Les astrocytes sont des cellules gliales du système nerveux central, essentielles à la formation des synapses, à la barrière hémato-encéphalique ainsi qu’au maintien de l'homéostasie. Récemment, les astrocytes ont été identifiés comme éléments clés du traitement de l'information dans le système nerveux central. Les astrocytes peuvent communiquer avec les neurones au niveau des synapses et moduler la communication neuronale en libérant des gliotransmetteurs et en absorbant des neurotransmetteurs. L’utilisation de nouvelles techniques comme la microscopie à super-résolution et les indicateurs calciques encodés génétiquement a permis de révéler une grande diversité spatio-temporelle des signaux calciques astrocytaires. La majorité de ces signaux sont observés au sein de leurs prolongements cellulaires, qui sont le site de communication entre neurones et astrocytes. Ces prolongements sont trop fins pour être observés en microscopie optique conventionnelle, de sorte que la microscopie à super-résolution et la modélisation informatique sont les seules méthodes adaptées à leur étude. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour but d’étudier l'effet des propriétés spatiales (telles que la géométrie cellulaire, les distributions moléculaires et la diffusion) sur les signaux calciques dans les prolongements astrocytaires. Historiquement, les signaux calciques ont été modélisés à l'aide d'approches déterministes non spatiales. Ces modèles ont permis l'étude des signaux calciques à l’échelle de la cellule entière voire à l’échelle du réseau de cellules. Ces méthodes ne prennent cependant pas en compte la stochasticité inhérente aux interactions moléculaires ainsi que les effets de diffusion, qui jouent un rôle important dans les petits volumes. Cette thèse présente un modèle stochastique et spatial qui a été développé dans le but d’étudier les signaux calciques dans les prolongements fins astrocytaires. Ce travail a été réalisé en collaboration avec des expérimentateurs, qui nous ont fourni des données de microscopie électronique et à super-résolution. Ces données ont permis de valider le modèle. Les simulations du modèle suggèrent que (1) la diffusion moléculaire, fortement influencée par la concentration et la cinétique des buffers calciques endogènes et exogènes, (2) l'organisation spatiale intracellulaire des molécules, notamment le co-clustering des canaux calciques, (3) la géométrie du reticulum endoplasmique et sa localisation dans la cellule, (4) la géométrie cellulaire influencent fortement les signaux calciques et pourraient être responsables de leur grande diversité spatio-temporelle. Ces travaux contribuent à une meilleure compréhension du traitement de l’information par les astrocytes, un prérequis pour une meilleure compréhension de la communication entre les neurones et les astrocytes ainsi que de son influence sur le fonctionnement du cerveau. / Astrocytes are predominant glial cells in the central nervous system, which are essential for the formation of synapses, participate to the blood-brain barrier and maintain the metabolic, ionic and neurotransmitter homeostasis. Recently, astrocytes have emerged as key elements of information processing in the central nervous system. Astrocytes can contact neurons at synapses and modulate neuronal communication via the release of gliotransmitters and the uptake of neurotransmitters. The use of super-resolution microscopy and highly sensitive genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) has revealed a striking spatiotemporal diversity of Ca2+ signals in astrocytes. Most astrocytic signals occur in processes, which are the sites of neuron-astrocyte communication. Those processes are too fine to be resolved by conventional light microscopy so that super-resolution microscopy and computational modeling remain the only methodologies to study those compartments. The work presented in this thesis aims at investigating the effect of spatial properties (as e.g cellular geometry, molecular distributions and diffusion) on Ca2+ signals in those processes, which are deemed essential in such small volumes. Historically, Ca2+ signals were modeled with deterministic well-mixed approaches, which enabled the study of Ca2+ signals in astrocytic networks or whole-cell events. Those methods however ignore the stochasticity inherent to molecular interactions as well as diffusion effects, which both play important roles in small volumes. In this thesis, we present the spatially-extended stochastic model that we have developed in order to investigate Ca2+ signals in fine astrocytic processes. This work was performed in collaboration with experimentalists that performed electron as well as super-resolution microscopy. The model was validated against experimental data. Simulations of the model suggest that (1) molecular diffusion, strongly influenced by the concentration and kinetics of endogenous and exogenous buffers, (2) intracellular spatial organization of molecules, notably the co-clustering of Ca2+ channels, (3) ER geometry and localization within the cell, (4) cellular geometry strongly influence Ca2+ dynamics and can be responsible for the striking diversity of astrocytic Ca2+ signals. This work contributes to a better understanding of astrocyte Ca2+ signals, a prerequisite for understanding neuron-astrocyte communication and its influence on brain function.

Les cytokines jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire ; elles modulent les propriétés et la survie de nombreuses cellules immunitaires. Les lymphocytes T (LT) sont régulés par un large spectre de cytokines. Néanmoins certaines sous-populations de LT restent peu définies à ce jour tout comme l’impact de cytokines sur ces cellules en conditions physiologiques et pathologiques. Une population de LT caractérisée par la double expression des corécepteurs CD4 et CD8 a été identifiée en périphérie chez des donneurs sains et sa fréquence est augmentée chez les patients atteints de certaines pathologies. Cependant, peu d’études ont déterminé le phénotype et les fonctions de ces cellules. Nous avons caractérisé le phénotype ex vivo des LT CD4+CD8+ issus de sujets sains et étudié la réponse de ces cellules à plusieurs cytokines importantes dans l’homéostasie et l’activation des lymphocytes. Notre étude révèle que les LT CD4+CD8+ forment une population hétérogène présentant de nombreuses caractéristiques des cellules mémoires. De plus, notre étude montre que ces cellules ont une capacité accrue de produire des cytokines et enzymes lytiques comparée aux LT CD4 et CD8. Finalement, nous avons observé qu’une plus grande proportion de LT CD4+CD8+ répond aux cytokines IL-2, IL-15 et IL-7 comparée aux LT CD4 et CD8 simples positifs. Plusieurs études ont révélé que certaines cytokines participent à la pathobiologie de maladies auto-immunes notamment la sclérose en plaques (SEP). La SEP est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une destruction de la gaine de myéline et une perte axonale à l’origine des symptômes cliniques. L’impact des médiateurs immunitaires dans la destruction et/ou la réparation reste néanmoins à éclaircir. Plusieurs études suggèrent que l’interleukine-27 (IL-27) joue un rôle central dans la SEP : l’IL-27 diminue la sévérité de la maladie dans un modèle murin de la SEP ; la réponse des patients à certaines thérapies corrèle avec des niveaux périphériques élevés d’IL-27. Notre étude avait pour but de déterminer comment l’IL-27 module les LT des patients atteints de SEP. Nous avons observé des niveaux d’IL-27 augmentés à la fois en périphérie et dans le SNC des patients SEP. Nous avons mis en évidence que les effets induits par l’IL-27 sont altérés dans les LT des patients SEP ; notamment l’induction de PD-L1 et la réponse à l’IL-12 sont plus faibles comparées aux LT de sujets sains. La voie de signalisation STAT3 est induite plus fortement en réponse à l’IL 27 dans les cellules de patients SEP en comparaison à celles de sujets sains. Finalement, nous avons démontré que la forme soluble du récepteur à l’IL-27 est présente en plus grande quantité dans le sérum des patients SEP et ces niveaux sont suffisants pour bloquer l’effet de l’IL-27 sur ses cellules cibles. En conclusion, nos résultats permettent de mieux comprendre comment certaines cytokines participent à la régulation des populations lymphocytaires. En condition pathologique, la modulation de ces cytokines pourrait s’avérer efficace dans un but thérapeutique afin de promouvoir et/ou inhiber certaines réponses immunitaires notamment dans la SEP. / Cytokines play an essential role in modulating the immune response. They act on cells from both innate and adaptive immunity by modulating their phenotype and influencing their survival. T cells are highly regulated by a broad spectrum of cytokines. Nevertheless, some subsets of T cells remain ill-defined and a better understanding of cytokine-mediated responses in physiological and pathological conditions requires further investigation. A T cell population characterized by the dual expression of CD4 and CD8 co-receptors has been identified in the periphery of healthy donors and its frequency is notably increased in several pathologies. However, very few studies have determined the phenotype and functions of these cells under physiological conditions. We performed an ex vivo phenotypic characterization of CD4+CD8+ T cells from healthy subjects and analyzed the response of these cells to several important cytokines implicated in homeostasis and activation of immune cells. Our study reveals that CD4+CD8+ T cells are heterogeneous and exhibit many characteristics of memory cells. In addition, our study shows that these cells have an enhanced ability to produce cytokines and lytic enzymes compared to CD4 and CD8 T cells. Finally, we found that a higher proportion of CD4+CD8+ T cells respond to IL-2, IL-15 and IL-7 cytokines compared to CD4 and CD8 counterparts. Numerous studies showed that lymphocyte populations and some cytokines are involved in the development of several autoimmune diseases, including multiple sclerosis (MS). MS is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS) characterized by the destruction of the myelin sheath, axonal loss and oligodendrocytic death leading to clinical symptoms. The immune mediators involved in the destruction and/or repair remain to be clarified. Several studies suggest that interleukin-27 (IL-27) plays a central role in MS: IL-27 dampens the severity of the disease in a MS mouse model and in MS patients the response to some therapies correlates with higher levels of peripheral IL-27. The purpose of our study was to determine how IL-27 modulates T cells in MS patients. We observed that IL-27 levels are increased in both periphery and CNS of MS patients. We found that IL-27-mediated effects are impaired in T cells from MS patients in particular PD-L1 induction and IL-12 response that are lower compared to T cells from healthy subjects. IL-27-triggered STAT3 signaling pathway is also enhanced in cells from MS patients compared to healthy subjects. Finally, our study showed that the soluble form of the receptor of IL-27 is present in greater levels in the serum of MS patients and the measured doses are sufficient to block the capacity of IL-27 to act on its target cells. To conclude, our results provide a better understanding of how certain cytokines participate in the regulation of lymphocyte populations. Under pathological conditions, modulation of these cytokines may be effective for therapeutic applications in order to promote and/or inhibit immune responses, particularly in MS.

Les lymphocytes T orchestrent la réponse immunitaire adaptative afin de nous protéger contre les pathogènes. Les lymphocytes T sont dotés d’un récepteur de surface, le récepteur de cellules T (TCR), qui transmet le signal de stimulation vers l’intérieur de la cellule afin d’amorcer la cascade d’activation des cellules T. Le TCR est un complexe multimérique composé des dimères TCRαβ, CDεγ, CD3εδ et CD3ζζ. Les chaînes TCRαβ reconnaissent les antigènes pathogéniques tandis que les chaînes CD3 initient la cascade de signalisation des cellules T par la phosphorylation de leurs chaînes cytoplasmiques. Il est toujours incompris comment le signal d’activation du TCR est transmis des chaînes TCRαβ jusqu’aux domaines cytoplasmiques des chaînes CD3. Chez les lymphocytes T au repos, les chaînes CD3ε et CD3ζ sont associées au feuillet interne de la membrane plasmique (MP). Le domaine cytoplasmique de CD3ε et CD3ζ est riche en acides aminés basiques, ce qui permet leur association électrostatique avec les phospholipides acides de la MP. La phosphatidylsérine (PS) est le phospholipide acide le plus abondant de la MP. La PS est redistribuée exclusivement à la face cytoplasmique de la MP. Lors de l’activation des lymphocytes T, les chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs doivent se détacher de la PS pour leur phosphorylation. La dissociation membranaire d’un grand nombre de chaînes CD3 est essentielle à l’amplification de l’activation des lymphocytes T. Un mécanisme de dissociation des chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs proposé dans la littérature est par l’élévation intracellulaire de calcium. Un influx robuste de calcium est généré suivant la stimulation des cellules T. En plus d’être essentiel à l’activation efficace des cellules T, il a été proposé que le calcium neutralise les phospholipides acides de la MP afin de dissocier les chaînes CD3. Le calcium est également un co-facteur dans l’activité de plusieurs enzymes, comme la scramblase lipidique TMEM16F. TMEM16F redistribue la PS à la MP suivant l’élévation du calcium intracellulaire, ce qui résulte en la réduction de la PS au feuillet interne. Nous avons donc émis l’hypothèse que le calcium régule la dissociation des chaînes CD3 par l’activation de TMEM16F. Notre étude démontre que la redistribution calcium-dépendante de la PS par TMEM16F est essentielle à la dissociation membranaire de CD3ε dans la lignée de cellules T Jurkat. La réduction de l’expression de TMEM16F par ARN interférant (shTMEM16F) empêche la dissociation massive des chaînes CD3ε suivant la stimulation des cellules T. De plus, les cellules shTMEM16F démontrent une diminution de la phosphorylation des molécules de signalisation des cellules T. En contraste, l’expression d’une forme constitutivement active de TMEM16F augmente la redistribution de PS à la MP, la dissociation membranaire des chaînes CD3ε et la phosphorylation des molécules de signalisation. Notre étude démontre que la redistribution de la PS par la scramblase calcium-dépendante TMEM16F régule la dissociation membranaire des chaînes CD3 du TCR afin d’amplifier l’activation des cellules T. Enfin, nous avons confirmé les défauts d’activation dans des cellules T murines primaires exprimant shTMEM16F lors d’une réponse immunitaire. En conclusion, notre étude démontre le rôle de la régulation de la PS dans l’activation des cellules T. Nous avons démontré que nous pouvons modifier le niveau d’activation des cellules T en modulant la PS à la MP. Nos résultats ont ainsi plusieurs implications pour la conception et l’amélioration des immunothérapies basées sur les cellules T. / T lymphocytes protect us against pathogens by orchestrating the adaptive immune response. T lymphocytes possess a specific surface receptor, the T cell receptor (TCR), which conveys the stimulation signal towards the cytoplasm for the initiation of the T cell activation cascade. The TCR is a multimeric complex composed of the TCRαβ, CDεγ, CD3εδ and CD3ζζ dimers. The TCRαβ chains recognize the pathogenic antigens while the CD3 chains initiate the T cells signaling cascade through the phosphorylation of their cytoplasmic tails. It is not yet understood how the TCR activating signal is transmitted through the membrane from the TCRαβ chains towards the cytoplasmic tails of the CD3 chains. In resting T cells, the CD3ε and CD3ζ chains are associated to the inner leaflet of the plasma membrane (PM). The cytoplasmic tails of CD3ε and CD3ζ are rich in basic amino acids, which allow electrostatic association with acidic phospholipids at the PM. Phosphatidylserine (PS) is the most abundant acidic phospholipid and is exclusively distributed towards the cytoplasmic PM leaflet. During T cell activation, the CD3ε and CD3ζ cytoplasmic tails have to dissociate from PS for their phosphorylation. The membrane dissociation of a large number of CD3 chains is essential for the amplification of T cell activation. A mechanism of CD3ε and CD3ζ chain dissociation that has been proposed in the literature is through intracellular calcium elevation. A robust calcium influx is generated following T cell stimulation. In addition to its essential role in regulating T cell activation, it has been proposed that calcium ions neutralize the PM acidic phospholipids for CD3 chain dissociation. Calcium is also an essential cofactor for the activity of many enzymes, such as the phospholipid scramblase TMEM16F. TMEM16F redistributes PS at the PM following intracellular calcium mobilization, resulting in a reduction of inner leaflet PS. We propose that calcium regulates CD3 chain dissociation through TMEM16F activity. Our study demonstrates that calcium-dependent PS redistribution by TMEM16F is required for CD3ε membrane dissociation in the Jurkat T cell line. Reduction of TMEM16F expression by shRNA targeting (shTMEM16F) prevents massive CD3ε chain dissociation following 8 T cell stimulation. The shTMEM16F cells show a reduction in the phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. In contrast, expression of a constitutively active mutant of TMEM16F increases PS redistribution, CD3ε chain dissociation and phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. Our study demonstrates that PS redistribution by the calcium-dependent TMEM16F scramblase regulates CD3 chain dissociation for the amplification of T cell activation. In addition, we have confirmed T cell activation defects in shTMEM16F murine primary T cells during an immune response. In conclusion, our study demonstrates the role of PS regulation by TMEM16F in T cell activation. We showed that we could modify the level of T cell activation by modulating the concentration of PS at the inner leaflet of the PM. Our results thus have important implications for the development and improvement of immune receptor-based cancer immunotherapies.

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La mélatonine est une neurohormone produite principalement par la glande pinéale de manière circadienne et agissant par l’activation de deux récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) appelés MT1 et MT2. La mélatonine régule de nombreuses fonctions physiologiques importantes. La régulation des niveaux de dopamine (DA) et de glucose en font partie mais nous ne savons pas clairement comment la mélatonine les régule.Les niveaux de DA extracellulaire sont principalement régulés par son transporteur (DAT) responsable de sa recapture dans les neurones présynaptiques afin de prévenir d’une hyperactivation des récepteurs dopaminergiques. Par conséquent, nous avons vérifié le rôle de DAT dans la régulation du système dopaminergique par le système mélatoninergique. Nous avons montré qu’en interagissant avec la forme immature non-glycosylée de DAT, MT1 et MT2 le retiennent dans le réticulum endoplasmique régulant ainsi son expression à la surface cellulaire et donc la recapture de la DA. De la même manière, les souris déficientes en MT1 ou MT2 ont montré une augmentation de la recapture de la DA dans les synaptosomes de striatum et une baisse de l’hypermotilité induite par l’amphétamine. Dans ce projet nous avons ainsi révélé un nouveau lien entre les systèmes mélatoninergiques et dopaminergiques basé sur la formation de complexes moléculaires entre les récepteurs de la mélatonine et DAT.Afin de mieux comprendre le rôle de la mélatonine dans la régulation des niveaux de glucose, nous avons ensuite étudié l’implication de variants génétiques de MT2 dans le développement du diabète de type 2 (DT2). Des études antérieures avaient montré que des variants naturels défectueux fonctionnellement étaient associés à un risque de développer le DT2. Afin de déterminer plus précisément les propriétés défectueuses en lien avec le DT2, nous avons mesuré l’activation spontanée et celle induite par la mélatonine de 40 variants MT2. Nous avons ainsi montré que des défauts d’activation des protéines Gαi et Gαz induite par la mélatonine et de recrutement spontané de la βarrestine-2 sont significativement reliés à un risque de développer le DT2. Les résultats expérimentaux corrélaient avec les prédictions de l’analyse sur le score d’évolution. Ce travail permettra de nouvelles avancées dans la recherche de traitements personnalisés pour les personnes portants les mutations sur MT2 afin qu’il retrouve une réponse non défectueuse.Le séquençage de 9393 personnes a permis l’identification de 32 variants naturels MT1. Le récepteur MT1 sauvage et les variants ont ainsi été caractérisés grâce aux techniques de transfert d’énergie par résonnance de bioluminescence (BRET). Nous avons montré que MT1 active les protéines Gαi/o, Gα12 et Gα15 et recrute la βarrestine-2. L’analyse des résultats par factorisation matricielle non linéaire a révélé l’existence de 5 clusters caractérisés par différents profils de signalisation. La modélisation 3D par homologie de MT1 a permis de déterminer l’impact de chaque variant sur l’activation du récepteur et ses interactions avec les protéines G et la βarrestine-2. Ce projet a ainsi permis de démontrer que des variants naturels sont très intéressant afin de comprendre les mécanismes d’action des RCPGs. En résumé, ce travail contribue à la compréhension des fonctions des récepteurs à la mélatonine et souligne leur importance dans la régulation du système dopaminergique et de l’homéostasie glucidique. Nos résultats offrent de nouvelles perspectives dans la recherche de nouveaux traitements personnalisés pour les patients souffrant d’un dérèglement du système dopaminergique ou de DT2. / Melatonin is a neurohormone mainly released from the pineal gland in a circadian manner acting through two G protein-coupled receptors (GPCRs) called MT1 and MT2. Melatonin regulates many important physiological functions. Regulation of dopamine (DA) and glucose levels are two of them but how they do this is not clear.Extracellular DA levels are mainly regulated by its transporter (DAT) which mediates DA re-uptake into presynaptic nerve termini to prevent DA receptor hyperactivation in the presynaptic cleft. Consequently, we verified the role of DAT in the regulation of the DA system by melatonin. We showed that MT1 and MT2, by interacting with the immature non-glycosylated form of DAT retain DAT in the endoplasmic reticulum thus regulating DAT cell surface expression and DA reuptake. Consistently, mice with targeted deletion of MT1 and MT2 show markedly enhanced DA uptake in striatal synaptosomes and decreased amphetamine-induced locomotor activity. Collectively, we revealed here a molecular link between the melatonin and DA systems, which is based on the formation of a molecular complex between melatonin receptors and DAT.To better understand the role of melatonin on the regulation of glucose levels, we studied the involvement of genetic variants of MT2 in the development of type 2 diabetes (T2D). Previous studies showed that natural loss-of-function variants of MT2 associate with T2D risk. To determine more precisely the defective properties linked to T2D risk we monitored spontaneous and melatonin-induced activation of different signaling pathways by 40 MT2 variants. We show that defects in melatonin-induced Gαi and Gαz activation and spontaneous βarrestin-2 recruitment are most significantly associated to T2D risk. Experimental results correlated well with those predicted by evolutionary lineage analysis. This work will help to propose personalized treatments for MT2 variant carriers to recover their defective responses.Sequencing of 9393 individuals resulted in the identification of 32 natural MT1 variants. MT1 wild-type and variants were functionally characterized in bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assays. We showed that MT1 activates Gαi/o, Gα12 and Gα15 proteins and recruits βarrestin-2. Analyzes of results by non-linear matrix factorization revealed the existence of 5 clusters characterized by different signaling profiles. Computational homology modeling of the 3D model of MT1 helped to determine the impact of each variant on receptor activation and interaction with G proteins and βarrestin-2. Collectively, our data illustrate that natural variants are powerful tools to understand the molecular basis of GPCR function. Overall, this work contributes to our understanding of the function of melatonin receptors and highlights their importance in the regulation of the DA system and glucose homeostasis. Our results will open new, personalized therapeutic options for patient suffering from a defective DA system or T2D.

Le cancer de la vessie (BCa), est une tumeur maligne de l’urothélium, fréquente dans le monde entier, dont le traitement particulièrement coûteux ne permet cependant pas d’éviter les récidives et les progressions. FGFR3 est l'un des gènes les plus fréquemment mutés dans le BCa et les cellules tumorales sont dépendantes de son expression pour leur prolifération. La mutation FGFR3 S249C est fortement surreprésentée (62% des mutations récurrentes de FGFR3). Dans la première partie de ma thèse, en réalisant une étude de la signature de mutation, nous avons montré que cette surreprésentation de la mutation FGFR3 était liée à une pression sélective induite par la mutagenèse APOBEC et non due à un gain de fonction plus important induit par cette mutation. En plus de FGFR3 S249C, 44 mutations fréquentes (représentant près de la moitié des mutations fréquentes du BCa) ont été identifiées comme étant associées à la signature mutationnelle APOBEC et la plupart d'entre elles étaient surreprésentées par rapport à d'autres mutations au sein du même gène. Il est intéressant de noter que ces mutations associées à APOBEC incluaient à la fois de nouveaux ‘conducteurs’ et des ‘passagers’ fréquents potentiels et qu’elles pouvaient potentiellement prédire la réponse à l’immunothérapie et à un traitement anti-ATR (pas anti-ATM). Dans la deuxième partie de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux effets fonctionnels du gène FGFR3 dans le BCa. En utilisant un modèle de souris transgénique, nous avons apporté la première preuve in vivo selon laquelle cette mutation FGFR3 S249C conférait un pouvoir de transformation maligne. Ce processus était associé à une instabilité accrue du génome, activation de MYC et à une angiogenèse accrue, probablement induites par le facteur induisant l'hypoxie (HIF1A). En outre, nous avons caractérisé le réseau de régulation contrôlé par FGFR3 en analysant des données protéomiques obtenues par spectrométrie de masse à partir d'une lignée de cellules cancéreuses du cancer de la vessie portant la mutation FGFR3 S249C - UMUC14. Plusieurs voies de signalisation bien connues comme étant régulées par FGFR3 ont été identifiées. Nous avons également mis en évidence de nouvelles cascades de signalisation suite à l'activation de FGFR3 pouvant être jouer un rôle dans la progression tumorale, notamment un axe FGFR3 / HIF1A / angiogenèse qui a été validé dans certains modèles de BCa in vitro et in vivo. / Bladder cancer (BCa) is a worldwide frequent and costly urothelial malignancy. FGFR3 is one of the most frequently mutated genes in BCa and a driver of an oncogenic dependency. Here, we systematically catalogued the FGFR3 point mutation spectrum in BCa and identified 14 recurrent residues (frequency ≥ 2). One hotspot mutation - FGFR3 S249C - was strongly over-represented compared to other recurrent FGFR3 mutations (62% of all recurrent mutations). Based on in-depth investigation of mutational signature, we revealed that this over-representation of FGFR3 S249C mutation was merely favoured by APOBEC mutagenesis rather than a stronger functional selection compared to other oncodriver mutations on FGFR3. Similarly, together with FGFR3 S249C, 44 frequent mutations (accounts for nearly half of all frequent mutations in BCa) were pinpointed to be associated with APOBEC mutational signature and most of them were over-represented compared to other mutations within the same gene. Interestingly, these APOBEC-associated mutations included both novel potential ‘drivers’ as well as ‘frequent passengers’, and had a potential to predict responders for immunotherapy and anti-ATR but not anti-ATM treatment. On the other hand, we were interested in functional effects of FGFR3 activation in BCa. We provided the first in vivo evidence that FGFR3 S249C mutation conferred potency to BCa transformation using a transgenic mice model. This process was associated with increased genome instability, MYC activation and enhanced angiogenesis probably mediated by hypoxia-inducing factor (HIF1A). Further, we tried to characterize FGFR3-driven regulatory network through mass spectrometry based proteomic data generated in a BCa cell line bearing FGFR3 S249C mutation – UMUC14. As expected, several well-known FGFR3 regulated signaling pathways could be identified. Of note, we also highlighted some novel signaling cascades that may be relevant to FGFR3 activation, including a FGFR3/HIF1A/angiogenesis signaling axis that we validated in several in vitro and in vivo BCa models.

La vaccination est largement utilisée pour la génération de lymphocytes T spécifiques contre les tumeurs. Malheureusement, cette stratégie n'est pas adaptée aux personnes âgées car leur thymus régresse avec l'âge conduisant ainsi à une baisse dans la production de cellules T et à l'accumulation de cellules immunitaires âgées ayant des défauts liés à leurs stimulations. Comme il a été démontré auparavant que L’IL-21 est capable d’induire des fonctions thymiques, nous avons émis l’hypothèse que l’injection d’IL-21 à des souris âgées stimulera la thymopoïèse. Nos résultats montrent que l’administration de l’IL-21 augmente le nombre absolu de thymocytes chez les souris âgées et augmente la migration de ces cellules vers la périphérie ou ils contribuent à la diversité du TCR. De plus les cellules T en périphérie expriment un niveau plus élevé de miR181-a, et par conséquent moins de phosphatase comme SHP2, DUSP5/6 qui inhibent le TCR. En vaccinant des souris âgées avec le peptide Trp2, les souris traitées avec l’IL-21 montrent un retard dans la croissance des cellules B16 tumorales. Cette étude montre que l’IL-21 pourrait être utilisé comme stratégie pour le rétablissement du systeme immunitaire chez les personnes âgées. / Vaccines have been largely sought for the generation of protective tumor-specific T cells. Unfortunately however, this strategy is not suitable for the elderly as their thymus regresses with age leading to a decline in T-cell production and accumulation of aged lymphocytes endowed with stimulation-related defects. Interleukin (IL)-21 has been shown to display thymostimulatory properties. Therefore, we hypothesized that IL-21 administration to ageing host may boost T-cell production and restore a competent peripheral T-cell compartment. Our study shows that IL-21 injection to aged mice lead to an increase in the thymocytes absolute number and an increase in thymocytes egress to the periphery where they enhance the T-cell receptor (TCR) diversity. Furthermore T-cell in the periphery express higher level of miR-181a and thus less TCR-inhibiting phosphatases SHP-2 and DUSP5/6 enable them to be more responsive upon stimulation. Consequently, aged rIL-21-treated mice vaccinated using a tyrosinase-related protein 2 (Trp2)-derived peptide exhibited a substantial delay in B16 tumor growth and improved survival. The results of this study highlight the immunorestorative function of rIL-21 paving its use as a strategy for the re-establishment of effective immunity in the elderly.

Au pic de la réponse effectrice des LT CD8, on retrouve deux sous-populations, soit les effecteurs à demi-vie courte (SLEC) ou les effecteurs précurseurs de cellules mémoires (MPEC). La phase de contraction de la réponse effectrice implique l’apoptose des SLEC et la survie des MPEC, qui se différencient en cellules mémoires pour protéger contre une réinfection. La voie Notch est impliquée dans les choix de différenciation binaire et l’interaction ligand-récepteur mène au clivage du domaine intracellulaire de Notch (NICD), qui migrera au noyau afin d'induire l’expression de gènes cibles. Dans un modèle où l’expression des récepteurs Notch1 et Notch2 est absente uniquement dans les LT CD8 (N1N2∆/∆), le laboratoire a démontré que l’absence du signal Notch favorisait la différenciation en MPEC et affectait l’expression de 217 gènes. Cette étude visait à 1) identifier les gènes cibles de Notch contrôlant la différenciation SLEC-MPEC, et 2) évaluer si l’absence du signal Notch permet un meilleur contrôle tumoral par les LT CD8. Nous avons priorisé les 217 gènes en fonction de différents critères et identifié Il2ra comme une cible importante en aval de la voie Notch. Toutefois, nous avons établis que lors d’une infection aiguë, la surexpression rétrovirale de Il2ra dans les LT CD8 N1N2∆/∆ n’influençait pas la différenciation SLEC-MPEC. Nous avons également déterminé qu’une thérapie adoptive de LT CD8 N1N2∆/∆ limitait le contrôle de la croissance tumorale et impliquait une diminution des fonctions effectrices des LT CD8 N1N2∆/∆, qui étaient moins terminalement différenciés. Une meilleure compréhension du rôle de Notch dans la réponse des LT CD8 permettra de développer de nouvelles stratégies de vaccination et de traitement du cancer. / In response to acute infections, effector CD8 T cells differentiate into short-lived effector cells (SLECs) and memory precursor effector cells (MPECs) capable of generating long-lived memory CD8 T cells. The Notch signaling pathway is a key regulator of cell fate decision. Following ligand- receptor interaction, the Notch intracellular domain (NICD) is cleaved and migrates to the nucleus in order to induce the expression of target genes. In a model in which Notch1 and Notch2 expression is inhibited only in mature CD8 T cells, our team has established that Notch deficiency favors MPEC differentiation in CD8 T cells and influences the expression of 217 gens. This study aims to: 1) identify target genes of the Notch pathway regulating SLEC-MPEC differentiation, 2) evaluate if Notch deficiency can augment tumor control by CD8 T cells. We have prioritized the list of genes differentially expressed in the absence of Notch signaling according to various criteria. We hence identified Il2ra as a target gene, but during an acute infection, overexpression of Il2ra in Notch deficient CD8 T cell was insufficient to modulate SLEC-MPEC differentiation. In addition, we have established that adoptive therapy with Notch deficient CD8 T cell impaired tumor control and implicated a diminution of effector function in Notch deficient CD8 T cell, which were less terminally differentiated. A better understanding of Notch signaling pathway’s role in the CD8 T cell response will allow for improvement of vaccinal strategies and cancer treatment.

Cette thèse de doctorat englobe deux projets majeurs visant à étudier l'interaction entre les nanotubes à effet tunnel inter-péricytes (IP-TNT), le couplage neurovasculaire et la modulation des cellules gliales dans le contexte du glaucome. Le premier projet se concentre sur la caractérisation et l'importance fonctionnelle des IP-TNT dans la régulation du couplage neurovasculaire, tandis que le second projet explore le rôle des cellules gliales, en particulier S100Β, dans la modulation des réponses des péricytes pendant l'hypertension oculaire (HTO), un facteur de risque important pour le développement du glaucome. Dans le premier projet, nous avons étudié la présence et les implications fonctionnelles des IP-TNT dans l'unité neurovasculaire. Grâce à des techniques d'imagerie avancées et à des expériences d'imagerie en direct chez la souris, nous avons visualisé et caractérisé ces nanotubes à effet tunnel qui relient les péricytes voisins dans la rétine. Nous avons découvert que les IP-TNT jouent un rôle crucial en facilitant la communication intercellulaire et la signalisation calcique entre les péricytes. Ces nanotubes contribuent à la régulation du flux sanguin capillaire et au couplage neurovasculaire, assurant l'apport efficace d'oxygène et de nutriments aux neurones actifs. Nos résultats mettent en lumière les interactions cellulaires complexes au sein de l'unité neurovasculaire et élargissent notre compréhension des mécanismes qui sous-tendent le couplage neurovasculaire. Dans le second projet, nous nous sommes concentrés sur le rôle des cellules gliales, en particulier la protéine S100Β qui se lie au calcium, dans la modulation des réponses des péricytes au cours de l'HTO, une caractéristique pathologique clé du glaucome. Grâce à une combinaison d'expériences in vivo, d'analyses moléculaires et de techniques d'imagerie, nous avons étudié l'impact de la S100Β sur les niveaux de calcium des péricytes et sur le flux sanguin capillaire. Nous avons observé que la S100Β est régulée à la hausse dans les cellules gliales, y compris les cellules de Müller et les astrocytes, au cours de l'HTO. L'administration de la protéine recombinante exogène S100Β a exacerbé l'influx de calcium intra-péricyte et altéré le flux sanguin capillaire, tandis que le blocage de la fonction S100Β a amélioré les niveaux de calcium des péricytes et rétabli un flux sanguin basal. La neutralisation de la S100Β a également protégé les cellules ganglionnaires de la rétine de la mort induite par l'HTO. Ces résultats mettent en évidence le rôle critique des cellules gliales et de la S100Β dans les déficits du couplage neurovasculaire au cours du glaucome, et donnent un aperçu des cibles thérapeutiques potentielles pour préserver la santé et la fonction de la rétine. Collectivement, les résultats des deux projets contribuent à notre compréhension de l'interaction complexe entre les IP-TNT, le couplage neurovasculaire et la modulation des cellules gliales dans le contexte du glaucome. En élucidant le rôle des IP-TNT dans la régulation neurovasculaire et l'impact des cellules gliales, en particulier la S100Β, sur les réponses des péricytes, cette thèse fournit des informations précieuses sur les mécanismes sous-jacents de la pathogenèse du glaucome. Ces résultats peuvent ouvrir la voie au développement de stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les IP-TNT et la modulation médiée par les cellules gliales afin de préserver la fonction rétinienne et de prévenir la perte de vision dans le glaucome et les maladies neurodégénératives associées / This PhD thesis encompasses two major projects aimed at investigating the interplay between interpericyte tunneling nanotubes (IP-TNTs), neurovascular coupling, and glial cell modulation in the context of glaucoma. The first project focuses on the characterization and functional significance of IP-TNTs in neurovascular coupling regulation, while the second project explores the role of glial cells, particularly S100Β, in modulating pericyte responses during ocular hypertension (OHT), an important risk factor for developing glaucoma. In the first project, we investigated the presence and functional implications of IP-TNTs in the neurovascular unit. Through advanced imaging techniques and live imaging experiments in mice, we visualized and characterized these tunneling nanotubes connecting neighboring pericytes in the retina. We found that IP-TNTs play a crucial role in facilitating intercellular communication and calcium signaling between pericytes. These nanotubes contribute to the regulation of capillary blood flow and neurovascular coupling, ensuring the efficient delivery of oxygen and nutrients to active neurons. Our findings shed light on the intricate cellular interactions within the neurovascular unit and expand our understanding of the mechanisms underlying neurovascular coupling. In the second project, we focused on the role of glial cells, specifically the calcium-binding protein S100Β, in modulating pericyte responses during OHT, a key pathological feature of glaucoma. Through a combination of in vivo experiments, molecular analyses, and imaging techniques, we investigated the impact of S100Β on pericyte calcium levels and capillary blood flow. We observed that S100Β is upregulated in glial cells, including Müller cells and astrocytes, during OHT. Administration of recombinant S100Β protein exacerbated intrapericyte calcium influx and impaired capillary blood flow, while blocking S100Β function improved pericyte calcium levels and restored normal blood flow. Notably, S100Β neutralization also protected retinal ganglion cells from OHT-induced death. These findings highlight the critical role of glial cells and S100Β in neurovascular coupling deficits during glaucoma, providing insights into potential therapeutic targets for preserving retinal health and function. Collectively, the results from both projects contribute to our understanding of the complex interplay between IP-TNTs, neurovascular coupling, and glial cell modulation in the context of glaucoma. By elucidating the role of IP-TNTs in neurovascular regulation and the impact of glial cells, particularly S100Β, on pericyte responses, this thesis provides valuable insights into the underlying mechanisms of glaucoma pathogenesis. These findings may pave the way for the development of innovative therapeutic strategies targeting IP-TNTs and glial cell-mediated modulation to preserve retinal function and prevent vision loss in glaucoma and related neurodegenerative diseases

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et le plus mortelle chez la femme, où sa progression vers le stade métastatique constitue une menace pour la vie des patientes. La présence de métastases représente le défi clinique central de l'oncologie des tumeurs solides, de sorte que les mécanismes et les voies sous-jacents au processus métastatique doivent être mieux définis. L'expression aberrante du récepteur tyrosine kinase (RTK) AXL a été liée cliniquement à la formation de métastases et à l'acquisition d'une résistance aux médicaments contre le cancer. AXL est un membre de la sous-famille des récepteurs tyrosine kinase TAM et intervient dans plusieurs processus biologiques tels que l'atténuation de la réponse immunitaire, l'élimination des cellules apoptotiques et la promotion de la survie cellulaire. L'expression d'AXL dans les tumeurs primaires humaines corrèle avec la faible survie des patients. Malgré sa régulation positive préférentielle dans les lignées cellulaires triple négatives / basales B, des études ont montré que l’expression d’AXL est indépendante du sous-type de la tumeur mammaire des patients. AXL peut être activé par son ligand GAS6 ou par d'autres RTK. Lors de son activation, AXL induit une signalisation en aval entraînant l'activation d'intermédiaires de signalisation canoniques, notamment MAPK, AKT et PI 3-kinases. Cependant, les voies de signalisation spécifiques engagées par AXL pour conférer un tel pouvoir pro-invasion ne sont pas connues. Ainsi, le but de cette thèse est d'identifier des substrats spécifiques d’AXL et des voies en aval qui jouent un rôle important dans le maintien d'un état « EMT » et d'un renforcement du phénotype mésenchymal dans les cellules cancéreuses. À la recherche de régulateurs en amont du complexe ELMO/DOCK1 impliqués dans l’activation de RAC, nous présentons au chapitre 2 les protéines d’échafaudage ELMO en tant que substrats directs et partenaires de liaison d’AXL. Grâce à des approches de protéomique et de mutagenèse, nous révélons que la kinase AXL phosphoryle ELMO1/2 sur un résidu tyrosine carboxy-terminal conservé. Dans les cellules cancéreuses du sein, l'activation d'AXL dépendante de GAS6 a conduit à la phosphorylation endogène d'ELMO2 sur Tyr-713, menant ainsi à la formation du complexe AXL/ELMO. En outre, l'activation de RAC induite par GAS6 dans les cellules cancéreuses du sein dépendait de l'expression d'ELMO2. Semblable au blocage d’AXL, l'inhibition d’ELMO2 ou l'inhibition pharmacologique de DOCK1 supprime l'invasion des cellules du cancer du sein, qui, selon nous, dépendait de l'état de phosphorylation d'ELMO. Notre travail au chapitre 2 définit un nouveau mécanisme par lequel AXL favorise la prolifération et l'invasion cellulaire et identifie l'inhibition de la voie ELMO/DOCK comme une cible thérapeutique potentielle pour arrêter les métastases induites par AXL. Bien qu'il soit encore difficile de savoir comment les signaux d’AXL induisent son phénotype pro-invasif, notre travail au Chapitre 3 vise à identifier des substrats et des voies de signalisation spécifiques qui sont significativement modulés lors de l'activation d'AXL. Pour y remédier, nous avons défini le phosphoprotéome de la régulation d’AXL dans des cellules cancéreuses du sein triple-négatives en utilisant une approche quantitative. Nous révélons qu’AXL module de manière robuste, parmi de nombreux processus et voies biologiques importants, la phosphorylation d'un réseau de protéines d'adhésion focale (FA) aboutissant à un désassemblage plus rapide des FA. De manière intéressante, nous avons trouvé que la modulation de la voie FA était unique à AXL par rapport à d'autres RTK tels que l'EGFR. En particulier, nous avons trouvé qu’AXL phosphoryle la protéine NEDD9, modulant la formation du complexe NEDD9/CRKII/DOCK3, qui orchestre la phosphorylation de la pseudo-kinase PEAK1 médiée par AXL. Nos données révèlent un mécanisme distinct par lequel les complexes PEAK1 avec la kinase CSK médient la phosphorylation de PXN et le renouvellement des FA induit par AXL. En utilisant l'injection orthotopique de cellules cancéreuses du sein dans le tissu adipeux mammaire des souris et dans la veine de la queue, nous révélons que l'inactivation de PEAK1 par CRISPR diminue la croissance tumorale et les métastases in vivo. De plus, notre travail au chapitre 3 révèle une contribution unique et inattendue de la signalisation d’AXL à la dynamique des FA, révélant un mécanisme longtemps recherché sous-tendant l'activité invasive d'AXL. Cette compréhension approfondie des réseaux de signalisation régulés par AXL identifie PEAK1 comme une nouvelle cible thérapeutique dans les tumeurs AXL positives. En conclusion, cette thèse a identifié, pour la première fois, le phosphoprotéome d’AXL et des voies de signalisation spécifique à AXL, pouvant justifier le rôle du récepteur en tant que promoteur de métastases et de résistance aux médicaments. Notre travail révèle de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient avoir un grand potentiel si elles sont utilisées en thérapie combinatoire avec l’inhibition d’AXL pour prévenir la formation de métastases des tumeurs AXL positives. / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women where its progression to the metastatic stage poses a threat to the life of patients. The metastatic disease represents the central clinical challenge of solid tumor oncology such that mechanisms and pathways underlying the metastatic process must be better defined. The aberrant expression of the receptor tyrosine kinase (RTK) AXL has been linked clinically to metastasis and acquisition of drug resistance. AXL is a member of the TAM subfamily and functions in several biological processes such as dampening the immune response, clearing apoptotic cells and promoting cell survival. Despite its preferential upregulation in triple negative/basal B cell lines, studies have shown AXL expression in the clinic to be subtype independent. AXL can be activated by its ligand GAS6 or by a crosstalk with other RTKs. Upon its activation, AXL induces downstream signaling resulting in the activation of canonical signaling intermediates including MAPKs, AKT and PI 3-kinases. However, the specific signaling pathways engaged by AXL to confer such enhanced pro-invasion power are not known and the goal of this thesis is to identify AXL-specific substrates and downstream pathways that are behind AXL’s significant role in maintaining an EMT state and reinforced mesenchymal phenotype in cancer cells. In search of upstream regulators of ELMO/DOCK1 complex involved in RAC activation, we reported ELMO scaffolds as direct substrates and binding partners of AXL. Through proteomics and mutagenesis approaches, we revealed phosphorylation of ELMO1/2 by AXL kinase on a conserved carboxyl-terminal tyrosine residue. In breast cancer cells, GAS6-dependent activation of AXL led to endogenous ELMO2 phosphorylation on Tyr-713 and AXL/ELMO complex formation. In addition, GAS6-induced RAC activation in breast cancer cells was dependent on ELMO2 expression and phosphorylation. Our work in chapter 2 defines a new mechanism by which AXL promotes cell proliferation and invasion and identifies inhibition of ELMO/DOCK pathway as a potential therapeutic target to stop AXL-induced metastases. While it still remains elusive how AXL signals to induce its pro-invasive phenotype, our work strove to identify specific substrates and signaling pathways that are significantly modulated upon AXL activation using a quantitative phosphoproteomics approach. By generating GAS6-induced AXL phosphoproteome, we found that AXL robustly modulates, among many different significant biological processes and pathways, the phosphorylation of a network of focal adhesion (FA) proteins culminating in faster FA disassembly. Interestingly, we found AXL modulation of FA pathway to be unique to AXL in comparison with other RTKs such as EGFR. NEDD9 FA protein was identified to be a direct substrate of AXL, where its phosphorylation modulates its complex formation with CRKII/DOCK3, and this subsequently orchestrates the AXL-mediated phosphorylation of the pseudo-kinase PEAK1. Our data revealed a distinct mechanism by which PEAK1 complexes with CSK kinase, mediating PXN phosphorylation and AXL-induced FA turnover. Using in vivo assays such as tail-vein metastasis assay and tumor growth assay, we revealed that gene inactivation of PEAK1 by CRISPR CAS9 decreased tumor growth and metastasis. Furthermore, our work in chapter 3 uncovers an unexpected and unique robust contribution of AXL signaling to FA dynamics revealing a long sought-after mechanism underlying AXL pro-invasive activity. This in-depth understanding of AXL regulated signaling networks identifies PEAK1 as a new therapeutic target in AXL positive tumors. In conclusion, this thesis identified, for the first time, AXL phosphoproteome and AXL specific downstream signaling pathways that may justify AXL’s role as a promoter of metastasis and drug resistance. Our work reveals novel therapeutic drug targets that may hold a great potential if used in combinational therapeutics with AXL inhibition to prevent metastasis of AXL positive tumors.