In cells and organelles transporters are responsible for translocation of amino acids, sugars and nucleotides among others. In the central nervous system (CNS), amino acid transporters can function as neurotransmitter transporters and nutrient sensors. The Solute carrier (SLC) superfamily is the largest family of transporters with 395 members divided in 52 families. The system A and system N amino acid transporter family, SLC38, consists of 11 members, SNAT1-11 (SLC38A1-11). The members are expressed in the brain, exclusively in neurons or astrocytes and some in both. Amino acid signaling is mainly regulated via two pathways, the amino acid responsive (AAR) pathway and the mechanistic/mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) pathway. These pathways regulate the protein synthesis in opposite directions depending on the amino acid availability. SLC38 members along with other SLCs have been identified to participate in these pathways. In paper I, the regulation of SLC genes after complete amino acid starvation in mouse hypothalamic cells have been studied with microarray and we found that 47 SLC genes were significantly altered at five hours of starvation. Interestingly, we found that Slc38a1 and Slc38a7 were upregulated along with the known starvation responding gene, Slc38a2. A complementary starvation study for the SLC38 genes was performed using primary mouse embryonic cortex cells. We found that Slc38a1, Slc38a2, Slc38a5, Slc38a6 and Slc38a8 were upregulated while Slc38a3, Slc38a7 and Slc38a11 were downregulated. Three members from the SLC38 family, SNAT8 (paper IV), SNAT9 (paper III) and SNAT10 (paper II) have been histologically characterized in mouse brain and all these transporters are exclusively neuronal. SNAT8 and SNAT10 were also functionally characterized and shown to be transporters for alanine and glutamine among others. SNAT8 was shown to mediate sodium dependent transport and was classified to system A. SNAT10 was shown to be a sodium independent bidirectional transporter and displayed characteristics for system A and N. SNAT9 is a lysosomal component of the Ragulator-Rag complex which senses amino acid availability and activates mTORC1. In paper III we also found that Slc38a9 gene expression was upregulated following starvation and downregulated following high-fat diet in mouse brain.

Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: Introduction – Due to spatial separation from the native vascular bed, solid tumours develop regions with limited access to nutrients essential for growth and survival. The promotion of a process known as macroautophagy may facilitate in the maintenance of intracellular amino acid levels, through breakdown of cytoplasmic proteins, so that they remain available for macromolecular biosynthesis and ATP production. Several studies point to the potential ability of some cancers to temporarily increase autophagy and thereby prolong cell survival during metabolic stress. The validity of these claims is assessed when a commonly used breast cancer cell line and an epithelial breast cell line are starved of amino acids in this study. Furthermore, we go on to hypothesize that acute amino acid deprivation during treatment will result in an elevated sensitivity of MDAMB231 cells to doxorubicin toxicity but limit its cytotoxic side-effects in MCF12A cells. Methods and study design- Human breast cancer cells (MDAMB231) and breast epithelial cells (MCF12A) cultured in complete growth medium were compared to those incubated in medium containing no amino acids. Steady state autophagy levels were monitored using classical protein markers of autophagy (LC3-II and beclin-1) and the acidic compartmentalization in cells (Lysotracker™ red dye) in conjunction with autophagy inhibition (bafilomycin A1 and ATG5 siRNA). Cell viability was monitored using several techniques, including caspase 3/7 activity. ATP levels were assessed using a bioluminescent assay, while mass spectrometry based proteomics was used to quantify cellular amino acid levels. Similar techniques were used to monitor autophagy during doxorubicin treatment, while cellular doxorubicin localization was monitored using immunofluorescence microscopy. Finally, a completely novel GFP-LC3 mouse tumour model was designed to assess autophagy and caspase activity within tumours in vivo, during protein limitation and doxorubicin treatment. Results - Amino acid deprivation resulted in a transient increase in autophagy at approximately 6 hours of amino acid starvation in MDAMB231 cells. The amino acid content was preserved within these cells in an autophagy-dependent manner, a phenomenon that correlated with the maintenance of ATP levels. Inhibition of autophagy during these conditions resulted in decreased amino acid and ATP levels and increased signs of cell death. MCF12A cells displayed a greater tolerance to amino acid starvation during 24 hours of amino acid starvation. Evidence indicated that autophagy was important for the maintenance of amino acid and ATP levels in these cells and helped prevent starvation-induced cell death. Furthermore, data showed that concomitant amino acid withdrawal resulted in decreased cellular acidity in MDAMB231 cells, and increased acidity in MCF12A cells, during doxorubicin treatment. These changes correlated with evidence of increased cell death in MDAMB231 cells, but a relative protection in MCF12A cells. A novel model was used to apply these techniques in vivo, and although mice fed on a low protein diet during high dose doxorubicin treatment had increased mean survival and smaller tumour sizes, evidence suggested that autophagy is protecting a population of cells within these tumours. Conclusions - This novel approach to tumour sensitization could have several implications in the context of cancer therapy, and given the delicate relationship that autophagy has with the cancer microenvironment, efforts to determine the mechanisms involved in autophagy and sensitization could lead to new and innovative treatment opportunities for cancer management. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Inleiding – As gevolg van hul skeiding van die oorpronklike vaskulêre netwerk, ontwikkel soliede gewasse areas met beperkte toegang tot noodsaaklike voedingstowwe. Die bevordering van 'n proses wat as makro-autofagie bekend staan, kan die handhawing van intrasellulêre aminosuur vlakke fasiliteer. Voorafgenoemde proses word waarskynlik deur die afbreek van sitoplasmiese proteïene teweegebring om sodoende vir makro-molekulêre biosintese en ATP produksie beskikbaar te kan wees. Verskeie studies dui daarop dat sommige kankersoorte die vermoë het om autofagie tydelik te verhoog, en daarby sel oorlewing gedurende metaboliese stress te verleng. Die geldigheid van hierdie eise word evalueer wanneer 'n algemeen beskikbare borskanker sellyn, en 'n borsepiteelsellyn in hierdie studie van aminosure verhonger word. Verder, veronderstel ons dat akute aminosuur ontneming gedurende behandeling 'n verhoogde sensitiwiteit van MDAMB231 selle tot doxorubicin toksisiteit tot gevolg sal hê, maar terselfdetyd die middel se sitotoksiese newe-effekte in MCF12A selle sal beperk. Metodes en studie ontwerp – Menslike borskanker- (MDAMB231) en bors epiteel selle (MCF12A) wat in volledige groeimedium gekweek is, is vergelyk met selle wat in aminosuur vrye medium gekweek is. Basislyn autofagie-vlakke is gemonitor deur die gebruik van klassieke autofagie proteïen merkers (LC3-II en beclin-1) en die asidiese kompartementalisering in selle (Lysotracker™ rooi kleurstof) saam met autofagie inhibisie (bafilomycin A1 and ATG5 siRNA). Sellewensvatbaarheid is deur die gebruik van verskeie tegnieke, insluitend caspase 3/7 aktiwiteit, gemonitor. ATP-vlakke is deur die gebruik van 'n bioluminiserende tegniek gemeet, terwyl massa-spektrometrie-gebaseerde “proteomics” gebruik is om sel aminosuur vlakke te kwantifiseer. Soortgelyke tegnieke is gebruik om autofagie gedurende doxorubicin behandeling waar te neem, terwyl sellulêre doxorubicin lokalisasie deur die gebruik van immunofluoresensie mikroskopie gemonitor is. Ten slotte, is 'n unieke GFP-LC3 muismodel in hierdie studie ontwikkel. Hierdie model is gebruik om autofagie en caspase aktiwiteit in gewasse in vivo te bestudeer tydens proteïen beperking en doxorubicin behandeling. Resultate – Aminosuur ontneming het tot 'n tydelike verhoging in autofagie na ongeveer 6 ure van aminosuur verhongering in MDAMB231 selle gelei. Die aminosuur inhoud van hierdie selle het op 'n autofagie-afhanklike manier behoue gebly. Hierdie verskynsel het met die handhawing van ATP-vlakke gekorreleer. Autofagie inhibisie gedurende hierdie kondisies het 'n verlaging in aminosuur en ATP-vlakke teweeggebring, sowel as vermeerderde tekens van seldood tot gevolg gehad. MCF12A selle het 'n groter toleransie tot aminosuur verhongering tydens die 24 uur aminosuur verhongeringsperiode getoon. Getuienis het aangedui dat autofagie belangrik vir die handhawing van aminosuur en ATP-vlakke in hierdie selle was, en gehelp het om verhongerings-geïnduseerde seldood te voorkom. Verder het data gewys dat aminosuur ontrekking tot verminderde sellulêre asiditeit in MDAMB231 selle, en verhoogde asiditeit in MCF12A selle gedurende doxorubicin behandeling gelei het. Hierdie veranderinge stem ooreen met getuienis van toenemende seldood in MDAMB231 selle, maar 'n relatiewe beskerming in MCF12A selle. 'n Unieke model was gebruik om hierdie tegnieke in vivo toe te pas. Alhoewel verhoogde oorlewing en kleiner gewasse in muise op 'n lae proteïen dieet gedurende hoë dosis doxorubicin behandeling opgemerk is, het bewyse voorgestel dat autofagie 'n populasie selle binne die gewasse beskerm. Gevolgtrekkings – Hierdie unieke benadering tot tumor sensitisering kan verskeie implikasies in die konteks van kanker behandeling hê. Gegewe die delikate verhouding van autofagie met die kanker mikro-omgewing, kan pogings om die meganismes betrokke in autofagie en sensitisering te bepaal, tot nuwe en innoverende behandelings vir kanker lei.

The trade-off between gametes and soma is central to life-history evolution. Oosorption has been proposed as a mechanism that can mediate this trade-off. When conditions are not conducive to successful reproduction, females are expected to be able to recoup nutrients from unfertilized oocytes and reinvest them into the somatic processes that promote survival and hence future reproduction. Although positive correlations between oocyte degradation and lifespan have been documented in oviparous insects, the adaptive significance of this process in species with more complex reproductive biology has not been explored. Oocyte degradation via apoptosis (programmed cell death) occurs in response to enforced virginity in females of the ovoviviparous cockroach, Nauphoeta cinerea. Observed apoptosis may represent oosorption, however, an alternative but not mutually exclusive argument is that oocyte apoptosis may represent oocyte ageing and clearance in order to maintain reproductive synchrony. The aim of this thesis was to test the hypothesis that the function of oocyte apoptosis is oosorption in N. cinerea. I found that in addition to enforced virginity, starvation induces oocyte apoptosis. However, the life history outcome following one form of stress is the opposite of the other. Hence, the functional role of oocyte apoptosis appears to be different depending on whether apoptosis is induced through starvation or age. Following a period of starvation-induced apoptosis females exhibit the increase in survival and future reproduction predicted by oosorption. Whereas, following a period of age-induced apoptosis females suffer fecundity and longevity cuts. However, age-induced apoptosis does not appear to simply be cellular ageing and clearance. In conjugation with age-induced apoptosis, ovariole number declines whilst the size of surviving oocytes increases. Hence, it appears that resources from sacrificed oocytes are being recycled into the survivors, and that this reinvestment in current reproduction trade-offs with future reproductive capacity. My thesis shows the importance of studying proximal mechanisms alongside more traditional measures of life history, as the relationship between isolated biological levels is not always clear.

Rampant increases in oil prices and detrimental effects of fossil fuels on the environment have been the main impetus for the development of environmentally friendly and sustainable energy sources. Amongst the many possibilities, microalgae have been proposed as a new alternative energy source to fossil fuels, as their growth is both sustainable and ecologically safe. By definition, microalgae are unicellular photosynthetic microorganisms containing chlorophyll a. These organisms are capable of producing large quantities of oils, surpassing that of traditional oil-seed crops, which can be transformed, through chemical processes, into biofuels such as biodiesel or bio-gasoline. Thus, recent research has gone into discovering high lipid producing algal strains, optimising growth media for increased lipid production and developing metabolic engineering to make microalgae a source of biofuel that is competitive to more traditional sources of biofuel and even to fossil fuel. In this context, the research reported here focused on using a mixotrophic growth mode as a way to increase lipid production for certain strains of microalgae. In addition, nitrogen starvation combined with mixotrophy was studied to analyse its effects on lipid production. Mixotrophy is the parallel usage of two trophic modes, in our case photoautotrophy and heterotrophy. Consequently, 12 algal strains were screened for mixotrophic growth, using glycerol as a carbon source. Glycerol is a waste product of the current biodiesel industry; it is a cheap and abundant carbon source present in many metabolic pathways. From this initial screening, several strains were chosen for subsequent experiments involving nitrogen starvation. Nitrogen starvation has been shown to induce lipid accumulation. The results obtained show that a mixotrophic growth mode, using glycerol as a carbon source, enhances lipid production for certain strains. Moreover, lipid enhancement was shown for nitrogen starvation combined with mixotrophic growth mode. This was dependant on time spent under nitrogen starvation and on initial concentrations of the nitrogen source. / L’augmentation effrénée des prix du pétrole et les effets néfastes des carburants fossiles sur l’environnement sont les raisons principales pour la recherche et le développement de nouvelles sources d’énergie durables et écologiques. Parmi de grands nombres de possibilités, les micro-algues sont proposées comme une source alternative d’énergie aux carburants fossiles, étant donné que leur croissance est durable et écologique. Les micro-algues sont des organismes unicellulaires et photosynthétiques détenant comme pigment essentiel la chlorophylle a. Ces organismes sont capables de produire de grandes quantités d’huile, parfois excédant celles des cultures agricoles traditionnellement utilisées pour les biocarburants. Ces huiles peuvent être transformées en biocarburants, tel que le biodiésel et le bio-essence, par certains procédés chimiques. La recherche actuelle est basée sur la découverte de souches d’algues capables de produire un haut rendement de lipides, l’optimisation de milieux de croissance pour accroitre la production lipidique et la manipulation génomique afin de créer des souches de micro-algues dont les rendements peuvent rivaliser avec l’agriculture tradionnelle et même les carburants fossiles. Dans ce contexte, notre recherche se concentre sur l’utilisation d’un mode de croissance mixotrophe afin d’induire une augmentation dans la production lipidique de certaines souches de micro-algues. De plus, des études sur la carence en azote combinée à la croissance mixotrophe ont été entreprises pour évaluer l’effet de ces paramètres sur la production lipidique. La mixotrophie est un mode de croissance qui utilise en parallèle deux modes trophiques différents, tel que l’hétérotrophie et l’autotrophie. De ce fait, 12 souches d’algues ont été examinées pour leur capacité à croitre dans un milieu mixotrophe. Le glycérol est un produit secondaire de l’industrie du biodiésel actuelle. Cette substance est à bas prix, abondante et peut être utilisé comme substrat dans plusieurs voies métaboliques. Du criblage initial, plusieurs souches ont été choisies pour des expériences subséquentes impliquant la carence en azote. La carence en azote à été démontrer comme un déclencheur de l’accumulation de lipide chez les micro-algues dans des recherches antérieures. Les résultats obtenus démontrent que la croissance mixotrophe permet d’augmenter la production de lipide chez certaines souches. De plus, la carence en azote combinée à la croissance mixotrophe a permis d’augmenter la production lipidique. Cependant, celle-ci dépendait du temps passer en carence et des concentrations initiales de source d’azote.

Les mécanismes de perception du phosphate chez les plantes ainsi que la mise en place des réponses à une carence demeurent relativement méconnus. On explique le nombre restreint d'éléments identifiés jusqu'ici par la complexité des mécanismes mis en jeu, impliquant probablement une redondance fonctionnelle. Ce travail de thèse avait pour but de contourner cet obstacle pour tenter d'apporter de nouveaux éléments de compréhension de la réponse à la carence en phosphate chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Une approche de génétique chimique a donc été utilisée pour isoler une famille de molécules (les Phosphatins) inhibant de nombreuses réponses induites par la carence phosphatée. Elles agissent aussi bien au niveau de la réponse morphologique que métabolique. Ceci révèle l'existence de blocages génétiques limitants la croissance des plantes en condition de carence en phosphate. Cette étude suggère aussi l'existence de « cross talks » potentiels ou de mécanismes redondants ignorés jusqu'ici entre les réponses morphologiques et biochimiques. / The plant mechanism of phosphate perception and responses pathways to a starvation are still poorly understood. We explain that only few elements have been identified so far by the complexity of the mechanisms involved, probably coupled with functional redundancy. The aim of this work was to bypass this obstacle in order to deep our knowledge on the understanding of the phosphate starvation response in the plant model Arabidopsis thaliana. A chemical genetic approach was used to isolate a drug family (the Phosphatins) inhibiting several responses induced by a phosphate starvation. They act both on morphological and metabolic response. This reveals the existence of genetic blocking limiting plant growth under conditions of phosphate deficiency. This study also suggests the existence of potential "cross talks" or redundant mechanisms hitherto unknown between morphological and biochemical responses.

L’autophagie est un processus d’autodigestion dans lequel la cellule dégrade ses propres composants dans le but de maintenir l’homéostasie dans ses conditions basales. En absence de nutriments, l’autophagie est activée et favorise la survie cellulaire en fournissant des substrats énergétiques résistant aux conditions de stress. Autophagie et métabolisme communiquent à différents niveaux; une baisse en métabolites richement énergétiques, tels qu’en ATP et en NADH, est détectée par des senseurs cellulaires (AMPK et SIRT1 respectivement) et mène à l’activation de l’autophagie. Ici, nous définissons un niveau supplémentaire de régulation de l’autophagie induite par le jeûne. Dans ce travail, nous montrons que cette privation en nutriments est caractérisée par une diminution rapide de l’Acétyl CoA, intégrateur majeur de l’état nutritionnel au carrefour du catabolisme des graisses, des sucres et des protéines. La baisse en AcCoA s’accompagne de la réduction proportionnelle des niveaux généraux d’acétylation des protéines ainsi que par l’induction de l’autophagie. Les manipulations destinées à augmenter ou diminuer les niveaux cytosoliques d’AcCoA, ciblant soit la synthèse mitochondriale soit son transport dans le cytoplasme, résultent en la suppression ou l’induction de l’autophagie aussi bien dans les cultures cellulaires que dans les tissus de souris. La déplétion en AcCoA impacte directement l’activité des KATs utilisant l’AcCoA comme substrat pour l’acétylation protéique. Nous avont montré que cette baisse en AcCoA réduit spécifiquement l’activité de EP300; cette KAT est en effet nécessaire à la suppression de l’autophagie à des niveaux élevés d’AcCoA, se comportant ainsi comme le senseur des niveaux cytosoliques d’AcCoA. A son tour, EP300 contrôle l’autophagie en inhibant les protéines autophagiques clés. Dans l’ensemble, nos résultats illustrent les fonctions de l’AcCoA cytosolique comme régulateur métabolique central de l’autophagie, délimitant ainsi des stratégies pharmacologiques centrées sur l’AcCoA qui permettent la manipulation thérapeutique de l’autophagie. En effet, la privation en nutriments et la restriction calorique sont connues pour jouer un rôle positif sur la santé et la longévité en promouvant leurs effets. Néanmoins, les stratégies basées sur la restriction calorique sont difficilement applicables en clinique. Ici, nous proposons une nouvelle définition biochimique des Mimétiques de la Restriction Calorique, composés imitant l’effet positif du jeûne. Dans notre contexte, un MRC est un composé capable de réduire l’acétylation protéique par des mécanismes distincts mais convergents: premièrement, par diminution des niveaux d’AcCoA, deuxièmement par inhibition directe des KATs, et enfin, par activation des protéines déacétylases. Ces résultats de l’exécution d’un programme cellulaire conduisent finalement à des effets pro-santé liés à la restriction calorique incluant mais non limités à l’autophagie. / Autophagy is a self-digestion process in which cell degrades its own components in order to maintain homeostasis in basal conditions. In absence of nutrients, autophagy is activated and promotes cell survival by providing energetic substrates to sustain stressful condition. Autophagy and metabolism crosstalk at different levels; a drop in energy-rich metabolites, such as ATP and NADH, is detected by cellular sensors (AMPK and SIRT1 respectively) and leads to autophagy activation. Here, we define a further regulatory level of starvation-induced autophagy. In this work, we show that nutrient deprivation is characterized by a rapid depletion of Acetyl CoA, a major integrator of the nutritional status at the crossroads of fat, sugar, and protein catabolism.Decrease in AcCoA is accompanied by the commensurate reduction in overall protein acetylation levels as well as by autophagy induction. Manipulations designed to increase or reduce cytosolic levels of AcCoA, either targeting mitochondrial synthesis or its transport in the cytoplasm, resulted in the suppression or induction of autophagy both in cultured cells and in mice tissues. Depletion of AcCoA directly impacts on the activity of cellular KATs, which use AcCoA as substrate for acetylating proteins. We showed that a drop in AcCoA specifically reduces the activity of EP300; this KAT was indeed required for the suppression of autophagy by high AcCoA levels, thus behaving as the sensor of cytosolic AcCoA levels. In turn, EP300 controls autophagy by inhibiting key autophagic proteins. Altogether, our results indicate that cytosolic AcCoA functions as a central metabolic regulator of autophagy, thus delineating AcCoA-centered pharmacological strategies that allow for the therapeutic manipulation of autophagy. Indeed, nutrient deprivation and caloric restriction are known to play pro-healthy and longevity promoting effects. Nonetheless, CR-based strategies are hardly suitable in clinical settings. Here, we propose a new biochemical definition of Caloric Restriction Mimetics, compounds that mimic the positive effects of nutrient starvation. In our setting, a CRM is a compound able to reduce protein acetylation through distinct but convergent mechanisms: first, by decreasing AcCoA levels, second by directly inhibiting KATs, third by the activation of protein deacetylases. This results in the execution of a cellular program ultimately leading to CR-related pro-healthy effects, including but not limited to autophagy.

Une partie conséquente de mon travail a été d'effectuer un crible génétique en utilisant une bibliothèque de mutants générés par insertion aléatoire de Tn5-Sm, un minitransposon bactérien. Le crible a été réalisé dans un contexte défini: celui de mouches-hôtes auxquelles manquait le gène Eater, lequel code un récepteur de phagocytose (Kocks et al., 2005). Dans ces mouches, l'infection n'est plus contrôlée dans l'hémocoele par les hémocytes et les drosophiles mutantes succombent rapidement à une bactériémie. Plusieurs phénotypes bactériens étaient attendus à l'issue de ce crible. Une première catégorie de phénotype prévisible était une virulence accrue, par exemple si les bactéries mutantes devenaientcapables de traverser plus rapidement ou efficacement la barrière intestinale conséquemment à la perte d'un régulateur négatif. Un deuxième type de phénotype attendu était une virulence atténuée pouvant s'expliquer de plusieurs manières: 1- perte de résistance à l'environnement existant dans le lumen intestinal (enzymes digestives et lysozyme, radicaux libres et peptides antimicrobiens induits au niveau de l'épithélium intestinal dans le cadre d'une réponse immunitaire locale de l'hôte); 2- incapacité à traverser la matrice péritrophique; 3-incapacité à envahir les cellules épithéliales (adhésion, pénétration); 4- incapacité à résister aux défenses intracellulaires potentielles; 5- incapacité à sortir du côté basal des entérocytes 6- incapacité à proliférer dans l'hémolymphe ou perte de la résistance à l'action de la réponse immunitairesystémique qui est, quant à elle, fortement induite en l'absence de phagocytose, laquelle empêche chez les mouches sauvages la prolifération des bactéries ayant traversé la paroi intestinale. [...] Dans le cadre d'une infection intestinale, les mouches sauvages (et imd) succombaient en six jours alors que, de manière surprenante, les mouches mutantes de la voie Toll périssaient plus lentement, une situation opposée à celle du modèle de la piqûre septique. Quelques bactéries sont capables de traverser la paroi intestinale mais sont incapables de proliférer à moins que la réponse cellulaire ait été préalablement bloquée. L'épithélium intestinal apparaissait normal à la dissection et la presque totalité des bactéries ingérées étaient tuées dans l'intestin. Après avoir exclu l'hypothèse d'une toxine sécrétée dans le surnageant des bactéries adsorbées sur le filtre sur lequel viennent se nourrir les mouches, nous avons testé l'hypothèse qu'une suractivation de la réponse immunitaire était à l'origine du décès des mouches. La génétique mettant hors de cause les peptides antimicrobiens, la voie Toll n'étant apparemment pas activée dans l'épithélium intestinal, nous avons alors étudié laréponse oxydative induite par l'ingestion de bactéries (Ha et al., 2009), laquelle est capable de tuer les mouches lorsqu'elle n'est pas régulée correctement. Là-aussi, le résultat s'est avéré négatif. En fin de compte, j'ai pu établir que la mort des mouches était due à un état de famine, confirmé par des mesures des réserves métaboliques. Mes travaux ont permis d'établir un nouveau rôle de la voie Toll dans la résistance à la famine, en présence ou absence d'infection, qui sera peut-être à mettre en relation avec un rôle métabolique de la voie Toll consistant à bloquer la voie de réponse à l'insuline lors d'une infection. En conclusion, mes travaux permettent de mieux comprendre les relations hôte-pathogènequi s'établissent lors d'une infection intestinale. / For the systematic study of bacteri al virulence factors, we initially planned to screen the 12,000 mutant strains of the miniTn5-Sm tranposon-induced mutant bank in a wild-type S. marcescens strain Db10. Phagocytosis-deficient eater mutant flies (Kocks et al., 2005) were used in this screen to isolate the bacterial strains mutated for virulence factors and the genes responsible for crossing the gut barrier. In the eater mutant background, flies succumb to septicemia caused by the rapid proliferation of the bacteria in the hemolymph. Out of 1348 mutant strains screened, 58 candidate mutants have been isolated. Only 20% percent of the potential mutant strains displayed an increased virulence indicating that there are very few factor(s) that negatively control the virulence program of the bacterium. The fly survival phenotypes induced by the candidate mutants isolated in the first round of screen were retested. Only those bacterial strains that were consistent with the phenotype were chosen for the molecular identification of the transposon insertion sites using one primer PCR (Karlyshev et al., 2000). Once the genes impaired in each case had been identified, they were knocked off in the S. marcescens Db10 by site specific plasmid insertion mutagenesis. A mutant strain with the transposon inserted into the fliR gene, a component of the type III flagellar protein export system, exhibited attenuation of virulence. The plasmid insertionmutant strain generated to interrupt the gene fliR reproduced the fly survival phenotyp, indicating that the fliR gene is important for the virulence of S. marcescens. The fliR mutants are able to cross the peritrophic matrix, functionally similar to the human mucus. The bacteria were found in the vicinity of the epithelial cells but were not able to efficiently invade the intestinal epithelium as compared to the wild-type strain. Consequently lower titer of FliR mutants was found in the hemolymph. The inefficiency of the FliR mutants to invade cells was also confirmed in ex-vivo assay using insect cells.I thus demonstrated that the fliR gene which is important in the motility apparatus is also required by S. marcescens for the crossing of the epithelial barrier of D. melanogaster.[...]A strong oxidative response is triggered by D. melanogaster in the midgut against commensals and pathogens (Ha et al., 2009). In order to check whether the strong oxidative immune response is eventually killing the flies themselves, hydrogen peroxide was chemically neutralized in the midgut during the S. xylosus A. oral infection. No difference inthe fly survivals was observed with or without neutralization of the oxidative response indicating that over-production of reactive oxygen species (ROS) does not seem to be responsible for the fly death caused by a very low number of bacteria. Flies could efficiently survive to killed bacteria and filtered supernatant solution from overnight bacterial culture indicating that they do not die to the toxins released by the bacteria. Most surprisingly MyD88-, the Toll pathway-, mutant flies were surviving better to S. xylosus A. oral infection. A series of experiments lead us to the finding that the flies actually succumbed to starvation when orally infected with S. xylosus and that the MyD88 is required for the starvation susceptibility in microbiota-mediated manner. In conclusion my work has lead us to the better understanding of the host-bacterial interactions in the intestine.

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Min utgångshypotes var att en minskad köttkonsumtion ger en minskad boskapsuppfödning. En boskapsuppfödning som idag tar i anspråk ca 70 procent av all jordbruksmark och 40 procent av den globala spannmålsproduktionen. Tanken var att en minskad boskapsuppfödning skulle bidra till en ökad tillgång på spannmål för människor och därmed en minskad svält. Men sambandet mellan svält och jordens resurser var inte så enkelt som jag hade förespeglat mig. Maktkoncentrationen som återfinns i matens distributionsled visade sig ha satt spelreglerna om tillgång och efterfrågan mer eller mindre ur spel. En ökad tillgång på mat genom en minskad köttkonsumtion och bättre resurshantering verkar därför inte påverka fattigdom och svält nämnvärt. Den nuvarande världshandeln visade sig också vara en bidragande orsak till fattigdom och svält då mat från nord, producerad med hjälp av statliga subventioner, konkurrerar ut lokalproducenter i syd. Den avgörande faktorn tycks vara människors tillgång på pengar. Inga pengar, ingen mat oavsett om maten finns i överflöd eller inte. Mina efterforskningar tyder på att de viktigaste faktorerna för att minska världssvälten är en förändring av den globala handeln för att därigenom öka de utsattas tillgång på kapital och självförsörjningsgrad samt en diskussion om vilket politiskt och ekonomiskt system som krävs för det.

La picoalgue verte marine Ostreococcus tauri est un eucaryote minimal développé en système modèle et qui a servi de ressource de gènes en biologie des lipides. Des informations détaillées sur ces caractéristiques lipidiques étaient cependant manquantes. Lors de ma thèse j’ai caractérisé le glycérolipidome d’O. tauri et ai cherché à déterminer quelles sont les cibles enzymatiques responsables de la dynamique des acides gras (FA) et de la régulation du métabolisme lipidique en réponse à des modifications de l’environnement (carences nutritives et refroidissement). O. tauri présente des caractéristiques uniques de composition en lipides et en FA mixtes entre les algues vertes et les Chromalveolates, et a été validé comme espèce modèle pour la classe des Mamiellophyceae. L’acide docosahexaénoïque (DHA) est confiné dans les lipides présumés extraplastidiaux : le phosphatidyldimethylpropanethiol (PDPT) et le bétaïne-lipide diacylglyceryl-hydroxymethyl-trimethyl-β-alanine (DGTA), tous deux marqueurs lipidiques des Chromalveolates. Les lipides plastidiaux de type procaryotique sont caractérisés par une prépondérance de FA polyinsaturés (PUFA) en C18 n-3, le 18:5 n-3 étant restreint aux galactolipides. Le 16:4 n-3, PUFA typique des galactolipides des microalgues vertes, est également un composant majoritaire des lipides extraplastidiaux chez O. tauri. Les triacylglycérols (TAG) présentent tout le panel d’acides gras d’O. tauri et leurs combinaisons moléculaires indiquent une origine plastidiale majoritaire. La carence azote provoque une forte accumulation de TAG, notamment des espèces présentant des combinaisons sn-1/sn-2 en 18:X/16:X et s'accompagne d'un transfert de carbone du phosphatidylglycérol (PG) et du monogalactosyldiacylglycérol (MGDG) aux TAG ce qui indique une contribution croissante de la voie plastidiale à la synthèse des TAG. Des expériences préliminaires de RT-qPCR sur des gènes du métabolisme des TAG révèlent une forte activation transcriptionnelle de certaines diacylglycérol acyltransférases (DAGT). Les carences nutritives répriment sévèrement l’activité Δ6 désaturase, générant une inversion du ratio 18:3/18:4 dans les lipides plastidiaux qui se répercute dans les TAG. La régulation fine et dynamique de ce ratio suggère un rôle important du 18:3 et du 18:4 dans les membranes plastidiales. Le refroidissement engendre une augmentation spécifique du 18:5 des galactolipides. La recherche active de la désaturase responsable de ce phénotype par une approche d'expression de gènes candidats en systèmes homologue et hétérologues (S. cerevisiae, N. Benthamiana) a conduit à l’indentification de deux Δ6 désaturases plastidiales jamais caractérisées dans d'autres systèmes. Celles-ci possèdent des spécificités non redondantes et originales entre elles et par rapport à l'acyl-CoA-Δ6 d'O. tauri. / The marine green picoalga Ostreococcus tauri is a minimal eukaryote implemented as model system that has been used as gene resource for lipid biology. Detailed information about its lipidic features was however missing. During my PhD, I characterized O. tauri glycerolipidome and associated dynamics under environmental stresses such as nutrient starvations and chilling and investigated transcriptional variations of putative target enzymes responsible for these changes. O. tauri which could be validated as model for related species of the class Mamiellophyceae, was found to display unique lipidic features related to both green and Chromalveolates microalgae. Docosahexaenoic acid (DHA) is confined to presumed extraplastidial lipids i.e. phosphatidyldimethylpropanethiol (PDPT) and the betaine lipid diacylglyceryl-hydroxymethyl-trimethyl-β-alanine (DGTA); all of these compounds are hallmarks of Chromalveolates. Plastidial lipids found to be of prokaryotic type are characterized by the overwhelming presence of C18 n-3 polyunsaturated FA (PUFA), 18:5 n-3 being restricted to galactolipids. C16:4 n-3, an FA typical of green microalgae galactolipids, also was a major component of O. tauri extraplastidial lipids. Triacylglycerols (TAGs) display the complete panel of FAs, and their molecular combinations designate a major plastidial origin of DAG precursors. Nitrate starvation greatly increases TAG content, in particular 18:X/16:X (sn-1/sn-2) combinations, and was associated with the transfer of carbon from phosphatidylglycerol (PG) and monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) to TAG indicating an increased contribution of the plastidial pathway to the TAG synthesis. Preliminary RT-qPCR experiments on TAG metabolism genes revealed an important transcriptional activation of some diacylglycerol acyltransferases (DGAT). Nutrient starvations severely repress Δ6 desaturase activity and result in the inversion of the 18:3/18:4 ratio in plastidial lipids that was feedback into TAG. The fine-tuning and dynamic regulation of the 18:3/18:4 ratio suggests an important physiological role of these FAs in photosynthetic membranes. Chilling generates an increase of 18:5 in galactolipids. The active quest for the desaturases responsible for this phenotype was achieved by expressing candidate genes in homologuous and heterologous (S. cerevisiae, N. Benthamiana) systems and led to the identification of two yet uncharacterized plastidial Δ6 desaturases. These desaturases display original and non-redundant specificity between each other and with the previously characterized in O. tauri Δ6 acyl-CoA desaturase.