La spermatogenèse est le processus par lequel les cellules germinales se différencient pour former les spermatozoides. Elle se déroule à l’intérieur des tubes séminifères. Pendant la période embryonnaire, les précurseurs des cellules germinales adultes constituent un pool de cellules appelées cellules germinales primordiales (Primordial Germ Cells, PGCs), qui vont migrer pour aller coloniser les gonades (Durcova-Hills and Capel, 2008; Surani et al., 2008). Au cours de leur migration, les PGCs vont subir une reprogrammation épigénétique de l’ensemble de leur génome, qui leur sera nécessaire pour passer de l’état somatique à l’état de totipotence (Ohinata et al., 2005). Durant cette reprogrammation, l’ADN est massivement démethylé, entrainant l’activation de plusieurs gènes qui sont importants pour le développement des PGCs, mais également l’activation des éléments transposables (ETs) (Hajkova et al., 2008; Sasaki and Matsui, 2008; Surani and Hajkova, 2010). Ces derniers constituent environ 50% du génome des mammifères. Ils sont subdivisés en deux classes et sont connus par leur capacité à être mobilisés dans le génome (Zamudio and Bourc'his, 2010). Cette mobilisation se fait au hasard et constitue ainsi un risque considérable de mutations, qui peuvent provoquer des tumeurs, des pathologies de développement et une infertilité (Zamudio and Bourc'his, 2010). Pour cela, leur expression doit être contrôlée pour maintenir l’intégrité du génome de la lignée germinale. Pour toutes ces raisons, les PGCs ainsi que les cellules germinales en cours de méiose ont développé des stratégies de défenses pour contrôler la mobilisation et l’expression des ETs basées entre autre sur la voie des piwi-interacting RNA (piRNA) (Chuma and Pillai, 2009; Pillai and Chuma, 2012b). Dans le laboratoire du Pr. Stéphane Viville, mes travaux de thèse se sont concentrés sur l’étude d’un gène nommé Tex19 pour Testis Expressed gene chez la souris. Nous avons démontré que ce gène est spécifique des mammifères et est dupliqué chez le rat et la souris en deux paralogues nommés Tex19.1 et Tex19.2. Deux domaines hautement conservés ont été identifiés par alignement multiple des protéines TEX19 et nommés MCP et VPTEL. Ces domaines ne présentent aucune homologie avec des domaines déjà caractérisés, prévenant ainsi toute prédiction de leurs fonctions (Kuntz et al., 2008). L’étude du profil d’expression de Tex19.1 et Tex19.2 a montré que ces deux gènes sont exprimés dans l’ectoderme et les PGCs. Ils sont aussi co-exprimés dans le testicule de l’âge embryonnaire à l’âge adulte. Néanmoins, seul Tex19.1 est exprimé dans les ovaires et le précurseur du placenta appelé cône ectoplacentaire (Celebi et al., 2012). Le knockout (KO) de Tex19.1 provoque une infertilité masculine chez la souris avec un arrêt de la spermatogenèse au stade pachytène, accompagnée d’une surexpression d’un rétrotransposon, MMERVK10C (Ollinger et al., 2008). Récemment, il a été démontré que Tex19.1 joue aussi un rôle dans le développement du placenta (Reichmann et al., 2013). Au cours de mes trois années de thèse, nous avons approfondie l’étude du KO de Tex19.1dans le testicule, les cellules embryonnaires souches (Embryonic Stem Cells, ESCs) et le placenta (Tarabay et al., 2013). Nous avons également étudié le phénotype observé suite au double KO de Tex19.1 et Tex19.2. [...] / We recently characterized two new mammalian specific genes, Tex19.1 and its paralog Tex19.2. Both genes are expressed in pachytene spermatocytes in adult testes. In addition, Tex19.1 is expressed in pluripotent cells (ES, EG, iPS and PGC cells), the inner cell mass of the blastocysts and the placenta. In order to decipher Tex19 functions, we generate three types of knockout (KO): i) KO of Tex19.1 ii) KO of Tex19.2 iii) double KO (DKO) of both genes. All Tex19.1-/- KO animals are growth-retarded and half of them die just after birth. This phenotype is probably linked to placenta defects. Surviving adults Tex19.1-/- KO males display a variable spermatogenesis phenotype, associated with an up-regulation of one endogenous retrovirus, MMERVK10C. Tex19.2 KO mice exhibit a subtle phenotype. Few seminiferous epitheliums are degenerated while the rest appear normal. DKO show a fully penetrant phenotype similar to the most severe Tex19.1-/- phenotype. DKO males exhibit small testes. Despite the presence of spermatogonia and spermatocytes, spermatogenesis is blocked at the pachytene stage. By RNA deep-sequencing on 10 days old DKO and WT testes, prior to histological phenotype, 114 genes are significantly up-regulated and 320 genes significantly down-regulated in the DKO compared to the WT. Gene ontology analyses show that among of these genes, two essential pathways are altered: meiosis and the piRNA pathway. Consistent with that, GST-pulldown and immunoprecipitation experiments demonstrate that MIWI, MILI, MAEL and MVH are partners of TEX19. Considering PIWI proteins function in the silencing of transposable elements through the piRNA pathway, we checked if TEX19 paralogs bind piRNA. By immunoprecipitation using WT and KO testes, we show that both TEX19.1 and TEX19.2 bind small RNA of 30 nucleotides through their VPTEL domain. This study highlights the pivot role of Tex19 paralogs in three essential functions of mammalian life cycle, i.e. pluripotency, placenta-supported in utero growth and fertility. The functional similarities of both paralogs, through the expression control of one endogenous retrovirus and the binding of piRNAs, lead us to propose that Tex19 paralogs are new members of the piRNA pathway.

Les capacités d’auto-renouvellement ou de différenciation progressive en gamètes des cellules souches spermatogoniales (SSC) sont indispensables à la production de spermatozoïdes tout au long de la vie des individus de sexe mâle. Les travaux réalisés au cours de la thèse ont eu pour objectif de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires potentiellement impliqués dans le contrôle du devenir des SSC chez les poissons téléostéens. Grâce à une nouvelle lignée de poisson-zèbre transgénique exprimant la GFP sous le contrôle d’un nouveau fragment promoteur du gène vasa, nous avons caractérisé une sous-population de spermatogonies indifférenciées composés de doublets asymétriques. L’ensemble de nos observations suggère que ces doublets asymétriques constituent un pool de cellules souches recrutées pouvant soit poursuivre leur différenciation spermatique soit participer à la dynamique de renouvèlement du stock de SSC.Une approche de séquençage à haut débit des transcrits exprimés au sein des spermatogonies indifférenciées fluorescentes et des cellules de Sertoli met en évidence la diversité des voies de régulation paracrine potentiellement impliquées dans le contrôle du devenir des SSC (molécules d’adhésion cellulaire, cytokines, facteurs de croissance…). Les analyses phylogénétiques montrent que certaines de ces voies de régulation sont conservées chez les Gnathostomes alors que d’autres ont été perdues chez les tétrapodes ou les mammifères seulement. Une approche comparée initiée chez la truite arc-en-ciel confirme l’intérêt générique des données acquises chez / By their ability to self-renew or differentiate into gametes, the spermatogonial stem cells (SSCs) are essential for sperm production throughout the life of male. The work done during the thesis had for objective the understanding of the cellular and molecular mechanisms potentially involved in the fate of the SSC in the teleost fish. With a new line of transgenic zebrafish expressing GFP under the control of a new gene promoter fragment vasa, we characterized a subpopulation of undifferentiated spermatogonia composed of asymmetric doublet. The observation of the GFP protein indicates that these doublets can fragment to generate isolated spermatogonia. Transplantation of fluorescent spermatogonial cells into the abdominal cavity of a recipient embryo shows that these cells have all functional properties of SSC. All our observations suggest that asymmetric doublet constitute a pool of stem cells with bivalent fate:they can continue their sperm differentiation or participate in the dynamic renewal of SSC pool. A rnaseq based transcritpome analysis of transcripts expressed in undifferentiated spermatogonia fluorescent and Sertoli cells highlights the diversity of paracrine regulatory pathways potentially involved in the control of the SSC (cell adhesion molecules, cytokines, growth factors, primary metabolites). Phylogenetic analyzes show that some of these regulatory pathways are well conserved among all Gnathostomes while others were lost in tetrapods or mammals only. A comparative approach initiated in rainbow trout generic confirms the interest of the data acquired in th

La protéine de liaison aux ARN MEX-3 est un régulateur essentiel du développement embryonnaire chez le nématode Caenorhabditis elegans. Une famille de quatre gènes homologues à hMex-3 (dénommés hMex-3A, 3B, 3C et 3D) a été identifiée chez les mammifères par notre équipe. Afin de mieux comprendre la fonction physiologique in vivo des protéines Mex-3, nous avons invalidé le gène Mex-3B chez la souris. Cette approche expérimentale a révélé que Mex-3B est un acteur majeur de la spermatogenèse. Les souris mâles nullizygotes présentent une obstruction des tubes séminifères conduisant à une réduction importante du nombre des spermatozoïdes produits. L’ablation de Mex-3B ciblée à la cellule de Sertoli, cellule somatique essentielle à la fonction de l’épithélium séminifère, a permis d’établir que le phénotype testiculaire a pour origine une perturbation des propriétés biologiques de cette cellule. En effet, les cellules de Sertoli déficientes pour Mex-3B présentent des défauts de la phagocytose qui conduisent à une élimination défectueuse des corps résiduels au cours de la spemiogenèse. L’exploration des mécanismes moléculaires impliqués a montré que Mex-3B contrôle la phagocytose via la régulation de l’activité et de la localisation membranaire de Rap1GAP, une protéine qui régule négativement la petite protéine G Rap1. En accord avec ces données, l’absence de Mex-3B provoque une déstabilisation de la barrière hémato-testiculaire due à un défaut de localisation à la membrane plasmique des molécules de jonction connexine 43 et N-Cadhérine, protéines dont la translocation et la stabilité dépendent de Rap1. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un rôle clé de Mex-3B dans le contrôle spatial de la voie de signalisation Rap1 au cours de la spermatogenèse / The RNA binding-protein MEX-3 is a post-transcriptional regulator involved in early embryogenesis of the nematode Caenorhabditis elegans. We have recently reported the characterization of a novel family of four mammalian genes homologous to hMex-3 (called hMex-3A, 3B, 3C and 3D). To gain insight into the biological functions of these proteins in vivo, we disrupted the Mex-3B gene in mice. Using this experimental approach, we found that Mex-3B is as a major regulator of spermatogenesis. We observed that male Mex-3B null mice hypofertile and present an obstruction of seminiferous epithelium. Phagocytic properties of Sertoli cells were impaired, thus impeding the clearance of residual bodies released during spermiogenesis. Exploration of the underlying molecular mechanisms revealed that Mex-3B regulates phagocytosis through the activation and the transport at the peripheral membrane of Rap1GAP, a protein that downregulates the small G protein Rap1. Consistently, the Rap1-dependent recruitment of the junction proteins, connexin 43 and N-Cadherin at the cell surface was compromised in Mex-3B deficient mice. In conclusion, my work highlights a key role gor Mex-3B in the spatial control of Rap1 signaling during spermatogenesis

Les homéoprotéines sont des régulateurs transcriptionnels impliqués dans le développement, l'embryogenèse et la différenciation cellulaire chez plusieurs espèces. Les homéoprotéines sont les produits des homéogènes et elles sont exprimées dans une pléiade de tissus au cours du développement. Dans le but d'approfondir nos connaissances sur les contrôles transcriptionnels qui régissent le développement et la différenciation des organes reproducteurs, je me suis intéressée à l'expression des homéoprotéines dans les cellules de Leydig dû à l'importance de ces facteurs dans les processus développementaux. Nous avons nouvellement identifiés dans les cellules de Leydig, le gène Lbx2 et l'homéoprotéine PBX1. Il n'existe actuellement pas de données sur l'expression de ces gènes au cours de la différenciation du système reproducteur et ce faisant des cellules de Leydig. Cette thèse présente donc l'expression de Lbx2 et PBX1 au cours de la différenciation du système reproducteur dans le testicule, l'épididyme, l'ovaire et les cellules de Leydig. J'ai précisé le profil d'expression du gène Lbx2 au cours du développement testiculaire, épididymaire et ovarien. J'ai déterminé que les transcrits de Lbx2 sont présents durant le développement du testicule, de l'épididyme et de l'ovaire. De plus, mes analyses révèlent également que Lbx2 est un gène dont l'expression est sexuellement dimorphique dans les gonades embryonnaires. L'élaboration du profil d'expression de la protéine PBX1 révèle qu'elle est présente au cours du développement testiculaire et durant la vie adulte. Dans les cellules de Leydig, mes résultats démontrent que PBX1 est principalement exprimée à la puberté. L'expression de PBX1 est plus forte dans les cellules de Sertoli chez l'adulte et dans les cellules myoïdes péritubulaires au cours du développement embryonnaire et postnatal. Les travaux présents dans cette thèse auront également permis d'identifier d'autres nouvelles homéoprotéines, PRRX2, GBX1, MEIS1, PREP1 exprimées dans les organes reproducteurs. Ainsi, la caractérisation du profil d'expression des homéoprotéines au cours du développement du système reproducteur aura permis d'identifier de potentiels régulateurs transcriptionnels du développement et de la différenciation du système reproducteur.

Les modifications post-transcriptionnelles qui régulent la structure et la fonction de la chromatine sont reconnues par de multiples modules protéiques, dont les bromodomaines. Alors que la reconnaissance de modifications individuelles des histones par ces modules est bien caractérisée, la reconnaissance d'histones portant plusieurs modifications est mal connue. Nous avons étudié comment Brdt s'associe à la chromatine acétylée par l'intermédiaire de ses deux bromodomaines (BD1 et BD2) pour induire sa compaction au cours des dernières étapes de la spermatogenèse. Nous avons également étudié l'effet de la mutation K61Q du premier bromodomaine de Brdt, impliquée dans certains cas d'infertilité masculine. BD1, bien que présentant une structure de bromodomaine classique, se montre sélectif pour des formes di-acétylées de la queue N terminale de l'histone H4 avec une préférence pour le peptide H4-K5/K8ac et ne montre pas d'affinité pour les peptides mono-acétylés H4-K5ac, H4-K8ac et H4-K12ac. Au contraire, BD2 présente un spécificité pour l'histone H3 mono-acétylée sur K18. La structure cristallographique du complexe Brdt-BD1/H4‑K5/K8ac révèle que les deux lysines acétylées se placent ensemble dans la cavité hydrophobe du bromodomaine. Ces observations mettent en évidence un nouveau mode de lecture du code histone par lequel un bromodomaine reconnaît spécifiquement le motif formé par l'acétylation de deux lysines adjacentes.

Les cils et les flagelles sont des organites conservés chez les eucaryotes où ils jouent des rôles essentiels et variés comme la motilité et la signalisation cellulaire. La zone de transition est une structure complexe, localisée à la base des cils, indispensable à l'assemblage du cil et pour la sélection des constituants ciliaires. Chez l'Homme, de nombreuses pathologies appelées ciliopathies sont associées à des défauts d'assemblage ou de fonctionnement des cils. Les plus sévères sont liées à des défauts de protéines de la zone de transition. La zone de transition comprend les fibres de transition qui font le lien entre le centriole et la membrane plasmique, puis les liens Y avec une composition protéique complexe organisé en 3 complexes, MKS, NPHP et CEP290 interagissant étroitement entre eux. D'autres protéines, dont CBY conservée des mammifères à la drosophile, s'ajoutent à ces modules mais leur interconnections ne sont pas connues.Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé fonctionnellement les orthologues des protéines des fibres de transition et analysé la fonction de nouvelles protéines de la zone de transition en utilisant le modèle de la drosophile. J'ai également caractérisé une protéine impliquée dans la spermatogenèse qui est essentielle pour l'individualisation des spermatides et la fertilité des males.En conclusion, ce travail apporte de nouvelles connaissances sur l'assemblage de la zone de transition et sur le rôle de CBY dans les mécanismes qui contrôlent la ciliogenèse. De plus l'étude de Salto amène à une meilleure compréhension de la spermatogenèse chez la drosophile / Cilia and flagella are highly conserved organelles among eukaryotes species. They are composed of a microtubular cytoskeleton and play essential functions during development and in numerous physiological processes. As a result, in humans, cilia dysfunction leads to a wide range of pathologies, called ciliopathies

La spermatogenèse, processus de production des gamètes mâles, représente un modèle physiologique pertinent pour l'étude de la dynamique de la chromatine. En effet, la chromatine de type somatique subit un remodelage drastique en fin de spermatogenèse, lors des étapes post-méiotiques. La chromatine, organisée en nucléosomes, est restructurée par enlèvement massif des histones qui sont remplacées par des petites protéines basiques spécifiques des spermatozoïdes, les protamines. Les mécanismes moléculaires responsables de cette transition structurale de la chromatine sont encore mal connus et constituent le champ d'investigation de notre laboratoire. D'autre part, la programmation de l'expression des gènes doit être finement régulée au cours de la spermatogenèse, afin de permettre l'expression des facteurs qui guideront les transitions structurales de la chromatine en post-méiose. Les marques épigénétiques mises en œuvre pour déterminer le statut d'expression des gènes sont encore mal documentées. Enfin, après fécondation de l'ovocyte par le spermatozoïde, le génome mâle subit à nouveau une restructuration visant à inverser le processus et à rendre la chromatine de type somatique, tout en prenant en compte les informations épigénétiques amenées par le spermatozoïde. Les évènements chromatiniens visant à reprogrammer le génome mâle après fécondation sont eux aussi peu connus. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à décrypter l'action de nouveaux acteurs épigénétiques, tels que des variants d'histones et des modifications post-traductionelles des histones, dans le cadre de la spermatogenèse chez la souris. Je démontre leurs implications lors du remplacement massif des histones en post-méiose, mais également vis-à-vis de la régulation de l'expression des gènes, ainsi que lors du développement embryonnaire précoce après fécondation. / The process of male gametogenesis, called spermatogenesis, represents a relevant physiological model to study chromatin dynamics. Indeed, a drastic chromatin remodeling occurs during the postmeiotic steps of spermatogenesis. The nucleosomal-based chromatin is restructured by massive eviction of histone and subsequent replacement by sperm small basic proteins, the protamines. Molecular mechanisms involved during this structural transition of chromatin are obscure, and constitute the area of investigation of our lab. On the other hand, gene expression program has to be tightly regulated during spermatogenesis, to allow expression of factors that will guide postmeiotic chromatin structural transitions. Implemented epigenetic marks which determined this gene expression program are poorly documented. Finally, the male genome undergoes a new chromatin restructuration after fertilization by an inverted process that lead to a somatic chromatin, while taking into account epigenetic information carried by the spermatozoa. Chromatin events involved in male genome reprogramming after fertilization are also poorly documented. During my PhD thesis, I have been interested in deciphering the role of new epigenetic actors in the context of murine spermatogenesis, as histone variants and histones post-translational modifications. I reveal their involvement in the massive postmeiotic histone replacement, for the regulation of gene expression, and in the early embryonic development.

Les chromosomes sexuels subissent pendant la spermatogenèse de multiples modifications qui entrainent d’importantes variations dans le niveau d’expression des gènes qu’ils portent. Notamment, ils sont inactivés au cours de la méiose et la majorité reste réprimé tout au long de la spermiogenèse. Cette étude met en évidence l’existence de transcrits alternatifs particuliers de gènes sur le chromosome X et Y, dont les profils d’expressions témoignent de leur rôle au cours de ces deux phases de la spermatogenèse. Sur le chromosome X nous avons isolé, chez l’homme et chez la souris, trois gènes ubiquitaires (Uba1x, Prdx4, Atp11c) réactivés dans les spermatides via un transcrit alternatif exprimé de façon majoritaire dans les testicules. Le gène Prdx4 code, pour deux isoformes de protéines différentes par leur domaine N-terminal. Nous avons mis au point des anticorps spécifiques de chaque isoforme et nous avons démontré que, chez la souris, le transcrit réactivé est traduit dans les spermatides et produit une protéine dans un compartiment cellulaire distinct de l’autre isofome ubiquitaire. Un total de cinq mutations, affectant ces transcrits exprimés dans les spermatides, ont été retrouvées dans les gènes UBA1X et PRDX4 chez des hommes infertiles. Sur le chromosome Y chez la souris, nous avons étudié les gènes Zfy1 et Zfy2, deux homologues testicules spécifiques codant pour des protéines à doigt de zinc avec un long domaine d’activation. Zfy2, mais pas Zfy1, promeut l’élimination apoptotique des spermatocytes contenant un chromosome X univalent. Nous avons identifié un transcrit alternatif du gène testicule spécifique Zfy1 exprimé dans les spermatocytes et les spermatides. La protéine putative issue de ce transcrit, possédant un domaine acidique réduit de moitié qui pourrait être à l’origine des différences fonctionnelles entre les gènes homologues Zfy1 et Zfy2 au cours de la méiose murine. Chez l’homme, l’orthologue de ces gènes ZFY est ubiquitaire et nous avons montré qu’il produisait un transcrit alternatif testicule spécifique, codant une protéine avec le même domaine acidique raccourci que Zfy1. Nos données indiquent que ce transcrit alternatif est prédominant dans les spermatocytes et les spermatides chez l’homme et chez la souris. Ces résultats apportent la première évidence d’une fonction du gène ZFY au cours de la spermatogenèse chez l’homme et de son implication possible dans la fertilité masculine. / Sex chromosomes undergo many modifications during spermatogenesis, leading to dramatic variations in the expression levels of their genes. In particular, they are inactivated during meiosis with most genes remain silent throughout spermiogenesis. Our study describes specific alternative transcripts produced by X and Y chromosome genes, whose expression indicates roles in early spermatocytes (meiosis) and in spermatids (spermiogenesis). On the X chromosome, we have shown that three widely transcribed genes, Uba1x, Prdx4, and Atp11c, are reactivated in mouse and human spermatids via an alternative transcript that is expressed mainly in the testis. The Prdx4 gene codes two isoforms of the peroxiredoxin 4 that differ in their N-terminal domain. We have raised antibodies specific for each PRDX4 isoform and demonstrate, in mouse, that the reactivated transcript is translated in spermatids, producing a protein in a distinct cellular compartment from the ubiquitous isoform. Altogether, five mutations, affecting the spermatid-reactivated transcripts uniquely, of UBA1x and PRDX4, have been found specifically in our group of infertile men. On the mouse Y chromosome, we have studied Zfy1 and Zfy2, nearly identical testis specific zinc finger genes with long acidic (activation) domains. Zfy2, but not Zfy1, promotes the apoptotic elimination of spermatocytes with an unpaired X chromosome. We have identified an alternatively spliced transcript of Zfy1 that lacks half the acidic domain, and could explain the functional difference between Zfy1 and Zfy2. In human, the ZFY gene is widely transcribed, but we show that ZFY produces a testis specific variant transcript, encoding the same short acidic domain as Zfy1. Our data indicate that the alternative transcripts predominate in spermatocytes and spermatids, in both human and mouse. This provides the first evidence that human ZFY may play a conserved role during spermatogenesis, and contribute to human male fertility.

Depuis quelques années, une biopsie testiculaire suivie d’une congélation du tissu testiculaire est proposée aux enfants atteints de cancer avant introduction d’un traitement gonadotoxique. Cette procédure de préservation de la fertilité est proposée avec l’espoir qu’une méthode de restauration de la fertilité soit développée. Le tissu testiculaire décongelé pourrait ainsi être utilisé afin d’effectuer une maturation in vitro, évitant la réintroduction de cellules tumorales, pour produire des spermatozoïdes. Ce travail de thèse a consisté, dans un premier temps, à évaluer la mise en place de la méthylation de l’ADN au sein du tissu testiculaire prépubère de souris au cours de la spermatogenèse in vitro. La culture de tissu testiculaire frais ou décongelé de souris prépubère permet le maintien des niveaux d’expression des ADN méthyltransférases 1 et 3a dans les spermatogonies et les spermatocytes. De plus, la méthylation de l’ADN est retrouvée jusque dans les spermatozoïdes produits in vitro. Par la suite, la qualité nucléaire des spermatozoïdes ainsi obtenus a été analysée. La culture de tissu testiculaire n’a pas d’impact sur le taux d’aneuploïdie, la condensation de la chromatine et la fragmentation de l’ADN spermatique. Cependant, la congélation suivie par la culture organotypique augmente la proportion de spermatozoïdes avec un ADN oxydé. Enfin, la fonctionnalité des spermatozoïdes produits in vitro a été analysée par micro-injection ovocytaire et la dynamique de différentes marques épigénétiques a été étudiée au cours du développement préimplantatoire. Les taux de développement embryonnaire sont diminués par l’utilisation de spermatozoïdes produits in vitro. Les niveaux des histones H3K4me3, H3K27me3 et H3K9ac sont peu modifiés dans les embryons issus de spermatozoïdes générés in vitro alors que la méthylation et déméthylation de l’ADN sont plus impactées. La production de spermatozoïdes après culture de tissu prépubère frais ou décongelé dans le modèle murin a permis de mettre en évidence que cette procédure n’est pas sans impact sur l’embryon précoce bien que la qualité des spermatozoïdes produits soit peu altérée. / In recent years, testicular biopsy followed by the freezing of testicular tissue has been proposed to children with cancer before the introduction of a gonadotoxic treatment. This fertility preservation procedure is offered with the hope that a fertility restoration method will be developed. The thawed testicular tissue could thus be used to perform in vitro maturation, avoiding the reintroduction of tumor cells, to produce spermatozoa. This thesis work first consisted in assessing the establishment of DNA methylation in mouse prepubertal testicular tissue during in vitro spermatogenesis. The culture of fresh or thawed mouse testicular testicular tissue allows the expression levels of DNA methyltransferases 1 and 3a to be maintained in spermatogonia and spermatocytes. In addition, DNA methylation is found even in in vitro produced spermatozoa. The nuclear quality of these spermatozoa was then analyzed. The culture of testicular tissue has no impact on sperm aneuploidy rate, chromatin condensation and DNA fragmentation. However, freezing followed by organotypic culture increases the proportion of spermatozoa with oxidized DNA. Finally, the functionality of in vitro produced spermatozoa was analyzed by oocyte microinjection and the dynamics of different epigenetic marks was studied during preimplantation development. Embryo developmental rates are decreased when using in vitro produced spermatozoa. The levels of H3K4me3, H3K27me3 and H3K9ac are slightly modified in embryos derived from spermatozoa generated in vitro whereas DNA methylation and demethylation are more affected. The production of spermatozoa after culture of fresh or thawed prepubertal tissue in the mouse model has shown that this procedure is not without impact on the early embryo, although the quality of the spermatozoa produced is relatively unaltered.

Durant ces dernières décennies, la fertilité masculine est en constante diminution à l’échelle mondiale. Même si les facteurs environnementaux ont une part de responsabilité indéniable, il n’en reste pas moins que les altérations génétiques mais également épigénétiques semblent aussi largement impliquées. La compréhension des mécanismes épigénétiques qui régulent la fertilité masculine est récente mais essentielle pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce contexte, l’objectif de mes travaux de thèse s’est focalisé sur l’étude du rôle du variant d’histone H3.3 dans la spermatogenèse. H3.3 possède la capacité de remplacer l’histone canonique H3 dans la chromatine modifiant ainsi les propriétés épigénétiques de cette dernière. H3.3 est nécessaire à la spermatogenèse mais son rôle reste à élucider. Grace à plusieurs modèles murins, mes travaux de thèse ont montré que la forme H3.3B est essentielle à la reproduction masculine notamment pour la transition méiose/post-méiose. Lors de cette transition, on observe une forte régulation des piARN, des rétrotransposons et des chromosomes sexuels. Nos expériences révèlent pour la première fois que la perte de H3.3B provoque une chute de l’expression des piARN. À l’inverse, l’absence de H3.3B est aussi associée à une augmentation de l’expression de l’ensemble des gènes des chromosomes sexuels comme des rétrotransposons RLTR10B et RLTR10B2. Ces changements d’expression se traduisent par une spermatogenèse altérée et une infertilité. Par des expériences de ChIP-seq, nous avons observé que H3.3 est fortement enrichie sur les piRNA, les rétrotransposons RLTR10B et RLTR10B2 et l'ensemble des chromosomes sexuels. Toutes ces expériences ont permis de mieux caractériser la fonction régulatrice de l’histone H3.3B au cours de la spermatogenèse. En particulier, elles démontrent que H3.3B, en fonction de sa localisation sur la chromatine, intervient dans la régulation positive ou négative de l'expression de régions chromatiniennes définies. Ces résultats montrent l’importance des contrôles épigénétiques au cours de la spermatogenèse et ouvrent de nouvelles pistes dans la compréhension des causes d’infertilité masculine. / In last decades, male fertility has been steadily declining worldwide. Even if environmental factors have an undeniable responsibility, the fact remains that both genetic and epigenetic alterations also seem to be widely implicated. The understanding of the epigenetic mechanisms that regulate male fertility is recent but essential to develop a new therapeutic approaches. In this context, the objective of my thesis work focused on the study of the role of histone variant H3.3 in spermatogenesis. H3.3 has the ability to replace the H3 canonical histone in chromatin thus modifying the epigenetic properties of chromatin. H3.3 is necessary for spermatogenesis but its role remains unclear. Used to several mouse models, my thesis work has shown that the H3.3B form is essential for male reproduction and especially for the meiosis/post-meiosis transition. During this transition, there is a strong regulation of piRNAs, retrotransposons and sex chromosomes. Our experiments reveal at the first time that the loss of H3.3B resulted in down-regulation of the expression of piRNA. In contrast, the absence of H3.3B is also associated with increased expression of all sex chromosom genes as well as of both RLTR10B and RLTR10B2 retrotransposons. These expression changes result in altered spermatogenesis and infertility. By ChIP-seq experiments, we observed that H3.3 is markedly enriched on the piRNA clusters, RLTR10B and RLTR10B2 retrotransposons and the whole sexual chromosomes. All these experiments allowed bettering characterizing the regulatory function of histone H3.3B during spermatogenesis. In particular, he demonstrates that H3.3B, depending on its chromatin localization, is involved in either up-regulation or down-regulation of expression of defined chromatin regions. These results show the importance of epigenetic controls during spermatogenesis and open new tracks for understanding the causes of male infertility.