Das Schicksal einer differenzierten Zelle wird durch epigenetische Grenzen bestimmt und mittels Schutzmechanismen bewahrt, wodurch die Reprogrammierung in andere Zelltypen verhindert wird. In dieser Studie haben wir ein Chromatin-regulierendes Protein, das konservierte MORF4-Verwandte-Gen (MRG) Protein MRG-1, als Barriere für die Reprogrammierung von Zellen in Caenorhabditis elegans (C. elegans) identifiziert. RNAi gegen MRG-1 ermöglicht es uns Keimzellen mittels Überexpression des Neuronen-induzierenden Transkriptionsfaktors CHE-1 in neuronenartige Zellen umzuwandeln. Mittels ChIP-seq fanden wir heraus, dass MRG-1 unterschiedliche DNA Bindungsstellen in den Keimbahnen und somatischen Geweben von C. elegans aufweist. Wir konnten zeigen, dass MRG-1 besonders stark am Genkörper angereichert ist und sich hauptsächlich auf Genen befindet, welche die aktive Histonmarkierung H3K36me3 tragen. Die Charakterisierung der Protein-Protein-Interaktionspartner von MRG-1 mittels Co-IP/MS ergab, dass MRG-1 mit der Histon-H3K9-Methyltransferase SET-26 und der b-gebundenen N-Acetylglucosamin Transferase OGT-1 zusammenarbeitet, um die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen zu verhindern. Basierend auf RNA-Seq Experimenten in mrg-1-Mutanten und Wildtyp konnten wir weitreichende Veränderungen der Genexpression mit Auswirkung auf Signalwege wie den Notch Signalweg enthüllen, welcher bekanntermaßen die Zelltyp-Reprogrammierung fördern. Mittels Long-Read basiertem RNA-seq in mrg-1-Mutanten und der Integration entsprechender ChIP-seq Daten habe ich die Beteiligung von MRG-1 am prä-mRNA-Spleißen in C. elegans gezeigt, analog zum Säugetierortholog MRG15. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass MRG-1 durch die Regulierung des Chromatins und die Sicherstellung des korrekten Spleißens die Expressionsniveaus kritischer Gene und Signalwege aufrechterhält, um eine ordnungsgemäße Keimbahnentwicklung zu gewährleisten und das Schicksal der Keimzellen zu schützen. / Das Schicksal einer differenzierten Zelle wird durch epigenetische Grenzen bestimmt und mittels Schutzmechanismen bewahrt, wodurch die Reprogrammierung in andere Zelltypen verhindert wird. In dieser Studie haben wir ein Chromatin-regulierendes Protein, das konservierte MORF4-Verwandte-Gen (MRG) Protein MRG-1, als Barriere für die Reprogrammierung von Zellen in Caenorhabditis elegans (C. elegans) identifiziert. RNAi gegen MRG-1 ermöglicht es uns Keimzellen mittels Überexpression des Neuronen-induzierenden Transkriptionsfaktors CHE-1 in neuronenartige Zellen umzuwandeln. Mittels ChIP-seq fanden wir heraus, dass MRG-1 unterschiedliche DNA Bindungsstellen in den Keimbahnen und somatischen Geweben von C. elegans aufweist. Wir konnten zeigen, dass MRG-1 besonders stark am Genkörper angereichert ist und sich hauptsächlich auf Genen befindet, welche die aktive Histonmarkierung H3K36me3 tragen. Die Charakterisierung der Protein-Protein-Interaktionspartner von MRG-1 mittels Co-IP/MS ergab, dass MRG-1 mit der Histon-H3K9-Methyltransferase SET-26 und der b-gebundenen N-Acetylglucosamin Transferase OGT-1 zusammenarbeitet, um die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen zu verhindern. Basierend auf RNA-Seq Experimenten in mrg-1-Mutanten und Wildtyp konnten wir weitreichende Veränderungen der Genexpression mit Auswirkung auf Signalwege wie den Notch Signalweg enthüllen, welcher bekanntermaßen die Zelltyp-Reprogrammierung fördern. Mittels Long-Read basiertem RNA-seq in mrg-1-Mutanten und der Integration entsprechender ChIP-seq Daten habe ich die Beteiligung von MRG-1 am prä-mRNA-Spleißen in C. elegans gezeigt, analog zum Säugetierortholog MRG15. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass MRG-1 durch die Regulierung des Chromatins und die Sicherstellung des korrekten Spleißens die Expressionsniveaus kritischer Gene und Signalwege aufrechterhält, um eine ordnungsgemäße Keimbahnentwicklung zu gewährleisten und das Schicksal der Keimzellen zu schützen.

Phosphorylierung modulieren. Obwohl heute bereits Tausende von Phosphorylierungsstellen annotiert sind, sind entsprechende funktionelle Informationen begrenzt. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass es keine Hochdurchsatzmethoden zur Erforschung der Funktion einer Phosphorylierungsstelle gibt. Um dieser Herausforderung zu begegnen, habe ich eine auf Shotgun-Proteomik basierende Strategie zur Messung der RNA-Bindungsaktivität von RBPs und ihren phosphorylierten Proteoformen entwickelt, die 'quantitative RNA-Interactome Capture (qRIC)' genannt wird. QRIC quantifiziert die Pull-Down-Effizienz von RBPs, die mit Oligo(dT)-Magnetbeads isoliert werden. Diese Effizienz korreliert mit der Anzahl der RNA-Bindungsstellen und der Spezifität der Motivbindung, und spiegelt so die RNA-Bindung in vivo wieder. In einer Gegenüberstellung der Pull-Down-Effizienz verschiedener Proteoformen in unbehandelten Zellen, habe ich qRIC als unvoreingenommenes Screening von regulatorischen Phosphorylierungsstellen in RBPs eingesetzt. Für jede einzelne Phosphorylierungsstelle wurde ein Delta-Effizienzwert berechnet, der den Einfluss auf die RNA-Bindung in vivo reflektiert. Die Effizienzunterschiede spiegelten das erwartete Verhalten von RBPs während der Phasentrennung von membranlosen Organellen und die Ladungsabstoßung zwischen Phosphorylierungsstellen und Nukleotiden bei physiologischem pH-Wert wider. Mithilfe des Delta-Effizienzwertes identifizierte ich mehrere bereits bekannte regulatorische Phosphorylierungsstellen in SF3B1, UPF1 und ELAVL1, sowie neue, bisher unbekannte und möglicherweise regulatorische Phosphorylierungsstellen in SERBP1, LARP1 und RBM20. Phosphomimetische Mutationsvarianten dieser Phosphorylierungsstellen wurden analysiert, um den molekularen Einfluss auf die Regulation der RBP-Funktion zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung bestimmter Stellen im Spleißregulator RBM20 dessen nukleo-zytoplasmatische Lokalisierung, die Assoziation mit zytosolischen RNA-Granula und die Spleißfunktion beeinflusst. Diese Erkenntnisse könnten sich beispielsweise auf die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden für Patienten mit dysfunktionalen RBM20-Mutationen auswirken, die zu dilatativer Kardiomyopathie führen. QRIC kann als Hochdurchsatzverfahren dazu beitragen, unser Wissen über die Regulierung von Protein-RNA-Interaktionen durch Phosphorylierung zu erweitern. / Post-transcriptional regulation of gene expression is fundamental in health and disease. RNA-binding proteins (RBPs) directly bind and govern the fate of RNAs in cells. At the same time, cell signaling cascades control RBP functions by modulating their physicochemical properties through post-translational modifications, like phosphorylation. Although thousands of phosphorylation sites have been annotated, functional information is limited. This, in part, is due to the lack of high-throughput methods that measure function. To tackle this challenge I developed a shotgun proteomics-based strategy for measuring the RNA-binding activity of RBPs and their phosphorylated proteoforms, named quantitative RNA-interactome capture (qRIC). In qRIC, pull-down efficiency of RBPs isolation with oligo(dT) magnetic beads is quantified in cells at steady state and correlates with the number of RNA-binding sites and motif binding specificity, reflecting a link to RNA-binding in vivo. By contrasting pull-down efficiency of different proteoforms in the cells, I applied qRIC as an unbiased screening of regulatory phosphorylation sites in RBPs affecting pull-down efficiency. A delta efficiency score was calculated for each individual phosphorylation site to denote its influence on RNA-binding in vivo. Efficiency differences globally reflected the expected behavior of RBPs during phase separation of membraneless organelles and charge repulsion between phosphorylation sites and nucleotides in physiological pH. Using the delta efficiency score, I identified several previously known regulatory phosphorylation sites in SF3B1, UPF1 and ELAVL1, plus novel candidate regulatory sites in SERBP1, LARP1 and RBM20. Phosphomimetic mutant variants of these sites were analysed to investigate the molecular mechanism of regulation. Importantly, I show that phosphorylation of candidate sites in the splicing regulator RBM20 affects its nucleo-cytoplasmic localization, association with cytosolic RNA granules, and splicing function. These findings could have implications for the development of novel treatments based on kinase activity for patients with dysfunctional RBM20 mutations leading to congenital dilated cardiomyopathy. I anticipate that qRIC, as a high throughput approach, will help to expand our knowledge about the regulation of protein-RNA interactions and their regulation by phosphorylation.

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Durch Immunregulation und -modulation sorgt das Immunsystem dafür, daß von außen in den Organismus gelangende Agentien nicht zu dauerhaften Schäden führen. Wesentliche Funktionen des Immunsystems stützen sich dabei auf die zelluläre Immunität. Gerät dieses komplizierte Regelwerk aus dem Gleichgewicht, können schwere Erkrankungen autoimmuner oder atopischer Genese resultieren. Der erste Teil der Arbeit befaßt sich mit zwei Aspekten der zellulären Immunantwort. Allergische Immunantworten sind durch die Typ 2 T Zellantwort charakterisiert. Für die Induktion einer Typ 2 Antwort wird Interleukin-4 benötigt, dessen Herkunft nicht geklärt ist. NK1.1 positive T Zellen als Quelle des initialen IL-4 konnten durch in vivo und in vitro Messung von allergie-spezifischen Parametern ausgeschlossen werden. Der MHC-Komplex präsentiert T Zellen Antigene in Form von Peptiden. Pathologische T Zellantworten können durch fortwährende Antigenpräsentation unterhalten werden. Durch Untersuchungen zur molekularen Charakteristik der MHC - Peptid Interaktion ließen sich Bindungsmotive so verfeinern, daß Peptide mit sehr starker Bindung an den MHC ohne gleichzeitige Erkennungssequenz für den T Zellrezeptor entwickelt werden konnten. Peptide dieser Art könnten zur Blockierung einer pathologischen T Zellantwort genutzt werden. Für viele immunologische Erkrankungen ist die Beteiligung genetischer Faktoren beschrieben worden. Der zweite Teil der Arbeit befaßt sich mit der Bedeutung genetischer Disposition bei Allergien im Mausmodell. Homozygote Inzuchtstämme konnten als High- und Low-Responder für den Phänotyp "allergische Soforttypreaktion der Haut" gegenüber Birkenpollenextrakt definiert werden. Die Phänotypisierung der F1 Generation wies auf dominante Vererbung hin, die informative Rückkreuzung auf die Beteiligung von mindestens zwei Genen für die Ausprägung des Merkmals. Wie die Analyse MHC congener Mäuse zeigte, entspricht einer dieser Loci dem MHC Komplex. Durch eine genomweite Kartierung mit Mikrosatelliten wurde als weiterer Kandidat der IL-5 Rezeptor identifiziert. Die detaillierte Analyse des Gens in High-und Low-Respondern weist auf eine Anzahl funktionell bedeutsamer Polymorphismen hin. Dabei imponiert das Low-Responder Allel als Suszeptibilitätsallel. Die Unterschiede haben Auswirkung auf Transkription/Translation und Spleißvorgänge, die zu quantitativer Differenz der Genprodukte führt. Die Daten weisen damit auf einen regulatorischen Mechanismus hin, da die Proteinstruktur des Rezeptors bei High- und Low-Respondern identisch ist. / Immune deviations can lead to serious autoimmune or atopic disorders. Two possible candidates for such pathological immune responses have been investigated: (i) the MHC class I allele HLA-B27, which is strongly linked to ankylosing spondylitis and reactive arthritis. Its presentation of potentially pathogenic peptides and therapeutical modifications of peptidic ligands have been studied. (ii) Interleukin-4 (IL-4), which is the key player in the induction and maintenance of allergic immune responses. A subpopulation of natural killer (NK1.1) cells have been discussed as a source of initial IL-4. Through experiments with NK1.1 deficient mice we could demonstrate, that such immune resonses are not dependent on the presence of NK1.1 cells. Both, autoimmunity and atopy belong to the large group of multifactorial diseases, i. e. genetic and environmental factors influence the expression of the various phenotypes. To dissect the genetics of allergic diseases systematically, a mouse model of immmediate cutaneous hypersensitivity (ICHS) upon birch pollen sensitization has been etablished. Phenotyping of the F1 progeny of high- and low-responder mice revealed ICHS as a dominant trait with incomplete penetrance. Mice from a backcross to the low-responder strain did split into the three classes of high-, intermediate and low-response. Genotyping of these mice revealed a strong candidate gene on chromosome 6: the interleukin-5 receptor (IL-5R). Analysis of the IL-5R gene resulted in the detection of genetic variance of the high- and low-responder allele in non-coding regions with functional relevance. Additional regulatory variance is implicated through differential alternative splicing of the three receptor isoforms. A second gene cluster contributes to the expression of the allergic phenotype: MHC class II alleles, as has been demonstrated for other immunologic disorders in mice and humans.

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