A distrofia muscular do Golden Retriever é uma doença degenerativa de caráter hereditário com alterações musculares semelhantes às descritas na distrofia muscular de Duchenne, sendo comprovada a existência de alterações na musculatura lisa do trato gastrointestinal destes animais. Alguns autores sugerem que um dos fatores responsáveis por essas alterações possa estar relacionado com a motililidade intestinal. Este trabalho tem como objetivo estudar os neurônios nitrérgicos e colinérgicos, além da expressão do receptor P2X7, no plexo mioentérico do cólon descendente de cães afetados e não afetados pela distrofia muscular. Foram utilizadas técnicas de imunohistoquímica para marcação das enzimas Óxido Nítrico Sintase (NOS) e Acetilcolina Transferase (ChAT) e da população neuronal total pelo HuC/D e analisada a presença do receptor P2X7. Também foram utilizadas técnicas de microscopia eletrônica de transmissão e histologia básica. Os resultados indicam que neurônios nitrérgicos tendem a ser maiores em cães distróficos e apresentam morfologia Dogiel tipo I; neurônios que expressam o receptor P2X7 colocalizam com neurônios nitrérgicos e colinérgicos. As análises qualitativas demonstram que cães distróficos apresentam maior quantidade de colágeno entre as fibras musculares, entre as camadas musculares circular e longitudinal e, ainda, no interior dos gânglios mioentéricos. Este estudo fornece base para futuras pesquisas e tratamentos da distrofia muscular do Golden Retriever e mais futuramente da Distrofia Muscular de Duchenne, além de poder auxiliar no entendimento das desordens gastrointestinais que são observadas nesta última. / The golden retriever muscular dystrophy is a hereditary degenerative disease characterized by muscle changes similar to those described in Duchenne muscular dystrophy, as well as by alterations in the smooth muscles of the gastrointestinal tract. Some authors suggest that these abnormalities may be associated with intestinal motility. This study evaluated nitrergic and cholinergic neurons in the myenteric plexus of the descending colon of dogs with and without muscular dystrophy, in addition to P2X7 receptor expression. Immunohistochemical techniques were used to label nitric oxide synthase (NOS) and acetylcholine transferase (ChAT), as well as to label total HuC/D-immunoreactive neurons and neurons containing the P2X7 receptor. Transmission electron microscopy and basic histology were used for analysis. Results showed that nitrergic neurons tend to be larger in dystrophic dogs and to be characterized by Dogiel type I morphology, and neurons that express the P2X7 receptor colocalize with nitrergic and cholinergic neurons. Transmission and light microscopy revealed higher collagen density between muscle fibers, between circular and longitudinal muscle layers and within myenteric ganglia of affected dogs. These findings provide support for future research and treatment of the golden retriever muscular dystrophy and hence of the Duchenne muscular dystrophy and contribute to the understanding of the gastrointestinal disorders found in these patients.

Foi descrita a presença do receptor P2X2 no sistema nervoso entérico e foi constatado que a desnutrição afeta os neurônios mioentéricos. Este projeto analisou os neurônios dos plexos mioentérico (PM) e submucoso (PS) imunorreativos ao receptor P2X2(ir), calbindina (Calb-ir), calretinina (Calr-ir), colina acetil transferase (ChAT-ir) e ao óxido nítrico sintase (NOS-ir) do íleo de ratos submetidos à desnutrição protéica pré e pós-natal e a renutrição pós-natal. Foram utilizados íleos de animais nutridos (N42), desnutridos (D42) e renutridos (RN42). Os resultados do PM e PS demonstraram 100% de neurônios Calb-ir, Calr-ir, ChAt-ir e NOS-ir expressavam o receptor P2X2-ir nos grupos. As densidades neuronais do PM e PS demonstraram aumento de 30% e 25% respectivamente, dos neurônios receptor P2X2-ir, Calr-ir, ChAT-ir e NOS-ir no grupo D42 e, recuperação no grupo RN42, os neurônios Calb-ir aumentaram 60% no PS. O perfil neuronal do PM mostrou diminuição de 26% nos neurônios receptor P2X2-ir e Calr-ir no grupo D42 e, no PS houve diminuição nos neurônios receptor P2X2-ir. Concluiu que a desnutrição afetou os neurônios entéricos e houve recuperação na renutrição, isto pode influenciar as funções do trato gastrintestinal. / It is showed the expression of the P2X2 receptor in the enteric nervous system; it was observed that undernutrition affect the myenteric neurons. This project analyzed the ileum myenteric (MN) and submucous (SN) neurons immunoreactive to P2X2 receptor, calbindin (Calb-ir), calretinin (Calr-ir), coline acetil transferase (ChAT) and nitric oxide sintase (NOS) of the animals submitted to pre- and postnatal protein deprivation and postnatal refeeding. Ileum was used from nourished (N42), undernourished (D42) and Refeeding (RN42) animals. The results showed 100% coexpression myenteric and submucous Calb-ir, Calr-ir, ChAt-ir e NOS-ir neurons with P2X2-ir receptor. The myenteric and submucos neuronal density showed increase of the 30% and 25% respectively, of the P2X2-ir, Calr-ir, ChAT-ir e NOS-ir neurons of the D42 group, the Calb-ir neurons increase 60% in the SN. It was observed in the MN neuronal profile decrease of the 26% of the P2X2-ir and Calr-ir in the RN42 group and recover in the RN42, there was decrease of the P2X2-ir receptor neurons in the submucous plexus. The conclusion demonstrated that undernutrition affects the enteric neurons and there was recuperation in the refeeding, this can influence the gastrointestinal functions.

O trato gastrointestinal (TGI) é a principal rota de exposição ao fluoreto (F) e o seu mais importante sítio de absorção. Acredita-se que a toxicidade do F comprometa a fisiologia do intestino, devido à relevante sintomatologia gastrointestinal relatada em consequência da exposição excessiva ao F. A função intestinal é controlada por uma complexa rede neuronal interligada e incorporada à parede deste órgão, denominada Sistema Nervoso Entérico (SNE). Embora os efeitos tóxicos do F sobre o Sistema Nervoso Central sejam descritos na literatura, não há estudos relacionados à sua toxicidade sobre o SNE. Neste estudo realizado em ratos, foi avaliado o efeito da exposição aguda ou crônica ao F, sobre a população geral de neurônios entéricos e sobre as subpopulações que expressam os principais neurotransmissores entéricos: Acetilcolina (ACh), Óxido Nítrico (NO), Peptídeo Vasoativo Intestinal (VIP), Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP) e Substância P (SP). Os animais foram divididos em 5 grupos: 3 destinados à exposição crônica (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F na água de beber) e 2 à exposição aguda (0 ou 25 mgF/Kg por gavagem gástrica). Foram coletados os 3 segmentos do intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e processados para a detecção da HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP e SP, através de técnicas de imunofluorescência, no plexo mioentérico. Foram obtidas imagens para a realização da análise quantitativa dos neurônios da população geral (HuC/D) e nitrérgicos (imunorreativos à nNOS); e morfométrica dos neurônios imunorreativos à HuC/D ou nNOS; e das varicosidades imunorreativas à ChAT, VIP, CGRP ou SP. Amostras dos 3 segmentos intestinais foram preparadas e coradas em Hematoxilina e Eosina para análise histológica da morfologia básica. O segmento intestinal considerado mais afetado na análise morfométrica da população geral de neurônios, o duodeno, foi selecionado para a realização da análise proteômica, com o objetivo de oferecer o seu perfil proteico e determinar diferenças na expressão proteica em decorrência da exposição crônica ou aguda ao F. A análise da concentração de F no plasma sanguíneo foi realizada para a confirmação da exposição. Na análise quantitativa, o grupo de 50 ppm F, apresentou uma diminuição significativa na densidade da população geral de neurônios do jejuno e do íleo e na densidade dos neurônios imunorreativos à nNOS no duodeno e no jejuno. Quanto à análise morfométrica, a população geral e as subpopulações neuronais entéricas avaliadas apresentaram alterações morfológicas significativas, tanto após a exposição crônica quanto a aguda. Para a análise proteômica do duodeno, verificou-se que da associação de seus genes a um termo, e assim classificadas de acordo com diferentes processos biológicos. No caso do grupo da dose aguda, o processo biológico com a maior porcentagem de genes associados foi a geração de metabólitos precursores e energia (27% das proteínas); enquanto para os grupos de 10 e 50 ppm F foram o processo metabólico da piridina (41%) e a polimerização proteica (33%), respectivamente. / The gastrointestinal tract (GIT) is the main route of fluoride (F) exposure, and the most important site of its absorption. It is believed that F toxicity compromises the intestine physiology, due to the relevant gastrointestinal symptomatology reported in consequence to excessive exposure. The intestinal function is controlled by a complex neuronal net, which is interconnected and embedded in the wall of this organ, named Enteric Nervous System (ENS). Although the toxic effects of F on the Central Nervous system are described in the literature, there are no studies related to its toxicity on the ENS. Therefore, in this study performed in rats, the effects of chronic and acute F exposure were evaluated, on the general population of enteric neurons and on the subpopulations that express the main enteric neurotransmitters: Acetylcholine (Ach), Nitric Oxide (NO), Vasoactive Intestinal Peptide (VIP), Calcitonin gene related peptide (CGRP), and Substance P (SP). The animals were divided into 5 groups: 3 designed to the chronic exposure (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F in the drinking water) and 2 to the acute exposure (0 ou 25 mgF/Kg - gastric gavage). Three intestinal segments were collected (duodenum, jejunum, and ileum) and processed for the immunofluorescence techniques to detect HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP and SP, on the myenteric plexus. Images were obtained for the quantitative analysis of the general population of neurons (HuC/D immunoreactive) and the nitrergic neurons (nNOS immunoreactive), for the morphometric analysis of the general population and nitrergic neurons and also for the immunoreactive varicosities to ChAT, VIP, CGRP or SP. Samples of the 3 intestinal segments were prepared and stained with hematoxylin and eosin for histological analysis of the basic morphology. Duodenum, the intestinal segment considered the most affected in the morphological analysis of the general population of neurons, was selected for the proteomic analysis, with the objective to offer the entire protein profile and to determine differences in the protein expression due to chronic or acute F exposure. Plasma F concentration was analyzed to confirm the exposure. In the quantitative analysis, the 50 ppm F group presented a significant decrease in the density of the general population of neurons in the jejunum and ileum, and in the density of the nitrergic neurons in the duodenum and jejunum. Regarding the morphometric analysis, the general population of neurons and all the neuronal subpopulations evaluated presented significant morphological alterations, for both exposures, chronic and acute. In the proteomic analysis of the duodenum, it was verified that both exposures caused alterations in the expression of intestinal proteins. These proteins identified with differential expression were distributed according the association of their genes to a specific term, and by this term classified in different biological process. In the group that received the acute dose the biological process with the highest percentage of associated genes was the generation of precursor metabolites and energy (27% of proteins), and for the 10 and 50 ppm F groups, they were pyridine nucleotide metabolic process (41%) and protein polymerization (33%), respectively.

Admite-se que mais de 40% das crianças são acometidas pela desnutrição crônica em Moçambique (África Oriental). A doença pode estar relacionada, entre outros fatores, à qualidade da dieta que é oferecida à população, já que é bastante precária, pois exibe sérias deficiências de ferro, gordura e, principalmente, proteína animal em sua composição. Essa insuficiência proteica poderia acarretar em prejuízo ao desenvolvimento do organismo, pois a proteína animal é considerada uma boa fonte de aminoácidos essenciais, em decorrência de sua maior digestibilidade e absorção no intestino delgado, quando comparadas às fontes de origem vegetal. Na presente pesquisa foi reproduzida em laboratório, a dieta básica da população de Moçambique (DM), com o objetivo de avaliar seus efeitos nos componentes do plexo mioentérico e na mucosa dos segmentos do intestino delgado de ratos Wistar. Para isso, os animais foram divididos nos grupos Controle, com dieta AIN-93G com adição de 20% de caseína (NN21 e NN42); Dieta de Moçambique (DM21 e DM42) e Dieta Moçambique suplementada, acrescida de 20% de caseína (NM21 e NM42); e grupo Renutrido (RM42), composto por animais do grupo DM21 que, a partir do 22º dia, receberam a dieta NM até atingirem 42 dias de vida. Os segmentos foram coletados e submetidos às técnicas histoquímicas da NADH-diaforase e da NADPH-diaforase para evidenciação de neurônios do plexo mioentérico; histológicas (HE, Picro-sírius, Weigert) para avaliação da parede intestinal, mucosa, gânglios e seu tecido conjuntivo associado; de microscopia eletrônica de varredura (MEV) para observação da estrutura da mucosa; e de microscopia eletrônica de transmissão (MET) para a ultraestrutura dos componentes ganglionares. Estatisticamente, o peso corporal e o comprimento dos animais submetidos à dieta de Moçambique estavam abaixo dos valores encontrados para os animais controle. Na análise qualitativa, observou-se a presença de fibras elásticas, elaunínicas e oxitalânicas, assim como predominância de fibras colágenas do tipo I nos grupos NN42 e DM42, e do tipo III nos grupos NM42 e RM42 ao redor dos gânglios. A mucosa apresentou uma menor área no grupo DM21 com recuperação em DM42, com diminuição da altura das vilosidades nos dois grupos. Foram observadas alterações na organização do retículo endoplasmático rugoso e disposição dos materiais fibrilares e granulares do nucléolo dos animais DM. Sob MEV as vilosidades do grupo DM42 apresentaram superfície mais lisa, com poucas delimitações entre elas. A densidade dos neurônios reativos à NADH diminuiu de 21 para 42 dias em todos os grupos; porém, o DM21 e DM42 apresentou uma maior densidade. Os neurônios reativos à NADPH apresentaram a diminuição da densidade de 21 para 42 dias nos grupos DM e NM, quando comparados ao controle. Assim, conclui-se que a dieta vegetal de Moçambique levou à alterações na morfologia da mucosa, parede intestinal e neurônios entéricos, como uma forma de adaptação à dieta imposta / It is assumed that more than 40% of children are affected by chronic malnutrition in Mozambique (East Africa). The disease may be related, among other factors, the quality of diet that is offered to the population, since it is quite precarious, because it displays serious deficiencies of iron, fat and especially animal protein in their composition. This protein failure could result in damage to the development of the organism, as animal protein is considered a good source of essential amino acids, due to its higher digestibility and absorption in the small intestine when compared to vegetable sources. In this research has been reproduced in the laboratory, the staple diet of the population of Mozambique (DM), in order to evaluate its effects on components of the myenteric plexus and the mucosa of the small intestine segments of Wistar rats. For this, the animals were divided into control groups with AIN-93G diet with the addition of 20% casein (NN21 and NN42); Diet Mozambique (DM21 and DM42) and diet supplemented Mozambique, plus 20% casein (NM21 and NM42); and Refeeding group (RM42), consisting of the animals DM21 group, from the 22th day, given NM diet until they reached 42 days of life. The segments were collected and submitted to histochemical techniques of NADH-diaphorase and NADPH-diaphorase for disclosure of neurons of the myenteric plexus; histologic (HE, Sirius red, Weigert) for evaluation of the intestinal wall, mucosa, lymph nodes and its associated connective tissue; scanning electron microscopy (SEM) for observation of mucosal structure; and Transmission electron microscopy (TEM) ultrastructure to ganglion components. Statistically, body weight and length of the animals submitted to Mozambique diet were below the values found for control animals. Qualitative analysis showed the presence of elastic fibers, and elauninic oxytalan, and predominance of type I collagen fibers in the NN42 and DM42 groups, and type III in the NM42 and RM42 groups around the ganglia. The mucosa showed a smaller area in DM21 group recovery DM42, with a decrease in villus height in both groups. There have been changes in the organization of the rough endoplasmic reticulum and arrangement of fibrillar and granular materials nucleolus of DM animals. Under SEM the villi of the DM42 group showed smoother surface, with few boundaries between them. The density of reactive NADH decreased from 21 to 42 days in all groups; however, the DM21 and DM42 had a higher density. Reactive neurons to NADPH had decreased from 21 to 42 days density in DM and NM groups when compared to the control. Thus, it is concluded that vegetable diet Mozambique led to changes in the morphology of the mucosa, the intestinal wall and enteric neurons, as a way to adapt to the imposed diet

O intestino apresenta a maior área do corpo exposta ao ambiente, recebendo constantemente antígenos provenientes da alimentação e de microrganismos. A fim de manter a homeostase, evitando respostas inflamatórias desnecessárias e ao mesmo tempo respondendo apropriadamente à possíveis ameaças ao tecido, as células intestinas tem que ser capazes de perceber e responder apropriadamente a uma diversa gama de perturbações vindas do ambiente. Além do seu vasto sistema imune o intestino também abriga o maior número de neurônios fora do sistema nervoso central, os quais compõe o Sistema Nervoso Entérico (SNE). O SNE é composto por aproximadamente 100 milhões de neurônios que são capazes de regular autonomamente diversas funções fisiológicas do intestino e também de receber e enviar sinais para os sistemas nervoso autônomo simpático e parassimpático. Diversas evidências clínicas correlacionam inflamações intestinais com alterações no SNE, demonstrando a importância de se entender melhor as relações neuroimunes presentes no intestino. Os macrófagos são células essências da imunidade inata que residem tanto na área do intestino conhecida como lâmina própria como também na área conhecida como muscularis. Essas células fagocíticas desempenham um importante papel nas respostas antibacterianas e também na manutenção da homeostase do tecido, sendo capazes de adaptar rapidamente sua fisiologia em resposta aos sinais ambientais. Neste trabalho avaliamos a existência de uma comunicação bidirecional entre macrófagos e neurônios intestinais. Caracterizamos as duas populações de macrófagos presentes no intestino em homeostase e após um estimulo com SpiB um mutante de Salmonella, avaliando assim como estas células respondem à sinais de infecção provenientes do lúmen intestinal. Utilizando abordagens in vivo e in vitro, observamos que os macrófagos presentes na região da muscularis respondem rapidamente a uma possível infecção presente no lúmen regulando positivamente genes de proteção tecidual e reparo de danos, como Arg1 e Chi3l3. Nossos resultados indicam ainda que são os neurônios através da liberação de norepinefrina capaz de ativar os receptores β2 adrenérgicos presentes nos macrófagos intestinais que induzem a expressão dos genes relacionados com a proteção tecidual e reparo de danos. Observamos ainda que esta via induzida através da ativação dos receptores β2 adrenérgicos parece conferir também aos macrófagos um papel neuro-protetor em caso de danos teciduais. Em conjunto nossos resultados indicam a presença de uma comunicação neuroimune bidirecional entre os neurônios e macrófagos intestinais capaz de modular a resposta dos macrófagos a uma infecção entérica e de proteger os neurônios em caso de danos teciduais / The intestine is the largest area of the body exposed to the environment, which receives food and microbe antigens. In order to maintain homeostasis, avoiding unnecessary inflammation, and at the same time responding properly to potential treats to the tissue, intestinal cells must be able to sense and respond properly to this diverse set of environmental perturbations. In addition to a vast immune system, the intestine also harbors the largest collection of neurons outside the central nervous system, which constitute the enteric nervous system (ENS). The ENS is composed of approximately 100 million neurons that are capable of regulating the physiological functions of the gut autonomously and also receive input and send signals to the sympathetic and parasympathetic nervous system. Numerous clinical findings correlate gut inflammation with abnormalities in the ENS, revealing the importance of a better understanding of the neuro-immune interactions at this site. Macrophages comprise an essential innate immune cell residing both in the intestinal lamina propria and muscularis regions. These phagocytic cells play important roles in anti-microbial responses but also in tissue homeostasis, being able to quickly adapt their physiology in response to environmental cues. We evaluated the crosstalk between intestinal macrophages and surrounding enteric neurons, characterizing how these cells respond to possible infection in the intestinal lumen. Using in vivo and in vitro approaches, we found that macrophages in the intestinal muscularis quickly respond to a possible distal luminal infection, up regulating tissue-protective and wound repair genes, like Arg1 and Chi3l3. Also, our results indicate that the neurons trough norepinephrine release and subsequent activation of the β2 adrenergic receptor present on the intestinal macrophages are the ones up regulating tissue-protective and wound repair genes. We also observed that this pathway, trough the β2 adrenergic receptor activation seems to induce a neuro-protective role to these macrophages under tissue damage scenarios. All together our results indicate that a neuro-immune crosstalk between neurons and macrophages modulates macrophages response towards enteric infections and confers neuro-protection in case of tissue damage

O intestino apresenta a maior área do corpo exposta ao ambiente, recebendo constantemente antígenos provenientes da alimentação e de microrganismos. A fim de manter a homeostase, evitando respostas inflamatórias desnecessárias e ao mesmo tempo respondendo apropriadamente à possíveis ameaças ao tecido, as células intestinas tem que ser capazes de perceber e responder apropriadamente a uma diversa gama de perturbações vindas do ambiente. Além do seu vasto sistema imune o intestino também abriga o maior número de neurônios fora do sistema nervoso central, os quais compõe o Sistema Nervoso Entérico (SNE). O SNE é composto por aproximadamente 100 milhões de neurônios que são capazes de regular autonomamente diversas funções fisiológicas do intestino e também de receber e enviar sinais para os sistemas nervoso autônomo simpático e parassimpático. Diversas evidências clínicas correlacionam inflamações intestinais com alterações no SNE, demonstrando a importância de se entender melhor as relações neuroimunes presentes no intestino. Os macrófagos são células essências da imunidade inata que residem tanto na área do intestino conhecida como lâmina própria como também na área conhecida como muscularis. Essas células fagocíticas desempenham um importante papel nas respostas antibacterianas e também na manutenção da homeostase do tecido, sendo capazes de adaptar rapidamente sua fisiologia em resposta aos sinais ambientais. Neste trabalho avaliamos a existência de uma comunicação bidirecional entre macrófagos e neurônios intestinais. Caracterizamos as duas populações de macrófagos presentes no intestino em homeostase e após um estimulo com SpiB um mutante de Salmonella, avaliando assim como estas células respondem à sinais de infecção provenientes do lúmen intestinal. Utilizando abordagens in vivo e in vitro, observamos que os macrófagos presentes na região da muscularis respondem rapidamente a uma possível infecção presente no lúmen regulando positivamente genes de proteção tecidual e reparo de danos, como Arg1 e Chi3l3. Nossos resultados indicam ainda que são os neurônios através da liberação de norepinefrina capaz de ativar os receptores β2 adrenérgicos presentes nos macrófagos intestinais que induzem a expressão dos genes relacionados com a proteção tecidual e reparo de danos. Observamos ainda que esta via induzida através da ativação dos receptores β2 adrenérgicos parece conferir também aos macrófagos um papel neuro-protetor em caso de danos teciduais. Em conjunto nossos resultados indicam a presença de uma comunicação neuroimune bidirecional entre os neurônios e macrófagos intestinais capaz de modular a resposta dos macrófagos a uma infecção entérica e de proteger os neurônios em caso de danos teciduais / The intestine is the largest area of the body exposed to the environment, which receives food and microbe antigens. In order to maintain homeostasis, avoiding unnecessary inflammation, and at the same time responding properly to potential treats to the tissue, intestinal cells must be able to sense and respond properly to this diverse set of environmental perturbations. In addition to a vast immune system, the intestine also harbors the largest collection of neurons outside the central nervous system, which constitute the enteric nervous system (ENS). The ENS is composed of approximately 100 million neurons that are capable of regulating the physiological functions of the gut autonomously and also receive input and send signals to the sympathetic and parasympathetic nervous system. Numerous clinical findings correlate gut inflammation with abnormalities in the ENS, revealing the importance of a better understanding of the neuro-immune interactions at this site. Macrophages comprise an essential innate immune cell residing both in the intestinal lamina propria and muscularis regions. These phagocytic cells play important roles in anti-microbial responses but also in tissue homeostasis, being able to quickly adapt their physiology in response to environmental cues. We evaluated the crosstalk between intestinal macrophages and surrounding enteric neurons, characterizing how these cells respond to possible infection in the intestinal lumen. Using in vivo and in vitro approaches, we found that macrophages in the intestinal muscularis quickly respond to a possible distal luminal infection, up regulating tissue-protective and wound repair genes, like Arg1 and Chi3l3. Also, our results indicate that the neurons trough norepinephrine release and subsequent activation of the β2 adrenergic receptor present on the intestinal macrophages are the ones up regulating tissue-protective and wound repair genes. We also observed that this pathway, trough the β2 adrenergic receptor activation seems to induce a neuro-protective role to these macrophages under tissue damage scenarios. All together our results indicate that a neuro-immune crosstalk between neurons and macrophages modulates macrophages response towards enteric infections and confers neuro-protection in case of tissue damage

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A forma digestiva decorrente da doença de Chagas é uma das principais causas de morbidade e mortalidade na fase crônica da doença. Pacientes portadores da forma digestiva apresentam uma série de sintomas relacionados à obstrução do órgão. No megacólon, os órgãos exibem grande aumento do lúmen e hipertrofia da camada muscular. Análises histológicas dos órgãos afetados têm demonstrado lesões inflamatórias do sistema nervoso entérico (SNE), associadas com uma grande redução no número de neurônios. Embora o mecanismo de lesão neuronal continue obscuro, a frequente observação de ganglionite e periganglionite em pacientes com megacólon aponta para a participação de células do sistema imune nesse processo. Indivíduos não portadores de megacólon também apresentaram processos de denervação e inflamação, porém menos intensas em relação aos portadores de megacólon. Conhecendo que a inter-relação entre o SNE e o sistema imune é muito rica, é de extrema importância compreender os mecanismos que atuam em comum entre estes dois sistemas, o que pode elucidar e mostrar novos caminhos para o controle efetivo de doenças que afligem o trato gastrintestinal. Dados preliminares de nossos estudos utilizando a proteína GAP-43, marcador de regeneração neuronal, sugerem que esse processo de plasticidade neuronal esteja ocorrendo no cólon de pacientes portadores da infecção crônica. A hipótese é que o desenvolvimento do megacólon chagásico esteja intimamente relacionado com a expressão de neurotrofinas, substâncias capazes de estimular o processo de regeneração neuronal. A partir desses dados uma nova linha investigativa abriu-se no estudo da patologia do megacólon chagásico. Para a compreensão do desenvolvimento dessa patologia, avaliamos o grau de destruição das diferentes classes neuronais, a taxa de regeneração e as substâncias envolvidas com as mesmas, sendo essa a hipótese norteadora da dissertação aqui apresentada. / Patients with the digestive form of Chagas' disease exhibit a number of symptoms related to obstruction of the organ. Histological analysis of affected organs have demonstrated inflammatory lesions of the enteric nervous system (ENS), associated with a large reduction in the number of neurons caused, mainly, by inflammatory process. However, previous studies presented that some substances, like neurotrophins, may restrict neuronal destruction levels. The objective of this study is to characterize the neurotrophins expression in tissues from chagasic patients with chagasic megacolon and verify its involvement in megacolon development. For this, we used samples from chagasic patients with megacolon (n=8) and non-infected individuals (n=8) that, after preparation, were submitted to confocal fluorescence immunohistochemistry. To identify the sources and expression level of neurotrophins (NGF, GDNF and NT3), we performed a co-localization with Peripherin (neuronal marker) and S-100 (glial cell marker). Our results presented that, in the colon, the glial cells are the main sources of neurotrophins in all analyzed groups. Besides, chagasic patients with megacolon presented high expression of all investigated neurotrophins when compared with non-infected individuals. Our data point that neurotrophins might perform a protective role in the enteric nervous system and that prevent the megacolon installation. By the other side, chagasic patients that do not express an adequate level of neurotrophins may progress to megacolon form. We believe that this data can suggest new treatment protocols, like drugs administration qualified to elevate neurotrophins levels, what could prevent the megacolon installation and maintain the normal function of the gastrointestinal tract. / Dissertação (Mestrado)

O trato gastrointestinal (TGI) é a principal rota de exposição ao fluoreto (F) e o seu mais importante sítio de absorção. Acredita-se que a toxicidade do F comprometa a fisiologia do intestino, devido à relevante sintomatologia gastrointestinal relatada em consequência da exposição excessiva ao F. A função intestinal é controlada por uma complexa rede neuronal interligada e incorporada à parede deste órgão, denominada Sistema Nervoso Entérico (SNE). Embora os efeitos tóxicos do F sobre o Sistema Nervoso Central sejam descritos na literatura, não há estudos relacionados à sua toxicidade sobre o SNE. Neste estudo realizado em ratos, foi avaliado o efeito da exposição aguda ou crônica ao F, sobre a população geral de neurônios entéricos e sobre as subpopulações que expressam os principais neurotransmissores entéricos: Acetilcolina (ACh), Óxido Nítrico (NO), Peptídeo Vasoativo Intestinal (VIP), Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP) e Substância P (SP). Os animais foram divididos em 5 grupos: 3 destinados à exposição crônica (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F na água de beber) e 2 à exposição aguda (0 ou 25 mgF/Kg por gavagem gástrica). Foram coletados os 3 segmentos do intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e processados para a detecção da HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP e SP, através de técnicas de imunofluorescência, no plexo mioentérico. Foram obtidas imagens para a realização da análise quantitativa dos neurônios da população geral (HuC/D) e nitrérgicos (imunorreativos à nNOS); e morfométrica dos neurônios imunorreativos à HuC/D ou nNOS; e das varicosidades imunorreativas à ChAT, VIP, CGRP ou SP. Amostras dos 3 segmentos intestinais foram preparadas e coradas em Hematoxilina e Eosina para análise histológica da morfologia básica. O segmento intestinal considerado mais afetado na análise morfométrica da população geral de neurônios, o duodeno, foi selecionado para a realização da análise proteômica, com o objetivo de oferecer o seu perfil proteico e determinar diferenças na expressão proteica em decorrência da exposição crônica ou aguda ao F. A análise da concentração de F no plasma sanguíneo foi realizada para a confirmação da exposição. Na análise quantitativa, o grupo de 50 ppm F, apresentou uma diminuição significativa na densidade da população geral de neurônios do jejuno e do íleo e na densidade dos neurônios imunorreativos à nNOS no duodeno e no jejuno. Quanto à análise morfométrica, a população geral e as subpopulações neuronais entéricas avaliadas apresentaram alterações morfológicas significativas, tanto após a exposição crônica quanto a aguda. Para a análise proteômica do duodeno, verificou-se que da associação de seus genes a um termo, e assim classificadas de acordo com diferentes processos biológicos. No caso do grupo da dose aguda, o processo biológico com a maior porcentagem de genes associados foi a geração de metabólitos precursores e energia (27% das proteínas); enquanto para os grupos de 10 e 50 ppm F foram o processo metabólico da piridina (41%) e a polimerização proteica (33%), respectivamente. / The gastrointestinal tract (GIT) is the main route of fluoride (F) exposure, and the most important site of its absorption. It is believed that F toxicity compromises the intestine physiology, due to the relevant gastrointestinal symptomatology reported in consequence to excessive exposure. The intestinal function is controlled by a complex neuronal net, which is interconnected and embedded in the wall of this organ, named Enteric Nervous System (ENS). Although the toxic effects of F on the Central Nervous system are described in the literature, there are no studies related to its toxicity on the ENS. Therefore, in this study performed in rats, the effects of chronic and acute F exposure were evaluated, on the general population of enteric neurons and on the subpopulations that express the main enteric neurotransmitters: Acetylcholine (Ach), Nitric Oxide (NO), Vasoactive Intestinal Peptide (VIP), Calcitonin gene related peptide (CGRP), and Substance P (SP). The animals were divided into 5 groups: 3 designed to the chronic exposure (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F in the drinking water) and 2 to the acute exposure (0 ou 25 mgF/Kg - gastric gavage). Three intestinal segments were collected (duodenum, jejunum, and ileum) and processed for the immunofluorescence techniques to detect HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP and SP, on the myenteric plexus. Images were obtained for the quantitative analysis of the general population of neurons (HuC/D immunoreactive) and the nitrergic neurons (nNOS immunoreactive), for the morphometric analysis of the general population and nitrergic neurons and also for the immunoreactive varicosities to ChAT, VIP, CGRP or SP. Samples of the 3 intestinal segments were prepared and stained with hematoxylin and eosin for histological analysis of the basic morphology. Duodenum, the intestinal segment considered the most affected in the morphological analysis of the general population of neurons, was selected for the proteomic analysis, with the objective to offer the entire protein profile and to determine differences in the protein expression due to chronic or acute F exposure. Plasma F concentration was analyzed to confirm the exposure. In the quantitative analysis, the 50 ppm F group presented a significant decrease in the density of the general population of neurons in the jejunum and ileum, and in the density of the nitrergic neurons in the duodenum and jejunum. Regarding the morphometric analysis, the general population of neurons and all the neuronal subpopulations evaluated presented significant morphological alterations, for both exposures, chronic and acute. In the proteomic analysis of the duodenum, it was verified that both exposures caused alterations in the expression of intestinal proteins. These proteins identified with differential expression were distributed according the association of their genes to a specific term, and by this term classified in different biological process. In the group that received the acute dose the biological process with the highest percentage of associated genes was the generation of precursor metabolites and energy (27% of proteins), and for the 10 and 50 ppm F groups, they were pyridine nucleotide metabolic process (41%) and protein polymerization (33%), respectively.

Foi descrita a presença do receptor P2X2 no sistema nervoso entérico e foi constatado que a desnutrição afeta os neurônios mioentéricos. Este projeto analisou os neurônios dos plexos mioentérico (PM) e submucoso (PS) imunorreativos ao receptor P2X2(ir), calbindina (Calb-ir), calretinina (Calr-ir), colina acetil transferase (ChAT-ir) e ao óxido nítrico sintase (NOS-ir) do íleo de ratos submetidos à desnutrição protéica pré e pós-natal e a renutrição pós-natal. Foram utilizados íleos de animais nutridos (N42), desnutridos (D42) e renutridos (RN42). Os resultados do PM e PS demonstraram 100% de neurônios Calb-ir, Calr-ir, ChAt-ir e NOS-ir expressavam o receptor P2X2-ir nos grupos. As densidades neuronais do PM e PS demonstraram aumento de 30% e 25% respectivamente, dos neurônios receptor P2X2-ir, Calr-ir, ChAT-ir e NOS-ir no grupo D42 e, recuperação no grupo RN42, os neurônios Calb-ir aumentaram 60% no PS. O perfil neuronal do PM mostrou diminuição de 26% nos neurônios receptor P2X2-ir e Calr-ir no grupo D42 e, no PS houve diminuição nos neurônios receptor P2X2-ir. Concluiu que a desnutrição afetou os neurônios entéricos e houve recuperação na renutrição, isto pode influenciar as funções do trato gastrintestinal. / It is showed the expression of the P2X2 receptor in the enteric nervous system; it was observed that undernutrition affect the myenteric neurons. This project analyzed the ileum myenteric (MN) and submucous (SN) neurons immunoreactive to P2X2 receptor, calbindin (Calb-ir), calretinin (Calr-ir), coline acetil transferase (ChAT) and nitric oxide sintase (NOS) of the animals submitted to pre- and postnatal protein deprivation and postnatal refeeding. Ileum was used from nourished (N42), undernourished (D42) and Refeeding (RN42) animals. The results showed 100% coexpression myenteric and submucous Calb-ir, Calr-ir, ChAt-ir e NOS-ir neurons with P2X2-ir receptor. The myenteric and submucos neuronal density showed increase of the 30% and 25% respectively, of the P2X2-ir, Calr-ir, ChAT-ir e NOS-ir neurons of the D42 group, the Calb-ir neurons increase 60% in the SN. It was observed in the MN neuronal profile decrease of the 26% of the P2X2-ir and Calr-ir in the RN42 group and recover in the RN42, there was decrease of the P2X2-ir receptor neurons in the submucous plexus. The conclusion demonstrated that undernutrition affects the enteric neurons and there was recuperation in the refeeding, this can influence the gastrointestinal functions.

A diabetes mellitus (DM) pode levar a distúrbios da motilidade gastrointestinal que podem se tornar clinicamente relevantes em alguns pacientes. Modelos de Dm em roedores indicam anormalidades morfofuncionais do sistema nervoso entérico nessa doença. Neste trabalho, avaliamos se o DM experimental pode levar a alterações na eferência colinérgica excitatória, densidade neuronal e expressão dos canais de sódio voltagemdependente (Nav) no plexo mioentérico do íleo. Hiperglicemia induzida por estreptozotocina em ratas foi desenvolvida durante oito semanas. Experimentos de imunofluorescência de tripla marcação revelaram que a densidade de neurônios por área do íleo no DM foi significativamente reduzida quando comparada ao controle. Foram observadas reduções médias de 52,2% do total de neurônios (p=0,0001); 50,0% dos neurônios colinérgicos (p=0,0068) e 54,8% dos neurônios nitrérgicos (p=0,0042). Também foram observadas reduções significativas de neurônios por área de gânglio (28,2% do total, p=0,0002; 27,7% de colinérgicos, p= 0,0002 e 32,1% de neurônios nitrérgicos, p=0,0016). A densidade de fibras colinérgicas na superfície do músculo longitudinal também foi significativamente reduzida (controle: 41 ± 2, DM: 24 ± 3%; p=0,003), embora a análise western-blot não indicasse redução na expressão de ChAT no DM. grupo. A isoforma Nav1.6 foi detectada em diferentes neurônios mioentéricos e a DM tendeu a mudar o padrão de imunomarcação para neurônios de tamanho maior (297,4 ± 10 vs. 372,5 ± 8,4 µm2), mas esse efeito não foi significativo (p=0,3). Os dados de RT-qPCR não sugeriram uma alteração dos transcritos para ChAT, nNOS, Nav1.3, Nav1.6 ou Nav1.7. Nossos dados confirmam a visão de que o DM crônico leva à redução das fibras colinérgicas excitatórias e da densidade neuronal. No entanto, mudanças no perfil de expressão do canal de sódio, que poderiam levar à disfunção neuronal, não foram detectadas. / Diabetes mellitus (DM) may lead to gastrointestinal motility disorders that may become clinically relevant in some patients. Rodent models of DM indicate morpho-functional abnormalities of the enteric nervous system in this disease. In this work, we have evaluated whether experimental DM can lead to changes in excitatory cholinergic efference, neuronal density and voltage-gate sodium channels (Nav) expression in the myenteric plexus of ileum. Streptozotocin-induced hiperglycemia in female rats was allowed to develop during eight weeks. Triple immunofluorescence labeling experiments revealed that the density of neurons per area of ileum in DM was significantly reduced when compared to the control. It were observed average reductions of 52.2% of total neurons (p=0.0001); 50.0% of cholinergic (p=0.0068) and 54.8% of nitrergic neurons (p=0.0042). Significant reductions of neurons per area of ganglion were also observed (28.2% of total, p=0.0002; 27.7% of cholinergic, p=0,0002 and 32.1% of nitrergic neurons, p=0.0016). The cholinergic fibers density at the surface of longitudinal muscle was also significantly reduced (control: 41 ± 2, DM: 24 ± 3%; p=0.003), although western-blot analysis did not indicate a reduction in the expression of ChAT in DM group. The Nav1.6 isoform was detected in different myenteric neurons and DM tended to shift the immunolabeling pattern towards neurons of bigger size (297.4 ± 10 vs. 372.5 ± 8.4 m2), but this effect was not significant (p=0.3). RT-qPCR data did not suggest an alteration of transcripts for ChAT, nNOS, Nav1.3, Nav1.6 or Nav1.7. Our data support the view that chronic DM leads to reduction in excitatory cholinergic fibers and neuronal density. However, changes in sodium channel expression profiling, which could lead to neuronal dysfunction, were not detected. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais