastrointestinal (Caco-2) systems. The cytotoxic parameters analyzed were cellular detachment and alterations in the morphology, permeability and mitochondrial metabolism of the cells. To investigate the role of Sat in EAEC infection, Y-1 cells were incubated with EAEC CV323 and DEC/Sat+ in the presence or absence of PMSF (a serine protease inhibitor) and rabbit antibodies anti-Sat. The parameters analyzed were cellular detachment and alteration in the morphology of the cells. The results demonstrated that: i) Sat is secreted by EAEC CV323 and DEC/Sat + and in both strains there are two mutations in amino acid residues that did not interfere with enzymatic activity; ii) endothelium cells are more sensitive to the Sat effect than the cells derived from urinary tract system, being the gastrointestinal cell lineage the most resistant one; iii) Sat secreted by EAEC CV323 during infection induced intense cellular damage which in the presence of anti-Sat antibodies and PMSF was reduced in about 80 to 90%, respectively. This is the first work demonstrating the expression of Sat by EAEC and the action of the toxin on endothelial cells suggesting that the role of Sat may be broader in pathogenesis than has been proposed so far.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Aranhas do gênero Loxosceles, são responsáveis por acidentes em todo o mundo, com grande importância clínica no Sul do Brasil. Os venenos destas aranhas são compostos por diversas toxinas, entre elas proteínas, responsáveis pelo quadro conhecido como loxoscelismo. No intuito de descrever o perfil transcricional da glândula produtora de veneno da aranha Loxosceles intermedia geramos uma biblioteca de cDNA bastante ampla e seus transcritos foram funcionalmente caracterizados. Após o processamento inicial das sequências, 1.843 ESTs (Expressed Sequence Tags) apresentavam qualidade suficiente para as análises posteriores. Estas sequências foram montadas em 538 clusters, sendo que 281 eram singletons. Após análises de similaridade, mais de 50% das ESTs demonstraram algum grau de semelhança com proteínas conhecidas. As análises de similaridade também demonstraram que os transcritos que codificavam para toxinas, perfaziam 43% de todas as sequências e abrangem uma parte significativa das ESTs. As toxinas mais frequentes foram anotadas como pertencentes à família LiTx de toxinas inseticidas. As fosfolipases-D e as metaloproteases semelhantes à astacinas perfazem, cada uma, cerca de 9% do total de transcritos. Componentes tóxicos tais como inibidores de serino-proteases, hialuronidase e proteínas alergênicas foram também identificadas, porém com menor representação. Quase 10% das ESTs codificam para proteínas envolvidas em processos celulares. O presente trabalho descreve também as etapas para clonagem, expressão heteróloga e purificação de um transcrito semelhante a um inibidor de serino-protease, identificado na biblioteca de cDNA. É sabido que proteínas desta família apresentam um grande potencial de aplicação como drogas antitrombóticas, atuando como agentes terapêuticos que influenciam a atividade de fatores de coagulação. Esses dados fornecem uma visão global do perfil de expressão da glândula de veneno de L. intermedia, revelam diferenças significantes entre venenos de aranhas do gênero Loxosceles e descrevem a produção de uma nova toxina recombinante. / Loxosceles genus spiders are responsible for accidents all over the world and have clinical importance in the South of Brazil. The venom of these spiders is made up of several toxins, including proteins, which are responsible for the clinical pattern called loxoscelism. To describe the transcriptional profile of the L. intermedia venom gland, we generated a wide cDNA library, and its transcripts were functionally and structurally analyzed. After initial analyses, 1,843 ESTs produced readable sequences that were grouped into 538 clusters, 281 of which were singletons. Nine hundred eighty-five reads (53% of total ESTs) matched to known proteins. Similarity searches showed that toxinencoding transcripts totalize 43% of the total library and comprise a great number of ESTs. The most frequent toxins were from the LiTx family, which are known for their insecticidal activity. Both phospholipase-D and astacin-like metalloproteases toxins account for approximately 9% of total transcripts. Toxins components such as serine proteases, hyaluronidases and venom allergens were also found but with minor representation. Almost 10% of the ESTs encode for proteins involved in cellular processes. This work also describes the stages for cloning, heterologous expression and purification of a cDNA similar to a protease inhibitor identified in the cDNA library. It is known that proteins belonging to this family have an application potential as antithrombotic drugs, acting as therapeutic agents that influences the activity of coagulation factors. These data provide an important overview of the L. intermedia venom gland expression scenario, revealed significant differences from profiles of other spiders from the Loxosceles genus and describe the production of a novel recombinant toxin. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / O Feijão Caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) é uma leguminosa com importante representatividade econômica e nutricional, especialmente no Brasil. Inibidores de serino proteases, como a tripsina, já foram descritos na espécie, assim como em outras plantas. No entanto, nesta espécie, ainda não foram identificados inibidores que apresentem atividade sobre a elastase de neutrófilos humana (HNE), protease envolvida em muitos processos patológicos, como na instalação e progressão da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Nesse estudo, purificamos um inibidor a partir do extrato protéico de Vigna unguiculata que apresenta atividade sobre HNE. Inicialmente, foi realizado o processo de extração alcalina de proteínas, seguido de três passos cromatográficos distintos, utilizando as colunas Hitrap-Q (Troca-iônica), Source15RPC (Fase-Reversa) e ACE18 (Fase-Reversa). Essas etapas foram acompanhadas por testes de atividade inibitória, utilizando os substratos fluorogênicos Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (Elastase) e Z-Phe-Arg-MCA (Tripsina), além de ensaios da quantificação de concentração total de proteínas. Para determinar a massa do inibidor, foram utilizadas as técnicas de espectrometria de massa por MALDI-TOF e SDS-PAGE, o inibidor apresenta massa molecular de 10,99 KDa. O Ki para HNE foi determinado no valor de 9 pM. O inibidor não apresentou atividade inibitória sobre tripsina e trombina, porém foi observada atividade sobre subtilisina e quimotripsina. Estes dados indicam que o inibidor purificado trata-se de uma molécula ainda não caracterizada, devido às suas atividades inibitórias o nomeamos de Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI). / The cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) is a legume of important economic and nutritional representativeness, especially in Brazil. Serine protease inhibitors, such as trypsin, have been described in many species, as well as in other plants. In this specie an inhibitor with activity on human neutrophil elastase (HNE) has not yet been identified. This protease is involved in many pathological processes, such as the onset and progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). We purified and characterized an inhibitor from the protein extract of Vigna unguiculata presenting activity towards HNE. Firstly, we performed the alkaline extraction procedure for proteins followed by three different chromatographic steps using Hitrap Q (ion exchange), Source15RPC (Reversed-Phase) and ACE18 (Reversed Phase) columns. These steps were followed by the inhibitory activity tests using fluorogenic substrates, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (elastase) and Z-Phe-Arg-MCA (trypsin), and quantitation assays of protein concentration. To determinate the size of the molecule, we used MALDI-TOF mass spectrometry and SDS-PAGE. The molecular mass of the inhibitor was 10,99 kDa. The dissociation constant (Ki) toward HNE was 9 pM. HNE inhibitor showed no inhibitory activities toward trypsin and thrombin. However, the inhibitor presented activity toward subtilisin and chymotrypsin. These datas indicate that this molecule is a novel inhibitor to HNE and we named it Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI).

A asma ocupacional é a forma mais comum de doença pulmonar relacionada ao trabalho e vários dos casos reportados estão correlacionados à exposição de proteases. A serino protease subtilisina foi bastante utilizada na década de 60 e foi a principal responsável pela alta incidência de asma na indústria de detergente. Este projeto visou a desenvolver um modelo murino de inflamação alérgica pulmonar à subtilisina e caracterizar os mecanismos principais envolvidos nessa resposta. A sensibilização e desafio com subtilisina induziu doença alérgica pulmonar, verificada pela eosinofilia às vias aéreas, produção de muco, IgE total, hiper reatividade brônquica e produção de citocinas tipo II no pulmão. Estas respostas foram dependentes da atividade enzimática da subtilisina, PAR-2, receptor de IL-33 ST2, IL-1R e da sinalização via MyD88. Em conjunto, nossos resultados estabelecem um novo modelo experimental de asma ocupacional induzida por subtilisina e fornece os principais mecanismos moleculares responsáveis pela inflamação alérgica. / Occupational asthma is the most common form of pulmonary disease related to work. Most of occupational asthma cases reported are strictly correlated with proteases exposure. Serine protease subtilisin was widely used in the detergent industry during the 60s, which resulted in increased incidence of occupational asthma. We aimed to develop and characterize a murine model of occupational asthma using subtilisin as allergen. Briefly, sensitization and challenge with subtilisin triggered lung allergic inflammation, as accessed by eosinophilic influx to the airways, mucus production, and increased levels of type II cytokines. Subtilisin induced total IgE and airway hyperactivity. Allergic responses to subtilisin were dependent on its serine protease activity, protease-activated receptor (PAR)-2, IL-33 receptor ST2, IL-1R, and Myd88 signaling. Together, these data establish a new murine model of occupational asthma induced by subtilisin and provide the main molecular mechanisms responsible for allergic inflammation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-09-15Bitstream added on 2014-06-13T21:03:48Z : No. of bitstreams: 1 provazzi_pjs_dr_sjrp.pdf: 1081709 bytes, checksum: 9a35b9ad50fc4eed266a481d830f02de (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A proteína NS3 apresenta dois domínios e é bifuncional. Apresenta três funções enzimáticas que são; 1) atividade de protease; 2) NTPase e 3) helicase. A função protease relaciona-se a tradução da proteína precursora e as funções NTPase e helicase tem grande participação na replicação do material genético viral. Trata-se de uma molécula essencial para o processamento da poliproteína precursora e também para a replicação viral e portanto, um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas antivirais. No domínio Protease foram evidenciadas substituições na tríade catalítica e na região de ligação ao íon zinco nos pacientes avaliados. Estas substituições, quando somadas podem explicar a resposta ao tratamento. Também foram visualizadas alterações na porção Helicase da NS3. As substituições ocorreram nos sítios de ligação ao ATP e ao RNA. Outros resíduos da Helicase relevantes para o desenvolvimento de inibidores, como R2133 e F258 e F264 não apresentaram substituições, evidenciando tratarem-se de aminoácidos conservados nessa região. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem informações sobre o perfil genético do vírus HCV do genótipo 3 especificamente da região codificadora da proteína NS3, permitindo o conhecimento do genoma viral e a identificação de regiões para ligação de possíveis inibidores. Este projeto certifica que a modelagem é uma ferramenta útil para a biologia estrutural e funcional, e que os modelos obtidos aqui contribuem para o desenho de novas drogas anti-virais específicas para o genótipo 3 do vírus HCV / The NS3 protein has two domains and is bifuntional. It presents three functions: 1) protease activity, 2) NTPase and 3) helicase. The protease function is related to the translation of the poliprotein precursor and functions NTPase and helicase has great participation in the replication of the viral genetic material. So. The NS3 is considered the major target for the development of antiviral drugs. In the Protease portion substitutions were evidenced in catalytic triad and the zinc ion binding sites, in the patients evaluated. These substitutions, when added up can explain the response to treatment. Also were observed changes in Helicase portion of NS3. The substitutions took place on ATP and RNA binding sites. Other residues of Helicase relevant to the development of inhibitors, as R2133 and F258 and F264, showed no substitutions, highlighting the great conservation of amino acids in this region. The results obtained in this work provide information on the genetic profile of the HCV virus genotype 3, specifically the region of NS3 protein, allowing the knowledge of the viral genome and the identification of regions for possible connection of inhibitors. This project certifies that the modeling is a useful tool for structural biology and functional, and that the models obtained here contribute to the design of new anti-viral drugs specific to the genotype 3 of HCV virus

A asma ocupacional é a forma mais comum de doença pulmonar relacionada ao trabalho e vários dos casos reportados estão correlacionados à exposição de proteases. A serino protease subtilisina foi bastante utilizada na década de 60 e foi a principal responsável pela alta incidência de asma na indústria de detergente. Este projeto visou a desenvolver um modelo murino de inflamação alérgica pulmonar à subtilisina e caracterizar os mecanismos principais envolvidos nessa resposta. A sensibilização e desafio com subtilisina induziu doença alérgica pulmonar, verificada pela eosinofilia às vias aéreas, produção de muco, IgE total, hiper reatividade brônquica e produção de citocinas tipo II no pulmão. Estas respostas foram dependentes da atividade enzimática da subtilisina, PAR-2, receptor de IL-33 ST2, IL-1R e da sinalização via MyD88. Em conjunto, nossos resultados estabelecem um novo modelo experimental de asma ocupacional induzida por subtilisina e fornece os principais mecanismos moleculares responsáveis pela inflamação alérgica. / Occupational asthma is the most common form of pulmonary disease related to work. Most of occupational asthma cases reported are strictly correlated with proteases exposure. Serine protease subtilisin was widely used in the detergent industry during the 60s, which resulted in increased incidence of occupational asthma. We aimed to develop and characterize a murine model of occupational asthma using subtilisin as allergen. Briefly, sensitization and challenge with subtilisin triggered lung allergic inflammation, as accessed by eosinophilic influx to the airways, mucus production, and increased levels of type II cytokines. Subtilisin induced total IgE and airway hyperactivity. Allergic responses to subtilisin were dependent on its serine protease activity, protease-activated receptor (PAR)-2, IL-33 receptor ST2, IL-1R, and Myd88 signaling. Together, these data establish a new murine model of occupational asthma induced by subtilisin and provide the main molecular mechanisms responsible for allergic inflammation.