Au cours de la myogenèse post-natale, la voie de signalisation de Notch participe au développement et à la régénération du muscle squelettique chez les mammifères. Elle permet le maintien de l'état prolifératif des myoblastes, contrôle la quiescence des cellules satellites in vivo et préserve une sous-population de cellules de réserve indifférenciées in vitro. L' activation de la voie et l'interaction du récepteur Notch avec ses ligands est dépendante de leur entité glucidique, notamment de leurs O-fucosylglycannes. La synthèse de ces derniers est initiée par la protéine O-fucosyltransférase 1 (Pofut1) qui greffe un O-fucose sur des domaines peptidiques particuliers appelés EGF-like. Bien que les acteurs moléculaires de la différenciation myogénique aient été largement étudiés par la communauté scientifique, la contribution de la glycosylation des protéines dans ce processus reste peu documentée. Une approche expérimentale in vitro basée sur l'utilisation de la lignée myoblastique murine C2C12 nous a permis d'identifier une expression importante de Pofut1 dans les cellules de réserve tandis qu' elle est restreinte dans les myotubes durant la différenciation myogénique. Plusieurs lignées de cellules C2C12 ont été générées pour qu' elles expriment de manière stable et différentielle Pofut1. Elles permettent ainsi d' évaluer l' importance du niveau d' expression de Pofut1 sur la différenciation myogénique.La sous-expression de Pofut1 réduit l' activation de la voie de signalisation de Notch conduisant à une entrée précoce des myoblastes dans le programme myogénique. Ceci a pour conséquence la dépletion des cellules de réserve Pax7+/MyoD- au profit d' une augmentation du nombre de myotubes. Des études morphométriques ont révélé un défaut d' accrétion nucléaire dans les myotubes sous-exprimant Pofut1, caractéristique d' une altération de la fusion secondaire. Ces observations sont accompagnées d' une diminution significative de l' expression du récepteur à l' interleukine 4 dans les cellules de reserve sous-exprimant Pofut1. Les lignées cellulaires ré-exprimant Pofut1 présentent une activation de la voie de signalisation de Notch et un processus de fusion myoblastique correctement restaurés.Ces travaux de thèse ont mis en exergue pour la première fois le rôle essentiel de Pofut1 dans le devenir cellulaire et la fusion des myoblastes au cours de la différenciation myogénique. / During post-natal myogenesis, Notch signaling pathway is involved in the development and regeneration of skeletal muscle in mammals. It maintains progenitor cell properties during the development of the myogenic lineage and controls the transition of satellite cells from a quiescent to an active state and preserves a subpopulation of reserve cells, in cell culture, in an undifferentiated state. The interaction between Notch and its ligands and the activation of this signaling is mainly controlled by the activity of protein O-fucosyltranferase 1 (Pofut1) and thus by the O-fucosylation state of the EGF-like repeats.Although the molecular players in myogenic differentiation have been extensively studied by the scientific community, the contribution of glycosylated proteins in this process remains poorly documented. An experimental in vitro study based on the C2C12 mouse myoblast cell line allowed us to identify a high expression of Pofut1 in reserve cells while a low expression was found in myotubes during myogenic differentiation. Several C2C12 cell lines were generated to express Pofut1 at different levels. They were used to evaluate the contribution of Pofut1 expression to the myogenic differentiation.The knockdown of Pofut1 repressed Notch signaling pathway activation leading to an earlier entrance of myoblasts in myogenic program. This resulted in the depletion of reserve cells Pax7+/MyoD- and an increase in the number of myotubes. Morphometric analysis revealed a nuclear accretion defect in Pofut1 knockdown myotubes. A significant decrease in the expression of the interleukin-4 receptor in Pofut1 knockdown reserve cells was also observed. Cell lines re-expressing correctly Pofut1 restored Notch signaling pathway and subsequently myoblast fusion process.This thesis work highlights, for the first time, the crucial role of Pofut1 in the cell fate decision and the fusion of myoblasts during myogenic differentiation.

Le glioblastome (GBM), tumeur de plus haut grade du système nerveux central (OMS grade 4) a un pronostic très sombre, quelque soit le traitement, lié à une résistance à l’apoptose. L’erlotinib (Tarceva®, OSI 774) est un inhibiteur de la tyrosine kinase du récepteur au facteur de croissance épithélial (EGFR). L’hyper-expression et l’amplification du gène de l’EGFR dans 40 à 60% des GBM, fourni un rationnel pour utiliser l’erlotinib. Nous avons montré sur U87-MG et DBTRG-05MG, deux lignées de GBM, l’absence d’apoptose avec l’erlotinib, liée soit à un déficit en pro-caspase 3, soit à une accumulation d’αB-crystalline bloquant l’activation de la caspase-3. L’absence d’apoptose dévie alors la cellule vers l’autophagie. L’inhibition de l’autophagie par ARN interférents ou par la chloroquine permet d’obtenir une synergie avec l’erlotinib en induisant la mort des cellules tumorales à des doses acceptables.Les GBM ont composition cellulaire hétérogène, avec un petit nombre d’éléments appelés cellules souches cancéreuses (CSC). Douées d’auto-renouvellement, elles participent à la propagation tumorale et à la résistance aux traitements. Nous avons testé l’erlotinib sur trois lignées issues de GBM humains, ayant deux modes de croissance distincts selon les conditions de milieu: en neurosphères (NS) et de type adhérent. Erlotinib a un effet inhibiteur minime sur les trois lignées adhérentes, alors que l’effet est significatif sur les lignées NS, traduisant l’importance de la voie d’EGFR pour les NS. Dans les lignées en NS, l’erlotinib est efficace sur les cellules progénitrices, mais n’a pas d’action ni sur les cellules initiatrices de NS, ni sur les cellules différenciées. L’auto-renouvellement des NS n’est pas non plus altéré. L’association cyclopamine, inhibiteur pharmacologique de la voie de Hedgehog, -erlotinib est synergique en bloquant la croissance et l’initiation des NS, laissant présager une efficacité sur les CSC. Les résultats obtenus sur ces différents modèles permettent d’une part de préciser certains mécanismes de résistance des cellules de GBM, et aussi d’orienter les indications et le choix des traitements susceptibles d’être les plus efficaces. / Glioblastoma (GBM) is the most common primary central nervous system tumor in adults and the prognosis remains dismal, any treatment used. Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is amplified, overexpressed, and/or mutated in GBM, making it a rational for therapy. Erlotinib, an EGFR kinase inhibitor is strongly associated with clinical response in several cancers. We showed for U87-MG and DBTRG-05MG, two human GBM cell lines, that erlotinib can’t trigger apoptosis, related either to accumulation of αB-crystallin capable to impair caspase 3 cleavage, or to constitutive deficit for procaspase 3 in DBTRG-05MG. Apoptosis deficit switches the cell to autophagic process. Inhibition of autophagy with RNA interference or chloroquine resulted in sensitization of U87 and allowed a synergistic effect with erlotinib at therapeutic doses.Moreover, GBM showed a heterogeneous cell composition with cancer stem cells, progenitors and more differentiated cells. In this study, we test erlotinib in vitro on other GBM models: three cell lines established from surgically resected GBM specimens, grown along two features adherent and neurospheres. On the three differentiated adhering cell lines, erlotinib had only a moderate activity. Conversely, on neurosphere forming cell lines, erlotinib induced a strong inhibition of cell growth related to the EGFR amplification and EGFR expression. A short erlotinib exposure induced cell death primarily in nestin-positive cells; however it was found without effect on neurosphere initiating activity and self renewal. These results suggest that EGFR pathway activation is essential for the proliferation of GBM progenitor cells but dispensable for stem-like cancer cells self–renewal. As Hedgehog pathway is known to be activated in neural stem cells, we assayed the Hedgehog pathway inhibitor cyclopamine in association with erlotinib. While each drug separately was without effect on sphere initiation, their combination led to a 25 fold decrease in the sphere number (p=0.0004).These in vitro models are convenient to investigate resistance mechanisms in GBM. Furthermore, they focus on the necessity to exploit drug combinations for greatest efficiency.

L’hémostase primaire est un processus permettant la formation d’un clou plaquettaire qui sera stabilisé par un réseau de fibrine. Ce caillot est également consolidé grâce à des phases tardives de l’hémostase primaire résultant des fonctions plaquettaires ; il s’agit principalement de la rétraction qui diminue la taille du caillot afin de le stabiliser. Cette phase est déclenchée par une signalisation « outside-in », consécutive à l’activation de l’intégrine αIIbβ3 et à l’agrégation plaquettaire, et est dépendante d’une réorganisation du cytosquelette. Le premier objectif de ce travail a été d’étudier la signalisation impliquée dans la rétraction, et en particulier l’implication des protéines ROCK, MLCK, Rac-1 et de l’actine dans l’activité de la chaine légère de la myosine (MLC) . MLC est en effet une protéine clé de la réorganisation du cytosquelette. Nous avons mis en évidence une phosphorylation biphasique de MLC dont le deuxième pic, corrélé à la rétraction, est dépendant de Rac1 et de la polymérisation de l’actine. Cette étude a été appliquée à une pathologie, le syndrome de Lowe. Il s’agit d’une maladie génétique rare, également appelée OCRL (Oculo cérébro rénal de Lowe) en référence aux organes majoritairement touchés. Suite à l’observation d’événements hémorragiques per et postopératoires suggérant une instabilité du caillot et l’observation dans une étude précédente d’un temps d’occlusion allongé au PFA100®, nous avons mis en place une étude sur 15 patients et 15 témoins pour lesquels nous avons étudié les différentes phases de l’hémostase primaire. Outre une anomalie et un retard de maturation des mégacaryocytes, nous avons mis en évidence pour la première fois chez ces patients un défaut de la voie « outside-in » responsable d’une anomalie de l’étalement plaquettaire et de la rétraction du caillot. Ce défaut de rétraction, dû à un défaut d’activation de MLC, pourrait être en partie responsable des événements hémorragiques observés chez ces patients. / Primary hemostasis is a mechanism allowing platelet clot formation that is thereafter stabilized by a fibrin network. Fibrin clot is also consolidated following post occupancy events, mainly clot retraction that decrease clot size and thus strengthen it. This phase is triggered by « outside-in » signaling. It is consecutive to αIIbβ3 integrin activation and platelet aggregation, dependent on cytoskeleton organization. Our first objective was to investigate signaling events underlying retraction, and particularly the involvement of ROCK, MLCK, Rac-1, and actin in MLC (Myosin Light Chain) phosphorylation. Indeed, MLC, involved in cytoskeleton rearrangement, is a key protein of this mechanism. We described a MLC biphasic phosphorylation profile, which second peak was dependent of Rac1 and actin polymerization. In a second part, we studied clot retraction signaling in patients with the Lowe syndrome. It is a rare genetic disease, caused by absence of OCRL (oculo cerebro renal of Lowe) protein in reference to the majority of affected organs. The rationale of this study was a previous observation of hemorrhagic events during and after surgeries, suggesting clot instability. A thrombopathy was suggested by a closure time lengthening in the PFA-100 system. The study enrolled 15 patients and 15 controls. Besides a defect of megakaryocyte maturation, we described a defect of « outside-in » signaling responsible for spreading and clot retraction abnormality. This retraction defect, caused by a MLC activity defect, could be partly responsible for hemorrhagic events reported in these patients.

La formation de la jonction neuromusculaire des vertébrés (JNM), une synapse cholinergique périphérique entre les motoneurones et les fibres musculaires squelettiques repose sur la reconnaissance et l’apposition précise des motoneurones présynaptiques sur leurs cibles musculaires postsynaptiques. Les données de la littérature montrent que les morphogènes Wnt agissent comme des régulateurs clés de la formation de la JNM. Cependant, l'identité précise des Wnts, leur collaboration et les mécanismes moléculaires de la signalisation Wnt régissant la formation de la JNM restent encore incompris. A la JNM, la transduction du signal Wnt s’effectue par l'intermédiaire de l’interaction des Wnt soit avec le complexe formé par le récepteur tyrosine kinase MuSK et la lipoprotéine Lrp4 ou les récepteurs classiques Frizzled (Fzd). Dans cette thèse, nous avons étudié les mécanismes moléculaires de la formation de la JNM médiés par les Wnts. Nous avons montré que Wnt4 et Wn11 sont nécessaires pour l’étape indépendante du nerf de prepatterning musculaire, caractérisée par l’agrégation des récepteurs de l’acétylcholine (RACh) dans des domaines discrets de la surface du muscle où la future synapse va se former, via l'activation différentielle des voies canonique et polarité cellulaire planaire (PCP). De plus, Fzd3 et Vangl2, deux composantes essentielles de la voie PCP, sont accumulées à la JNM et sont impliquées distinctement dans la formation de la JNM, Fzd3 étant nécessaire à la croissance des axones moteurs alors que Vangl2 joue un rôle dans l’agrégation du RACh et la restriction de la croissance des axones moteurs une fois leur cible musculaire atteinte. Pour étudier le rôle fonctionnel de l'interaction Wnt/MuSK, nous avons généré une souris transgénique délétée du domaine de liaison de MuSK aux Wnts (CRD, domaine riche en cystéines). Nous avons démontré que l'absence du CRD de MuSK affecte la formation de la JNM dès l’étape deprepatterning jusqu’à la maintenance de la JNM chez l’adulte, aboutissant à un phénotype pathogène. De plus, nous avons montré que le lithium, un inhibiteur réversible de la glycogène synthase kinase-3 restaure les défauts de formation de la JNM chez les embryons mutants et pourrait constituer un nouveau réactif thérapeutique pour le traitement des maladies neuromusculaires liées à une déficience de la voie de signalisation Wnt/MuSK. / Formation of the vertebrate neuromuscular junction (NMJ), a peripheral cholinergic synapse between motoneurons and skeletal muscle fibers relies on the accurate recognition and apposition of presynaptic motoneurons on postsynaptic muscle target. Recently, a growing body of evidence indicates that Wnt morphogens act as key regulators of NMJ formation. Yet, the specific Wnts identity, their collaborative function and the downstream molecular mechanisms of Wnt signaling regulating NMJ formation still remain elusive. At the NMJ, Wnt ligands transduce their signal through interaction of either the receptor complex formed by the muscle specific tyrosine kinase MuSK and the low density lipoprotein (Lrp) Lrp4 or the classical frizzled receptors. In this thesis, we have investigated the molecular mechanisms of Wnt-induced NMJ formation. We found that both Wnt4 and Wn11 are required for the nerve-independent muscle prepatterning step, characterized by acetylcholine receptor (AChR) aggregation in discrete domains of the muscle surface where the synapse will form, via differential activation of either canonical and/or planar cell polarity (PCP) pathways. Moreover, Fzd3 and Vangl2, two core components of the PCP pathway, are accumulated at the developing NMJ and play distinct roles in NMJ formation, with Fz3 required for motor axon growth and Vangl2 involved in AChR clustering and motor axon growth restriction within the target field. To further study the functional role of Wnt/MuSK interaction, we generated a transgenic mice deleted from MuSK Wnt binding domain (CRD, cysteine rich domain). We demonstrated that the absence of MuSK CRD affected NMJ formation from the prepatterning step to NMJ maintenance in adult leading to a pathogenic phenotype. Moreover, we found that lithium, a reversible inhibitor of the glycogen synthase kinase-3 fully rescued NMJ defects in mutant embryos and therefore may constitutes a novel therapeutic reagent for the treatment of neuromuscular disorders linked to Wnt/MuSK signaling pathway deficiency.

Les cellules NK sont des lymphocytes ayant un rôle majeur dans les réponses immunes innées, particulièrement contre les cellules tumorales ou infectées par un agent pathogène. L'activation des cellules NK déclenche leur cytotoxicité cellulaire et/ou sécrétion de cytokines, telle que l'IFN-gamma. L'activité des cellules NK est régulée par une variété de facteurs intrinsèques et extrinsèques qui assurent leur tolérance et efficacité. L'analyse de la signalisation NK permettrait de démontrer leur potentiel clinique. Parmi les protéines impliquées dans la signalisation NK, les protéines adaptatrices ont été très peu analysées. Dans ce projet, je décris les adaptateurs Dok-1/Dok-2 (Downstream of kinase), lesquels sont fortement exprimés dans des cellules hématopoïétiques, notamment dans le lignage myéloïde et les cellules NK. La structure de Dok-1 et Dok-2 est pourvue de différents domaines d'interaction protéine-protéine leur permettant de recruter différentes molécules de signalisation intracellulaire. Au cours de mon travail de thèse, je démontre que Dok-1 et Dok-2 sont phosphorylées sur tyrosine suite à l'activation des NK. La surexpression de Dok-1/Dok-2 dans les cellules NK induit un frein à leur activation déclenchée par des récepteurs activateurs. En revanche, l'invalidation d'expression de Dok1 et Dok2 chez la souris entraine un défaut de développement/maturation NK, mais également une augmentation de leur sécrétion d'IFN-gamma induite par l'engagement de récepteurs activateurs. Ces résultats dévoilent ainsi que Dok-l et Dok-2 sont impliquées dans une boucle de rétrocontrôle négatif en aval des récepteurs activateurs des cellules NK chez l'homme et chez la souris. / NK cells are an important component of innate immunity by virtue of their ability to recognize microbe-infected, transformed (tumors) and allogenic cells, while sparing most autologous healthy cell. NK cell activation can elicit two different effector functions: cytotoxicity of target cell and/or secretion of a large array of cytokines and chemokines. NK cell activation is regulated by intrinsic and extrinsic mechanisms that ensure NK tolerance and efficacy. Determining signaling events downstream of the NK receptors is in this line of establishing the clinical potential of NK cells. Among the proteins involved in NK signaling, the adaptor molecules are poorly understood. Here, I described two Downstream of tyrosine kinase (Dok) adaptors: Dok-1 and Dok-2; these two proteins are mainly expressed in hematopoietic cells, especially in myeloid lineage and NK cells. Dok-1 and Dok-2 adaptors contain a variety of protein-protein interaction motifs enabling them to recruit various intracellular signaling molecules. During my PhD work, I demonstrate that the cytoplasmic signaling molecules Dok1 and Dok2 are tyrosine phosphorylated upon NK cell activation. Overexpression of Dok proteins in human NK cells reduces cell activation induced by NK cell activating receptors. Dok1 and Dok2 gene ablation in mice induces an NK cell developmental/maturation defect and leads to increased IFN-gamma production induced by activating receptors. Taken together, these results reveal that Dok-1 and Dok-2 adaptors are involved in an intrinsic negative feedback loop downstream of NK cell activating receptors in mouse and human.

Les cellules béta pancréatiques synthétisent et sécrètent l’insuline, unique hormone hypoglycémiante de l’organisme. Ces cellules jouent un rôle central dans l’apparition du diabète, préserver leurs masses fonctionnelles est donc essentiel. Le récepteur GLP-1, appartenant à la classe B de la super famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs), est considéré comme une cible thérapeutique majeure dans le traitement du diabète de type 2. Via son récepteur, le GLP-1 potentialise la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et favorise la survie des cellules beta. Les glucocorticoïdes sont des hormones du stress impliquées dans la régulation énergétique, largement utilisés en thérapeutique pour leur propriétés anti-inflammatoire, immunosuppresseur et antiallergique. Néanmoins, les glucocorticoïdes administrés en chronique sont diabétogènes en exerçant notamment des effets délétères sur les cellules beta. Nous avons caractérisé l’impact d’une exposition prolongée des cellules beta à un glucocorticoïde de synthèse (la dexaméthasone) sur les actions biologiques du glucose et du GLP-1.Nous montrons qu’une exposition prolongée des cellules beta à la dexaméthasone exerce des effets délétères en inhibant la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et l’activation des kinases de survie ERK1/2 (Extracellular Regulated Kinases 1/2). A l’inverse, nous démontrons que l’exposition prolongée des cellules bêta à la dexaméthasone favorise le maintien du récepteur GLP-1 à la membrane plasmique, augmente le couplage du récepteur à la protéine Galpha s, ce qui se traduit par une production de second messager (AMPc) intracellulaire doublée. Malgré une diminution des effets du glucose, la sécrétion d’insuline et l’activation des kinases ERK1/2 en réponse au GLP-1 ne sont pas affectées. Cette étude révèle qu’une exposition chronique des cellules beta aux glucocorticoïdes 1) régule le trafficking du récepteur GLP-1 et favorise son maintien à la surface cellulaire, 2) hypersensibilise la signalisation du récepteur GLP-1 dépendante de la protéine Gαs , et 3) pourrait impacter les effets thérapeutiques des molécules ciblant l’activation du récepteur GLP-1. / Pancreatic beta cells synthesize and secrete insulin, the only hypoglycemic hormone in the body. These cells play a central role in the onset of diabetes. To protect the functional beta-cell mass is essential. The GLP-1 receptor, which belongs to the class B of the G protein-coupled receptor (GPCR) family, is a major therapeutic target in type 2 diabetes. Through its receptor, GLP-1 potentiates glucose-induced insulin secretion and improves the survival of pancreatic beta cells. Glucocorticoids are stress hormones implied in energetic metabolism and are widely used in therapeutics for their anti-inflammatory, immunosupressive and anti-allergic properties. Neverless, on chronic administration, glucocorticoids can induce metabolic syndrome especially due beta cell functional mass impairement. Here, we characterized the impact of a prolonged exposure of pancreatic beta cells to a synthetic glucocorticoid (dexamethasone) on biological actions of glucose and GLP-1.We show that a chronic exposure of beta cells to dexamethasone exerted deleterious effects on glucose-induced insulin secretion and ERK1/2 (Extracelllular Regulated Kinases 1/2) activation. In contrast, we observed that the glucocorticoid treatment increased GLP-1 receptor expression at the plasma membrane and improved the Galpha s protein coupling leading to an enhancement of cAMP production (2 fold increase). Despite the negative impact on glucose effects, glucocorticoids did not impair neither GLP-1-induced insulin secretion nor ERK1/2 activation. This study reveals that a glucocorticoid chronic exposure 1) regulates GLP-1 receptor trafficking and increases its expression to the plasma membrane, 2) causes supersensitization of Gαs-associated signaling, and 3) could impact on therapeutic effects of GLP-1 receptor-based drugs.

Le cancer de la prostate (PCa) est le deuxième cancer le plus courant chez les hommes au niveau mondial. Le suppresseur de la signalisation des cytokines 1 (SOCS1) est considéré comme un suppresseur de tumeur en raison de la fréquente répression épigénétique de ce gène dans de nombreux cancers. Il a été reporté que SOCS1 inhibait l’activation de STAT3 induite par l’IL-6, ainsi que les cyclines et les kinases dépendantes des cyclines dans les cellules malignes de la prostate. D’autre part, il a été montré que SOCS1 n’était pas essentiel lors du contrôle de la signalisation de l’IL-6 dans les hépatocytes dépourvus de cette protéine, cependant elle est essentielle pour atténuer la signalisation du facteur de croissance des hépatocytes (HGF) via son récepteur MET. MET est un récepteur de tyrosine kinases qui est surexprimé dans le PCa agressif et métastatique. Notre hypothèse de recherche propose que la répression de SOCS1 par méthylation du promoteur et la dérégulation de l’expression de MET et de sa signalisation, sont des mécanismes pathogéniques liés au développement et à la progression du PCa. Nous avons généré des lignées de cellules PC3 et DU145 stables exprimant SOCS1. Les cellules ont été stimulées avec HGF et l’activation des voies de signalisation a été évaluée par immunobuvardage. Des essais in vitro de migration, de prolifération et d’invasion ont été effectués en présence de HGF. Des gènes de transition épithélio-mésenchymateuse ont été évalués par PCR quantitatif en présence ou non du facteur de croissance. Les cellules du PCa transfectées ou pas avec SOCS1 ont été inoculées dans des souris NOD SCID gamma de façon sous-cutanée ou orthoptique afin d’évaluer respectivement la croissance tumorale et la formation de métastases. Les tumeurs reséquées ont été analysées histologiquement et biochimiquement. Nos résultats montrent que SOCS1 atténue l'activation de MET induite par HGF et la phosphorylation d’ERK dans les cellules PC3, ainsi que la phosphorylation d’ERK et d’AKT dans les cellules DU145. SOCS1 inhibe également la prolifération cellulaire induite par HGF, ainsi que la migration et l’invasion in vitro. De plus, SOCS1 réduit l’expression des gènes de transition épithélio-mésenchymateuse impliqués dans la dégradation des composants de la matrice extracellulaire dans les cellules DU145 mais pas dans les cellules PC3. La surexpression de SOCS1 a stimulé l’augmentation de déposition de collagène, in vivo. Les tumeurs formées par les cellules exprimant SOCS1 étaient de taille significativement plus petites avec une réduction de la prolifération comparé aux tumeurs provenant des cellules contrôles. En outre, SOCS1 a inhibé la formation de métastases à distance dans un modèle orthotopique. En conclusion, nous suggérons que SOCS1 est un suppresseur de tumeur indispensable de la prostate, et qu’au moins une partie de sa fonction a lieu via la régulation négative de la signalisation du récepteur MET. / Abstract : Prostate cancer (PCa) is the second most common cancer among men worldwide. Suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) is considered a tumor suppressor due to frequent epigenetic repression of the SOCS1 gene in several human malignancies. Inactivation of SOCS1 also occurs in PCa by gene methylation and micro-RNA-mediated repression. SOCS1 has been reported to inhibit IL-6-induced STAT3 activation and down-regulates cyclins and cyclin-dependent kinases in PCa cells. It has been shown that SOCS1 is not required to control IL-6 signaling in SOCS1-deficient hepatocytes, but is essential to attenuate hepatocyte growth factor (HGF) signaling via its receptor MET. This protein is a receptor tyrosine kinase (RTK), overexpressed in aggressive and metastatic PCa. Thus we hypothesized that the repression of SOCS1 via promoter methylation and deregulated MET expression and signaling are inter-related pathogenic mechanisms in PCa development and progression. We generated stable SOCS1-expressing PCa cell lines (PC3 and DU145) using lentiviral transduction followed by clonal selection via limiting dilution. Cells were stimulated with HGF and downstream signaling events were assessed by Western blot. Proliferation, migration and invasion assays were also conducted in the presence of HGF in vitro. Epithelial mesenchymal transition genes were evaluated by qPCR in the presence or absence of the growth factor. The PCa cells transfected with SOCS1 and non-transfected controls were inoculated into NOD SCID gamma mice as xenografts or as orthotopic tumors to assess tumor growth and metastasis formation, respectively. Resected tumors were further analyzed histologically and biochemically. Our results showed that SOCS1 attenuates HGF-induced MET activation and ERK phosphorylation in PC3 and DU145 PCa cell lines. SOCS1 inhibited HGF induced cell proliferation, migration and invasion in vitro. Additionally, SOCS1 decreased epithelial mesenchymal transition genes involved in the degradation of extracellular matrix components in DU145 cells but not in PC3. In vivo, SOCS1 overexpression leads to an increase of collagen deposition. Tumors formed by SOCS1 expressing cells were significantly smaller in size with reduced cell proliferation compared to tumors arising from control cells. Furthermore, SOCS1 inhibited distant metastasis formation in the orthotopic model. Overall our results suggest that SOCS1 has a tumor suppressor role in PCa evolution and part of this function is mediated by the negative regulation of MET receptor signalling and down-regulation of genes supporting migration and invasion processes such as matrix metalloproteinases.

L’évolution de la denture des vertébrés est un sujet majeur et des plus intéressants en biologie développementale évolutive (évo-dévo). Dans ce domaine, la souris Mus musculus est traditionnellement l’animal modèle utilisé. La denture de la souris inclus quatre incisives à croissance continue et douze molaires présentant une organisation caractéristique de leurs cuspides. Le réseau moléculaire régulant le développement de ces deux types de dents est très spécifique.La cascade ERK-MAPK est impliquée lors de différentes étapes du développement dentaire. Une étude comparée du phénotype des molaires de souris mutantes pour des gènes activés à différents points de la cascade a démontré l’existence d’un phénotype caractéristique, à savoir la présence d’une dent surnuméraire en position mésiale des rangées de molaires, ainsi que la présence d’anomalie dans le nombre et la forme de certaines cuspides. Parmi ces caractères présents chez les mutants, certains rappellent des caractères ancestraux présents uniquement chez des rongeurs fossiles. Ceci appuie le rôle que la cascade ERK-MAPK a pu jouer au cours de l’évolution de la denture chez les rongeurs. En travaillant sur une lignée transgénique sur-exprimant un inhibiteur de cette cascade, j’ai pu perfectionner notre connaissance du rôle des gènes de la famille Fgf dans les processus de mise en place des centres de signalisation dentaire et de minéralisation de l’émail.Si l’on considère les incisives à croissance continue, la denture de la souris est dynamique à l’échelle de la vie d’un individu. Réalisant un suivi des incisives supérieures d’une cohorte de souris au cours de leur vieillissement, j’ai pu préciser la chronologie d’apparition de défauts liés au vieillissement. Ces défauts apparaissent sur les incisives à partir de six mois, et le plus fréquent est le développement d’un sillon visible sur l’émail de l’incisive. J’ai enfin utilisé des techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) pour comprendre les bases moléculaires du vieillissement des niches de cellules souches des incisives. Ce faisant, j’ai détecté des changements dans les profils d’expression de gènes régulant le maintien des cellules souches, la prolifération cellulaire et le métabolisme. La présence d’un sillon apparaît corrélée à une forte réponse immunitaire détectée dans les tissus dentaires, ce qui constitue une perspective d’étude majeure dans le but d’achever la caractérisation du vieillissement des cellules souches dentaires. / The evolution of the vertebrate dentition is among the most exciting topics in the evo-devo field, with particular attention being drawn to the mouse model. The mouse dentition includes four ever-growing incisors and twelve molars with a specific cusp pattern. Incisors and molars develop according to a tightly regulated molecular network.The ERK-MAPK cascade is involved at various stages of tooth development. Molar tooth phenotype comparisons in mutant mice for genes acting at various levels of the cascade highlighted a dental phenotype signature, which consists in the presence of a supernumerary tooth and shared cusp pattern defects. Some of these recall characters present in fossil rodents, supporting the ERK-MAPK as a good candidate to explain some evolutionary trends of the rodent dentition. By working on a mouse line over-expressing one of this pathway inhibitor in the oral epithelium, I perfect our understanding of Fgf gene role in specifying signaling center formation at the right stage, and in achieving correct mineralization.When considering evergrowing incisors, mouse dentition is also dynamic at the lifetime scale. I monitored the ageing process of the mouse upper incisors, and provided a chronology of occurrence of the variety of age-related defects display. These defects are set up from the six months on, the most frequent abnormality being the presence of an enamel groove along the surface of the incisor. Using Next Generation Sequencing technologies, I detected transcriptomic changes in the stem cell niches affecting cell proliferation and metabolism, as well as the stem cell niche functioning. The correlation found between the groove occurrence and a large immune response in dental tissues expands our concern for dental stem cell ageing.

Les β2-agonistes sont couramment utilisés pour prévenir et réduire les symptômes de l'asthme et de la bronchoconstriction induite par l'exercice. Mais, pris en quantités supérieures aux doses thérapeutiques, les β2-agonistes ont un effet anabolisant qui a été clairement démontré in vivo. Un certain nombre d’acteurs sont mis en jeu dans la réponse biologique du tissu musculaire aux β2-agonistes. L’un de ces acteurs est la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR, voie d’initiation de la traduction, ayant un rôle majeur dans la synthèse protéique. Dans ce contexte, notre première étude avait pour objectif de déterminer la cinétique des événements moléculaires responsables de l’hypertrophie du muscle squelettique de rat après administration de formotérol pendant 1 jour (J1), 3 jours (J3) et 10 jours (J10). Nous avons montré que l’administration de formotérol induisait une hypertrophie musculaire à J3 et J10 associée à l’activation transitoire de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR (J1 et J3), et à une diminution de l’expression de l’E3 ubiquitine ligase MAFbx/Atrogin-1 (J3). La voie autophagie lysosome ne semblait pas être affectée. Ainsi, l’ensemble de ces résultats suggère que l’activation de la voie PI3K/Akt/mTOR est associée à la voie ubiquitine-protéasome mais pas à la voie autophagie-lysosome. La régulation transitoire de la voie PI3K/Akt/mTOR suggère que d’autres voies de signalisation sont impliquées dans l’hypertrophie musculaire induite par le formotérol. Le 007-AM, analogue de l’AMPc, a été décrit comme pouvant stimuler la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR via l’activation de la protéine Epac, suggérant que le 007-AM puisse constituer une molécule de substitution à l’utilisation des β2-agonistes. Notre seconde étude avait pour but de déterminer si le 007-AM avait une action anabolisante sur le tissu musculaire, mais également de déterminer si la 007-AM était une molécule stable permettant d’envisager son usage dans un cadre pharmacologique. L’administration de 007-AM pendant 7 jours chez des souris n’engendrait pas d’hypertrophie musculaire. En revanche, in vitro sur cellules C2C12, le 007-AM activait la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR comme en témoignait l’augmentation de la phosphorylation des protéines rpS6 et 4E-BP1. Nos résultats montraient également que le 007-AM était instable dans le plasma alors que son produit de dégradation, le 007 était plus stable. Pris ensembles, ces résultats suggèrent qu’un traitement de 7 jours au 007-AM n’est pas suffisant pour induire une hypertrophie musculaire et que l’absence d’hypertrophie musculaire pourrait provenir de l’instabilité du 007-AM dans le plasma. Toutefois, des études supplémentaires seront nécessaires pour confirmer ces résultats / Β2-agonists are traditionally used to prevent and reduce asthma symptoms and bronchoconstriction induced by exercise. Nevertheless, when administrated in vivo, at relatively high, far away from therapeutic doses, β2-agonists induce anabolic effects. Numerous actors are involved in biological response of the skeletal muscle, induced by β2-agonists. PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, which initiates translation, is one of these actors. In this context, our first study aimed at determined the kinetic of molecular events responsible for skeletal muscle hypertrophy after 1 day (D1), 3 days (D3) and 10 days (D10) of formoterol administration. We have shown that formoterol administration induced skeletal muscle hypertrophy at D3 and D10 associated with a transient activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway (D1 and D3), and, with a decrease in E3 ubiquitin ligase MAFbx/atrogin-1 expression (D3). The autophagy-lysosome pathway seems not to be regulated by formoterol administration. Taken together, these results suggest that PI3K/Akt/mTOR activation is temporally associated with the regulation of ubiquitin-proteasome but not the autophagy-lysosome pathway. The transient nature of the regulation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway also indicates that other unidentified pathways are probably activated to sustain the increase in skeletal muscle mass. Recently, 007-AM synthetic molecule has been described to stimulate PI3K/Akt/mTOR signaling pathway through Epac protein activation, suggesting that 007-AM could be an alternative to the use of β2-agonists. The purpose of our second study was to determine whether 007-AM had an anabolic action on skeletal muscle and if 007-AM was stable allowing considering its use in pharmacology. 007-AM administration for 7 days to mice does not lead to muscle hypertrophy. Nonetheless, in vitro on C2C12 cells, 007-AM activated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by increasing phosphorylation of rpS6 and 4E-BP1. Our results showed that contrary to 007, 007-AM was instable in plasma. Altogether, these results suggest that a 7-day 007-AM treatment is not sufficient to induce skeletal muscle hypertrophy. This lack of hypertrophy could be due to 007-AM instability in plasma. However, supplemental studies are needed to confirm these results

Chez la souris, le Leukemia Inhibitory Factor (LIF) joue un rôle clé dans le maintien des cellules souches embryonnaires (ES) à l’état pluripotent. Le LIF agit en activant le facteur de transcription STAT3 via les kinases Jak. Cette activation est nécessaire et suffisante au maintien des cellules ES en autorenouvellement en présence de sérum. Une étude du transcriptome de STAT3 réalisée au laboratoire a permis d’identifier plusieurs gènes cibles de ce facteur, parmi lesquels plusieurs gènes inconnus. L’un d’eux, le gène 1456160_at, est fortement exprimé dans les cellules ES de souris et son expression diminue après induction de la différenciation. Ce gène a été appelé Asgard pour Another Self-renewal GuARDian. La caractérisation et le séquençage de ce gène ont permis de mettre en évidence qu'Asgard code pour un microARN. De nombreux microARNs jouent un rôle clé dans le maintien de l'autorenouvellement des cellules ES et dans le contrôle de la différenciation. Des expériences d’inhibition et de surexpression ont permis de montrer que Asgard est impliqué dans la régulation de la différenciation endoderme versus mésoderme. Des analyses préliminaires ont permis d’identifier Pbx3, FoxA2 et Sox17 comme cibles potentielles. Bien que les mécanismes d’action du microARN Asgard restent à confirmer, ce travail a permis d’identifier un nouveau gène clé de l'autorenouvellement des cellules ES de souris / The Leukemia Inhibitory Factor (LIF) activates the transcription factor STAT3, which results in the maintenance of mouse embryonic stem cells in the undifferentiated state by inhibiting mesodermal and endodermal differentiation. We identified several target genes of STAT3 by transcriptomic analysis. Among them, we focused on an unknown gene referred as 1456160_at on Affymetrix array. This gene is highly expressed in embryonic stem cells and its expression level decreases during differentiation. We named this gene Asgard for Another Self-renewal GuARDian. Its characterization and sequencing revealed that Asgard encodes for a microRNA sequence. Several microRNAs have been shown to play key role in the maintenance of self-renewal of mouse ES cells and in the control of differentiation. Inhibition and overexpression assays showed that Asgard inhibits endodermal differentiation in order to maintain self-renewal. Through preliminary analysis, we identified Pbx3, FoxA2 and Sox17 as potential targets of the microRNA Asgard. Our work enables us to identify a new key gene of self-renewal of mouse ES cells