Ce travail de thèse porte sur le développement de méthodes en spectrométrie de masse (MS) et mobilité ionique (IM-MS) supramoléculaires pour la caractérisation fine de complexes protéine-ligand et d’assemblages protéiques hétérogènes de hauts poids moléculaires. L’optimisation instrumentale apportée à l’étude de ces systèmes, permet d’étendre le potentiel de ces deux approches en biologie structurale. Le criblage de complexes protéine-ligand permet ici une détermination de leurs propriétés d’interaction et la mise en évidence de subtils changements de conformation induits, pouvant être suivis au cours du temps. L’application de ce couplage à l’analyse de complexes multi-protéiques, réfractaires aux techniques conventionnelles, donne accès à la topologie de ces assemblages, facilitant la proposition de modèles structuraux. Enfin, l’apport récent de la haute résolution en MS native est ici illustré à travers l’étude de protéines complexes et hétérogènes : les anticorps thérapeutiques et leurs conjugués. Ces développements permettent de repousser certaines limites en MS native et IM-MS native, élargissant leurs perspectives d’application dans la recherche et l’industrie pharmaceutique. / This PhD thesis aims at developing methods in native mass spectrometry (MS) combined with ion mobility (IM-MS) to characterize protein-ligand complexes and large protein assemblies. Fine-tuning of instrumental settings allowed expanding the scope of these approaches in structural biology. Real-time monitoring of protein-ligand complexes by native MS and IM-MS enabled to screen their binding properties while depicting subtle conformational changes induced upon binding. Applying these methods to refractory multi-protein complexes provided insights about their topology, making structural modeling easier. Finally, benefits from high-resolution native MS were highlighted through the characterization of heterogeneous systems, including monoclonal antibodies and their drug conjugates. Here, these developments enable to push some technical limits one step forward, increasing the potential of native MS and IM-MS both in academic research and pharmaceutical industry.

Le développement actuel très rapide des différentes approches « omiques » génère un grand nombre de biomarqueurs potentiels, en particulier dans le domaine de la cancérologie.L’analyse protéomique par spectrométrie de masse a particulièrement bénéficié des progrès technologiques récents qui ont permis la mise au point de nouvelles approches quantitatives globales ou ciblées. Néanmoins, peu de biomarqueurs potentiels finissent par être concrètement utilisés en pratique clinique, nécessitant l’optimisation des différentes étapes de leur développement.Dans la continuité des travaux ayant abouti à l’identification de biomarqueurs diagnostiques dans les hémopathies lymphoïdes B, ce travail de thèse a permis le développement d’une méthode d’analyse protéomique ciblée pour la vérification et la validation de nouveaux biomarqueurs potentiels. La possibilité d’appliquer des stratégies quantitatives globales à un très grand nombre d’échantillons a pu être démontrée. L’application de ces stratégies quantitatives globales à du tissu ganglionnaire provenant de lymphomes agressifs a permis d’identifier des biomarqueurs potentiellement associés à une résistance au traitement. Enfin,le mode de préparation tube-gel, facilitant l’étude d’un grand nombre d’échantillons, a été validé pour la réalisation d’analyses protéomiques différentielles. / The current development of new « omics » technologies has led to the discovery of a large number of potential biomarkers, particularly in the field of oncology. Proteomics analysis bymass spectrometry have particularly benefited from these technological advances with the development of new global or targeted quantitative approaches. Nevertheless, only a few numbers of potential biomarkers are finally used in clinical practice, requiring further optimization of the development process. Following the initial identification of biomarkers in the diagnosis of lymphoid malignancies performed previously, this thesis has allowed the development of a targeted proteomics method that can be used for the validation of new potential biomarkers. The ability of analysing a large number of samples with a global quantitative approach has also been demonstrated. The application of these global quantitative strategies on lymph node tissue of aggressive lymphoma has permitted the identification of potential new biomarkers associated with chemorefractoriness. Lastly, a tube-gel protocol facilitating the analysis of a large number of samples has been validated for differential proteomics studies.

Les cheveux constituent un matériau de choix en archéométrie pour l’étude des civilisations anciennes. L’étude moléculaire de cheveux de momies et de leur protéome peut apporter de précieuses informations sur la composition, la préservation et l’environnement de la fibre. Une approche protéomique bottom-up dédiée à l’analyse en MS des protéines de cheveux de momies a été donc implémentée. Celle-ci a permis l’identification des protéines capillaires de cheveux anciens à partir de quantités minimales, ainsi que la caractérisation de leur état de conservation. Cette approche a été associée à une stratégie interdisciplinaire, intégrant également des analyses structurelles par FTIR, et élémentaires par SEM-EDS, XRF et PIXE. Enfin, le couplage direct TLC-MALDI-MS a été mis en place pour la caractérisation de systèmes biologiques et archéologiques, complexes et précieux. / Hair is an ideal material for the archaeometric study of past civilizations. Although it is rarely described, molecular study of hair and its proteome can provide precious clues on the ancient hair composition, its preservation state, as well as its environment. Here, we describe the implementation of a bottom-up proteomic approach for the mass spectrometry analysis of proteins from mummy hair. Through this approach, it was possible to identify the ancient hair proteins from a minimal initial amount of sample, and to characterize their molecular conservation state. This study was associated to an interdisciplinary project that also integrates structural analyses by FTIR and elemental analyses by SEM-EDS, XRF and PIXE. Finally, TLC-MALDI-MS hyphenation was implemented for the characterization of biological and archaeological systems, which are also complex and precious.

La thématique des maladies infectieuses représente un réel enjeu politique, économique et de santé publique. Les objectifs de mes travaux de thèse étaient de développer des approches protéomiques pour identifier, détecter, caractériser et/ou quantifier des protéines et de les appliquer à l’étude de maladies infectieuses pour lesquelles des données de protéomique pourraient ouvrir à de nouvelles approches thérapeutiques et/ou diagnostiques. Les stratégies d’identification et de détection des protéines développées pour l’étude de la maladie de Lyme ont permis de prouver la faisabilité du diagnostic par spectrométrie de masse et de proposer des protéines candidates-vaccin. Les stratégies de quantification mises en place pour l’étude de la toxoplasmose ont permis d’identifier et de quantifier un complexe protéique clef. Les stratégies de caractérisation du N-terminome pour l’étude du paludisme ont permis d’apporter des preuves expérimentales des processus de maturation et d’adressage des protéines. / Infectious diseases represent a real challenge in terms of politic, economic and public health. The purposes of my thesis works were to develop proteomic approaches able to identify, to detect, to characterize and/or to quantify proteins and to apply these approaches to the study of infectious diseases for which proteomic data cou Id open to new therapeutic and/or diagnostic strategies. Identification and specific detection strategies developed in the study of Lyme's disease allowed to prove the feasibility of diagnosis by mass spectrometry and to propose new vaccine-candidate proteins. Quantification strategies developed in the study of toxoplasmosis allowed us to identify and to quantify a key protein complex of the parasite. N-terminome characterization strategy developed in the study of malaria allowed us to bring experimental proofs of proteins processing and trafficking.

L’analyse protéomique consiste en l’analyse qualitative et quantitative de l’ensemble des protéines exprimées dans une cellule ou tissu dans des conditions données (protéome). Les progrès instrumentaux en spectrométrie de masse et les avancées bioinformatiques des dernières années ont permis d’imposer ce domaine dans les sciences de la vie. Diverses stratégies protéomiques permettent ainsi, aujourd’hui, d’identifier et quantifier plusieurs centaines/milliers de protéines dans un échantillon complexe, ce qui permet classiquement de caractériser les états physiopathologiques. En revanche, la protéomique est un outil émergent en biologie évolutive. Ce domaine vise à comprendre les déterminants de la diversité des organismes présents sur Terre et de leur « fonctionnement », notamment leurs adaptations à certaines contraintes environnementales.L’objectif de cette thèse était d’étudier, de l’organe à l’écosystème, les variations protéomiques induites par des changements environnementaux, tout en adaptant les différentes étapes de l’analyse à chaque type d’échantillons, à chaque organisme, de la préparation d’échantillons à l’analyse des données. Grâce à la mise en place d’une stratégie de séquençage de novo quantitative originale, ces travaux de thèse ont été l’occasion d’étudier le rôle du tissu adipeux brun dans la protection contre l’obésité chez le campagnol, espèce dont le génome n’est pas séquencé. D’autres traits particuliers ont été explorés, tels que l’obésité réversible du microcèbe, ou encore les interactions entre socialité et longévité chez la fourmi. Les solutions logicielles envisagées ne permettant de quantifier de manière robuste des peptides identifiés par séquençage de novo à partir d’échantillons fractionnés, nous avons ainsi établi que le préfractionnement permet d’obtenir une meilleure couverture de protéome. En revanche, sans préfractionnement, le séquençage de novo produit un gain indéniable. Enfin, en étudiant le métaprotéome de communautés biotiques des sols alpins, nous avons mis en évidence l’intérêt de combiner protéomique et génomique, afin d’établir la banque de données protéiques la plus appropriée, mais aussi pour « valider » les données protéomiques. / Proteomics analysis corresponds to the qualitative and quantitative analysis of all proteins expressed in a cell or tissue under given conditions (proteome). Instrumental progresses in mass spectrometry and bioinformatics advances in recent years have allowed its establishment in life sciences. Diverse proteomics strategies thus allow identification and quantification of hundreds/thousands of proteins in complex samples, which classically allows physiopathological states to be characterized. However, proteomics is only emerging in the evolutionary biology field. This field aims at understanding the determinants of the diversity of organisms present on Earth and their “functioning”, including their adaptations to certain environmental constraints.The objective of this thesis was to study, from the organ to the eco-system, the proteomic variations induced by environmental changes, while adapting the different steps of the analysis to each type of sample, each organism, from sample preparation to data analysis. Through the introduction of an original quantitative de novo sequencing strategy, we studied the role of brown adipose tissue against obesity in a non-sequenced species: the vole. Other particular traits were explored, such as the reversible obesity of the grey mouse lemur or the interactions between sociality and longevity in the ant. The considered software solutions did not allow to robustly quantify peptides identified by de novo sequencing from fractionated samples, we thus determined that prefractionation allows for better proteome coverage. On the other hand, without prefractionation, de novo sequencing produces an undeniable gain. Finally, by studying the metaproteome of alpine soil biotic communities, we have highlighted the advantage of combining proteomics and genomics, in order to establish the most appropriate protein database and to “validate” proteomics data.

Les objectifs de mes travaux de thèse étaient de développer de nouvelles méthodes d’identification, de caractérisation et de quantification de protéines, mieux adaptées à la diversité des études en protéomique, ce dont la biologie a besoin aujourd’hui. L’analyse protéomique par spectrométrie de masse est apparue comme un outil précieux et pertinent pour évaluer la qualité de l’isolement d’un complexe spécifique, et pour guider les biologistes dans les choix de la stratégie à adopter. La stratégie de marquage de N-terminomique développée a permis de caractériser un processus de maturation biologique en déterminant précisément les sites d’activation de la protéine Perséphone par marquage spécifique des extrémités N-terminales. Ce travail a permis d’élucider un nouveau mécanisme fin de régulation dans l’immunité innée chez la drosophile. De nouveaux modes de marquages ont été mis au point et les familles chimiques des réactifs de marquage étudiés permettront d’adapter au mieux les études de quantifications protéomiques à la nature et aux contraintes des études biologiques à mener. / The aim of this work was to develop new methods for the identification, characterization and quantification of proteins best suited to a large diversity of proteomics studies, which is nowadays essential to biology. Our work has shown that proteomic analysis based on mass spectrometry can be a valuable and relevant tool to evaluate the isolation strategy efficiency set up for a specific complex and thus guide the biologists in their choice. The N-terminomic labeling strategy developed allowed us to describe a biological maturation process by determining precisely the Persephone protein activation sites using specific labeling of the successively generated N-terminal extremities. This work allowed elucidating a new regulation mechanism in the Drosophila innate immunity system. New chemical labeling reagents to target specific amino acids (cysteine, tyrosine and tryptophan) have been set up for fast mass-spectrometry based proteomics. These labeling strategies combined with proteomic tools will allow developing a robust and quantitative approach essential for biological studies.

Les récents progrès instrumentaux en spectrométrie de masse, notamment en terme de- rapidité de balayage et de résolution, ont permis l'émergence de l'approche « data independent acquisition» (DIA). Cette approche promet de combiner les points forts des approches « shotgun » et ciblées,mais aujourd'hui l'analyse des données DIA reste compliquée. L'objectif de cette thèse a été de développer des méthodes innovantes de spectrométrie de masse, et en particulier d'améliorer l'analyse des données DIA. De plus, nous avons développé une approche originale Top 3-ID-DIA, permettant à la fois un profilage complet des protéines de la cellule hôte (HCP) ainsi qu'une quantification absolue d'HCP clés dans les échantillons d'anticorps monoclonaux (mAb), au sein d'une même analyse.Cette méthode est prête à être implémentée en industrie, et pourrait fournir un support en temps réel aux développements du procédé de production de mAb, ainsi que pour évaluer la pureté des biomédicaments. / Recent instrumental developments in mass spectrometry, notably in terms of scan speed and resolution, allowed the emergence of “data independent acquisition” (DIA) approach. This approach promises to combine the strengths of both shotgun and targeted proteomics, but today DIA data analysis remains challenging. The objective of my PhD was to develop innovative mass spectrometry approaches, and in particular to improve DIA data analysis. Moreover, we developed an original Top 3-ID-DIA approach, allowing both a global profiling of host cell proteins (HCP) and an absolute quantification of key HCP in monoclonal antibodies samples, within a single analysis. This method is ready to be transferred to industry, and could provide a real time support for mAb manufacturing process development, as well as for product purity assessment.

La compréhension des cycles couplés de la matière organique et des éléments traces métalliques (ETMs) tels que Cu, Zn, Cd, Pb et les lanthanides (Ln) dans les sols nécessite des connaissances sur les espèces formées aux interfaces solide-solution. La sorption des acides fulviques (AFs) sur les surfaces minérales est d’importance car les AFs modifient la réactivité de surface et la capacité de sorption des minéraux vis-à-vis des ETMs. Les AFs sont des mélanges complexes de milliers de composés organiques qui subissent un fractionnement chimique lors de leur sorption sur les surfaces minérales des sols. Le but principal de cette étude est d’élucider le fractionnement d’AFs d’origines et de compositions différentes sur des surfaces minérales (argiles, hydroxydes de fer et d’aluminium) d’intérêt pour les sols, et d’en investiguer l’effet sur la sorption des ETMs dans des systèmes métaux-AF-minéral-solution modèles. Il s’agit ensuite d’appliquer les connaissances acquises dans les systèmes modèles à la compréhension du comportement des ETMs dans des systèmes eaux-sols.L’utilisation de la spectrométrie de masse haute résolution ESI(-)-FTMS pour l’analyse de solution d’AFs (PPH,extrait d’un sol sous hêtraie ; PPC, extrait d’un sol sous conifères; PPFA, AF de référence issu d’une tourbe)issus d’expériences de sorption sur l’hématite, l’alumine et la kaolinite a permis de mettre en évidence que les propriétés de surface des minéraux sont un paramètre clé régissant le fractionnement de sorption des AFs. Les données ont montré que l'affinité relative des molécules d’un AF pour la surface des oxydes métalliques est régie par l'acidité moléculaire, l’échange de ligand étant le principal mécanisme impliqué dans le processus de sorption à pH acide. En revanche, la surface de la kaolinite a montré une faible sélectivité, la sorption résultant principalement de la formation de liaisons H avec les sites de faible affinité sur les plans basaux des particules.En combinant des données macroscopiques sur la sorption compétitive des métaux (Cu, Zn, Cd, Pb et Ln) avec des descriptions à l'échelle moléculaire du fractionnement de PPH sur l’hématite et la kaolinite à différents rapports AF/minéraux, nous avons mis en évidence que le comportement de sorption des métaux sur une surface minérale en présence d’AFs est largement influencé par la distribution moléculaire des AFs aux interfaces minéral-solution, qui dépend principalement de la nature (oxyde métallique versus argile) et des propriétés des surfaces minérales ainsi que du rapport AF/minéral dans le cas des oxydes métalliques.L’acquisition de données sur deux profils de sols développés sous hêtraie et sous conifères par différentes approches complémentaires (minéralogie, calculs de bilans massiques, extractions séquentielles, et analyses ESI(-)-FTMS des substances humiques) a montré que les dynamiques (distribution verticale, fractionnement) des AFs et le comportement des ETMs sont interconnectés et gouvernés par la nature et la réactivité des surfaces minérales présentes dans les sols. / Building a comprehensive description of the coupled cycles of organic matter and trace metal elements (TMEs) such as Cu, Zn, Cd, Pb and lanthanides (Ln) in soils requires knowledge on the species formed at the solid-solution interfaces. The sorption of fulvic acids (FAs) on mineral surfaces is of importance, because FAs modify the surface reactivity and the sorption capacity of minerals towards TMEs. FAs are complex mixtures of thousands of organic compounds which undergo a chemical fractionation during their sorption on mineral surfaces of soils. The purpose of this study was to elucidate the fractionation of FAs of different origins and compositions on mineral surfaces (Fe and Al hydroxides, clays) relevant to soils, and to investigate its effect on the sorption of TMEs in model metals-FA-mineral-solution systems. The next step was to use the knowledge acquired on model systems for understanding the behavior of TMEs in water-soil systems. The use of high-resolution ESI(-)-FTMS mass spectrometry for analyzing FA solutions (as FAs: PPH, extracted from a soil under a beech forest; PPC, extracted from a soil under a fir forest; and PPFA, a reference peat FA) resulting from sorption experiments onto hematite, alumina and kaolinite provided evidence that mineral surface properties are a key parameter governing the FA sorptive fractionation. The MS data showed that the relative affinity of FA molecules for the surface of metal oxides is governed by molecular acidity, ligand exchange being the main mechanism involved in the sorption process at acidic pH. In contrast, the surface of kaolinite displayed alow selectivity, the sorption resulting mainly from H-bonding with low-affinity basal sites. By combining macroscopic data on the competitive sorption of metals (Cu, Zn, Cd, Pb and Ln) with molecular scale descriptions of PPH fractionation onto hematite and kaolinite at different FA/mineral ratios, we have shown that the sorption behavior of metals on mineral surfaces in the presence of PPH is greatly impacted by the molecular distribution of PPH at the mineral-solution interface, which mainly depends on the nature (metal oxidevs clay) and properties of the mineral surfaces as well as on the FA/mineral ratio for metal oxides. Data acquired on two soil profiles developed under beech and fir forests by using different complementary approaches (mineralogy, mass balance calculations, sequential extractions and ESI(-)-FTMS analyzes of humic substances) showed that the dynamics (vertical distribution, fractionation) of FAs and the behavior of TMEs are interconnected and governed by the nature and reactivity of mineral surfaces in soils.

Cette thèse présente une étude des propriétés optiques et de la photofragmentation de biomolécules en phase gazeuse. Les expériences sont effectuées sur un piège ionique quadripolaire couplé avec des lasers UV-Visible accordables en longueur d'onde. Les molécules sont isolées en phase gazeuse au centre du piège puis irradiées par le faisceau laser. Pour les molécules polyanioniques, le canal de relaxation principal après excitation laser est l'émission d'électron. Cette perte d'un électron conduit à la formation d'un ion radicalaire. Une partie de ce travail est consacrée à l'étude de la relaxation de molécules polyanioniques après excitation laser et notamment aux mécanismes conduisant à la perte d'électron. Les expériences de photodétachement réalisées à Lyon ont été complétées par des expériences de spectroscopie de photoélectron effectuées à Karlsruhe (Pr. Kappes). La production d'anions radicalaires a un potentiel analytique important. L'un des objectifs de ce travail de thèse a été d'étudier la réactivité de ces ions radicalaires et de montrer l'intérêt de leur fragmentation pour l'analyse structurelle de peptides. L'autre objectif était de sonder les propriétés électroniques de protéines et de peptides en phase gazeuse. Pour cela, le taux de détachement d'électron a été enregistré en fonction de la longueur d'onde du laser. Nous avons notamment pu déterminer des signatures optiques pour des chromophores neutres, déprotonnés ou radicalaires au sein des protéines. Ces résultats ont été comparés à des calculs théoriques (TD DFT). / This manuscript discusses optical properties and photofragmentation of gas phase biomolecules. These experiments are performed with a quadrupolar ion trap coupled to a UV-visible tunable laser. Molecules are isolated at the center of the trap, and irradiated by the laser beam. The most intense relaxation channel observed for multiply negatively charged ions is electron emission. This loss of one electron leads to radical anion formation. The first part of this manuscript is dedicated to the study of the mechanisms leading to the electron loss. Photodetachment experiments performed in Lyon were completed by photoelectron spectroscopy experiments performed in Karlsruhe (Pr. Kappes). The radical anion production has an important analytical potential. One of the main objectives of this work was to study the reactivity of this radical anion and to show the interest of radical fragmentation for the structural analysis of peptides. An other objective was to probe electronical properties of gas phase peptides and proteins. The electron detachment yield is recorded as a function of laser wavelength. We have determinated optical fingerprints for neutral, deprotonated and radical chromophores localized in the heart of proteins. These results are compared to computational methods (TD DFT).

La virulence de Plasmodium falciparum est fonction de sa capacité à séquestrer les érythrocytes infectés (iEs) dans les organes profonds de l’hôte. Elle est liée à la mise en place d’un trafic protéique conséquent au niveau membranaire et sub-membranaire de l’iE. Cet adressage protéique aboutit à l’expression d’antigènes variant de surface, dont P. falciparum Erythrocyte Membrane Protein-1, PfEMP-1. Cet adhésine présente une affinité pour divers récepteurs de l'hôte impliqués dans la physiopathologie des formes graves, telles que le paludisme associé à la grossesse (PAM) et le paludisme cérébral (CM). La diversité de liaison de PfEMP-1 est associée à la variabilité de séquence de son domaine extracellulaire. Ce domaine est constitué d’une succession de domaines DBL et CIDR en nombre variable. PfEMP-1 est codée par les gènes var classifiés en groupes Ups A, B, C, E et B/A, B/C. Des régions de PfEMP-1 constituées d’une succession établie de 2 à 4 domaines, nommées Domain Cassette, « DC » sont retrouvées dans différents isolats. L’obtention de données exhaustives par LC-MS/MS a permis d’établir un comparatif du protéome membranaire et hypothétique à partir des échantillons PAM et CM en comparaison à des accès simples de paludisme (UM). L’identification protéique des PfEMP-1 a montré la singularité de l’expression d’une PfEMP-1 particulière, VAR2CSA chez les PAM. Ces résultats corroborent les analyses des transcrits du gène var2csa comme surexprimé chez les PAM, transcrit qu’on retrouve également dans les infections de début et de fin de grossesse. Les PfEMP-1 identifiés au sein des CM étaient significativement associés aux groupes Ups A et B/A et la plupart des peptides identifiés étaient associés à la cassette DC8 dont le transcrit était également surexprimé. L’analyse de filter-based feature selection a permis d’identifier un sous ensemble de 13 et 14 protéines assignées comme protéines membranaires ou hypothétiques, prédictives des formes de paludisme PAM et CM, respectivement. Parmi ces protéines surexprimées chez les PAM, la présence de VAR2CSA valide l’approche d’analyse. PFI1785w a été identifiée et associée au PAM, quatre autres protéines apparaissent prédictives de cette forme clinique PFB0115w, PFF0325c, PFA_0410w et PF14_0018. Pour les CM, on distingue les protéines PfEMP-2 et antigen-332 comme spécifiques de cette forme clinique. Les autres protéines qui émergent de ce groupe sont des protéines de fonction inconnue, dont trois sont assignées comme des protéines exportées. L’obtention et l’analyse en LC-MS/MS d’extraits protéiques issus d’isolats de terrain font l’originalité de ce travail et permettent la corrélation entre les données cliniques et biologiques. Cette étude confirme les données de transcrits sur la famille des gènes var et suggère de nouvelles intéractions protéiques dans le cadre du paludisme associé à la grossesse et cérébral. / Plasmodium falciparum is responsible for severe malaria (cerebral malaria, CM and pregnancy associated malaria, PAM). During the intra-erythrocytic maturation of P. falciparum, parasite-derived proteins are expressed, exported and presented at the surface of the infected erythrocyte (iE) membrane. These include Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein-1 (PfEMP-1). PfEMP-1 is a highly polymorphic adherence receptor, variants of which have been assigned to four groups (A-E) based on their sequence homology. Semi-conserved types, defined by tandem runs of specific domains (“domain cassettes” (DC)), are also recognized. The PfEMP-1 type expressed determines the iE adherence phenotype, and is associated with the clinical outcome of infection. Parasite isolates from Beninese children or women presenting with, respectively, CM or PAM were collected along with samples from patients with uncomplicated malaria (UM). We assessed the transcript level of var genes by RT-qPCR and the expression of membrane and hypothetical proteins of Plasmodium by LC-MS/MS. Obtaining LC-MS/MS data enabled a comparison of hypothetical and membrane proteome samples from PAM and CM for comparison with UM samples. The proteomics-based identification of PfEMP-1 showed the expression of a particular PfEMP-1, VAR2CSA, in PAM isolates. These results corroborate the analysis of gene transcripts showing that var2csa is overexpressed in PAM, with transcripts found in isolates from infections both early and late in pregnancy. The PfEMP-1 variants identified in CM samples were predominantly from the Ups groups A and B/A, and most of the peptides identified by LC-MS/MS were associated with the DC8 cassette for which the transcripts were also overexpressed. Analysis using filter-based feature selection identified subsets of 13 and 14 proteins, assigned either as hypothetical or membrane proteins that were predictive of PAM and CM syndromes respectively. The presence of VAR2CSA amongst the proteins overexpressed in PAM samples validates the analytical approach. PFI1785w has previously been identified and associated with the PAM, whilst four other proteins, PFB0115w, PFF0325c, PFA_0410w and PF14_0018, appear to be also predictive of the syndrome. PfEMP-2 protein and antigen-332 were found to be specifically expressed in CM samples. Three other proteins, assigned as ‘exported’ but with unknown function, were also associated with CM samples. Obtaining and analyzing LC-MS/MS-derived data from protein extracts of field isolates represents the originality of this work and it allowed the identification of correlations between clinical and biological data. This study confirms the transcriptional data relating to the var gene family and provides evidence of new protein interactions in the context both of malaria associated with pregnancy and of cerebral malaria.