La compréhension des mécanismes de défense mis en place lors de la résistance des plantes vis-à-vis d'agents pathogènes a pour objectif de proposer des alternatives à l'utilisation de produits phytosanitaires utilisés en agriculture. Dans une première partie, nous avons étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance induite aux pathogènes par l'acide β-aminobutyrique (BABA) chez la vigne. En effet, cet acide aminé non protéique favorise un état physiologique particulier, appelé potentialisation, dans lequel la plante est capable de mobiliser plus rapidement et/ou plus intensément ses réactions de défense en réponse à un stress. Contrairement aux éliciteurs comme les oligogalacturonates (OG), nous avons montré que le BABA seul n’induisait pas les événements précoces de signalisation sur suspensions cellulaires de vigne, tels que les variations de la concentration en calcium cytosolique libre ([Ca2+]cyt), la production de monoxyde d’azote (NO), la production d’H2O2, la phosphorylation de MAPkinases, ni l’expression de gènes de défense. Seules la production d’H2O2 et l’expression plus intense du gène RbohD codant une NADPH oxydase sont potentialisées par le BABA dans les suspensions cellulaires élicitées par les OG. In planta, le BABA potentialise également une production d’H2O2 en réponse à l’infection par l’oomycète Plasmopara viticola. L’utilisation d’un inhibiteur de NADPH oxydase abolit complètement cette production d’H2O2 et bloque partiellement la résistance induite par le BABA. Nous montrons donc que la potentialisation de la production d’H2O2 dépendante d’une NADPH oxydase contribue à l’établissement de la résistance induite par le BABA chez la vigne. Une deuxième partie a permis d’appréhender les événements cellulaires impliqués dans la résistance des plantes en se focalisant sur le mutant pad2 (phytoalexin deficient) d’Arabidopsis thaliana. Ce mutant présente une sensibilité accrue à différents pathogènes et contient un taux de glutathion de l’ordre de 20 % par rapport à l’écotype sauvage. Nous avons tout d’abord montré que le faible taux de glutathion dépendait d’une quantité réduite de la première enzyme de sa biosynthèse, la glutamate-cystéine ligase. Le glutathion étant impliqué dans la mise en place des réactions de défense, nous avons tenté de définir le lien entre la déficience en glutathion et la sensibilité de pad2 aux pathogènes. Nous avons tout d’abord montré que pad2 possédait un état redox du glutathion plus oxydé que le sauvage. Une analyse transcriptomique à l’état basal a révélé que la plupart des gènes différentiellement exprimés étaient réprimés chez pad2. Parmi ces gènes, certains codent des protéines impliquées dans les flux d’ions qui pourraient déréguler la dépolarisation membranaire. Nous avons ainsi confirmé que la dépolarisation de la membrane plasmique est amoindrie chez pad2 en réponse aux OG. De plus, des événements en aval tels que la production d’H2O2 et la production de NO sont également plus faibles chez le mutant par rapport au sauvage. Cette absence de la production d’H2O2 a également été spécifiquement observée sur plantes pad2 infectées par l’oomycète Phytophthora brassicae. Il en résulte un développement accru du pathogène corrélé à une absence de réponse hypersensible, une mort cellulaire localisée normalement observée dans le cas du sauvage résistant. En réponse aux OG ou à l’infection par P. brassicae, les analyses transcriptomiques font ressortir un fort enrichissement de gènes relatifs à la dégradation des protéines chez pad2. De manière globale, nos résultats suggèrent que la déficience en glutathion chez pad2 pourrait profondément modifier le turn-over des protéines, perturbant ainsi la signalisation cellulaire et les réponses biologiques associées. / Alternative strategies are required to reduce pesticide input into the environment for effective and sustainable plant protection. One solution is the activation of plant basal resistance that relies on the application of resistance inducer molecules. In the first part of this study, we analyzed the mode of action of β-aminobutyric acid (BABA), a non-protein amino acid, in the grapevine induced resistance. BABA confers a physiological state, called priming, during which plants are able to mobilize better and/or more rapidly defense responses to biotic or abiotic stress. Unlike oligogalacturonides (OG), we showed that BABA did not induce early signaling events in grapevine cells such as variations of cytosolic free calcium concentration, H2O2 and nitric oxide production, MAPkinase phosphorylation, nor the expression of defense-related genes. Among them, only H2O2 production and the expression of RbohD gene, which encodes a NADPH oxidase, are primed by BABA in OG-treated cells. Moreover, BABA-treated plants display a stronger accumulation of H2O2 in response to the oomycete Plasmopara viticola. Application of an NADPH oxidase inhibitor completely abolishes this H2O2 production and leads to a reduction of BABA-induced resistance against P. viticola. These data suggest that the priming of an NADPH oxidase-dependent H2O2 production contributes to BABA-induced resistance in grapevine. The second part consisted to analyze molecular events involved in plant resistance by using the pad2 (phytoalexin deficient) mutant of Arabidopsis thaliana which is susceptible to a broad range of pathogens. We showed that the glutathione depletion depends on the low amount of glutamate-cysteine ligase protein, the first enzyme involved in its biosynthesis. We studied molecular events, which are involved in defense mechanisms, to understand the impact of the glutathione content on pad2 susceptibility. Our results show that the redox state of glutathione is more oxidized in pad2 than in wild type Col-0. Since cellular redox state change is known to regulate gene expression, a basal transcriptome analysis has been performed in pad2 and wild type plants. Interestingly, most of the identified genes in pad2 are down-regulated, some of them encoding proteins involved in ion fluxes. As expected, the plasma membrane depolarization and events downstream like H2O2 and NO production are impaired in pad2 in response to OG. During infection with Phytophthora brassicae, the lack of H2O2 production is concomitant with an absence of the hypersensitive response, a localize cell death observed in the resistant wild type. After OG treatment or P. brassicae infection, microarray analysis brings out genes related to protein machinery including degradation in pad2. Taken together, these data suggest that the depletion of glutathione has an impact on protein turn-over which disturbs cell signaling events and related biological responses.

Zymoseptoria tritici est l'un des dix plus importants champignons pathogènes des plantes. Son impact économique sur la production de blé et ses caractéristiques biologiques (dimorphisme levure-hyphae, hémi-biotrophie, populations sexuées et diversifiées) fait de Z. tritici un organisme unique parmi les champignons pathogènes des plantes. Au cours des dix dernières années, il a suscité un intérêt croissant de la communauté scientifique conduisant au développement d'outils génomiques et génétiques. Ces efforts ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa pathogénie et son évolution. Nous avons focalisé notre étude sur les trois «Mitogen-Activated Kinases» (MAPK) ZtFus3, ZtHog1 et ZtSlt2 de Z. tritici nécessaires au succès de l’infection. Nous avons réalisé une caractérisation phénotypique détaillée du mutant de délétion ZtSLT2 lors de l'infection du blé et du développement fongique in vitro. Nous avons montré que le mutant ΔZtslt2 est non pathogène pour les feuilles de blé, même lorsque la pénétration stomatique est court-circuitée par injection de spores dans la feuille, ce qui suggère que ce mutant présente un défaut dans la colonisation des tissus de la plante. Pendant la croissance in vitro, ZtSLT2 est nécessaire à la pigmentation, des colonies, l’émergence des hyphes aériens, la formation de biofilm et l’hydrophobicité de la colonie. Ces phénotypes sont des marqueurs d'un processus développemental qui se produit pendant le vieillissement de la colonie de Z. tritici (développement de colonies pigmentées et hydrophobes portant des hyphes aériens blancs). Ce processus développemental survient à des moments différents selon le milieu de culture et la température, le plus rapide étant sur milieu pauvre «Pomme de terre Glucose» (PD) à 25 °C (4 jours) et le plus lent sur milieu riche complet «Extrait de Levure, Peptone, Glucose» (YPD) à 18 °C (18 jours). Nous avons montré que les gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la mélanine, des α-1,3-glucanes et des hydrophobines sont surexprimées au cours de ce processus développemental dans la souche sauvage, en particulier après trois jours de culture sur PD à 25 °C par rapport aux autres conditions. Cette surexpression nécessite que la voie ZtSLT2 soit fonctionnelle. L’analyse transcriptomique (RNAseq) de ces conditions différentielles est en cours pour identifier le réseau de gènes nécessitant la protéine Slt2 pour leur expression. Ces gènes cibles de ZtSLT2 sont des facteurs de pathogénicité putatifs.Nous avons également développé un nouvel outil moléculaire pour Z. tritici. Nous avons montré que les promoteurs pMoNIA1 et pZtNIA1 des gènes codant les nitrates réductases de Magnaporthe oryzae et Z. tritici, respectivement, sont régulés par la source d’azote du milieu de la même façon chez Z. tritici. L’expression de gènes sous le contrôle de ces deux promoteurs est maximale en présence de nitrate comme seule source d'azote, mais réduite en présence de glutamate. Ces promoteurs peuvent donc être utilisés pour l'expression conditionnelle de gènes et le remplacement de promoteur chez Z. tritici. Ils seront utiles pour contrôler l'expression des allèles constitutivement actifs des MAP kinase kinases dans le but d’activer les voies des MAPK de manière conditionnelle. / Zymoseptoria tritici is one of the ten more important fungal plant pathogens. Its economic impact on wheat production and its biological characteristics (yeast-fungal dimorphism, hemi-biotrophy, sexual and highly diverse populations) make Z. tritici unique among fungal plant pathogens. It has therefore drawn attention of the scientific community during the last ten years, leading to the development of genomic and genetic tools. These efforts have improved our understanding of its pathogenicity and evolution. We have focused our study on the three Z. tritici Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) signalling pathways (ZtFUS3, ZtHOG1, and ZtSLT2) which are required for pathogenicity. We provided novel insights in the role of ZtSlt2 MAPK signalling pathway using a detailed phenotypic characterization of SLT2 deletion mutant during wheat infection and in vitro development. We showed that SLT2 is non-pathogenic on wheat leaves, even when stomatal penetration is bypassed by spore injection, suggesting a defect in leaf colonisation. During in vitro growth, SLT2 is required for melanisation, aerial hyphae emergence, biofilm formation and colony hydrophobicity which are markers of a developmental switch occurring during Z. tritici colony aging (development of melanised and hydrophobic colonies supporting abundant white aerial hyphae). This developmental switch occurs at different times depending on media and temperatures, quickest being on poor plant-derived Potato Dextrose (PD) medium at 25°C (4 days) and slowest on rich complex Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) medium 18°C (18 days). We provided evidence that genes encoding enzymes involved in both melanin and α-1,3-glucan biosynthesis, and hydrophobins are up-regulated during this developmental switch in wild type, in particular at 3 days on PD at 25°C compared to other conditions. This up-regulation clearly requires a functional ZtSLT2 pathway. Transcriptomic analysis (RNAseq) of these differential conditions is ongoing to identify the network of genes requiring SLT2 for their expression. These SLT2 target genes are putative pathogenicity factors. We also provide a new molecular tool for Z. tritici. We showed that pMoNIA1 and pZtNIA1 promoters from nitrate reductases encoding genes of Magnaporthe oryzae, and Z. tritici, respectively, are nitrogen-responsive in Z. tritici to a similar extent. They are fully expressed in presence of nitrate as sole nitrogen source and down-regulated in presence of glutamate, showing they are suitable for conditional gene expression and promoter replacement in Z. tritici. These promoters will be useful to control the expression of constitutively active alleles of MAP Kinase kinases in order to activate MAPK pathways in a conditional manner.

Nous avons récemment démontré que le récepteur du morphogène Hedgehog, Patched, qui est exprimé dans de nombreux cancers, est un transporteur de multiples drogues qui contribue à la résistance des cellules cancéreuses à la chimiothérapie. Le criblage d'une banque de molécules nous a permis d'identifier deux molécules qui inhibent l'activité d'efflux de doxorubicine de Patched. Nous avons montré que ces molécules renforcent les effets cytotoxiques, proapoptotiques, antiprolifératifs et anticlonogéniques de la doxorubicine sur les cellules de cancer de la glande surrénale (surrénalome) qui expriment de façon endogène Patched. De plus, nous avons observé que l’ajout de la molécule P375 au traitement à la doxorubicine inhibe le développement des tumeurs chez des souris ayant reçu une xénogreffe de cellules de surrénalome de façon plus significative que la doxorubicine seule. Nos résultats suggèrent que l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité d'efflux de drogues de Patched en association avec la doxorubicine est une option thérapeutique prometteuse pour le surrénalome, et très probablement pour d'autres cancers exprimant Patched. Nous avons découvert qu'une petite fraction seulement des cellules de la lignée de surrénalome exprime Patched au niveau de la membrane plasmique (cellules PM-Patched). Les cellules PM-Patched sont plus résistantes à la doxorubicine, et présentent une expression plus élevée de Patched mais aussi de la protéine ABCG2. ABCG2 étant un marqueur de cellules souches cancéreuses (CSC), nous pensons que les cellules PM-Patched pourraient être des CSC.D'autres expériences sont nécessaires pour valider cette hypothèse. / We recently demonstrated that the Hedgehog receptor Patched, which is expressed in many recurrent and metastatic cancers, is a multidrug transporter contributing to chemotherapy resistance. The screening of a chemical library allowed us identifying two molecules which inhibit the doxorubicin efflux activity of Patched. We showed that these molecules enhance the cytotoxic, proapoptotic, antiproliferative and anticlonogenic effects of doxorubicin on adrenocortical carcinoma (ACC) cells which endogenously express Patched. Moreover, we reported that the addition of the drug-like molecule P375 to doxorubicin treatment prevents the development of xenograft ACC tumours in mice much more significantly than the doxorubicin alone. Our results suggest that the use of an inhibitor of Patched drug efflux activity in combination with doxorubicin is a promising therapeutic option for ACC and most likely for other Patched-expressing cancers. We discovered that only a small fraction of the ACC cell line expressed Patched at the plasma membrane (PMPatched cells). We observed that these cells are more resistant to doxorubicin treatment than ACC cells that express Patched only in intracellular compartments. Moreover, we estimated that PMPatched cells have higher expression of Patched but also of ABCG2/BCRP proteins. Based on the fact ABCG2/BCRP is a cancer stem cell (CSC) marker and that Hedgehog signaling is involved in maintenance of CSC, we think that PM-Patched cells could be CSCs. More experiments are needed to confirm this hypothesis.

L'insuffisance cardiaque (IC) est un processus progressif et inexorable menant au remodelage pathologique du cœur et à la destruction du parenchyme cardiaque. Indépendamment de l'étiologie, on observe une diminution d'environ 30% du nombre de cardiomyocytes ventriculaires au stade terminal de la maladie. Reposant sur les données précliniques convergentes dans les modèles d'IC, le concept novateur de thérapie cellulaire a suscité beaucoup d’espoir en cardiologie. Bien que leur rôle dans l'homéostasie cardiaque soit controversé, les progéniteurs cardiaques endogènes (eCPCs) qui perdurent au sein du myocarde adulte possèderaient les caractéristiques optimales en vue de la régénération myocardique. Nos données électrophysiologiques montrent que le courant potassique dépendant du Ca2+ de conductance intermédiaire (IKCa3.1) est dominant et qu'il contribue à la détermination du potentiel membranaire (Vmem). L'hyperpolarisation engendrée par l'activation du canal KCa3.1 (SK4; KCNN4) maintient le gradient électrique et favorise l'entrée capacitive de Ca2+ (ECC). D'un point de vue fonctionnel, la potentialisation de la signalisation calcique intracellulaire induite par KCa3.1 semble cruciale pour la prolifération des eCPCs c-Kit+. Puisque le statut clinique est connu pour avoir des conséquences néfastes sur la fonctionnalité des cellules souches, nous avons comparé la densité du courant IKCa3.1 dans des eCPCs c-Kit+ provenant de cœurs sains et insuffisants. En accord avec les données électrophysiologiques, nos résultats démontrent que l'insuffisance cardiaque congestive (CHF) diminue significativement l'expression de KCa3.1 ainsi que des protéines régulatrices du cycle cellulaire. Les cellules souches dérivées d'explants cardiaques (EDCs) représentent un autre produit cellulaire prometteur pour la thérapie cellulaire en cardiologie. Les EDCs se composent de sous-populations complémentaires dont la proportion varie en fonction du statut clinique. Alors que la population CD90- constitue la fraction active en termes d'efficacité thérapeutique, il a été démontré qu'une proportion élevée de cellules CD90+ réduit le potentiel régénératif des EDCs. Afin de faire la lumière sur les déterminants ioniques de la thérapie cellulaire cardiaque, les propriétés électrophysiologiques des populations CD90+ et CD90- ont été comparées. Considérant l'importance de KCa3.1 pour la fonction des eCPCs c-Kit+, la présence de canaux potassiques Ca2+-dépendants (KCa) dans les EDCs a été investiguée. Nous avons identifié 2 types de canaux KCa dans les EDCs humaines. Le canal KCa1.1 (BKCa; KCNMA1) est exprimé de façon homogène alors que KCa3.1 est présent exclusivement dans les cellules CD90-. D'un point de vue fonctionnel, l'activité du canal KCa3.1 détermine le Vmem et supporte la prolifération des EDCs. Puisque ce canal est présent uniquement dans la population cardiogénique, l'expression de KCa3.1 pourrait être un facteur déterminant de la capacité régénérative des EDCs. Nous avons investigué cette hypothèse et confirmé que la transplantation de cellules génétiquement modifiées pour exprimer le canal KCa3.1 augmente la régénération cardiaque dans un modèle murin d'IC d'origine ischémique. Pour la première fois, nous avons fait la démonstration que la modulation des propriétés ioniques de cellules souches peut améliorer leur efficacité thérapeutique. / Heart failure (HF) is a progressive disease characterized by extensive pathological remodelling of the heart and myocardial damage. Regardless of the etiology, a decrease of about 30% in the number of ventricular cardiomyocytes is observed at the terminal stage of HF. Based on converging preclinical data in HF models, the innovative concept of cell therapy has generated a great deal of enthusiasm in cardiology. Although the role of cardiac stem cells in cardiac homeostasis is highly controversial, the multipotent progenitors that persist within the adult myocardium possess the ideal characteristics for cardiac regeneration, especially because of their cardiogenic committment. Plasma membrane ion channels are involved in the fundamental processes of virtually all cells that make up the human body, including stem cells. A wide range of functional ion channels was identified in ex vivo proliferated endogenous cardiac progenitor cells (eCPCs), but their function remains poorly understood. We have completed the very first characterization of the ionic profile of freshly-isolated c-Kit+ eCPCs. We found that the intermediate conductance Ca2+-activated potassium current (IKCa3.1) is the predominant conductance and contributes to the determination of membrane potential (Vmem). The hyperpolarization generated by the activation of the KCa3.1 channel (SK4; KCNN4) maintains the electrical gradient and promotes store-operated Ca2+-entry (SOCE) that activates progenitor cell proliferation. Experimental congestive heart failure (CHF) significantly decreased the expression of KCa3.1 as well as cell cycle regulatory proteins. Taken together, these findings suggest that alterations in KCa3.1 may have pathophysiological and therapeutic significance in regenerative medicine In addition to c-Kit+ eCPCs, cardiac explants-derived cells (EDCs) represent another promising cell product for myocardial repair. EDCs are obtained as a heterogeneous mixture composed of complementary subpopulations. Interestingly, it was found that a high proportion of CD90+ cells reduce the functional benefits of EDCs therapy. Consistent with this observation, it has recently been shown that the CD90- population constitutes the active fraction in terms of therapeutic efficacy. In order to gain insight into the ionic determinants of EDCs function, the electrophysiological properties of the CD90+ and CD90- populations were studied. Considering the importance of KCa3.1 in c-Kit+ CPCs, we evaluated the presence of KCa channels in human EDCs. We have identified 2 types of KCa channels in ex vivo expanded EDCs. While KCa1.1 (BKCa; KCNMA1) channel was homogeneously expressed in both subpopulations, KCa3.1 was found exclusively in the CD90- cell fraction. Similar to our previous observations in freshly isolated c-Kit+ eCPCs, KCa3.1 was responsible for the determination of Vmem under resting conditions and during SOCE. Importantly, we demonstrated that transplantation of genetically-modified EDCs to over-express KCNN4 potentiates cardiac regeneration in a murine model of ischemic cardiomyopathy. This study provides the first evidence in the literature that modulating the activity of a single plasma membrane ion channel can truly improves the therapeutic efficacy of progenitor cells.

Candida albicans est une levure pathogène qui, à l’état commensal, colonise les muqueuses de la cavité orale et du tractus gastro-intestinal. De nature opportuniste, C. albicans cause de nombreuses infections, allant des candidoses superficielles (muguet buccal, vulvo-vaginite) aux candidoses systémiques sévères. C. albicans a la capacité de se développer sous diverses morphologies, telles que les formes levures, pseudohyphes et hyphes. Des stimuli environnementaux mimant les conditions retrouvées chez l’hôte (température de 37°C, pH neutre, présence de sérum) induisent la transition levure-à-hyphe (i.e. morphogenèse ou filamentation). Cette transition morphologique contribue à la pathogénicité de C. albicans, du fait que des souches présentant un défaut de filamentation sont avirulentes. Non seulement la morphogenèse est un facteur de virulence, mais elle constituerait aussi une cible pour le développement d’antifongiques. En effet, il a déjà été démontré que l’inhibition de la transition levure-à-hyphe atténuait la virulence de C. albicans lors d’infections systémiques. Par ailleurs, des études ont démontré que de nombreuses molécules pouvaient moduler la morphogenèse. Parmi ces molécules, certains acides gras, dont l’acide linoléique conjugué (CLA), inhibent la formation d’hyphes. Ainsi, le CLA posséderait des propriétés thérapeutiques, du fait qu’il interfère avec un déterminant de pathogénicité de C. albicans. Par contre, avant d’évaluer son potentiel thérapeutique dans un contexte clinique, il est essentiel d’étudier son mode d’action. Ce projet vise à caractériser l’activité anti-filamentation des acides gras et du CLA et à déterminer le mécanisme par lequel ces molécules inhibent la morphogenèse chez C. albicans. Des analyses transcriptomiques globales ont été effectuées afin d’obtenir le profil transcriptionnel de la réponse de C. albicans au CLA. L’acide gras a entraîné une baisse des niveaux d’expression de gènes encodant des protéines hyphes-spécifiques et des régulateurs de morphogenèse, dont RAS1. Ce gène code pour la GTPase Ras1p, une protéine membranaire de signalisation qui joue un rôle important dans la transition levure-à-hyphe. Des analyses de PCR quantitatif ont confirmé que le CLA inhibait l’induction de RAS1. De plus, le CLA a non seulement causé une baisse des niveaux cellulaires de Ras1p, mais a aussi entraîné sa délocalisation de la membrane plasmique. En affectant les niveaux et la localisation cellulaire de Ras1p, le CLA nuit à l’activation de la voie de signalisation Ras1p-dépendante, inhibant ainsi la morphogenèse. Il est possible que le CLA altère la structure de la membrane plasmique et affecte indirectement la localisation membranaire de Ras1p. Ces travaux ont permis de mettre en évidence le mode d’action du CLA. Le potentiel thérapeutique du CLA pourrait maintenant être évalué dans un contexte d’infection, permettant ainsi de vérifier qu’une telle approche constitue véritablement une stratégie pour le traitement des candidoses. / The yeast Candida albicans is an inhabitant of the oral cavity, the gastrointestinal and genitourinary tracts of humans. Generally encountered as a commensal, it is also an opportunistic pathogen that causes a spectrum of infections, ranging from superficial mycoses (thrush, vulvovaginitis) to severe and life-threatening systemic infections. A striking feature of C. albicans is its ability to grow in different morphological forms, including budding yeasts, pseudohyphae, and hyphae. Environmental cues that mimic host conditions (elevated temperature, neutral or alkaline pH, and serum) induce the yeast-to-hypha transition. Morphogenesis is considered to be an attribute of pathogenesis, as mutants locked as yeasts or filamentous forms are avirulent. Given that the yeast-to-hypha transition is a virulence factor, it may also constitute a target for the development of antifungal drugs. Indeed, evidence has shown that impairing morphogenesis is a means to treat systemic candidiasis. Concurrently, a number of molecules have been reported to modulate morphogenesis in C. albicans. For instance, several fatty acids, including conjugated linoleic acid (CLA), inhibited the yeast-to-hypha transition. By interfering with an important attribute of C. albicans pathogenesis, CLA may harbor antifungal properties. However, before assessing its therapeutic potential in a clinical context, it is mandatory to address CLA’s mode of action. The present study aims to further characterize the hypha-inhibiting properties of fatty acids and CLA and to elucidate the mechanism by which these molecules inhibit the yeast-to-hypha transition in C. albicans. Gene expression analyses were performed to gain insight into the transcriptional response of cells to CLA on a genome-wide scale and to probe the fatty acid’s mode of action. CLA downregulated the expression of hypha-specific genes and blocked the induction of genes encoding regulators of hyphal growth, including that of RAS1, which encodes the small GTPase Ras1p. A membrane-associated signaling protein, Ras1p plays a major role in morphogenesis. Quantitative PCR analyses showed that CLA prevented the increase in RAS1 mRNA levels which occurred at the onset of the yeast-to-hypha transition. Unexpectedly, CLA reduced the steady-state levels of Ras1p. Additionally, CLA caused the delocalization of GFP-Ras1p from the plasma membrane. These findings indicate that CLA treatment results in suboptimal Ras1p cellular concentrations and localization, which impedes Ras1p signaling and inhibits the yeast-to-hypha transition. CLA may indirectly affect Ras1p localization by altering the structure of the plasma membrane. These studies have provided the mechanism underlying CLA’s hypha-inhibiting properties and may serve as the rationale to examine CLA’s therapeutic potential in the context of a Candida infection. There is a general lack of clinical evidence demonstrating that impairing morphogenesis is a sound approach to treat candidiasis. To remedy this situation, the therapeutic potential of molecules that modulate morphogenesis, such as CLA, should be clinically assessed.

L’architecture polarisée des neurones est mise en place est maintenue grâce à un adressage hautement contrôlé de protéines vers l’axone ou vers le compartiment somatodendritique. Parmi ces protéines, les récepteurs aux protéines G (RCPG) neuronaux sont des cibles pharmacologiques clés. Cependant, leur pharmacologie est généralement étudiée dans des lignées cellulaires non polarisées et les résultats obtenus dans ces systèmes ne caractérisent pas correctement les effets physiologiques de l’activation des RCPG présents dans le cerveau. Par conséquent, un des principaux sujets de recherche de notre équipe est de comprendre comment la polarité neuronale influe sur la pharmacologie des RCPG, en étudiant l’un des RCPG les plus abondants dans le cerveau : le récepteur cannabinoïque de type-1 (CB1R). Les études précédentes de notre groupe ont suggéré que CB1R acquiert une polarisation axonale grâce à un adressage transcytotique : après leur synthèse, ces récepteurs apparaissent sur la membrane plasmique somatodendritique d’où ils sont rapidement enlevés par endocytose constitutive puis adressés à la membrane plasmique axonale où ils s’accumulent du fait d’une endocytose réduite. Au début de ma thèse, nous avons directement mesuré cette endocytose différentielle et le transport transcytotique de CB1R en utilisant des neurones de rats mis en culture dans des dispositifs microfluidiques. De plus, nous avons montré que des traitements pharmacologiques prolongés peuvent fortement changer la distribution de RCPG à la surface neuronale. Ces résultats démontrent que l’équilibre endocytotique dépendant du compartiment neuronal, qui est contrôlable pharmacologiquement, est important pour la distribution des RCPG neuronaux. Dans une seconde partie, nous avons étudié si le trafic différentiel de CB1R entre axones et dendrites est corrélé avec une pharmacologie différentielle. CB1R est majoritairement couplé à des protéines de type Gi/o et est connu pour inhiber la production d’AMPc. Nous avons donc développé l’imagerie par Föster Resonance Energy Transfer (FRET) appliqué aux cultures de neurones d’hippocampe de rats afin de mesurer la modulation de la voie de signalisation AMPc/PKA en aval de CB1R endogènes dans l’ensemble des compartiments neuronaux : somata, dendrites, mais aussi dans les axones matures très fins. Nos résultats montrent que CB1R possède une pharmacologie différente entre les dendrites et les axones. Notamment, son activation conduit à une diminution plus forte de l’activité basale de la PKA dans les axones comparé aux dendrites, lié au plus grand nombre de récepteurs présents sur la membrane de ce compartiment. De plus, nous démontrons que, contrairement aux récepteurs axonaux, les CB1R somatodendritiques inhibent constitutivement la voie AMPc/PKA. Cette différence est due à la distribution polarisée de la DAGLipase, l’enzyme synthétisant l’endocannabinoïde principal, le 2-arachidonoyglycerol (2-AG). De plus, l’inhibition pharmacologique de la DAGL modifie l’efficacité de plusieurs agonistes de CB1R dans le compartiment somatodendritique mais pas dans l’axone. Cet effet pourrait être dû à une modulation allostérique. Dans une troisième partie, nous avons étudié si les résultats ci-dessus peuvent être généralisés à d’autres RCPG. Etant donné que l’adressage axonal et la pharmacologie in vitro des récepteurs sérotoninergiques 5-HT1B montrent de fortes similitudes avec ceux de CB1R, nous avons étudié la pharmacologie de ces récepteurs en utilisant la technique de FRET développée précédemment. De façon similaire, nous avons trouvé une pharmacologie différentielle entre l’axone et les dendrites. / Polarized neuronal architecture is achieved and maintained mainly through highly controlled targeting of proteins to axons versus to the somatodendritic compartment. Among these proteins, neuronal G protein coupled receptors (GPCRs) are key therapeutic targets. However, their pharmacology is generally studied in non-polarized cell lines, and results obtained in such systems likely do not fully characterize the physiological effects of brain GPCR activation. Therefore, a main research subject of our group is to understand how neuronal polarity influences GPCR pharmacology, by studying one of the most abundant GPCR in the brain: the type-1 cannabinoid receptor (CB1R). Previous studies of the group suggested that CB1Rs achieve axonal polarization through transcytotic targeting: after their synthesis, these receptors appear on the somatodendritic plasma membrane from where they are removed rapidly by constitutive endocytosis and then targeted to the axonal plasma membrane where they accumulate due to relatively reduced endocytosis rate. At the beginning of my PhD project we directly demonstrated this differential endocytosis and transcytotic transport of CB1Rs by using cultured neurons in microfluidic devices. Moreover, we showed that chronic pharmacological treatments may strongly change neuronal GPCR distribution on the neuronal surface. These results demonstrate that subdomain-dependent steady-state endocytosis, which is pharmacologically controllable, is important for GPCR distribution in neurons. In a second part, we asked if differential traffic of CB1Rs between axons and dendrites is correlated with differential pharmacology. CB1R is predominantly coupled to Gi/o proteins and is known to inhibit cAMP production. Thus, we developed live Föster Resonance Energy Transfer (FRET) imaging in cultured hippocampal neurons in order to measure basal cAMP/PKA pathway modulation downstream of endogenous CB1Rs in all neuronal compartments: in somata, in dendrites but also in the very thin mature axons. Our results show that CB1R displays differential pharmacology between axon and dendrites. Notably, its activation leads to a stronger decrease of PKA activity in axons compared to dendrites, due to increased number of membrane receptors in this compartment. Moreover, we demonstrate that somatodendritic CB1Rs constitutively inhibit cAMP/PKA pathway, while axonal receptors do not. This difference is due to polarized distribution of DAGLipase, the enzyme that synthesizes the major endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG). Moreover, blocking DAGL by pharmacological treatment modifies somatodendritic, but not axonal effects of several CB1R agonists, possibly through allosteric action. In a third part, we asked if the above results may be generalized to other GPCRs. Because the axonal targeting and in vitro pharmacology of 5-HT1B serotonin receptors demonstrate strong similarities with CB1Rs, we studied their neuronal pharmacology by using the previously developed FRET technique. We found similar differential responses to pharmacological treatments between axon and dendrites. In a fourth part, we investigated the role of the threonine 210 (T210) residue in the constitutive activity of neuronal CB1R. We showed that the hypoactive mutant T210A-CB1R do not constitutively recruit signaling pathways even in somatodendritic compartment, where 2-AG is present. This result demonstrates that T210 is necessary for constitutive CB1R activation by 2-AG.Finally, previous results of our group demonstrated the involvement of CB1R in neuronal development. Notably, CB1R activation was shown to have an overall inhibitory effect on the development of polarized neuronal morphology. We established a bibliographic review on this subject. The published literature data suggest that not only neuronal polarization influences both CB1R traffic and pharmacology but CB1Rs also contribute to the achievement of neuronal polarization. (...)

Les plantes présentent une forme d’immunité innée face à des agents potentiellement pathogènes qui se traduit par l’induction de réponses de défense. Les réponses immunes des plantes sont induites après détection de motifs moléculaires associés à des pathogènes ou à des micro-organismes par des récepteurs reconnaissant spécifiquement ces motifs et/ou des molécules dérivées des agents pathogènes ou de la plante, appelés éliciteurs de réaction de défense. La cryptogéine (Cry) et les oligogalacturonates (OGs) sont des éliciteurs établis de réactions de défense et leur reconnaissance induit une signalisation Ca2+-dépendante : un influx calcique et une variation de la concentration cytosolique en Ca2+ libre ([Ca]cyt) sont des événements précoces induisant une voie de signalisation de défense. Nous avons démontré que chez le tabac, les éliciteurs induisent une signalisation calcique dans les mitochondries et les chloroplastes. Des études pharmacologiques indiquent que des canaux IP3-dépendants régulent la signalisation calcique induite par la Cry dans les mitochondries et les chloroplastes. La respiration mitochondriale et les mécanismes de dissipation de l’énergie dans les chloroplastes sont régulés en partie par la [Ca2+] dans ces organites. De plus, nous montrons par des approches pharmacologiques et génétiques, que des homologues aux récepteurs du glutamate (GLRs) participent à la signalisation calcique induite par les OGs dans Arabidopsis. Les GLRs contrôlent en partie la production d’oxyde nitrique (NO) et d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ainsi que l’expression de gènes de défense. Par ailleurs, les plantes traitées par des antagonistes des GLRs, présentent une moindre résistance au pathogène fongique nécrotrophique, Botrytis cinerea et à l’oomycète biotrophique, Hyaloperonospora arabidopsidis. L’analyse de mutants Atglr révèle l’importante contribution de AtGLR3.3 dans la résistance envers H. arabidopsidis. De plus, de frappantes similarités dans l’expression de gènes sont observées après traitement par les OGs ou après infection par H. arabidopsidis. Enfin, une analyse transcriptomique montre qu’environ 60 % des gènes modulés par les OGs ont une expression qui dépend de GLRs. Ces gènes dépendants de GLRs appartiennent à diverses familles fonctionnelles dont celle répondant aux stress biotiques. En conclusion, ces études montrent 1) que les mitochondries et les chloroplastes présentent aussi une signalisation calcique induite par des éliciteurs de réaction de défense chez le tabac et 2) l’implication de GLRs dans la signalisation calcique induite par des éliciteurs ou des agents pathogènes et la résistance envers des agents pathogènes chez Arabidopsis / Plants do not display an adaptive immune system but express an efficient innate immune system defending them by inducing sophisticated multilevel defense responses against different potential pathogens. Indeed, plant immune responses are triggered upon the detection of many common pathogen- or microbe-associated molecular patterns (PAMPs/MAMPs) through specific pattern-recognition receptors (PRRs) and/or pathogen- or plant-derived signal molecules called elicitors. Cryptogein (Cry) and oligogalacturonides (OGs) are well known elicitors of defense reactions and their recognition induce a Ca2+-dependent signaling pathway: Ca2+ influx and subsequent free cytosolic [Ca2+] ([Ca2+]cyt) variations are earliest steps to trigger downstream plant defense signaling. Here we have demonstrated that elicitor-induced Ca2+ signaling in tobacco also takes place in mitochondria and chloroplasts. Pharmacological studies indicated that IP3-channels play an important role in the regulation of Ca2+ signaling in mitochondria and chloroplasts. Mitochondrial respiration and energy dissipation mechanisms in chloroplasts are partly controlled by [Ca2+] in these organelles. Moreover, using pharmacological and genetic approaches, our data demonstrated that glutamate receptors homologs (GLRs) participate in OGs-mediated Ca2+ signaling in Arabidopsis. GLRs partly control OGs-induced nitric oxide (NO) production, reactive oxygen species (ROS) production and expression of defense-related genes. Importantly, plants treated with GLRs antagonists exhibited compromised resistance to necrotrophic fungal pathogen, Botrytis cinerea and biotrophic oomycete, Hyaloperonospora arabidopsidis. Analysis of Atglr single mutants revealed the important contribution of AtGLR3.3 in resistance against H. arabidopsidis. Moreover, striking similarities in gene expression levels were observed after OGs elicitation/H. arabidopsidis infection. Finally, transcriptomic analysis demonstrated that about 60 % of the total OGs-modulated genes modified their expression in GLRs-dependent manner. These GLRs-dependent genes belong to different functional categories including the category “responses to biotic stresses”. Taken together, these data provide strong evidences of 1) elicitor-induced Ca2+ signaling in mitochondria and chloroplasts in tobacco and 2) the regulation of elicitor/pathogen mediated plant defense signaling pathways through GLRs in Arabidopsis thaliana

Le récepteur D de l'interleukine-17 (IL-17RD), également connu sous le nom d'expression similaire aux gènes FGF (SEF), est un membre de la famille des récepteurs de l'IL-17 et une protéine carrefour qui régule principalement négativement les voies de signalisation mitogènes, comme la voie des MAP kinases ERK1/2 et la signalisation immunitaire innée. Au vu du nombre grandissant d’évidences montrant que l'expression d’IL-17RD est régulée à la baisse dans une variété de tumeurs solides, nous et d'autres équipes avons émis l'hypothèse qu'elle pourrait exercer des fonctions de suppression de tumeur. Cependant, le rôle d’IL-17RD dans la biologie tumorale reste à étudier in vivo. Dans une première étude, en combinant l’analyse d’une cohorte longitudinale de vieillissement et d’un modèle de cancer colorectal associé à la colite, nous avons découvert qu’IL-17RD est un véritable gène suppresseur de tumeur in vivo. Nous avons constaté que la perturbation génétique d’Il17rd entraîne une augmentation de la formation de tumeurs dans les deux modèles. De manière intéressante, le développement d'une tumeur dans le modèle de cancer colorectal associé à la colite a été associé à une réponse inflammatoire exacerbée. Parce qu'il est désormais généralement admis que l'inflammation et le cancer sont liés et que nous n’avons observé aucun changement dans la prolifération et l'activation de la voie des MAP kinases ERK1/2 dans les cellules épithéliales intestinales normales ou tumorales lors de l'inactivation génétique de l'IL-17RD, nos résultats établissent l'IL-17RD comme suppresseur de tumeur qui exerce sa fonction en limitant l'étendue et la durée de l'inflammation. Nous avons en outre montré que la perte d’IL-17RD accroît les signalisations du récepteur de type Toll et de l'IL-17A dans les cellules d'adénocarcinome du côlon. Dans une deuxième étude, nous avons évalué l'étendue du potentiel régulateur d'IL-17RD dans l'inflammation. Notre étude révèle qu'IL-17RD régule non seulement l'immunité innée médiée par le TLR et l'IL-17, mais inhibe également l'immunité innée antivirale médiée par les capteurs d'acide nucléique, à savoir la signalisation induite par RIG-I. Ces résultats établissent IL-17RD comme un nouveau régulateur de la réponse immunitaire innée antivirale. En conclusion, nos études sur le rôle d'IL-17RD dans la cancérogenèse et la signalisation immunitaire innée ont établi une fonction suppresseur de tumeur liée à une inflammation accrue in vivo et ont étendu sa fonction inhibitrice à la réponse cytoplasmique antivirale. / Interleukin-17 receptor D (IL-17RD), also known as Similar expression to FGF genes (SEF) is a member of the IL-17 receptor family and a signaling hub that negatively regulates mitogenic signaling pathways, such as the ERK1/2 MAP kinase pathway, and innate immune signaling. With the growing evidence that IL-17RD expression is down-regulated in a variety of solid tumors, we and others hypothesized that it may exert tumor suppressor functions. However, the role of IL-17RD in tumor biology remained to be studied in vivo. In a first study, combining analysis of a longitudinal aging cohort and a colitisassociated colorectal cancer model, we uncovered that IL-17RD is as a bona fide tumor suppressor gene in vivo. We found that genetic disruption of Il17rd leads to increased tumor formation in both models. Interestingly, tumor development in the model of colitisassociated colorectal cancer was associated with an exacerbated inflammatory response. Because it is now generally accepted that inflammation and cancer are linked, and because no change in the proliferation and ERK1/2 MAP kinase activation of normal or tumor intestinal epithelial cells was observed upon genetic inactivation of IL-17RD, our findings establish IL-17RD as a tumor suppressor that exerts its function by limiting the extent and duration of inflammation. We further showed that depletion of IL-17RD enhances Toll-like receptor and IL-17A signaling in colon adenocarcinoma cells. In a second study, we have evaluated the extent of the regulatory potential of IL-17RD in inflammation. Our study reveals that IL-17RD not only regulates TLR and IL-17 mediated innate immunity but also inhibits antiviral innate immunity mediated by nucleic acid sensors, namely RIG-I signaling. Our findings establish IL-17RD as a new regulator of antiviral innate immune response mediated by RIG-I. Altogether, our studies on the role of IL-17RD in carcinogenesis and innate immune signaling have uncovered a tumor suppressor function linked to increased inflammation in vivo and extended its inhibitory function to the antiviral cytoplasmic response.

La reproduction est un événement crucial pour la vie des plantes. Ce processus nécessite la formation du pollen et des ovules. Les cellules germinales vont subir la méiose puis une succession de mitoses, deux pour le pollen et trois pour l’ovule, ce qui va leur permettre d’acquérir leurs structures finales. Une fois formés, ces deux gamètes doivent se rencontrer. Pour cela, le grain de pollen va germer sur le stigmate puis former le tube pollinique. Le tube pollinique en croissance va traverser les différents tissus femelles et ainsi tracter les deux cellules spermatiques jusqu’à l’ovule, permettant la reproduction. Un important réseau de signalisation cellulaire est nécessaire pour permettre ces événements. Les cascades des Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) sont l’un des réseaux de signalisation les plus étudiés chez les plantes. Ces kinases sont impliquées dans de très nombreux processus développementaux tels que la formation de l’embryon ou des stomates. Pour autant, leurs rôles restent encore peu caractérisés pendant de la fécondation. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle que jouent les MAPK lors de la formation des gamètes mâles et femelles ainsi que lors de la croissance des tubes polliniques. Plusieurs membres de la superfamille des MAPKs ont été caractérisés pour leurs rôles dans la reproduction sexuée des végétaux. De précédents travaux dans le laboratoire de Daniel P. Matton, ont démontré l’implication de deux MAPK Kinases Kinases (MAP3K), la Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) et ScFRK2. Ces deux kinases sont nécessaires pour le développement de l’ovule et du pollen chez S. chacoense, une espèce de pomme de terre sauvage diploïde. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction d’une nouvelle ScFRK, la ScFRK3. Ce troisième membre de la classe des FRKs chez S. chacoense, est, elle aussi, impliquée dans le développement des gamétophytes mâles et femelles. Du patron d’expression jusqu’à l’établissement d’une voie de signalisation potentielle, en passant par la caractérisation phénotypique des mutants, plusieurs expériences ont été réalisées dans le but de comprendre le rôle de ScFRK3 lors de la formation des gamètes chez Solanum chacoense. Nous montrons que la ScFRK3 est impliquée dans la formation du pollen ainsi que celui des ovules. Nous avons ensuite poursuivi nos recherches en affinant le phénotypage du mutant de surexpression ScFRK2. En effet, les précédentes études ont permis de montré que la surexpression de ScFRK2 conduit le primordium ovulaire à la formation de structures carpéloïdes. Pour autant, les ensembles des primordius ovulaires ne sont pas devenu des strutures capéloïde. Nous montrons ici que seulement 10 % des ovules dans l'ovaire sont devenu 4 des carpéloïde. Notre étude montre qu’en plus des structures carpéloïdes, un grand nombre d'ovule n'ont pas de sac embryonnaire à l'anthèse ce qui explique le faible nombre de graines par fruit. L’analyse du développement des sacs embryonnaires monte que la surexpression de ScFRK2 entraine l’arrêt au stade mégaspore fonctionnelle. Ce phénotype est similaire à ce qui a pu être observé dans les lignées ARN interférant pour la ScFRK1 et la ScFRK3. De précédentes études faites chez Arabidopsis thaliana semblent montrer que les membres de la superfamille des MAPK ne sont pas essentiels pour la croissance du tube pollinique. Pour comprendre le rôle que jouent les MAPK dans l’élongation du tube pollinique, nous avons utilisé un inhibiteur des MAP Kinase Kinase (MKK), appelé U0126. La présence de cette drogue dans le milieu de croissance des grains de pollen provoque une diminution de la germination et de l’élongation du tube pollinique. L’utilisation de la méthode semi-in vivo montre une perte de la polarisation de la croissance des tubes polliniques causée par l’inhibition des MKK. La présence de l’inhibiteur conduit à la diminution de la quantité de filaments d’actine ainsi qu’à leur désorganisation à l’apex du tube. L’exocytose est aussi affectée par l’inhibition des MKK. Les cascades MAPK sont nécessaires à la croissance polarisée du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana. Pour finir, nous avons voulu identifier certains membres de la superfamille des MAPK impliqués dans la croissance du tube pollinique. Nous nous sommes intéressés en premier lieu aux orthologues de la famille ScFRK chez Arabidopsis thaliana. Les AtMAP3K19-20-21 sont les orthologues les plus proches de ScFRK3. Ces AtMAP3K sont exprimées lors du développement des grains de pollen et lors de l’élongation de tube pollinique. L’analyse du pollen des différentes lignées mutantes montre qu’en leur absence, le pollen ne présente aucun problème de développement contrairement à ScFRK3. Par contre, les doubles mutants et le triple mutant pour les AtMAP3K19-20-21 montrent une diminution de la capacité de germination. L’élongation du tube pollinique est affectée lors de la mutation d’au moins une des AtMAP3K. Ces deux études démontrent que les MAPK sont essentielles dans la formation et l’élongation du tube pollinique. / Reproduction is a crucial event for plant life. This process requires the formation of pollen and ovules. The germ cells will undergo meiosis and then a succession of mitosis, two for the pollen and three for the ovule, which will allow them to acquire their final structures. Once formed, these two gametes must meet each other. For this, the pollen grain will germinate on the stigmas to form the pollen tube. The growth of the pollen tube will pass through the different female tissues and thus pull the two sperm cells to the ovum for reproduction. An important cellular signaling network is necessary to allow these events to occur. The Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPKs) cascades are one of the most studied signaling networks in plants. These kinases are involved in a wide range of developmental processes such as embryo formation and stomata. However, their roles remain poorly characterized during fertilization. The aim of this project is to better understand the role played by MAPKs during the formation of male and female gametes as well as during the growth of pollen tubes. Several members of the MAPK superfamily have been characterized for their role in the sexual reproduction of plants. Previous work in Daniel P. Matton's laboratory has demonstrated the involvement of two MAPK Kinases (MAP3K), Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) and ScFRK2. These two kinases are necessary for egg and pollen development in S. chacoense, a diploid wild potato species. In a first step, we studied the functionality of a new ScFRK, ScFRK3. This third member of the class of FRKs in S. chacoense, is also involved in the development of male and female gametophytes. From the expression pattern to the establishment of a potential signaling pathway, through the phenotypic characterization of mutants, several experiments have been performed in order to understand the role of ScFRK3 in the formation of gametes in S. chacoense. We show that ScFRK3 is involved in the formation of pollen as well as that of the embryonic sac. We then continued our research by refining the phenotyping of the overexpression mutant ScFRK2. Indeed, previous studies have shown that ScFRK2 overexpression leads the ovular primordium to the formation of carpeloid structures. However, the sets of ovular primordia have not become capeloid structures. We show here that only 10% of the eggs in the ovary have become carpeloid. Our study shows that in addition to the carpeloid structures, a large number of ova do not have an embryonic sac in the anthesis, which explains the low number of seeds per fruit. The analysis of the development of the embryonic sacs shows that 7 overexpression of ScFRK2 leads to the cessation of the functional megaspore stage. This phenotype is similar to what has been observed in interfering RNA lines reducing expression of ScFRK1 and ScFRK3. Previous studies in Arabidopsis thaliana suggest that members of the MAPK superfamily are not essential for pollen tube growth. To understand the role that MAPKs play in pollen tube elongation, we used a MAP Kinase Kinase (MKK) inhibitor called U0126. The presence of this drug in the growth medium of pollen grains causes a decrease in germination and elongation of the pollen tube. The use of the semi in vivo method shows a loss of polarization of the pollen tube growth caused by the inhibition of MKK. The presence of the inhibitor leads to a decrease in the number of actin filaments and their disorganization at the apex of the tube. Exocytosis is also affected by MKK inhibition. We show in this chapter that MAPK cascades are necessary for polarized pollen tube growth in Arabidopsis thaliana. Finally, we wanted to identify some members of the MAPK superfamily involved in pollen tube growth. We were first interested in the ScFRK family orthologs in Arabidopsis thaliana. AtMAP3K19-20-21 are the closest orthologs to ScFRK3. These AtMAP3K are expressed during the development of pollen grains and during the elongation of the pollen tube. Pollen analysis of the different mutant lines shows that in their absence the pollen does not present any development problems unlike ScFRK3. On the other hand, double mutants and triple mutant for AtMAP3K19-20-21 show a decrease in germination capacity. Pollen tube elongation is affected when at least one of the AtMAP3Ks is mutated. These two studies demonstrate that MAPKs are essential for the formation and elongation of the pollen tube and that AtMAP3K19-20-21 participate in these biological processes.

Le réticulum endoplasmique et la mitochondrie sont deux organites majeurs impliqués dans la régulation du métabolisme glucido-lipidique. Ces structures interagissent au niveau de points de contact étroits appelés Mitochondria-Associated Endoplasmique Reticulum Membranes (MAMs). Les MAMs sont une zone de communication et d’échanges, de lipides et de calcium entre autre, indispensables à l’activité des deux organites et au maintien de l’homéostasie cellulaire. Des connexions physiques sont assurées par l’interaction de protéines complémentaires, comme le canal anionique voltage-dépendant (VDAC)-1, la protéine chaperonne (Grp)-75 et le récepteur de l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP3R)-1, constituant un complexe impliqué dans le transfert de calcium. D’autres acteurs comme les mitofusines 1 et 2 (MFN1/2) assurent également un rapprochement entre les deux organites et semblent jouer un rôle dans les échanges des lipides. Récemment, les MAMs sont apparues comme un nouveau carrefour de la signalisation de l’insuline dans le foie. Le monoxyde d’azote (NO) participe également au contrôle de la réponse à l’insuline hépatique et a une action spécifique sur la mitochondrie. Mes travaux de thèse ont montré que le NO à des concentrations physiologiques module les interactions entre le RE et la mitochondrie dans le foie et que son action sur les MAMs implique la voie de signalisation sGC/cGMP/PKG. J’ai également démontré que la modulation des MAMs par le NO semble jouer un rôle clé dans la régulation de la voie de signalisation à l’insuline (projet1). Par ailleurs, j’ai exploré l’importance des MAMs dans la régulation du métabolisme lipidique. Pour cela, j’ai modulé l’expression protéique de Grp75 et Mfn2 sur un modèle d’hépatocarcinome humain (Huh7). Mes résultats ont montré qu’une surexpression des deux protéines améliore les MAMs et la β-oxydation mitochondriale mais conduit à une accumulation intracellulaire de lipides. Ceci serait dû à un défaut de sécrétion des lipides dans les lipoprotéines VLDL et pourrait impliquer l’apparition d’un stress mitochondrial et une altération des échanges de phospholipides entre les deux organites (projet 2). Par conséquence mon travail confirme le rôle physiologique des MAMs et éclaire les mécanismes d’actions de cette plateforme cellulaire dans la régulation du métabolisme glucido-lipidique hépatique. A plus long terme ces connaissances participeront peut-être à l’identification de potentielles cibles thérapeutiques afin de prévenir la stéatose et la résistance à l’insuline hépatiques et leurs complications / The endoplasmic reticulum and mitochondria are two major organelles involved in the regulation of glucose and lipid metabolism. These structures interact at close contact points called Mitochondria-Associated Endoplasmic Reticulum Membranes (MAMs). MAMs constitute an area of communication and exchange, of lipids and calcium among others, essential for the activity of both organelles and the maintenance of cellular homeostasis. Physical connections are ensured by the interaction of complementary proteins, such as the voltage-dependent anionic channel (VDAC)-1, the chaperone protein (Grp)-75 and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R)-1, constituting a complex involved in calcium transfer. Other actors such as mitofusins 1 and 2 (MFN1/2) also connect the two organelles and are involved in lipid exchanges. Recently, MAMs have emerged as a new carrefour for insulin signaling in the liver. Nitric oxide (NO) also helps control the response to hepatic insulin and has a specific action on mitochondria. My thesis work showed that NO at physiological concentrations modulates the interactions between RE and mitochondria in the liver and that its action on MAMs involves the sGC/cGMP/PKG signalling pathway. I also demonstrated that NO modulation of MAMs plays a key role in regulating the insulin signaling pathway (project 1). In addition, I explored the importance of MAMs in the regulation of lipid metabolism. For that purpose, protein expression of Grp75 and Mfn2 was modulated in a human hepatocarcinoma model (Huh7). Results showed that overexpression of both proteins improves MAMs and mitochondrial β-oxidation but leads to intracellular lipid accumulation. This could be due to a defect in lipid secretion in VLDL lipoproteins and could imply the appearance of mitochondrial stress and an alteration of phospholipid exchanges between the two organelles (project 2). Consequently, my work confirms the physiological role of MAMs and sheds light on the mechanisms of action of this cellular platform in the regulation of glucose and lipid metabolism in the liver. In the longer term, this knowledge may contribute to the identification of potential therapeutic targets to prevent steatosis and hepatic insulin resistance and their complications