En influençant le degré de compaction de la chromatine ainsi que ses interactions avec différents partenaires protéiques, les modifications post-traductionnelles des histones sont impliquées dans la régulation de l’expression des gènes. Avec les différents variants d’histones incorporés dans la chromatine, ces modifications dynamiques et sensibles à l’environnement sont constitutives du code histone. Ce travail présente une approche globale de criblage baptisée approche histonomique, visant à révéler une perturbation épigénétique à l’échelle des histones. Cette approche originale offre une comparaison rapide et fiable des abondances relatives des variants d’histones et de leurs modifications post-traductionnelles dans des cellules humaines en une seule analyse LC-MS. Comme preuve de concept, des cellules BeWo issues de choriocarcinome humain ont été exposées au butyrate de sodium, un inhibiteur non spécifique d’histones désacétylases. Les histones extraites des échantillons témoins ou traités au butyrate de sodium à 1 ou 2,5 mM ont été analysées par chromatographie liquide ultra performante couplée à un spectromètre de masse de type Q-TOF. Les analyses statistiques multivariées ont permis de discriminer les échantillons témoins des échantillons traités sur la base des différences de degrés d’acétylation observés sur plusieurs formes d’histones. La même approche a ensuite été appliquée à des cellules exposées au B[a]P à 1 μM et a révélé deux principaux marqueurs caractéristiques d’un remodelage de la chromatine induit par les effets génotoxiques duB[a]P. En résumé, cette approche histonomique globale pourrait se révéler être un outil complémentaire très utile pour explorer une potentielle perturbation du code histone lors d’exposition à des xénobiotiques environnementaux. / While acting upon chromatin compaction, histone post-translational modifications (PTMs) are involved in modulating gene expression through histone–DNA affinity and protein–protein interactions. These dynamic and environment-sensitive modifications are constitutive of the histone code that reflects the transient transcriptional state of the chromatin. Here we describe a global screening approach for revealing epigenetic disruption at the histone level. This original approach enables fast and reliable relative abundance comparison of histone PTMs and variants in human cells within a single LC-MS experiment. As a proof of concept, we exposed BeWo human choriocarcinoma cells to sodium butyrate (SB), a universal histone deacetylase (HDAC) inhibitor. Histone acide xtracts equally representing 3 distinct classes, Control, 1 mM and 2.5 mM SB, we reanalyzed using ultra-performance liquid chromatography coupled with a hybrid quadrupoletime-of-flight mass spectrometer (UPLC-QTOF-MS). Multivariate statistics allowed us to discriminate control from treated samples based on differences in the acetylation level of several histone forms. We then applied the same procedure to cells treated with 1 μMB[a]P and suceeded in revealing two markers of chromatin remodeling in relation withgenotoxic properties of B[a]P. Indeed, this untargeted histonomic approach could be auseful exploratory tool in many cases of environmental xenobiotic exposure when histone code disruption is suspected.

L’identification des micro-organismes reposait jusqu’à présent sur l’étude des caractères culturaux et biochimiques de chaque espèce. Depuis quelques années, la spectrométrie de masse de type Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight (MALDI-TOF) s’est développée dans les laboratoires de microbiologie clinique. Cette nouvelle technologie permet de réaliser très rapidement et à moindre coût un diagnostic d’espèce sur des colonies de bactéries ou de champignons isolées sur des milieux de culture solides.Dans un premier temps, nous avons montré que cette technologie permet de réaliser une identification des germes isolés en milieu liquide, comme les flacons d’hémoculture au cours des bactériémies par exemple. Ce dépistage se fait directement à partir du flacon positif, sans attendre l’isolement des colonies sur milieu solide. Ce diagnostic disponible dès le premier jour permet d’adapter l’antibiothérapie au phénotype de résistance habituel de l’espèce.Dans un deuxième temps, nous avons cherché à identifier la nature des biomarqueurs utilisés pour l’identification des espèces bactériennes, en prenant comme exemple la bactérie pathogène Neisseria meningitidis. La comparaison du génome et du protéome des souches entièrement séquencées a permis de mettre en évidence la nature exacte des protéines impliquées dans le diagnostic d’espèce. Par ailleurs, les protéines ribosomales étant majoritaires et pouvant servir d’outil épidémiologique, nous avons constaté que la mise en évidence de leurs variations sur le spectre de masse rend la différenciation de souches au sein d’une même espèce possible, en adaptant la méthode d’analyse. Enfin, nous avons présenté des résultats préliminaires encourageants sur l’exploitation du caractère constant de certaines protéines ribosomales visibles directement sur le spectre de masse, permettant de différencier des espèces très proches, comme Streptococcus pneumoniae et Streptococcus mitis. / Until now, bacterial and fungal identification has been based on biochemical characterization of microorganisms. The Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Spectrometry (MALDI-TOF MS) has recently been developed in clinical microbiology laboratories. This new technology allows a rapid, accurate and less expensive identification of bacterial and fungal colonies grown on agar media. First, we have shown that the direct identification of bacteria grown in liquid media such as blood cultures was possible, without waiting for a subculture on solid media. Since the diagnosis is available on the first day, the presumptive antimicrobial treatment can be rapidly adapted according to the usual resistance phenotype of the microorganism. We have then searched to identify the biomarkers used for the identification of bacteria, using Neisseria meningitidis as a model. Comparing the genome and the proteome of sequenced strains allowed us to identify the ribosomal proteins as thoses involved in the MALDI-TOF MS diagnosis. Ribosomal proteins are very abundant and are very often used as epidemiological tools : their variations on the bacteria mass spectrum allows an intra-species differentiation of several strains. Finally we present encouraging preliminary results based on the detection of consistent ribosomal proteins directly visible on the mass spectrum that lead to the accurate identification of some very close species such as Streptococcus pneumoniae and Streptococcus mitis.

Deux approches ont été mises au point et utilisées afin de mieux comprendre les facteurs nutritionnels, physiopathologiques et génétiques intervenant dans la grande variabilité d'absorption du cholestérol chez l'homme (30-80%) :- le dosage de marqueurs plasmatiques d'absorption et de synthèse du cholestérol (METHODE INDIRECTE), qui s'applique aux grandes cohortes.- le dosage simultané de deux isotopes stables du cholestérol utilisés comme traceurs (METHODE DIRECTE), qui est la méthode de référence pour déterminer le taux d'absorption du cholestérol alimentaire.Nous avons déterminé, par la méthode indirecte, des interactions gène-régime-sexe, dans une population mixte présentant un risque cardiovasculaire modéré.On a montré qu'en modifiant les habitudes alimentaires, le statut d'absorption du cholestérol d'un sujet n'était pas modifié après 3 mois de régime méditerranéen, quel que soit le sexe. De plus la diminution du cholestérol circulant (LDL-C) induite par le régime de type méditerranéen était plus marquées chez les faibles absorbeurs de cholestérol. Le statut d'absorbeur est donc stable dans le temps et sous différents régimes, mais il module la réponse au régime, illustrant l'importance de ce statut dans la prise en charge nutritionnelle personnalisée des sujets. Nous avons aussi établi une interaction gène-régime sur le polymorphisme génétique du gène de la microsomal triglyceride transfer protein (-493G/T). Ce polymorphisme module le niveau d'absorption du cholestérol chez les femmes sous un régime occidental et cet effet est aboli sous un régime méditerranéen.La méthode indirecte présente cependant des limites. Aussi avons-nous mis au point une méthode de dosage directe originale, basée sur l'abondance relative des isotopomères du cholestérol, le but étant de mesurer simultanément les marqueurs directs et indirects et de comparer les deux méthodes en vue de l'application systématique de la méthode indirecte dans différentes études chez l'homme. / Two approaches were used to better understand nutritional, physio-pathological and genetic factors intervening in the great inter-individual variability of cholesterol absorption in humans (30-80%) : - INDIRECT METHOD consisting in the determination of both absorption and synthesis plasmatic markers of cholesterol, which is used in large scale studies; - a DIRECT METHOD by measuring simultaneaously two cholesterol stable isotopes, used as tracers. It is the "gold" method to determine the absorption percentage of dietary cholesterol. By using indirect method, we have shown gene-diet interactions according to sex in a population of men and women with moderate cardiovascular risks. Changing in dietary habits didn't alter cholesterol absorption statuts after 3 months of mediterranean type diet, whatever the sex. Moreover, the lowering of plasma LDL-cholesterol induced by mediterranean type diet was more marked in low-cholesterol absorbers. Thus, the cholesterol absorption status is stable over time and under differents regimes, but it modulates responsiveness to a dietary challenge. These findings illustrate the importance of cholesterol absorption status in personalized nutrition recommendations. Another finding is a gene-diet interaction in the -493G/T gene polymorphism of the microsomal triglyceride transfer protein. This polymorphism modulates the level of cholesterol absorption in women under a western diet, an effect abolished under a prudent mediterranean type diet. As indirect method shows limits, we established an original direct method, based on relative abundance of cholesterol isotopomers. Our goal is to measure simultaneously both direct and indirect plasmatic markers. Then, we could compare the two methods with the objective of applying systematically indirect method in different studies in humans.

De nouveaux composés anabolisants sont devenus accessibles via Internet : les modulateurs spécifiques des récepteurs androgènes (SARMs) actuellement développés pour le traitement des pertes musculaires. L’Ostarine® (MK-2866, GTX-024, enobosarm) en particulier, exerce ses effets sur les muscles squelettiques et ne présente pas d'activité androgénique. Sur la base de son mécanisme d’action et des résultats cliniques préliminaires, ce produit pourrait être utilisé comme promoteur de croissance en élevage bovin. Dans ce contexte, les objectifs de la thèse sont de valider des outils permettant de décrire les effets zootechniques pouvant être induits par l’administration orale d'enobosarm à des bovins et de développer des stratégies analytiques dédiées à la mise en évidence de son utilisation frauduleuse. En comparant animaux contrôles et animaux traités avec l'enobosarm, aucun effet morphologique n'a été mis en évidence en termes de croissance ou de conformation. Il a été ensuite démontré que l'enobosarm et ses principaux métabolites de phase II sont éliminés dans les urines et les fèces à des concentrations permettant leur détection par des techniques analytiques impliquant le couplage chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse. Enfin, une stratégie de type métabolomique conduite sur matrices urinaire et fécale a conduit à la description d’empreintes spécifiques et discriminantes pouvant signer l’administration d'enobosarm. Ce travail de recherche pluridisciplinaire contribue à générer des connaissances sur une nouvelle classe d'anabolisants, permettant par extension de contribuer à garantir au consommateur une sécurité chimique accrue des denrées d’origine animale. / New compounds with anabolic properties have recently become accessible via Internet-based suppliers: selective androgens receptor modulators (SARMs) currently developed for the treatment of chronic diseases with wasting muscle. Ostarine® (MK-2866, GTX-024, enobosarm), in particular, exerts its anabolic effects exclusively on the skeletal muscles and has no androgenic activity. Based on its mechanism of action and clinical preliminary results, this product could potentially be used as a growth promoter in cattle. In this context, the aims of this thesis are to validate tools allowing to describe the zootechnical effects that may be induced by an oral administration of enobosarm in calves and to develop analytical strategies dedicated to highlight its fraudulent use. Following a comparison between control animals and enobosarm treated animals, no morphological effect was visible and measurable in terms of growth and conformation. It was then demonstrated that enobosarm and its main phase II metabolites are eliminated in urine and feces at concentrations allowing their detection with analytical techniques using a liquid chromatography-mass spectrometry coupling. Finally, a metabolomics approach on urine and fecal matrices led to the description of specific and discriminant fingerprints signaling the administration of enobosarm. This multidisciplinary research work helps to generate knowledge on a new class of anabolic substance and therefore contributes to guarantee a more chemically-safe food of animal origin to the consumer.

Les lichens, organismes symbiotiques associant un champignon et un partenaire photosynthétique (algue verte et/ou cyanobactérie), sont caractérisés par la biosynthèse de métabolites secondaires uniques dotés de bioactivités variées. Pour valoriser au mieux cette ressource privilégiée, des méthodes innovantes de spectrométrie de masse ont été développées dans le but de minimiser la préparation de l’échantillon et la durée des analyses. Deux techniques de spectrométrie de masse ont été évaluées en ce sens : le DART-MS et le LDI-MS. L’apport de chacune de ces deux méthodes a pu être établi sur un large panel de lichens, représentant une part importante de l’espace chimique couvert par ces organismes. Il a été démontré que des profils chimiques complets pouvaient être obtenus respectivement à partir de thalles lichéniques et d’extraits acétoniques totaux. Compte tenu de la très large utilisation de la CCM pour l’analyse chimique de lichens, les possibilités offertes par le couplage de la CCM à l’ionisation electrospray ont également été explorées. Une seconde partie de ces travaux avait pour but de cartographier la distribution des métabolites secondaires au sein du thalle lichénique. À ces fins, des analyses d’imagerie LDI ont été réalisées sur une coupe transversale d’un lichen crustacé modèle : Ophioparma ventosa. Ce lichen a été étudié en phytochimie pour identifier six napthopyranones à partir des apothécies dont quatre nouvelles structures. Les principaux métabolites de ce lichen ont pu être imagés par LDI-MSI avec une résolution spatiale de 50 μm environ. Une corrélation entre la distribution des molécules et leur rôle écologique présumé permet d’avancer des hypothèses d’écologie chimique. Des approches conjointes reliant histolocalisation et étude génétique des partenaires de la symbiose ont été entreprises. La recherche des gènes de la biosynthèse de la mycosporine sérinol chez les symbiontes isolés de Lichina pygmaea par microdissection capture laser a été initiée en ce sens. D’autres approches innovantes comme l’analyse cristallographique par diffraction de poudre par les rayons X sont également abordées dans ce document articulé autour de six publications issues de ce travail et de deux articles en cours de soumission. / Lichens are self-sustaining symbiotic partnerships comprising a fungus associated with a green alga and/or a cyanobacteria. This consortium produces unique secondary metabolites that are endowed with various biological activities. To harness this privileged chemodiversity, innovative mass spectrometry techniques were developed in the course of this study to accelerate the dereplicative holdup through both a minimal sample preparation and a decrease of the time of analysis. Two approaches were considered during this work: DART-MS and LDI-MS and their adequacy for lichen dereplication was assessed on a vast array of samples encompassing a wide range of metabolites. Both of them facilitated complete chemical profiles, respectively from unprocessed lichen material and crude acetone extracts. Since TLC still enjoys a wide-spread popularity among lichenologists, the advantages offered by TLC-ESI-MS hyphenation were evaluated as well. A second part of this manuscript focused on the histolocalization of lichen metabolites. For this purpose, LDI mass spectrometry imaging studies were undertaken on the crustose lichen Ophioparma ventosa. The phytochemical investigation of this species afforded the isolation of six naphthopyranones from its apothecia, four of them being new molecules. LDI-MSI revealed the distribution patterns of all the main metabolites of this lichen, reaching a spatial resolution of 50 μm. Most interestingly, the distribution pattern of imaged metabolites within the thallus is highly organized and is related to their ecological relevance. Joint strategies combining histolocalization and genetic investigation of lichen symbionts separated using laser capture microdissection were also considered. As such, an investigation of the biosynthesis of mycosporine serinol within Lichina pygmaea dissociated symbionts was initiated. Further analytical strategies such as X-ray powder diffraction are introduced in this thesis that contains six publications and two drafts to be submitted.

La chromatographie en phase liquide bidimensionnelle « comprehensive » en ligne (LCxLC) est une technique à très haut pouvoir de séparation. Après avoir établi son intérêt mais aussi les enjeux liés au développement de méthodes et les conditions expérimentales utilisées, une attention particulière est portée à l'optimisation des méthodes en LCxLC. Une procédure d'optimisation basée une méthode « Pareto-optimal » est décrite. Les conditions optimales prédites sont ensuite appliquées à la séparation RPLCxRPLC d'un mélange complexe de peptides et comparée avec la 1D-RPLC en termes de capacité de pics, temps d'analyse et facteur de dilution démontrant l'avantage fournit par la RPLCxRPLC. L'optimisation d'une méthode HICxRPLC-UV/MS en ligne permettant la caractérisation exhaustive d'un anticorps conjugué est réalisée soulignant, entre autres, la grande complémentarité entre les différents modes de détection employés en 1D et 2D.Enfin, la possibilité de développer un couplage RPLCxSFC est explorée dans le but d'augmenter l'espace de séparation pour des composés neutres. La méthode RPLCxSFC optimisée est comparée avec une séparation RPLCxRPLC optimisée pour l'analyse d'une bio-huile montrant qu'elle peut-être considérée comme une alternative crédible pour la séparation de tels échantillons / Comprehensive two-dimensional liquid chromatography is a powerful but complex separative technique. After detailing the interest of such a technique, the method development issues and the experimental conditions employed throughout this work, a particular attention is paid to the optimization of LCxLC methods. Accordingly an optimization procedure based on Pareto-optimal method is described. The predicted optimal conditions are then applied to experimental RPLCxRPLC separations of complex samples of peptides and compared with 1D-RPLC in terms of peak capacity, analysis time and sensitivity clearly showing the advantage of RPLCxRPLC approach.The optimization of a HICxRPLC-UV/MS method for the exhaustive characterization of an antibody-drug conjugate is achieved highlighting the high complementarity of the different detection modes used both in 1D and 2D. Finally, a proof of concept concerning the implementation of RPLCxSFC coupling is achieved with the aim of increasing the separation space coverage for neutral compounds. The optimized RPLCxSFC separation is then compared with an optimized RPLCxRPLC approach for the analysis of a bio-oil sample showing that RPLCxSFC is a credible alternative for the separation of such a sample

La spectrométrie de masse fait partie des technologies haut débit et offre à ce titre un regard inédit, à une échelle nouvelle, sur les protéines contenues dans divers échantillons biologiques. Les études biomédicales utilisant cette technologie sont de plus en plus nombreuses et visent à détecter de nouveaux biomarqueurs de différents processus biologiques, notamment de processus pathologiques à l'origine de cancers. Cette utilisation comme outil de criblage pose des questions quant à la capacité même des expériences de spectrométrie de masse dans cette détection. La puissance statistique traduit cette capacité et rappelle que les études doivent être calibrées pour offrir des garanties suffisantes de succès. Toutefois, cette exploration de la puissance statistique en spectrométrie de masse n'a pas encore été réalisée. L'objet de cette thèse est précisément l'étude des déterminants de la puissance pour la détection de biomarqueurs en spectrométrie de masse. Une revue de la littérature a été réalisée, reprenant l'ensemble des étapes nécessaires du traitement du signal, afin de bien comprendre les techniques utilisées. Les méthodes statistiques disponibles pour l'analyse du signal ainsi traité sont revues et mises en perspective. Les situations de tests multiples, qui émergent notamment de ces données de spectrométrie de masse, suggèrent une redéfinition de la puissance, détaillée par la suite. La puissance statistique dépend du plan d'expérience. La taille d'échantillon, la répartition entre groupes étudiés et l'effet différentiel ont été investigués, par l'intermédiaire de simulations d'expériences de spectrométrie de masse. On retrouve ainsi les résultats classiques de la puissance, faisant notamment ressortir le besoin crucial d'augmenter la tailles des études pour détecter des biomarqueurs, particulièrement lorsque ceux-ci présentent un faible effet différentiel. Au delà de ces déterminants classiques de la puissance, des déterminants propres à la spectrométrie de masse apparaissent. Une chute importante de puissance est mise en évidence, due à l'erreur de mesure des technologies de spectrométrie de masse. Une synergie péjorative existe de plus entre erreur de mesure et procédure de contrôle du risque de première espèce de type FDR. D'autre part, les méthodes de détection des pics, par leurs imperfections (faux pics et pics manqués), induisent un contrôle suboptimal de ce risque de première espèce, conduisant à une autre chute de puissance. Ce travail de thèse met ainsi en évidence trois niveaux d'intervention possibles pour améliorer la puissance des études : la meilleure calibration des plans d'expérience, la minimisation de l'erreur de mesure et l'amélioration des algorithmes de prétraitement. La technologie même de spectrométrie de masse ne pourra conduire de façon fiable à la détection de nouveaux biomarqueurs qu'au prix d'un travail à ces trois niveaux. / Mass-spectrometry (MS) belongs to the high-throughput technologies and therefore offers an originalperspective on proteins contained in various biological samples, at a new scale. Biomedicalstudies using this technology are increasingly frequent. They aim at detecting new biomarkersof different biological processes, especially pathological processes leading to cancer. This use asa screening tool asks questions regarding the very detection effectiveness of MS experiments.Statistical power is the direct translation of this effectiveness and reminds us that calibratedstudies are required to offer sufficient guarantees of success. However, this exploration of statisticalpower in mass-spectrometry has not been performed yet. The theme of this work is preciselythe study of power determinants for the detection of biomarkers in MS studies.A literature review was performed, summarizing all necessary pretreatment steps of thesignal analysis, in order to understand the utilized techniques. Available statistical methods forthe analysis of this pretreated signal are also reviewed and put into perspective. Multiple testingsettings arising from MS data suggest a power redefinition. This power redefinition is detailed.Statistical power depends on the study design. Sample sizes, group repartition and the differentialeffect were investigated through MS experiment simulations. Classical results of statisticalpower are acknowledged, with an emphasis on the crucial need to increase sample sizes forbiomarker detection, especially when these markers show low differential effects.Beyond these classical power determinants, mass-spectrometry specific determinants appear.An important power drop is experienced when taking into account the high measurement variabilityencountered in mass-spectrometry. A detrimental synergy exists between measurementvariability and type 1 error control procedures (e.g. FDR). Furtheremore, the imperfections ofpeak detection methods (false and missed peaks) induce a sub-optimal control of this type 1error, leading to another power drop.This work shows three possible intervention levels if we want to improve power in MS studies: a better study design, measurement variability minimisation and pretreatment algorithmsimprovements. Only a work at these three levels can guarantee reliable biomarker detections inthese studies.

Une méthode permettant de caractériser l’ensemble du métabolome secondaire de moisissures a été appliquée à la caractérisation des métabolomes de Penicillium nordicum, Penicillium verrucosum et Fusarium graminearum. Le substrat représentant l’unique source de carbone et d’azote des moisissures, chacun des champignons ont été mis en culture sur trois types de grains de blé: (i) grains naturels, (ii) grains marqués à 97% de 13C, et (iii) grains marqués à 53% 13C et 97% de 15N. Les extraits ont été analysés par HRMS. Les métabolites secondaires ont été spécifiquement détectés et leurs formules brutes ont été caractérisées. La caractérisation de nouveaux métabolites secondaires a ensuite été assistées par la génération de réseaux moléculaires de similarités MS/MS. L’étude de P. verrucosum et P. nordicum a permis de détecter 98 et 92 métabolites secondaires respectivement. Parmi eux, 80% étaient inconnus. La génération de réseaux moléculaires a permis de mettre en évidence un groupe de 25 composés se fragmentant de manière similaire. Seize de ces composés ont été identifiés comme étant des dérivés de fungisporines, des métabolites suspectés d’intervenir dans la croissance aérienne des champignons. Des analyses structurales ont permis de caractériser de nouveaux composés potentiellement impliqués dans l’infestation des denrées alimentaires. Le marquage du métabolome de F. graminearum par des isotopes stables a permis de mettre en évidence la production de 37 métabolites secondaires dont 29 inconnus lorsque le champignon se développe in vitro. Des analyses par MSn ont permis d’élucider les structures des fusaristatines C et D. / Characterization of fungal secondary metabolomes became a great challenge in the last decades due to both the emergence of fungal threats, and the industrial interest of many natural products; In view of this, we recently developed an analytical strategy for fungal secondary metabolome characterization (Cano P. et al. Anal. Chem. (2013) 85:8412) based on untargeted MS metabolomics applied to labeled samples. This strategy has been here validated by application to the analysis of the complex secondary metabolomes of Penicillium verrucosum and Penicillium nordicum. HRMS acquisitions performed on specific isotopically labelled samples, MS/MS experiments and in-silico emerging tools such as molecular networks, allowed to characterize 181 metabolites, including 80% of new compounds, and the structural determination of seven potential new mycotoxins. Penicillium verrucosum (NRRL 5571) and Penicillium nordicum (NRRL 6062) were grown on wheat grains (Triticum aestivum) presenting different isotopic enrichments: (i) naturally enriched grains, (ii) 97% 13C, and (iii) 53% 13C / 97% 15N. Extracts of each culture were analyzed by HPLC coupled to a LTQ-Orbitrap mass spectrometer equipped with electrospray ionization, operating in the positive or the negative mode. Metabolites were then specifically detected according to the specific isotopic pattern of their respective isotopic enrichments. Known secondary metabolites were annotated using the Antibase database, then identified by comparison with standard compounds when available. Unknown secondary metabolites were annotated using molecular networks of MS/MS similarities (Watrous J. et al.; PNAS (2012) 109 E1743). Wheat grains representing the only source of carbon and nitrogen for fungal growth, the produced fungal secondary metabolites were either unlabeled (naturally enriched cultures), singly labeled (13C cultures) or doubly labeled (13C/15N cultures). This feature allowed discrimination of fungal metabolites against non-fungal compounds which remained unlabeled in the three substrates. Fungal origin was further confirmed by analysis of a control 12C wheat extract (without fungus). Furthermore, the comparison of m/z ratios of a same metabolite detected in the three different cultures, led to the unambiguous determination of the number of carbon and nitrogen atoms and therefore to the unambiguous characterization of its chemical formula. This approach previously developed and validated on a well characterized fungus, has been here successfully applied to the characterization of the complex and unknown secondary metabolomes of P. verrucosum and P. nordicum. Analyses of the two studied fungal strains allowed the detection of 181 secondary metabolites. Interestingly, only 20% of them are suspected to match known metabolites according to databases, meaning that 80% of this metabolome is unknown. To enhance unknown identification efficiency, a molecular network of MS/MS similarities has been generated from our data. A group of 24 metabolites with highly similar MS/MS spectra was highlighted on P. nordicum and P. verrucosum. Fifteen of them were identified as cyclic tetrapeptides from the fungisporin family. Tandem mass spectrometry experiments were performed to characterize the structure of these secondary metabolites. To the best of our knowledge, this is the first time these molecules are pointed out on these Penicillium species. More interestingly, seven of the other metabolites display some similarities with fungisporins, but have never been detected on fungal metabolomes. Furthermore, although the two studied strains are genetically close, these new metabolites seem to be strain specific.

La nutrition azotée des bactéries et des plantes est actuellement un sujet de grande importance, notamment pour comprendre comment améliorer les voies métaboliques aboutissant à l’assimilation de l’azote et à plus grande échelle, optimiser des apports d’engrais et augmenter le rendement des cultures. Dans ce contexte, la réaction d’amidation catalysée par la glutamine synthétase (GS), qui fixe l’ammonium (NH₄)⁺ en glutamine, est cruciale car elle est à la fois le point d’entrée de l’azote dans les végétaux, et une étape-clef du recyclage de l’azote (en particulier, NH₄⁺ photorespiratoire). Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à la cinétique enzymatique et au mécanisme chimique de la GS. Des systèmes analytiques (HPLC, RMN , GC-MS) ont  été optimisés pour permettre la mesure de l’activité enzymatique in vitro et pour réaliser des analyses par spectrométrie de masse à ratio isotopique. Avec ces techniques, nous avons pu regarder précisément les effets isotopiques ¹²C/¹³C, ¹⁴N/¹⁵N et H₂O/D₂O (solvant) lors de la catalyse, en utilisant la GS d’E. coli et d’Arabidopsis thaliana (GS1,2). Nos résultats montrent qu’il n’y a pas d’effet isotopique ¹²C/¹³C, mais qu’il y a un fractionnement ¹⁴N/¹⁵N de »16‰. En outre, il y a un effet inverse du solvant (réaction 1.5 à 2 fois plus rapide dans D₂O).  Cela suggère que la création de la liaison C----N (amidation) est partiellement limitante (engagement catalytique de »14% seulement) et que le réseau de ponts hydrogènes dans le site actif est crucial pour déterminer la vitesse de la réaction. L’apparition d’effets ¹⁴N/¹⁵N inverses dans certaines circonstances et les effets drastiques causés par une substitution du cofacteur métallique (Mg²⁺) suggèrent en outre que l’étape d’amidation peut être réversible et que la coordination par un métal joue un rôle très important pour stabiliser les intermédiaires de la réaction, en interaction avec le solvant. Ainsi, dans son solvant naturel qu’est H₂O, la GS réalise une réaction ‘chimiquement difficile’ (barrière énergétique élevée de l’amidation) rendue possible par le clivage de l’ATP et son caractère exergonique. / Nitrogen nutrition in bacteria and plants is currently an important topic, in particular to identify key points for metabolic improvements in N assimilation and more generally, to optimize fertilization and crop yield. In such a context, the amidation reaction catalyzed by glutamine synthetase (GS), which fixes ammonium (NH₄)⁺ into glutamine, is of crucial importance since it both represents the N entry in plants and the main step of N recycling (such as photorespiratory (NH₄)⁺. Here, we examined GS kinetics and chemical mechanism. Analytical methods (HPLC, NMR, GC-MS) have been set up so as to measure in vitro activities and isotopic abundance by isotope ratio mass spectrometry. These gave access to isotope effects (¹²C/¹³C, ¹⁴N/¹⁵N et H₂O/D₂O – solvent) during catalysis, with the GS from either E. coli or A. thaliana (GS1,2). Our results show that there no ¹²C/¹³C isotope effect but there is significant ¹⁴N/¹⁵N isotope fractionation of ca. 16‰. In addition, there is an inverse solvent isotope effect (reaction 1.5 to 2 times faster in D₂O). This suggests that forming the C----N bond (amidation) is partially rate-limiting (catalytic commitment of ca. 14% only) and the H-bond network in the active site is of substantial importance for the reaction rate. The occurrence of inverse ¹⁴N/¹⁵N isotope effects under certain circumstances as well as the drastic impact of changing the metal cofactor (Mg²⁺)) indicate that the amidation step can be reversible and that the coordination by the metal plays a key role in stabilizing reaction intermediates, by interfacing the solvent. In other words, in its natural solvent H₂O, the GS catalyses an intrinsically ‘difficult’ reaction (high energy barrier of amidation) made possible by both ATP cleavage and its exergonic nature.

Les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD) sont un groupe hétérogène de dystrophies musculaires à progression lente. Des mutations du gène de la dysferline causent la LGMD de type 2B, mutations dans le gène de la cavéoline-3 (cav-3) causent LGMD de type 1C et des mutations dans le gène anoctamine-5 (ano-5) sont liées aux LGMD. Dans le but d'analyser les mécanismes moléculaires des LGMD et d'étudier les potentielles interactions de la dysferline, de la cav-3 et de l'ano5, des expériences sur des cellules musculaires primaires portant des mutations associées aux gènes DYSF, CAV3 et ANO5 ont été analysées. Les études d'immunomarquage ont montré que la protéine dysferline et la cav-3 sont partiellement colocalisées dans des structures vésiculaires de la membrane plasmique des myotubes primaires humains. La purification biochimique des "detergent-resistant membranes" issus des myotubes différenciés a montré que la dysferline est associée aux " lipid raft " liées aux cytosquelettes d'actine. L'analyse de la microscopie électronique sur les myotubes issus des muscles des patients atteints de LGMD a montré des altérations dans l'abondance des cavéoles à la membrane plasmique qui est en corrélation avec les mutations causant la maladie. L'analyse de l'ultrastructure cellulaire a montré que la dysferline est localisée à la membrane plasmique mais également dans des vésicules cytosoliques. L'immunopurification de ces vésicules contenant de la dysferline a révélé la présence d'environ 500 protéines détectées par LC-MS, ce qui pourrait représenter des protéines structurales vésiculaires, ainsi que des nouveaux partenaires potentiels d'interaction de la dysferline. / Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) are a heterogeneous group of slowly progressive muscular dystrophies with common features such as hyperCKemia and skeletal muscle weakness. Mutations in the dysferlin gene cause LGMD 2B, in the caveolin-3 (cav-3) gene LGMD 1C and in the anoctamin-5 (ano-5) gene LGMD 2L, respectively. In order to reveal the molecular mechanisms underlying LGMD and to investigate the putative interactions of dysferlin, cav-3, and ano5, primary skeletal muscle cell lines with disease-related mutations in DYSF, CAV3, and ANO5 have been analyzed. Immunolabeling studies revealed that dysferlin and cav-3 are partially colocalized in vesicular structures at the plasma membrane. Biochemical purification of detergent-resistant membranes from differentiated myotubes showed that dysferlin is associated with lipid rafts linked to the actin-cytoskeleton. Transmission electron microscopy analysis of myotubes revealed alterations of caveolae abundance at the plasma membrane correlating with disease-causing mutations. Ultrastructural studies revealed localization of dysferlin at the plasma membrane, but also in cytosolic vesicles. These vesicles contained a subset of approximately 500 proteins detected by LC-MS, which might represent vesicular structural proteins, vesicle cargo, and putative new dysferlin interaction partners. Results from this study lead to the conclusion that caveolae play a crucial role in the context of LGMD. Dysferlin and cav-3 seem to be closely linked on structural as well as on functional level. Our results confirm that dysferlin is localized in cytosolic vesicles, which are involved in multiple cellular processes.