Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-11-24T17:17:11Z No. of bitstreams: 1 Ana Paula Menezes.Colonização...pdf: 2951203 bytes, checksum: 9bb7bf3f9b13f1072a22b34565226bf2 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-24T17:17:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Paula Menezes.Colonização...pdf: 2951203 bytes, checksum: 9bb7bf3f9b13f1072a22b34565226bf2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Streptococcus pneumoniae é um dos agentes etiológicos mais importantes em infecções adquiridas na comunidade. Este patógeno coloniza o trato respiratório de indivíduos saudáveis, apresentando maior prevalência entre 1 e 2 anos de idade (aproximadamente 50%) e depois diminui com a idade adulta (aproximadamente 10%). A alta incidência das doenças pneumocócicas e a crescente resistência aos antimicrobianos, favoreceu a introdução das vacinas conjugadas (ano de 2000). Após a introdução das vacinas conjugadas foi observado à queda na incidência da doença pneumocócica e diminuição da prevalência de colonização por sorotipos vacinais. Em contrapartida vem sendo notado o aumento de casos de doença sorotipos não vacinais. Por isso a importância de verificar a dinâmica da colonização nasofaringeana por pneumococos em crianças < 5 anos de idade antes da introdução da vacina. Foram selecionadas radomicamente 203 crianças residentes da comunidade de Pau da Lima, Salvador, Bahia, das quais foi colhido a amostra nasofaringeana em quatro períodos durante um ano com intervalo de três a quatro meses entre cada coleta. No período de janeiro de 2008 a janeiro de 2009 foram colhidos um total de 721 swabs, sendo 398 positivos para pneumococos (56%). Os fatores de risco associados a colonização foram: aglomeração, contato com crianças menores de 2 anos de idade e presença de ITRS. Os sorotipos vacinais mais prevalentes foram o 6A/B, 19F, 14, 23F e 18. O sorotipo 19F foi o segundo mais prevalente e associado com a não susceptibilidade à penicilina. Dezesseis isolados do sorotipo 19F foram não tipáveis (NT) pelo método de multiplex PCR; sendo identificados apenas quando submetidos a reação de Quellung. Por isso, foi desenvolvido um novo primer para identificação deste sorotipo. Entre os sorotipos não vacinais os mais prevalentes foram o 16F, 15B/C, 6C e 34. A não susceptibilidade a penicilina e TMP/SMX foi de 38,5% e 58,0%, respectivamente. Pode-se observar que 91% dessas crianças estiveram colonizadas pelo menos uma vez durante o seguimento e que sorotipos não vacinais (34 e 15B/C) persistiram colonizando a mesma criança em mais de uma coleta. Ao longo do estudo, clones internacionais foram identificados na comunidade como o “Spain9V-3” (ST 156) e “Portugal 19F-21” (ST 177), relacionados com a não susceptibilidade a penicilina. O monitoramento da dinâmica da colonização pós-vacina é importante para a adequação da prevenção na era das vacinas conjugadas com limitado número de sorotipos. / Streptococcus pneumoniae is one of the most important etiologic agents in community-acquired infections. This pathogen colonizes the respiratory tract of healthy individuals shortly after birth, with higher prevalence of between 1 and 2 years of age (approximately 50%) and then decreases with age reaching adult rates below 10%. The high incidence and increasing antimicrobial resistance, favored the introduction of conjugate vaccines in 2000. After the introduction of conjugate vaccines a decreasing incidence of pneumococcal disease and carriage rates by vaccine serotypes was observed. In contrast we observe an increase in number of cases of disease and carriage by non-vaccine serotypes. Thus, this study aims to determine the dynamics of nasopharyngeal colonization by pneumococci in children <5 years of age after introduced the conjugate vaccine. A total of 203 children were random selected at the community of Pau da Lima in Salvador, Bahia, of whom the nasopharyngeal swab was collected in four periods with interval of 3 to 4 months between each collection. A total of 721 swabs were collected from January 2008 to January 2009, with 398 positive for pneumococci (56%). Risk factors associated with colonization were: crowding, contact with children lower than 2 years old and the presence of URTI. and The most prevalent vaccine serotype were 6A / B, 19F, 14; 23F and 18. The serotype 19F was the second most prevalent and associated with non-susceptibility to penicillin. Sixteen isolates of serotype 19F were nontypeable (NT) by the method of multiplex PCR; being identified only when submitted to Quellung reaction. Therefore, we developed a new primer to identify this serotype. The most prevalent non-vaccine serotypes were 16F, 15B / C, 6C and 34. The non-susceptibility to penicillin and TMP / SMX was 38.5% and 58.0%, respectively. It can be seen that 91% of the children were colonized at least once during follow-up and non-vaccine serotypes (34 and 15B / C) persisted colonizing the same child on more the one collection. Throughout the study, international clones were identified circulating at this community as the Spain9V-3 (ST 156) and Portugal 19F-21 (ST 177), all related with non-susceptibility to penicillin. The monitoring of the dynamics of post-vaccine colonization is important for the adequacy of prevention in the era of conjugated vaccines with limited repertoire of serotypes.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-03-22T18:32:18Z No. of bitstreams: 1 Milena Soares dos Santos Efeito....docx: 5951904 bytes, checksum: d28e49e9a6c37cb463504bb5cf122c6f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-03-22T18:32:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Milena Soares dos Santos Efeito....docx: 5951904 bytes, checksum: d28e49e9a6c37cb463504bb5cf122c6f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T18:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milena Soares dos Santos Efeito....docx: 5951904 bytes, checksum: d28e49e9a6c37cb463504bb5cf122c6f (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Streptococcus pneumoniae é uma bactéria patogênica que afeta crianças e idosos em todo o mundo, sendo responsável por elevada morbidade e mortalidade, especialmente nos países em desenvolvimento onde o acesso às vacinas pneumocócicas conjugadas (PCVs) é limitado. A colonização da nasofaringe precede o desenvolvimento de infecções e as crianças são o principal reservatório deste patógeno na comunidade. As vacinas pneumocócicas conjugadas reduzem a taxa de colonização e de doenças causadas por sorotipos vacinais, entretanto, pouco se sabe sobre seu efeito em eventos na substituição de sorotipos. Os objetivos deste estudo foram determinar o efeito da vacina pneumocócica conjugada 10-valente (PCV10) na colonização nasofaríngea por pneumococos em crianças menores que um ano, saudáveis e que apresentaram doença crônica ou desordem imunológica nos períodos pré- e pós esquema vacinal primário entre maio de 2011 a janeiro de 2014 e determinar a influência desta vacina na distribuição de sorotipos, da susceptibilidade antimicrobiana e do perfil genotípico dos pneumococos. Foram investigadas 168 crianças, sendo 63 do grupo de portadores de doenças clínicas (Grupo I) e 105 do grupo de crianças sadias (Grupo II). O isolamento, a identificação e a avaliação da resistência antimicrobiana do pneumococo foram realizados através de técnicas microbiológicas convencionais. A determinação dos sorotipos capsulares foi realizada através das técnicas de reação de polimerase em cadeia multiplex e reação de Quellung. A taxa de colonização pneumocócica total foi de 24%, sendo 17% (11/63) e 28% (29/105) para os grupos I e II, respectivamente. Convívio com crianças menores que 6 anos no mesmo domicílio mostrou associação com colonização para o grupo I [OR= 8,36 (IC95%= 1,69-44,70); p=0.004 enquanto que renda foi associada a risco para crianças do grupo II [(OR=3,22; IC95%= 1,22-8,64; p=0,01]. Os sorogrupos/tipos identificados com maior frequência foram: 23F (10%), 19F e 15B/15C (7,5%) e cepas não tipáveis (15%), Após a 3 ª dose da vacina houve uma redução de 7% para 5% na taxa de colonização por sorotipos vacinais e um aumento de três vezes na probabilidade de colonização por sorotipos não vacinais (7% para 21%). Identificamos 17% de não susceptibilidade à penicilina. Os sorotipos PCV10 associados com um ST foram os sorotipos 19F (ST177) e 23F (ST338) e os não associados a PCV10 foram os seguintes: 11A/11D (ST62 e ST408), 15A/15F (ST73), 15B/15C (ST766), 23A (ST42) e 23B (ST727). Os resultados demonstram que três doses da PCV10 reduzem ou estabilizam a colonização por sorotipos vacinais, a despeito da colonização pelos sorogrupos/tipos vacinais 6A/6B, 14 e 23F e destaca-se a colonização por sorotipos não vacinais (6C<7C<13<23A<23B<15A/15F<15B/15C<11A/11D) e cepas não tipáveis, independente do grupo de crianças avaliadas. Embora não tenha sido avaliado o efeito da PCV10 após a 4ª dose da vacina neste estudo, ressaltamos a importância da manutenção da dose de reforço no calendário vacinal do programa nacional de imunizações para que a proteção contra os sorotipos oferecida pela vacina seja alcançada. Estudos epidemiológicos devem continuar para monitorar a taxa de colonização de pneumococos circulantes no período pós-vacinal, bem como as taxas de não susceptibilidade aos antimicrobianos que são essenciais para o direcionamento das estratégias de saúde pública no manejo clínico e prevenção das doenças pneumocócicas. / Streptococcus pneumoniae is a pathogenic bacterium that affects children and elderly throughout the world, accounting for high morbidity and mortality, especially in developing countries where acess to pneumococcal conjugate vaccines (PCVs) is limited. Nasopharyngeal colonization precedes the development of infections and children are the main reservoir of this pathogen in the community. The pneumococcal conjugate vaccine has been effective in reducing colonization and disease by vaccine serotypes, however, little is known about its effect on the overall rate of colonization due to serotypes replacement events. The study aims to evaluate the effect of pneumococcal conjugate vaccine on nasopharyngeal carriage in children younger than one years old, healthy, suffering from crhonic diseases or immune disorders during vaccine primary immunization with PCV-10 between may 2011 and jaanuary 2014 and the influence of this vaccine in the distribution of serotypes, antimicrobial susceptibility and genotypic profile of pneumococcus. A total of 168 children were enrolled, 63 with chronic diseases (Group I) and 105 of the group of healthy children (Group II). The isolation, identification and evaluation of antimicrobial resistance of pneumococci were made using conventional microbiological techniques. The determination of capsular serotypes was performed using the multiplex-PCR and/or Quellung reaction. Overal, the pneumococcal colonization rate was 24%, being 17% (11/63) and 28% (29/105) to group I and II, respectively. Living with children aged up to six 6 years in the same household was associated with colonization in group I[OR= 8,36 (CI95%= 1,69-44,70); p=0.004] and income was associated with risk for children in group II [(OR=3,22; IC95%= 1,22-8,64; p=0,01]. The most frequently serotypes identified were: 23F (10%), 15B/15C (7,5%) and nontypeable strains (15%). A total of 28% (11/40) of serotypes identified in both groups are represented in PCV10. After the 3rd dose of vaccine was reduced from 7% to 5% in vaccine serotypes colonization rate and a three-fold increase in the probability of colonization by serotypes not represented in the PCV-10 (7% to 21%). Penicillin nonsusceptibility was identified in 17% of the isolates. PCV10 serotypes associated with a ST serotypes were 19F (ST177) and 23F (ST338) and not associated with PCV10 were 11A/11D (ST62 and ST408), 15A/15F (ST73), 15B/15C (ST766), 23A (ST42) and 23B (ST727). The results demonstrate that three doses of PCV10 stabilizes or reduces colonization by the vaccine serotypes, regardless of colonization by vaccines types 6A/6B, 14 and 23F and highlight the rates of colonization by non vaccine serotypes (6C<7C<13<23A<23B<15A/15F<15B/15C<11A/11D) and nontypeable pneumococcal, independent of the study group. Although this study was not evaluated the effect of PCV10 after the 4th dose of the vaccine, we emphasize the importance of booster dose of maintenance in the immunization schedule of the national immunization program for the protection offered by the vaccine serotypes is achieved. Epidemiological studies should continue to monitor the rate of colonization of pneumococci circulating in the post-vaccine period and antimicrobial non-susceptibility rates that are essential for the targeting of public health strategies in the clinical management and prevention of pneumococcal diseases.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus pneumoniae é um importante agente etiológico de infecções invasivas e não invasivas, incluindo meningite, pneumonia e otite média. A cápsula polissacarídica é o principal fator de virulência desse microrganismo, sendo também considerada um importante marcador em estudos epidemiológicos. Dentre os mais de 90 tipos capsulares conhecidos, o sorotipo 14 se destaca pela prevalência elevada em várias regiões, inclusive no Brasil. A avaliação da diversidade genética desse microrganismo também inclui a aplicação de métodos moleculares, como PFGE e MLST. Entretanto, essas metodologias são relativamente onerosas, consomem muito tempo e os resultados obtidos com a técnica de PFGE são de difícil comparação entre diferentes laboratórios. A técnica de análise do polimorfismo numérico de segmentos repetitivos em múltiplos loci [MLVA, do inglês Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis] se apresenta como uma alternativa, embora ainda necessite de padronização e avaliação mais ampla para a espécie em questão. No presente estudo, 60 amostras de Streptococcus pneumoniae pertencentes ao sorotipo 14, isoladas de diversas fontes clínicas, em diferentes locais e períodos de tempo, foram caracterizadas pelas técnicas de MLVA (baseada na análise de 18 loci distintos), MLST, PFGE e tipagem do gene pspA. O gene pspA2 predominou entre as amostras analisadas, seguido pelo gene pspA1. Os tipos de MLVA, perfis de PFGE, e STs encontrados apresentaram resultados, em geral, concordantes, indicando o elevado poder discriminatório da versão da técnica de MLVA empregada. Cinco complexos clonais (CC) de MLVA e cinco singletons puderam ser definidos. O CC de MLVA denominado de L7 foi o predominante, compreendendo 36,7% da amostragem estudada. O CC L7 mostrou-se relacionado com genes pspA da família 2, com o CC1 de MLST, com o CC Pen14-H de PFGE, e com a não susceptibilidade à penicilina, Entre os complexos clonais de MLST, o CC1 foi o prevalente e incluiu predominantemente o ST156, pertencente ao clone internacional Spain9V-3. O CC L3 e o singleton L17 de MLVA apresentaram-se associados ao CC de PFGE Eri14-A, a família 1 de PspA e ao CC2 de MLST, que por sua vez também estava relacionado com o clone internacional England14-9. O CC L15 de MLVA esteve associado ao CC de PFGE Pen14-A, ao gene pspA2, aos CC3 e CC4 de MLST e ao clone internacional do PMEN Tennessee14-18. A técnica de MLVA revelou-se significativamente mais discriminatória que as técnicas de PFGE e MLST, conforme exemplificado pela detecção de 21 perfis de MLVA, 13 perfis de PFGE e cinco STs, entre as 22 amostras pertencentes ao CC de MLVA L7. Uma versão de MLVA, compreendendo um painel com os oito loci de maior poder discriminatório, pôde ser proposta a partir da análise dos resultados obtidos. Estes aspectos, aliados ao menor tempo e custo de execução, indicam que a técnica de MLVA constitui uma alternativa importante e satisfatória para uso em estudos sobre a diversidade genética de S. pneumoniae. / Streptococcus pneumoniae is a major pathogen causing invasive and non-invasive diseases in humans, including meningitis, pneumonia and otitis media. The polysaccharide capsule of this microorganism is considered a major virulence factor and an important marker for epidemiological studies. More than 90 pneumococcal capsular serotypes are recognized, and serotype 14 is highly prevalent in many regions, including Brazil. Genotyping methods, such as PFGE and MLST, are essential to evaluate genetic diversity of this bacterium. However, these methods are expensive, time-consuming and results from different laboratories are difficult to compare. Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis (MLVA) appears as an alternative, despite the fact that standardization and wide evaluation for application to this species is still required. In the present study, a total of 60 S. pneumoniae isolates belonging to serotype 14, isolated from different sources, regions and periods of time, were analyzed by MLVA (based on the analysis of 18 distinct loci), MLST, PFGE and pspA typing methods. Gene pspA2 was the predominant, followed by pspA1. Overall, the results of PFGE, MLST and MLVA typing were congruent, and indicated the discriminatory power of the MLVA method used. Five clonal complexes (CC) and five singletons were identified by MLVA. CC L7 was the predominant MLVA CC, comprising 36.7% of all the isolates. L7 was associated with pspA2 gene and non-susceptibility to penicillin, and it was related to MLST CC1, and to PFGE Pen14-H. CC1 was the prevalent MLST CC and included mostly ST156 that belongs to international clone (IC) Spain9V-3. Another MLVA CC, named L3, and the singleton L17 were related to PFGE CC Eri14-A, MLST CC2, and IC England14-9. MLVA CC L15 was related to PFGE Pen14-A, MLST CC3 and CC4, and IC Tennessee14-18. MLVA was found to be more discriminatory than PFGE and MLST, as exemplified by detection of 21 MLVA types, 13 PFGE profiles and 5 STs among the 22 strains belonging to L7, the predominant MLVA CC. A modified version of the MLVA method, based on the analysis of 8 loci only, is proposed. This aspect, in conjunction with reducing time and costs, indicate that MLVA represents an important and satisfactory alternative method to evaluate the genetic diversity of S. pneumoniae.

S. pneumoniae coloniza a nasofaringe e é um dos principais agente de otite média, pneumonia, bacteremia e meningite com altas taxas de morbidade e mortalidade. Estima-se que 1,6 milhões de pessoas morram de doença pneumocócica por ano, a maioria crianças menores de cinco anos de idade, principalmente em países em desenvolvimento. A cápsula polissarídica antifagocitária é o principal fator de virulência deste microrganismo e determina os 93 sorotipos conhecidos, sendo o alvo de vacinas pneumocócicas. No presente trabalho foi padronizada a tipagem molecular por Multiplex PCR de S. pneumoniae, que compreende 30 pares de iniciadores agrupados em seis reações sequenciais. Foram tipadas 270 cepas de pneumococo isoladas entre janeiro de 2005 a setembro de 2011, proveniente de líquor (13%), sangue (76%) e líquido pleural (11%) de 232 pacientes atendidos no Hospital Universitário da USP. Além disso, a caraterização dessas amostras quanto ao perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e à diversidade foi realizada, segundo o CLSI 2011 e a genotipagem molecular pelas técnicas de Multilocus Sequencie Typing Scheme (MLST) e Pulsed Field Eletrophoresis Gel (PFGE), respectivamente. A tipagem por Multiplex PCR detectou 24 sorotipos/sorogrupos diferentes, que foram: 14 (22%), 5 (12%), 12F/A (11%), 6A/B/C (10%), 7F/A (5%), 1 (4%), 3 (4%), 10A (4%), 19A (4%), 18 A/B/C/F (3%), 4 (3%), 8 (3%), 23F (3%), 19F (3%) e outros (9%) (9V/A, 9N/L, 15A, 22F, 11A/D, 31, 38, 34, 16F, 17F e não tipável). Este método apresentou 100% de especificidade e 98% de sensibilidade para determinação de sorogrupos e 66% para sorotipos. Os sorotipos 14, 6B, 5 e 19F foram significativamente mais comuns em criança até dois anos, já entre adultos, os sorotipos 5 e 12F foram os predominantes. O perfil de sensibilidade em infecções não meníngeas foi de 99% de sensibilidade e 1% de resistência intermediária para penicilina e ceftriaxona. Para infecções meníngeas os resultados mostraram 73% de sensibilidade e 27% de resistência para penicilina e 88% de sensibilidade e 12% de resistência intermediária para ceftriaxona. A resistência aos beta-lactâmicos está ligada principalmente ao sorotipo 14 que foi o sorotipo mais isolado com 52 cepas e dessas foram realizados MLST e PFGE. No MLST encontramos 51 cepas pertencentes ao clone Spain9V-3 (ST 156) que é predominante na região sul e sudeste do Brasil e uma cepa com um tipo de sequência ainda não depositada. Pela técnica de PFGE foram detectados três clusters e quatro amostras não relacionadas, o cluster A foi predominante com 41(79%) cepas com 81,7% de similaridade entre elas. A técnica de Multiplex PCR demonstrou ser excelente ferramenta para a detecção dos sorotipos/sorogrupos de S. pneumoniae. Não foi detectada resistência plena à penicilina e ceftriaxona em infecções não meníngeas consolidando a importância do uso da penicilina no tratamento da doença pneumocócica não meníngea. Houve grande similaridade genética entre cepas de S. pneumoniae sorotipo 14. / S.pneumoniae colonizes the nasopharynx and is a major agent of otitis media, pneumonia, bacteremia and meningitis with high morbidity and mortality. It is estimated that 1.6 million people die of pneumococcal disease every year, mostly children under five years old, mainly in developing countries. The antiphagocytic polissarídica capsule is the main virulence factor of this organism and determine the 93 serotypes known for being the target of pneumococcal vaccines. In the present study was standardized molecular typing by Multiplex PCR molecular typing, which comprises 30 primer pairs grouped into six sequential reactions. We performed antimicrobial susceptibility profile, according to the CLSI 2011 and the most frequent serotype was made by molecular genotyping techniques Multilocus Sequence Typing (MLST) and pulsed-field gel Eletrophoresis (PFGE). We studied 270 pneumococcal strains isolated from 2005 to September 2011, from CSF (13%), blood (76%) and pleural fluid (11%) of 232 patients attended at University Hospital of USP. Typing by Multiplex PCR detected 24 serotypes / serogroups different, which were: 14 (22%), 5 (12%), 12F / A (11%), 6A/B/C (10%), 7F / A (5 %), 1 (4%), 3 (4%), 10A (4%), 19A (4%), 18 A / B / C / F (3%), 4 (3%), 8 (3% ), 23F (3%), 19F (3%) and others (9%) (9V / A, 9N / L, 15A, 22F, 11A / D, 31, 38, 34, 16F, 17F and nontypable). This method showed 100% specificity and 98% sensitivity for the determination of 66% for serogroups and serotypes. Serotypes significantly more common in children under two years were: 14, 6B, 5 and 19F among adults serotypes 5 e12F were predominant. The sensitivity profile in non-meningeal infections was 99% sensitivity and 1% penicillin intermediate resistance to ceftriaxone. For meningeal infections the results showed 73% sensitivity and 27% resistance to penicillin and 88% sensitivity and 12% intermediate resistance to ceftriaxone. Resistance to beta-lactams is linked mainly to serotype 14 was the serotype most isolated, and of these 52 strains were performed MLST and PFGE. MLST found in 51 strains belonging to clone Spain9V-3 (ST 156) which is prevalent in south and southeastern Brazil and a strain with a type of sequence is not deposited. The technique of PFGE found three clusters and four non-related samples, cluster A predominated with 41 (79%) strains with 81.7% similarity between them. Multiplex PCR technique proved to be an excellent tool for the detection of serotypes/serogroups of S. pneumoniae. We did not detect full resistance to penicillin and ceftriaxone in non-meningeal infections showing the importance of use of penicillin in the treatment of pneumococcal non-meningeal disease. There was great genetic similarity among strains of S. pneumoniae serotype 14.

S. pneumoniae pode causar infecções do trato respiratório. Uma alternativa às vacinas conjugadas, que conferem proteção sorotipo-específica, seria uma vacina baseada em epitopos de diferentes variantes de antígenos como PspA e PspC. O objetivo deste trabalho foi a identificação de epitopos de variantes de PspA e PspC, utilizando a técnica peptide array, visando a síntese de um antígeno composto por múltiplos epitopos. Os resultados obtidos indicaram que anticorpos contra epitopos lineares de PspA reconhecem as regiões inicial N-terminal e rica em prolinas, mas estes epitopos parecem ser apenas marcadores de exposição ao pneumococo e epitopos conformacionais seriam os de fato protetores, como observado nos experimentos realizados com os Frags de 100 aminoácidos construídos a partir do PspARx1, especialmente aqueles presentes nas regiões dos Frags 2 e 4. Epitopos lineares de PspC parecem ser importantes na região de ligação à sIgA e FH. Assim, uma vacina proteica de ampla cobertura, poderia conter as regiões do Frag 2 de PspA e de ligação de sIgA e FH de PspC. / S. pneumoniae can cause respiratory tract infections. An alternative to the conjugate vaccines, which confer serotype-specific protection, would be a vaccine based on epitopes of variants of antigens such as PspA and PspC. The objective of this study was to identify epitopes of variants of PspA and PspC, using the peptide array technique, aiming at the synthesis of a multi-epitope antigen. The results obtained with peptide arrays indicated that antibodies against linear epitopes of PspA recognize the initial N-terminal and proline-rich regions, but these epitopes seem to be only markers of exposure to pneumococcus and conformational epitopes would be in fact protective, as observed in the experiments with fragments of 100 amino acids constructed from PspARx1, especially those present in Frags 2 and 4. Linear epitopes of PspC seem to be important in the regions of sIgA and FH binding. Thus, a protein-based vaccine with broad coverage could contain the regions of Frag 2 of PspA and the regions of sIgA and FH binding of PspC.

As meningites bacterianas constituem um sério problema de Saúde Pública em todo mundo, por sua incidência, sua letalidade e pela frequência das sequelas que os sobreviventes apresentam. Os agentes etiológicos Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis e Streptococcus pneumoniae são responsáveis por cerca de 60 a 80 por cento dos casos. O presente estudo tem como objetivo conhecer o comportamento epidemiológico das meningites por H.influenzae, S. pneumoniae e por bacilos Gram-negativo, especialmente as enterobactérias 1 no Município de São Paulo no pertodo 1960- 77. O levantamento foi realizado por uma equipe formada por professores do Departamento de Medicina Social da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, por médicos sanitaristas e por acadêmicos de medicina. Os dados, colhidos diretamente do prontuário dos pacientes, foram anotados em uma ficha pré-codificada. A meningite por H.influenzae somente foi confirmada quando se identificava o agente na cultura. A confirmação da meningite por S.pneumoniae se dava pela bacterioscopia e/ou pela cultura do líquor. As meningites por bacilo Gram-negativo foram subdivididas em 3 grupos. No primeiro, incluíram-se os casos em que a bacterioscopia e/ou cultura revelaram a presença de um bacilo Gram-negativo sem, contudo, haver a especificação do agente. No segundo, classificaram-se os casos em que, na cultura, foi isolada uma bactéria do gênero Salmonella. O último grupo correspondeu áquele em que se identificou a presença de uma outra enterobactéria. Os subdistritos ou distritos do Municipio de São Paulo foram agrupados de 3 maneiras. As duas primeiras corresponderam às 3 ou 6 áreas homogêneas especificadas pela Fundação SEADE. A última se baseou na distibuição da população economicamente ativa segundo sua participação nos diferentes setores da economia. A população dos subdistritos e distritos do Município de São Paulo segundo faixa etária para os anos compreendidos no estudo foi estimada pelo método geométrico modificado. No período estudado foram confirmados 900 casos de meningite por H.influenzae com um coeficiente médio de 0,89 por 100000 habitantes. Os menores de 5 anos contribuíram com 91,2 por cento dos casos, dos quais 63 por cento eram em menores de um ano. O coeficiente médio para menores de um ano foi de 23,3 por 100000 habitantes. As zonas central, intermediária e periférica não apresentaram incidências significantemente diferentes. Os coeficientes de morbidade padronizados segundo idade foram 0,8, 0,8 e 0,9 para as zonas central, intermediária e periférica, respectivamente. A letalidade média no período de 1960-77 foi de 31 por cento . As crianças menores de um ano apresentaram a maior taxa de letalidade, 40 por cento . No período 1960-77 foram confirmados 1951 casos de meningite por S.pneumoniae com um coeficiente médio de 1,9 por 100000 habitantes. As crianças menores de 5 anos contribuíram com 52 por cento dos casos dos quais 38.5 por cento eram menores de um ano. Os coeficientes médio por 100000 habitantes, para os menores de um ano, foram 37,1 e 29,7 para 1960-69 e 1970-77, respectivamente. A incidência por 100000 habitantes na zona periférica (2,2) na primeira década foi, praticamente, o dobro da zona central, (1,2). Os coeficientes padronizados segundo idade foram 1,6, 1,5 e 2,0 para as zonas central, intermediária e periférica, respectivamente. No período seguinte estes valores foram 1,4, 1,5 e 2,0. A letalidade média no período foi de 44 por cento . Ela foi inversamente proporcional ao número de leucócitos no llquor de entrada. A letalidade na faixa etária menores de um ano foi de 60 por cento no período estudado. No período estudado foram identificados 290 casos de meningite por Salmonella dos quais 10 por cento o foram na primeira década. O coeficiente médio por 100000 habitantes foi de 0,3. A S.typhimurium foi a espécie mais frequente com 112 casos. Os menores de um ano contribuíram com 91 por cento dos casos, dos quais 52 por cento ocorreram no primeiro trimestre de vida. A incidência média por zona não mostrou diferencas estatisticamente significantes. A letalidade média foi de 87 por cento . Os menores de um ano apresentaram um valor ainda maior, 89 por cento . No período estudado foram identificados 211 casos de meningite por outras enterobactérias com um coeficiente médio de 0,2. A primeira década contribuiu com 32 por cento dos casos. Os gêneros Escherichia e Enterobacter foram os mais frequentes sendo responsáveis por 71 por cento dos casos. Os menores de um ano contribuiram com 57 por cento dos casos, com coeficiente de 4.0 e 4.5 para os períodos 1960-69 e 1970-77 respectivamente. A letalidade média foi de 65 por cento sendo o grupo etário maior de 60 anos o de maior letalidade. A incidência por zona não diferiu significantemente. A meningite por bacilo Gram-negativo apresentou um comportamento epidemiológico distinto da meningite por H.influenzae e das enterobactérias, revelando ser composto por uma miscelânea de agentes. No período de estudo foram identificados 25455 casos de meningite bacteriana, com coeficiente médio de 25 por 100000 habitantes. O coeficiente passaria a ser de 36 por 100000 habitantes se acrecentássemos as meningites bacterianas de etiologia indeterminada. Este índice representou 1 caso para 2782 habitantes. A meningite por N.meningitidis ocupou o primeiro lugar, com 84 por cento dos casos e um coeficiente médio de 21 por 100000. Na primeira década ocorreram 2657 casos, com um coeficiente médio de 5,4 por 100000 habitantes. As três principais etiologias foram responsáveis por 89 por cento dos casos. No octênio seguinte a meningite por meningococo foi responsável por 90 por cento dos casos. No ano de 1974, acme da epidemia de meningite meningocócica, foram identificados 18069 casos de meningite representando um coeficiente de 264 por 100000. Este valor representaria que 1 em cada 379 habitantes foi acometido pela doença naquele ano. / Bacterial meningitis is an intectious disease of major public health throughout the world because of its high incidence and case fatality rates and the permanent sequelae that are seen in the survivors. Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis and Streptococcus pneumoniae are the etiologic agents responsible for 60 to 80 per cent of cases. The purpose of this study is to better understand the epidemiology of meningitis caused by H. influenzae, S. pneumoniae and gram-negative bacilli, especially, the Enterobacteriaceae, in the city of São Paulo during the period 1960-77. The survey was performed by a group of professors from the Department of Social Medicine of the \"Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo\", public health physicians and medical students. Data were obtained directly from the patient\'s records and registered on a pre-coded form. Cases of H.influenzae meningitis were confirmed by culture while S.pneumoniae cases were confirmed by gram stain and/or culture of the cerebrospinal fluid (CSP). The cases of gram negative bacillary meningitis were divided into three groups. The first included the cases that were diagnosed by gram stain and culture; the second, the cases where salmonella species were isolated in the culture: and the third, the cases where the presence of other Enterobacteriaceae were identified. The districts of the city of São Paulo were grouped in three ways: two corresponding to the homogenous areas specified by the \"Fundação SEADE\", and the third one based on the distribution of the economically active population according to its participation in the different branches of economic activity. The population of São Paulo by districts included in the study was estimated by the modified geometric method. During the study, 900 cases ot H. influenzae meningitis were confirmed, giving an average rate ot 0.89 cases per 100,000 population. Children <5 years old represented 91 per cent ot the cases, 63 per cent of them being less than one year old . The average rate for children <1 year old was 23.3 cases per 10O,OOO population. The average case fatality rate for the period 1960-77 was 31 per cent . The hightest case fatality rate ocurred in children <1 year old and was 40 per cent . The central, intermediate and peripheria zones didn\'t show significant different rates of incidence. The age standartized morbidity rates for these zones were, respectively, 0.8, 0.8 and 0.9. During 1960-77, 1,951 cases of S.pneumoniae meningitis were confirmed, giving an average rate of 1.9 per 100,000 population. Children <5 years old accounted for 52.4 per cent ot cases and 38.5 per cent were <l year old. The average rates for children <1 year of age were 37.1 and 29.7 per 100,000 population, for the periods of 1960-69 and 1970- 77, respectively. The incidence rate for the peripheria zone -2.2 per 100000 population- pratically doubled the rate for the central area- 1.2 per 100000 population- in the 1960\'s. The age standardized rates were 1.6, 1.5 and 2.0 tor central, intermediate, and peripheric zones, respectively. In the 1970\'s these rates were 1.4, 1.5 and 2.0. The average case fatality rate for the period was 46.9 per cent , which inversely proportional to the number ot CSF leucocytes at first examination. For children <1 year old, the case tatality rate was 60 per cent during the same period. Two hundred ninety cases of Salmonella meningitis were indentitied during the study, 10 per cent of them during the first decade. The average rate was 0.3 cases per 100,000 population. S. typhimurium was the most frequently isolated species, with 112 cases. Children <1 year old represented 91 per cent of the cases and 52 per cent ot these ocurred in children <3 months of age. The averages rates of incidence in the different zones didn\'t show statistically significant differences. The average case fatality rate was 87 per cent children <1 year old had a rate of 89 per cent . During the study period, 211 cases of meningites by other Enterobacteriaceae were indentified , giving an average rate of 0.2 per 100,000. Almost one-third of these cases ocurred in the first decade of the study period. The genus Escherichia and the genus Enterobacter were the most frequent, being responsible for 32 per cent of the cases. For children under one year 1 the rates were 4.0 and 4.5 for the periods of 1960-69 and 1970-77, respectively, representing 57 per cent of the total of cases. The average case fatality rate was 65 per cent , the hightest being among persons >60 years old. The rates of incidence by zone didn\'t show significant differences. The epidemiology of gram-negative bacillary meningitis was distinct from that of H.influenzae meningitis and meningitis due to the Enterobacteriaceae, giving evidence of being composed by a mixture of agents. In the same period, 25,455 cases of bacterial meningitis were identified, giving an average rate of 25 cases per 100,000 population. This rate would be 36.0 per 100,000 if we added the cases ot bacterial meningitis of unknown etiology. This represents one case per 2,782 inhabitants. N. meningitidis meningitis was the most frequent etiologic agent representing 84 per cent of the total, giving an average rate of 21 per 100,000. From 1960-69, 2,657 cases ocurred, giving an average rate of 5,4. The three principal etiologies were responsible for 89 per cent of cases. During the next eight years, 90 per cent of cases of meningitis were meningococcal. In year of 19/4, during the peak of the meningoccocal meningitis epidemic, 18,069 cases of meningitis were identified, representing a rate of 264 per 100,000. Put another way, 1 in 379 inhabitants developed menngitis.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T12:42:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amstalden_MariaCeciliaKrahenbuhl_M.pdf: 4328649 bytes, checksum: efc5c151f8382e97f2def6576eb633b6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestra em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

Doenças invasivas causadas por S. pneumoniae provocam cerca de 1,5 milhões de mortes anuais de crianças no mundo. Testes imunocromatográficos rápidos (dipsticks) são alternativa a métodos diagnósticos tradicionais, devido à fácil execução e baixo custo. Neste estudo foram desenvolvidos dipsticks para diagnóstico de S. pneumoniae utilizando: anticorpos de captura - monoclonais anti-pneumolisina recombinante (Ply) - AcMs D9-43 e E10-24, reativos contra 21 sorotipos prevalentes de S. pneumoniae; anticorpos de detecção (conjugados com diferentes partículas coloidais coloridas - corante têxtil, microesferas e nanopartículas de ouro) - Igs anti-Ply e anti-vacina pneumocócica celular (em desenvolvimento no Instituto Butantan) (anti-WCPV). Dipsticks com anti-Ply ou anti-WCPV conjugados com ouro ou microesferas coloidais detectaram a bactéria em todos os sorotipos prevalentes avaliados, entre 104 e 105 UFC/ml e pneumolisina nativa, em sobrenadantes de cultivo de S. pneumoniae, até uma concentração estimada 19,3 ng/ml e 9.7 ng/ml, respectivamente. Os resultados foram visualizados em aproximadamente 10 min. / Invasive diseases caused by S. pneumoniae are responsible for about 1.5 million child deaths per year worldwide. Rapid Immunochromatographic tests (dipsticks) are alternative to traditional diagnostic methods due to easy execution and low cost. In this study, dipsticks have been developed for diagnosis of S. pneumoniae using: capture antibodies - monoclonal anti- recombinant pneumolysin (Ply), MAbs D9 -43 and E10 - 24, reactive against 21 prevalent serotypes of S. pneumoniae; detection antibodies (conjugated with different colored colloidal particles - textile dye; microspheres and gold nanoparticles) - anti-Ply and anti whole cell pneumococcal vaccine (in developing in the Butantan Institute) (anti- WCPV). Dipsticks with anti-Ply or anti-WCPV conjugated with colloidal gold or microspheres detected the bacterium in all the evaluated prevalent serotypes, between 104 e 105 CFU/ml, and native pneumolysin in culture supernatants of S. pneumoniae to an estimated concentration 19.3 ng/ml and 9.7 ng/ml, respectively. The results could be visualized in around 10 min.

Streptococcus pneumoniae é um importante agente causador de pneumonia, meningite e septicemia. O alto custo e a cobertura limitada da vacina conjugada atual reforçam a necessidade de se desenvolver uma vacina mais abrangente e acessível. A proteína de superfície de pneumococo A (PspA) é imunogênica e protetora em modelos animais; porém, devido à sua diversidade - há 6 clados e 3 famílias de PspA - uma vacina baseada em PspA deverá incluir fragmentos das duas famílias prevalentes (1 e 2). Neste estudo, foram produzidos fragmentos contendo a região N-terminal de PspA das famílias 1 e 2, e proteínas híbridas - contendo fusões destes fragmentos. Os anticorpos gerados contra os híbridos reconheceram PspAs nativas das duas famílias, foram capazes de se ligar a bactérias íntegras, e de aumentar a deposição de complemento em sua superfície. Finalmente, a imunização de camundongos com os híbridos foi capaz de proteger contra desafio com pneumococos contendo PspAs diversas, mostrando que estes seriam candidatos promissores na composição de uma vacina anti-pneumocócica. / Streptococcus pneumoniae is an important cause of pneumonia, meningitis and septicaemia. The high cost and limited coverage of the available conjugate vaccine reinforce the need for cost effective strategies, with broader coverage. Pneumococcal Surface Protein A (PspA) is immunogenic and protective in animal models; however, due to its diversity - there are six clades and threee families of PspA - a PspA based vaccine should include fragments of each major family (1 and 2). In the present study, we have produced fragments of the N-terminal region of PspAs families 1 and 2, and hybrid proteins - containing fusions of these fragments. Sera made against the hybrids induced antibodies that recognized PspAs from both families; these sera were also able to bind pneumococcal strains bearing diverse PspAs, and to increase complement deposition on their surface. Finally, immunization of mice with PspA hybrids was protective against challenge with pneumococci bearing diverse PspAs, showing that these hybrids should constitute promising candidates in an anti-pneumococcal vaccine.

As infecções pneumocócicas são uma importante causa de morbi-mortalidade entre as crianças. Até 2000, era disponível apenas a vacina pneumocócica polissacarídica 23valente, de uso a partir dos 2 anos de idade. Essa vacina era recomendada para crianças com fibrose cística (FC) e para as asmáticas em uso de corticóide oral, dentre outras recomendações. A partir de 2000, licenciou-se a vacina pneumocócica conjugada 7valente, com grande impacto contra infecções causadas pelos sorotipos vacinais. Nos países onde as crianças não são universalmente vacinadas com essa vacina, as recomendações permanecem as mesmas. Atualmente, os adultos asmáticos estão incluídos nas recomendações para vacinação pneumocócica nos EUA. Há poucos estudos sobre o risco de doença pneumocócica em crianças asmáticas per si e naquelas com fibrose cística e sobre a resposta à vacina pneumocócica conjugada. Salienta-se que ainda não há um critério estabelecido para avaliar a resposta sorológica a essa vacina. Recentemente, foi sugerido o critério de 0,35mcg/ml por Elisa para se correlacionar com proteção para doença invasiva pneumocócica. Objetivou-se determinar a concentração dos anticorpos contra os sorotipos vacinais contidos na vacina pneumocócica conjugada 7valente em crianças com asma moderada em uso de corticóide inalatório e em crianças com fibrose cística; avaliando-as pelos critérios de 0,35mcg/ml, 1,3mcg/ml e aumento de 4 vezes o título pós em relação ao pré-vacinal, para cada sorotipo e para a vacina, considerando-se a positividade para 5 sorotipos. Foram avaliadas 18 crianças em cada grupo. A mediana da idade foi de 82,5m nas asmáticas e 69,5m naquelas com FC. Foi colhida amostra para sorologia pré-vacinação e outra após 2 doses da vacina conjugada. As concentrações de anticorpos para os sorotipos vacinais foram quantificadas pelo Elisa. Para 0,35mcg/ml de corte, a grande maioria nos dois grupos já era positiva à inclusão para os sorotipos vacinais e à vacina. Considerando-se o valor de 1,3mcg/ml, entre os que eram negativos, as crianças asmáticas responderam entre 66,7% (9V) e 100% (14), e as com FC, entre 50% (19F) e 100% (6B e 14); e, em relação à resposta vacinal para esse nível, as asmáticas apresentaram 81,8% de resposta, enquanto as com FC, 91,7%. Avaliando-se pelo aumento de 4 vezes o título pós em relação ao pré-vacinal, a melhor resposta aos sorotipos, nos asmáticos, foi de 33,3% (4, 6B, 14 e 18C), e a nos com FC, 61,1% para o 6B; em termos de resposta vacinal, obteve-se 16,7% e 44,4%, para as asmáticas e aquelas com FC, respectivamente. Não houve interferência da vacinação prévia com a vacina pneumocócica polissacarídica. As medianas dos títulos pós em relação aos pré-vacinais, para os sorotipos, nos dois grupos, apresentaram um aumento significante. Apesar de boa parte das crianças apresentarem uma positividade elevada à inclusão, aquelas que eram negativas tenderam a apresentar uma boa resposta à vacina. / Pneumococcal infections are an important morbi-mortality cause among children. Until 2000, it was only available the 23-valent polysaccharide pneumococcal vaccine for children over two years old. This vaccine was recommended for cystic fibrosis (CF) children and to asthmatics children in use of oral corticosteroids, among other recommendations. From 2000, it was licensed the 7-valent conjugated pneumococcal vaccine, with a great impact against the infections caused by the vaccine serotypes. In the countries that dont make a universally use of this vaccine for children, the recommendations remain the same. At the present time, asthmatic adults are included for the pneumococcal vaccine recommendations in the United States. There are few studies about pneumococcal disease risk with cystic fibrosis children and asthmatics, per si, and about the conjugated pneumococcal vaccine response. It points out that there are no a definitive criteria or evaluation established for the serology response for this vaccine. It was suggested, recently, that the level of 0,35mcg/ml, measured by ELISA, is adequate to correlate with the invasive pneumococcal disease protection. The goal of this study was to determine the antibodies concentration of the seven vaccine serotypes from 7-valent conjugated pneumococcal vaccine among children with moderate asthma in use of inhaled corticosteroids and with cystic fibrosis. It was considered the dosage 0,35mcg/ml and 1,3mcg/ml levels and the four-fold increase between pre- and post-immunization concentrations levels, to each serotype and to the vaccine (positivity for five serotypes or more) for positivity. Eighteen children were included in each study group. The age median was 82,5 months for the asthmatics and 69,5 months for the CF children. A blood sample was taken for pre-immunization serology and a second one after the second vaccine dose was given. The antibodies concentrations for the vaccine serotypes were measured by ELISA. Considering the 0,35mcg/ml levels, the majority of children, in both groups, was positive for vaccine serotypes and for the vaccine as well in the beginning. At the 1,3mcg/ml level, among the children with negative serology, asthmatic children responded between 66,7% (9V) and 100% (14), and those with CF, between 50% (19F) and 100% (6B e 14). Related to the vaccine response for this level, the asthmatics had a 81,8% response, while the CF childrens response was 91,7%. Evaluating for the four-fold increase between pre- and post-immunization concentrations, the best response observed for the vaccine serotypes was 33,3% (4, 6B, 14 e 18C) for the asthmatics. In the CF group the best result was 61,1% (6B). In terms of the vaccine response, it was observed that 16,7% and 44,4% were the results for both the asthmatics and CF group, respectively. The polysaccharide vaccine didnt interfere in the results. The medians of the pre- and post-immunization antibodies concentrations for the vaccine serotypes, in both groups, were significantly increased. Despite those children that were already positive for the criteria evaluated, at the first moment of the study, for those children that were negative, the majority had a positive serology towards the vaccination response.